专利名称：20(s)－喜树碱的药学上可接受的盐的制作方法
技术领域：
本发明涉及由通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐、它们的衍生物、它们的类似物、它们的互变异构体形式、它们的立体异构体、它们的多晶型物和包含它们的药学上可接受的组合物。
本发明还涉及一种用于制备上述的药学上可接受的盐、它们的衍生物、它们的类似物、它们的互变异构体形式、它们的立体异构体、它们的多晶型物，和包含它们的药学上可接受的组合物的方法。
由通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐用于治疗黑素瘤、前列腺、白血病、淋巴瘤、非小肺癌、中枢神经系统癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌或肾癌。
本发明涉及包含通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐或它们的混合物的药物组合物。
由通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐在稳定性和溶解度方面具有明显的制剂和散装操作优点。
在我们最近授权的美国专利6,177,439B1中，我们公开和描述了新的式(II)的化合物
其中R1、R2、R3和R4独立地代表氢或代表选自以下的基团羟基、低级烷氧基、低级烷酰基、硝基、氰基、卤素、羧基、氨基、取代的氨基，其中所述氨基被一或二取代，且所述取代基选自低级烷基、低级卤代烷基、苄基、苯甲酰基、羧基、酰氨基或低级烷基氨基、低级烷基或取代的低级烷基，其中所述的取代基选自羟基、低级卤代烷基、苄基、低级烷氧基、苄氧基、氰基、硝基、氨基或低级烷基氨基；或者R2和R3一起代表-O(CH2)n-O-，其中n＝1或2，R1、R2、R3和R4中的每一个不相同，除了R1、R2、R3和R4中的每一个为氢；R5代表氢、低级烷基、取代的低级烷基，其中所述取代基选自羟基、卤素、低级烷氧基、苄氧基、羧基、酰氨基或氨基，其中所述氨基被一取代或二取代，且所述取代基选自低级烷基、低级卤代烷基、苄基或苯甲酰基，当氨基被二取代时，所述取代基独立地或与连接的氮原子一起形成式(A)的饱和5或6元杂环； 其中当式(A)为5元环时Y代表O、S、NH或CH2，当式(A)为6元环时Y代表CH2；或者R5代表低级芳烷基，其中所述芳基选自苯基，联苯或萘基；而R6代表苯基或苄基，其中所述苯基可以未被取代或被选自以下的一、二或三取代基取代卤素、低级烷氧基、氰基、硝基、低级烷基、氨基或取代的氨基，其中所述氨基被低级烷基一取代或二取代；环烷基或环烷基低级烷基，其中所述环具有3-7个环原子，所有的该环原子为碳；被式(B)的饱和5或6元杂环取代的低级烷基 当式(B)为5元环时，X代表CH或N，并且Y代表O、S、NH或CH2，当式(B)为6元环时，X代表CH或N并且Y代表CH2；取代的苯甲酰基，其中所述取代基选自低级烷基、低级卤代烷基、卤素、低级烷氧基、硫代烷氧基、氰基、硝基、酰氨基、氨基或低级烷基氨基；低级链烯基；取代的低级烷基或取代的低级链烯基，其中所述取代基选自卤素、羟基、低级烷氧基、芳氧基、硫、硫代烷基、硫代芳基、芳基，其中所述芳基选自苯基、联苯基或萘基；杂芳基、其中所述杂芳基选自吡啶基、喹啉、异喹啉、吲哚、吡咯、呋喃、苯并呋喃、噻吩、噻唑烷或咪唑；羧基、氰基、硝基酰氨基或氨基，其中所述氨基可以未被取代或被一或二取代，其中所述取代基选自羟基、低级烷基、低级卤代烷基、苄基、苯甲酰基、低级烷氧基、羧基、酰氨基或低级烷基氨基，当所述氨基被二取代时，取代基独立地或与连接的氮原子一起形成式(A)的饱和5元或6元杂环基团， 当式(A)为5元环时，Y代表O、S、NH或CH2，当式(A)为6元环时，Y代表CH2；或者R6代表取代的低级烷酰基，其中所述取代基选自卤素、低级烷氧基、芳氧基、硫、硫代烷基、硫代芳基、芳基，其中所述芳基选自苯基、联苯基或萘基；杂芳基，其中所述杂芳基选自吡啶基、喹啉、异喹啉、吲哚、吡咯、呋喃、苯并呋喃、噻吩、噻唑烷或咪唑；羧基、氰基、硝基、酰氨基或氨基，其中所述氨基未被取代或被一或二取代，其中所述取代基选自羟基、低级烷基、低级卤代烷基、苄基、苯甲酰基、低级烷氧基、羧基、酰氨基、氨基或低级烷基氨基，当所述的氨基被二取代时，所述取代基独立地或与连接的氮原子一起形成式(A)的饱和5或6元杂环基团， 当式(A)为5元环时，Y代表O、S、NH或CH2；当式(A)代表6元环时，Y代表CH2；而当R1代表羟基、氨基或硝基时，R2、R3、R4和R5代表氢，并且R6代表氢、低级烷基、烷酰基或苯甲酰基。
背景技术：
已报道几种密切相关的喜树碱衍生物和它们的类似物用于治疗癌症。现有技术中描述的这些化合物中的一些如下列(i)EP公开0074256A1、US专利4473692&4545880公开式(III)的化合物 其中R1代表氢原子、烷基、羟基、烷氧基或酰氧基；R2代表氢原子、烷基、芳烷基、羟基甲基、羧基甲基或酰氧基甲基，而R3代表基团-XR′(其中R′为氢原子、烷基或酰基，并且X为氧原子或硫原子)、硝基、氨基、烷基氨基、酰基氨基或卤原子，附带条件是当R1和R2都为氢原子时，R3不应为羟基、甲氧基或乙酰氧基。
这些化合物的一个实例如式(IIIa)所示 (ii)GB专利2056973公开了通过将任选在X或Y处引入取代基然后对这些取代基和/或其它取代基进行修饰而制备式(IV)的化合物及其水溶性碱金属盐 其中X为H、CH2OH、COOH、烷基、芳烷基或基团CH2OR1或CH2OR2，其中R1为烷基或酰基，并且R2为低级烷基，Y为H、OH或基团OR3，其中R3为低级烷基或酰基，而Z为H或酰基，其中排除某些组合。
这些化合物一个实例如式(IVa)所示。
(iii)欧洲公开EP 321122公开了式(III)的拓扑替康(topotecan)，它已上市， 发明目的因此本发明的主要目的是提供具有良好稳定性和溶解度的由通式(I)的20(S)-喜树碱衍生物形成的药学上可接受的盐、它们的类似物、它们的互变异构体形式、它们的立体异构体、它们的多晶型物和包含它们或它们的混合物的药学上可接受的组合物，这些物质可以用于治疗黑素瘤、前列腺、白血病、淋巴瘤、非小肺癌、中枢神经系统癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌或其它耐受药物如阿霉素(Adriomycin)、拓扑替康、伊立替康、顺铂(Cisplatinate)等的癌，具有较好的功效、效力和较低的毒性。
本发明的另一目的是提供一种用于制备由以上定义的通式(I)的20(S)-喜树碱衍生物形成的药学上可接受的盐、它们的类似物、它们的互变异构体形式、它们的立体异构体和它们的多晶型物的方法。
本发明的另一目的是提供包含由通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐、它们的类似物、它们的衍生物、它们的互变异构体、它们的立体异构体、它们的多晶型物或混合物并组合适宜的载体、溶剂、稀释剂和其它通常用于制备这些组合物的介质的药物组合物。
发明详述本发明涉及由通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐 它们的衍生物、它们的类似物、它们的互变异构体形式、它们的立体异构体、它们的多晶型物和药学上可接受的组合物，其中R1代表取代的(C1-C6)烷基，其中所述取代基选自一(C1-C6)烷基氨基或二(C1-C6)烷基氨基；R2代表羟基；R3、R4和R5代表氢；而R6代表氢、取代的(C1-C6)烷基，其中所述取代基选自卤素，羟基或(C1-C6)烷氧基。
R1代表的适宜的基团选自取代的(C1-C6)烷基如取代的甲基、取代的乙基、取代的正丙基、取代的异丙基等；其中所述取代基选自(C1-C6)烷基氨基如甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、异丙基氨基等或二(C1-C6)烷基氨基如二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基等。
R6代表的适宜的基团选自氢或取代的(C1-C6)烷基如取代的甲基、取代的乙基、取代的正丙基、取代的异丙基等；其中所述取代基选自卤素原子，如氟、氯、溴、碘；羟基或(C1-C6)烷氧基如甲氧基、乙氧基、丙氧基等。
根据本发明的特别有用的化合物包括10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-羟基-[20(S)，5(R)]-喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-羟基-[20(S)，5(S)]-喜树碱盐酸盐；
10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-羟基-[20(S)，5(RS)]-喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2’-羟基乙氧基)-[20(S)，5(R)]喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-羟基乙氧基)-[20(S)，5(S)]-喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-羟基乙氧基)-[20(S)，5(RS)]喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-甲氧基乙氧基)-[20(S)，5(R)]喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-甲氧基乙氧基)-[20(S)，5(S)]喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-甲氧基乙氧基)-[20(S)，5(RS)]喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-氟代乙氧基)-[20(S)，5(R)]喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-氟代乙氧基)-[20(S)，5(S)]喜树碱盐酸盐；和10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-氟代乙氧基)-[20(S)，5(RS)]喜树碱盐酸盐。
本发明提供一种由通式(I)的化合物形成药学上可接受的盐的制备方法，所述方法包括使式(II)的化合物与化学计量的适宜的酸，在溶剂存在下，在20-100℃的温度下反应2-9小时的时间， 其中所有的符号如前面定义。
所用的式(II)的化合物可以是光学纯的形式或外消旋形式，并可以由美国专利6,177,439 B1报道的方法制备。
所述药学上可接受的盐可以通过式(I)的化合物与以下物质反应而制备选自盐酸或氢溴酸的氢卤酸、乙酸、硫酸、硝酸、磷酸、硼酸、高氯酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸，甲磺酸、苯甲酸、抗坏血酸、水杨酸、苯磺酸等。所用的溶剂可以选自酮如丙酮、二乙基酮、甲基乙基酮或它们的混合物、甲醇、乙醇、正己烷、乙酸乙酯、苯、二乙基胺、甲醛、氯仿、二氯甲烷或它们的混合物。
构成本发明部分的由通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐的不同的多晶型物可以通过在不同的条件下将由通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐结晶而制备。例如，将常用的不同溶剂或它们的混合物用于结晶；在不同的温度下结晶；不同的冷却方式；在结晶期间从快速结晶变化到缓慢结晶。还可以通过加热或熔解化合物然后逐渐或快速冷却而得到多晶型物。多晶型物的存在可以通过固体探针NMR光谱、IR光谱、差示扫描量热法(DSC)、粉末X射线衍射或这种其它技术确定。
构成本发明部分的化合物的立体异构体可以采用常规的拆分立体异构体混合物的方法，使用单一非对映异构体形式的由通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐而制备。Jaques等人，在″Enantiomers，Racemates和Resolution″(Wiley Interscience，1981)中编辑了常用的方法。
本发明提供一种包含由以上定义的通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐所形成的盐、它们的衍生物、它们的类似物、它们的互变异构体形式、它们的立体异构体、它们的多晶型物、它们的药学上可接受的溶剂化物并组合常规的药用载体、稀释剂等的药物组合物，所述组合物可用于治疗白血病、淋巴瘤、非小肺癌、中枢神经系统癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌或其它耐受药物如阿霉素、拓扑替康、伊立替康、顺铂(Cisplatinate)等的癌。
药物组合物可以是常用的形式，例如片剂、胶囊、粉末剂、糖浆、溶液、悬浮液等，可以包含调味剂、甜味剂等，处在适宜的固体或液体载体或稀释剂中，或者在适宜的无菌介质中形成注射溶液或悬浮液。这种组合物通常包含1-20wt％，优选1-10wt％的活性化合物，组合物的剩余部分为药学上可接受的载体、稀释剂或溶剂。
适宜的药学上可接受的载体包括固体填充剂或稀释剂和无菌水溶液或有机溶液。这种药物组合物中的活性成分将以足以提供在上述范围内的目标剂量的数量而存在。因此，对于口服给药，活性成分可以与适宜的固体或液体载体或稀释剂组合形成胶囊、片剂、粉末剂、糖浆、溶液、悬浮液等。如果需要的话，药物组合物可以包含附加的组分如调味剂、甜味剂、赋形剂等。对于肠胃外给药，可以将活性成分与无菌含水或有机介质组合形成注射溶液或悬浮液。例如，可以使用芝麻或花生油、丙二醇水溶液等溶液，以及化合物的水溶性药学上可接受的酸加成盐或与碱形成的盐的水溶液。还可以将含有溶于聚羟基化蓖麻油的活性成分的水溶液用于注射液。然后可以将以这种方式制备的注射液进行静脉内、腹膜内、皮下或肌内给药，其中对人优选肌内给药。
对于鼻给药，所述制剂可以包含溶解或悬浮在液体载体，特别是含水载体中的本发明的活性成分，用于气溶胶应用。载体可以包含添加剂如稳定剂如丙二醇、表面活性剂、吸收增强剂如卵磷脂(磷脂酰胆碱)或环糊精或防腐剂如对羟基苯甲酸酯类。
含有滑石和/或糖类载体粘合剂等的片剂、糖衣丸或胶囊特别适于任何口服应用。优选片剂、糖衣丸或胶囊的载体包括乳糖、玉米淀粉和/和马铃薯淀粉。在可以使用甜味赋形剂的情况下可以使用糖浆或酏剂。
如以上定义的由通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐在临床上通过口、鼻、肺、透皮或肠胃外、直肠、埋植、皮下、静脉内、尿道内、肌内、鼻内、眼溶液或软膏施用于哺乳动物、包括人。优选口服途径给药，它更为方便并避免可能的注射疼痛和刺激。但是，在患者由于疾病或其它异常而不能吞咽药物或者在口服之后吸收受损的情况下，进行肠胃外给药是必需的。通过任一途径，剂量范围为大约0.01至大约100mg/kg患者体重/天，或者优选大约0.01至大约30mg/kg体重/天，以单一剂量或作为分开的剂量给药。但是，受治疗的个体受试者的最佳剂量将由负责治疗的人来确定，通常最初以较小的剂量给药，然后增大以确定最合适的剂量。
本发明的化合物成功地在黑素瘤、前列腺、白血病、淋巴瘤、非小肺癌、中枢神经系统癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌或其它耐受药物如阿霉素(Adriomycin)、拓扑替康、伊立替康、顺铂(Cisplatinate)等的癌症的治疗中施用。这由体外和体内动物实验来证明。
在以下提供的实施例中详细地解释本发明，这些实施例仅以例示的方式提供，因而不应将其理解为对本发明保护范围的限定。
制备110-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-羟基-20(S)-喜树碱 向溶于乙醇(20ml)的10-羟基-9-N，N-二甲基氨基乙基-20(S)-喜树碱(200mg)[根据以下所述的方法制备(1)J.L.Wood等人，inJ.Org Chem.，5739-5740(1995)；(2)A.Pochini等人，inSynthesis，906(1983)]和氯化铁(200mg)的混合物中滴加硫酸(2ml)，并在80℃下加热20小时。在真空下除去过量的酸和乙醇，用碳酸钾溶液中和残余物，并用乙酸乙酯萃取。用水、盐水洗涤有机层，并用无水硫酸钠干燥。蒸发溶剂得到固体物质。通过硅胶柱色谱法，使用甲醇-氯仿作为洗脱剂纯化固体残余物得到10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-乙氧基-20(S)-喜树碱(160mg)，为黄色粉末。
将10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-乙氧基-20(S)-喜树碱(160mg)溶于乙醇(10ml)，并用50％HCl(10ml)处理。将溶液加热回流20小时。在反应结束时，除去过量的水和乙醇作为共沸混合物，用碳酸钾溶液中和残余物，并用乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤有机层，并用无水硫酸钠干燥。在通过用乙酸乙酯-氯仿作为洗脱剂进行硅胶柱色谱法纯化之后浓缩溶剂得到10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-羟基-20(S)喜树碱(100mg)，mp245℃。
1H-NMR(DMSO)δ11.7(s，可交换D2O，1H)，10.0(s，可交换D2O，1H)，8.95(s，1H)，8.10(d，J＝10.0Hz，1H)，7.70(d，J＝10.0Hz，1H)，7.20(s，1H)，6.95(s，0.5H)，6.85(s，1H)，5.40(s，2H)，4.70(s，2H)，2.40(s，6H)，1.95-1.80(m，2H)，0.95-0.75(m，3H)。
制备210-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-羟基乙氧基)-20(S)喜树碱 向溶于乙二醇(8ml)的10-羟基-9-N，N-二甲基氨基乙基-20(S)-喜树碱(50mg)[根据以下所述的方法制备(1)J.L.Wood等人，inJ.Org Chem.，5739-5740(1995)；(2)A.Pochini等人，inSynthesis，906(1983)]和氯化铁(50mg)的混合物中滴加硫酸(0.6ml)，并在90℃下加热10小时。在真空下除去过量的酸和乙二醇，用碳酸钾溶液中和残余物，并用5％甲醇-乙酸乙酯萃取。用水、盐水洗涤有机层，并用无水硫酸钠干燥。蒸发溶剂得到固体物质。通过硅胶柱色谱法，使用甲醇-氯仿作为洗脱剂纯化固体残余物得到10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2’-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱(25mg)，为黄色粉末。mp220℃。
1H-NMR(DMSO)δ11.7(s，可交换D2O，1H)，9.90(s，可交换D2O，1H)，8.85(s，1H)，8.20(d，J＝10.0Hz，1H)，7.70(d，J＝10.0Hz，1H)，7.20(s，1H)，6.95(s，0.5H)6.85(s，0.5H)，5.40(s，2H)，4.75(s，2H)，3.90-3.70(m，4H)，2.80(s，6H)，1.95-1.75(m，2H)，0.95-0.75(m，3H)。
制备310-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-氟代乙氧基)-20(S)-喜树碱 向悬浮在二氯甲烷(10ml)中的10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-羟基-20(S)喜树碱(50mg)(在制备1中得到)和硫酸(0.1ml)的混合物中加入2-氟乙醇(0.2ml)，并将混合物在回流温度下加热12小时。用水终止反应，并用乙酸乙酯萃取。用水、盐水洗涤有机层，并浓缩至干。残余物用丙酮-氯仿作为洗脱剂进行硅胶柱色谱法纯化之后得到10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-氟代乙氧基)-20(S)-喜树碱(25mg).mp200℃。
1H-NMR(DMSO)δ8.97(s，1H)，8.18(d，J＝9.4Hz，1H)，7.78(d，J＝9.4Hz，1H)，7.19-7.17(s，1H)，6.94(s，1H)，6.88(s，1H)，5.40(br，s，2H)，4.80(br，s，2H)，4.70(m，2H)，4.20(m，2H)，2.80(br，s，3H)，1.87(br，m，2H)，0.88(br，m，3H)。
实施例1
10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-羟基-20(S)-喜树碱盐酸盐 将10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-羟基-20(S)喜树碱(50mg)(在制备1中得到)、0.4N HCl水溶液(5ml)的混合物加热并搅拌4小时。然后将乙酸乙酯(40ml)分3批倾入反应混合物中。每次回流约10分钟。倾析有机层。用10％丙酮氯仿洗涤。最后在约80℃下在旋转蒸发仪中将水层蒸发为苯共沸物。用乙酸乙酯洗涤所得的固体并干燥。
1H-NMR(DMSO，200MHz)δ11.78(s，1H)，10.0(bs，1H)，8.9(s，1H)，8.1(dd，2H)，7.18(d，1H)，6.9(d，1H)，5.4(s，2H)，4.7(s，2H)，2.8(d，6H)，1.8(bs，2H)，0.9(bs，3H)。
实施例210-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-羟基乙氧基)-20(S)喜树碱盐酸盐 将10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-羟基乙氧基)20(S)-喜树碱(60mg)(在制备2中得到)和0.4 N HCl水溶液(6ml)的混合物加热并搅拌4小时。然后将乙酸乙酯(50ml)分3批倾入反应混合物中。每次回流约10分钟。倾析有机层。用10％丙酮氯仿洗涤。最后在约80℃下在旋转蒸发仪中将水层蒸发为苯共沸物。用乙酸乙酯洗涤所得的固体并干燥。
1H-NMR(DMSO，200MHz)δ8.63(s，1H)，7.95(d，1H)，7.4(m，2H)，6.9(d，1H)，5.4(dd，2H)，4.3-3.3(bs，8H)，2.5(s，6H)，1.9(q，2H)，0.9(t，3H)。
实施例310-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-氟代乙氧基)-20(S)-喜树碱盐酸盐 将10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-氟代乙氧基)20(S)-喜树碱(5g)溶于0.1N盐酸(120ml)，并过滤除去不溶物质。连续地用乙酸乙酯(25ml×4)洗涤滤液，并冻干水溶液。冻干后，在室温下和真空下将所得的产物干燥16小时，并用乙醇(50ml)和己烷(100ml)结晶。将产物过滤并在真空和室温下干燥24小时。产率4.5g。
1H-NMR(DMSO，200MHz)δ8.97(s，1H)，8.18(d，J＝9.4Hz，1H)，7.78(d，J＝9.4Hz，1H)，7.19-7.17(s，1H)，6.94(s，1H)，6.88(s，1H)，5.40(br，s，2H)，4.80(br，s，2H)，4.70(m，2H)，4.20(m，2H)，2.80(br，s，3H)，1.87(br，m，2H)，0.88(br，m，3H)。
抗癌活性本发明制备的化合物对不同的人肿瘤细胞系表现出非常好的体外抗癌活性。
针对代表8种不同类型的癌的细胞系组筛选每种试验化合物。在典型的方法中，将1×104细胞接种到在100μL体积的含有抗菌素和10％FCS的RPMI 1640培养基中的96孔平板的每孔。
在37℃下，在CO2存在下培养平板。24小时后，在5份范围为100至0.01μM的10倍稀释液中评价试验化合物。向每个试验孔中加入100μL试验化合物溶液，将含有载体的培养基加到对照孔中，并进一步培养平板。培养48小时后，通过硫罗丹明B(sulforhodamine B)法终止平板培养。
然后通过自动分光光度平板读数器，在515nm的波长下读取与蛋白质质量成比例的光密度。将读数转入微计算机，并计算平均50％生长抑制(GI50)和平均总生长抑制。本发明的化合物表现出抗癌活性，这可以从下表1提供的数据看出
表1对不同细胞系的生长抑制(GI50)和总生长抑制(TGI)值(实施例1)
表2对不同细胞系的生长抑制(GI50)和总生长抑制(TGI)值(实施例2)
表3对不同细胞系的生长抑制(GI50)和总生长抑制(TGI)值(实施例3)
HPLC法测定的溶解度室温下将过量的化合物在pH为5.0的0.5ml 0.1M乙酸钠缓冲液中浸泡24小时。将溶液过滤通过0.45微米PVDF注射过滤器(Gelman Sciences)。将滤液以不同体积(10&20μl)注射到HPLC。记录色谱图。由校准曲线外推所记录的反应，并计算化合物的溶解度(J.Med.Chem.，1995，38，400)。
表4HPLC法测定的溶解度
单一剂量口服药代动力学研究动物将雄性瑞士白化病小鼠(20-30g)用于实验，将动物保持在标准实验室条件下，并任意自由地获取饲料和水。实验前使动物禁食过夜(约15小时)，在此期间它们任意自由地获取水。
制剂和给药准确称取等于10mg的数量的药物，将其转移到清洁的研钵中，并研磨得到细粉。向其中加入500μl DMSO(10％)得到澄清溶液。向其中加入4.5ml羧甲基纤维素钠(钠CMC)以组成5ml的体积。
以动物体重为基准，通过口管饲法施用适宜体积(以克为单体的体重×10＝待给药剂量的μl数)的制备溶液。
动物实验服药后，在指定的时间点(0.5、1、2，3、5，8和12h)，从眼眶后丛中收集100μl血液至0.5ml含有EDTA(5μl 200mg/ml在MilliQ水中的溶液)的eppendorff管中。以12,800rpm将血液离心2分钟，分离血浆，并立即不迟延地取血分析，以评价内酯和羧酸酯形式的化合物。
生物分析方法将50μl血浆转移到清洁的2ml微离心管。向此管中加入冰冷的甲醇(450μl)，并搅拌混合15秒以萃取化合物。在12,800rpm的干燥离心管中将这些内容物离心2分钟。将澄清的上清液分离至保持在4℃下的300μl自动取样器小瓶中，并将20μl的此液体注射到HPLC柱中。
HPLC条件HPLC系统(Shimadzu)由系统控制器(SCL-10AVP)、等度泵(Isocratic pump)(LC-10ATVP)、自动取样器(SIL-10ADVP)、荧光检测器(RF-10AXL)组成，而25℃下的柱式烘箱(CTO-10ASVP)由Class-VP软件控制。用以1.0ml/分流速泵出的流动相[1％TEAA(pH＝5.5)∶乙腈∶MeOH＝80∶15∶5)，通过柱(Supelcosil-LC318，5μ，4.6×250mm，300°A)洗脱样品，并用设定在Ex.370nm/Em.537nm下的荧光检测器检测洗脱液。大约的RT为羧酸酯(CA1＝4.1分，CA2＝4.8分)和内酯(LA1＝7.9分，LA2＝11.6分)。
浓度的校准和确定关于药物浓度的确定，分别绘制关于羧酸酯和内酯形式的药物与内标的峰面积比率对浓度(范围0.05-10μg/ml)的图，并利用软件″Sigma Plot″(Jandel Scientific version，2.0，USA)应用线性回归。得到相关系数(r2)为0.99或更好。
计算和数据分析分别通过非隔室模型分析计算羧酸酯和内酯形式的药代动力学参数。由原始数据直接得到最大血浆浓度(Cmax)和对应的时间(Tmax)。通过线性和对数线性梯形总和得到直至最后可计量时间点的血浆浓度对时间曲线下的面积AUC(o-t)。通过加合C最后/Kel而将AUC(0-t)外推至无穷大(即AUC(0-∞))，其中C最后代表最后可测时间浓度，而Kel代表表观最终速率常数。Kel通过对log-最终阶段的药物转化浓度进行线性回归而计算。最终消除阶段的半衰期利用关系式t1/2＝0.693/Kel得到。
表4药代动力学参数(实施例3)
权利要求
1.由通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐、 它们的衍生物、它们的类似物、它们的互变异构体形式、它们的立体异构体、它们的多晶型物和它们的药物组合物，其中R1代表取代的(C1-C6)烷基，其中所述取代基选自一(C1-C6)烷基氨基或二(C1-C6)烷基氨基；R2代表羟基；R3、R4和R5代表氢；和R6代表氢、取代的(C1-C6)烷基，其中所述取代基选自卤素、羟基或(C1-C6)烷氧基。
2.根据权利要求1的化合物，其中R1代表取代的(C1-C6)烷基，其中所述取代基选自二甲基氨基。
3.根据权利要求1和2的药学上可接受的盐，所述的盐通过用选自以下的酸处理通式(I)的化合物而获得选自盐酸或氢溴酸的氢卤酸，乙酸，硫酸，硝酸，磷酸，硼酸，高氯酸，酒石酸，马来酸，柠檬酸，甲磺酸，苯甲酸，抗坏血酸，水杨酸或苯磺酸。
4.特别有用的本发明的化合物，所述化合物包括10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-羟基-[20(S)，5(R)]-喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-羟基-[20(S)，5(S)]-喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-羟基-[20(S)，5(RS)]-喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-羟基乙氧基)-[20(S)，5(R)]喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-羟基乙氧基)-[20(S)，5(S)]喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-羟基乙氧基)-[20(S)，5(RS)]喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-甲氧基乙氧基)-[20(S)，5(R)]喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-甲氧基乙氧基)-[20(S)，5(S)]喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-甲氧基乙氧基)-[20(S)，5(RS)]喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-氟代乙氧基)-[20(S)，5(R)]喜树碱盐酸盐；10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-氟代乙氧基)-[20(S)，5(S)]喜树碱盐酸盐，和10-羟基-9-N，N-二甲基氨基甲基-5-(2′-氟代乙氧基)-[20(S)，5(RS)]喜树碱盐酸盐。
5.一种由通式(I)的化合物形成药学上可接受的盐的制备方法，所述方法包括使式(II)的化合物与化学计量的适宜的酸，在溶剂存在下，在20-100℃的温度下反应2-9小时的时间， 其中所有的符号如前面定义。
6.一种药物组合物，所述组合物包含有效量的如权利要求1和4定义的由通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐 以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或溶剂化物。
7.如权利要求6所要求的药物组合物，所述组合物为片剂、胶囊、粉末剂、糖浆、溶液或悬浮液的形式。
8.一种治疗黑素瘤、前列腺、白血病、淋巴瘤、非小肺癌、中枢神经系统癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌或肾癌的方法，所述方法包括给需要的患者施用有效量的如权利要求1和4所要求的由通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐。
9.一种药物组合物，所述组合物包含有效量的如权利要求1和4定义的由通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或溶剂化物。
10.如权利要求9定义的药物组合物，所述组合物为片剂、胶囊、粉末剂、糖浆、溶液或悬浮液的形式。
全文摘要
本发明涉及由通式(I)的化合物形成的药学上可接受的盐、它们的衍生物、它们的类似物、它们的互变异构体形式、它们的立体异构体、它们的多晶型物和包含它们的药学上可接受的组合物。本发明还涉及一种用于制备上述药学上可接受的盐、它们的衍生物、它们的类似物、它们的互变异构体形式、它们的立体异构体、它们的多晶型物和包含它们的药学上可接受的组合物的方法。
文档编号A61K9/48GK1575292SQ02821084
公开日2005年2月2日 申请日期2002年9月25日 优先权日2001年9月25日
发明者S·波托库奇, S·杜维里, S·拉杰古帕尔 申请人:雷迪实验室有限公司