专利名称：L－甲硫氨酸在无hsa的制剂中用作nesp/epo的稳定剂的制作方法
背景技术：
由于近来遗传学和细胞工程技术的发展，在体内具有各种药理活性的蛋白质已经能够大批量生产，用作药物。这样的蛋白质包括红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素(α、β、γ、共有序列)、肿瘤坏死因子结合蛋白(TNFbp)、白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)、脑源神经营养因子(BDNF)、角化细胞生长因子(KGF)、干细胞因子(SCF)、巨核细胞生长分化因子(MGDF)、破骨细胞形成阻碍因子(OPG)、胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、肥胖蛋白(OB蛋白)和新的血红素形成刺激蛋白(NESP)。
EPO是红细胞系的远祖细胞向红细胞成熟的过程中所必需的糖蛋白类激素。它由肾脏产生，对于调节循环中的血红细胞水平至关重要。以低水平氧信号为标志的条件能够增加EPO的产生，进而刺激红细胞形成。举例来说，慢性肾衰(CRF)中肾功能丧失，常常导致EPO生成减少并同时伴有血红细胞减少。Miyake et al.，J.Biol.Chem.，2525558(1977)从再生障碍性贫血病人中纯化了人尿EPO。但是，这种来源获得的纯化EPO蛋白不足以用作药物。Lin的美国专利No.4,703,008中公开了鉴定和克隆编码人EPO的基因及表达重组蛋白的方法，该发明的内容在此引用作为参考。Lai等美国专利No.4,703,008中公开了从细胞培养基中纯化重组蛋白的方法，该发明的内容在此引用作为参考。具有生物活性的EPO在哺乳动物宿主细胞中的生成首次使EPO的产量适合于药用。另外，基因序列的获知和纯化蛋白质的更容易获得使人们对这种蛋白质的作用模式有了更深入的认识。
人尿来源的EPO(Miyake et al.，同上)和哺乳动物细胞中表达的重组人EPO都含有三个N-连接和一个O-连接的寡聚糖链，共占糖蛋白总分子量的40％。N-连接糖基化发生在24、38和83位的精氨酸残基上，而O-连接糖基化发生在126位的丝氨酸残基上(参见Lai et al.，J.Biol.Chem.，2613116(1986)；Broudy et al.，Arch.Biochem.Biophys，265329(1988))。末端唾液酸残基能够对寡聚糖链进行修饰。典型地说，每个N-连接糖链可具有4个唾液酸，每个O-连接糖链可具有2个唾液酸。一条EPO多肽链最多可以容纳共14个唾液酸。
许多研究都已表明改变EPO糖链影响其生物活性。在一项研究中，通过诱变精氨酸或丝氨酸残基这两个糖基化位点，单独或同时去除N-连接或O-连接糖链明显降低了哺乳动物细胞中产生的突变EPO的体外活性；Dube et.Al.，J.Biol.Chem.，26317516(1988)。但是，据DeLorme et al.，Biochemistry，319871-9876(1992)报道，去除EPO中的N-连接糖基化位点降低其体内生物活性，而不会降低其体外生物活性。
通过测定分离的EPO同工蛋白的体内活性，揭示了EPO中唾液酸含量和其体内生物活性之间的关系。通过测定等摩尔浓度的分离EPO同工蛋白使正常小鼠红细胞压积的增加量，以此反应EPO的体内生物活性。结果发现随着每个EPO分子中唾液酸的含量逐步增加，其体内生物活性也逐步增加；Egrie et al.，Glycoconjugate J.，10263(1993)。具有较高唾液酸含量的EPO同工蛋白还表现出较长的血清半衰期，但是与EPO受体的亲和力下降，说明血清半衰期是体内生物活性的一个重要指标。
在美国，EPO已经用于治疗处于透析及透析前阶段的慢性肾衰，治疗癌症化疗后的继发性贫血及叠氮胸苷治疗HIV感染后出现的贫血。在全球，EPO已经用于治疗与早、镰状细胞贫血、类风湿性关节炎和骨髓移植等相关的贫血；Markham et al.，Drugs，49232-254(1995)。
NESP是超级糖基化的红细胞生成素类似物，和rHuEPO的氨基酸序列相比有5处改变，具有两个额外的糖链。更具体地说，NESP在30和88位氨基酸残基(数字对应于人EPO的序列)之间含有两个额外的N-连接糖链(参见No.US94/02957号PCT申请，在此以整体形式引入作为参考)。NESP具有和EPO不同的生化特征，具有更长的血清半衰期和更高的体内生物活性；Egrie et al.，ASH，Blood，9056a(1997)。NESP在小鼠、大鼠、犬和人体内的血清半衰期增加了约3倍之多。和rHuEPO相比，小鼠中NESP更长的血清半衰期和更高的体内活性使获得相同生物反应性所需要的给药频率降低(每周一次或每隔一周一次)。
一项药代动力学研究结果和动物研究结果相一致。在慢性肾衰病人中，和rHuEPO相比，NESP明显具有更长的血清半衰期，说明对于人来说也可以降低给药频率；MacDougall，et al.，J American Societyof Nephrology，8268A(1997)。，给药频率降低使医生和病人更方便，对参与自我给药的病人来说尤其有帮助。给药频率降低的其他优点包括导入病人的药物减少，服用rHuEPO相关的一些副作用的性质或严重程度减小，依从性上升。
虽然商品化的EPO和NESP制剂具有良好的耐受性和稳定性，但也要考虑到一个事实，就是在极端条件下，这种蛋白质在生产、操作和保存过程中会变得不稳定，发生各种不希望的理化降解。这些降解包括聚集、失活和甲硫氨酸残基的氧化。一些外来因素会加速这种降低过程，如热、光、制剂中不含白蛋白之类的人血产品或多剂量制剂中含有苯甲醇之类的防腐剂。
有文献报道抑制含甲硫氨酸的多肽氧化的方法；Takruri et al.，U.S.Patent No.5,272,135(December 21，1993)。具体地说，Takruri介绍了抑制液体或半液体制剂中甲硫氨酸残基氧化的方法，其中制剂包含氨基酸序列中具有至少一个甲硫氨酸残基的多肽。往制剂中加入游离L-甲硫氨酸，使加入的量足以抑制多肽中甲硫氨酸残基的氧化，实现对甲硫氨酸氧化的抑制。甲硫氨酸残基的氧化与包装及储存制剂的塑料器皿有关，如易于使氧气透过的聚丙烯或低密度聚乙烯(LDPE)。Takruri文献中打算使用的多肽是生长因子，检验的制剂是表皮生长因子(EGF)的眼药水制剂。没有讨论包含EPO或NESP或其他糖基化蛋白的制剂，也没有讨论无HSA、多剂量或无HSA多剂量的制剂。
发明概述本发明提供EPO和/或NESP的药用制剂，其中所述制剂中甲硫氨酸和其他稳定剂的加入使制剂更稳定，即使在极端条件下也是如此，而不加这些成分时光、热、添加剂中的杂质、预先加满的注射器中存在的leacheats、生产过程、保存、运输和操作会诱导关键的降解。
重要的是，在关键降解更为明显的无HSA制剂及含防腐剂的无HSA多剂量的制剂中，制剂稳定性也有所提高。
附图简述
图1是说明游离甲硫氨酸对暴露在光线下的NESP聚集影响的图。磷酸盐缓冲液中的NESP于室温在紫外光下暴露4小时。
图2是说明游离甲硫氨酸对保存在2～8℃、添加有1％苯甲醇的NESP聚集影响的图。含有500μg/mL NESP的样品保存了13个月。
图3是说明各种添加剂和处理对37℃孵育90天的NESP中第54位甲硫氨酸残基氧化影响的图。通过胰蛋白酶消化，进而用反相HPLC和质谱测定氧化百分率(％)。
图4是说明游离甲硫氨酸对包含有1％苯甲醇的储存制剂中NESP氧化影响的图。对0～20mM游离甲硫氨酸进行试验，样品于4℃保存56天。
图5是说明游离甲硫氨酸对包含有1％苯甲醇的储存制剂中NESP氧化影响的图。对0～20mM游离甲硫氨酸进行试验，样品于29℃保存56天。
图6比较了Ph7.0±苯甲醇和±游离L-甲硫氨酸的溶液中EPO的胰蛋白酶图谱。
图7是比较通氮气和不通氮气(10分钟)情况下NESP甲硫氨酸氧化速率的图。％甲硫氨酸氧化对苯甲醛浓度作图。对0.1mg/mLNESP进行试验。
图8比较了过量氧化的NESP样品中的胰蛋白酶图谱。图中所有样品的甲硫氨酸-54都完全氧化。图中所示的数字表示往样品中加入的甲硫氨酸浓度。
发明详述这里“赋形剂”定义为为了产生所需的效应，如稳定性、等渗性，往药用组分中添加的非治疗性试剂。
这里“多肽”定义为具有多于10个氨基酸及所需生物活性的天然、合成或重组的蛋白质或肽。
这里所用的生物活性物质指动物或人的、用于预防、治疗或诊断等用途的重组或天然多肽。生物活性物质可以是天然的、合成的、半合成的，或是其衍生物。预期的活性物质包括肽、小分子、糖、核酸、脂、蛋白质和其类似物。本技术领域中的熟练人员能够将所需的生物活性物质配制成本发明的组合物。
预期使用的蛋白质包括但不局限于干扰素共有序列(参见美国专利号5,372,808、5,541,293、4,897,471和4,695,623，包括附图在此引用以作参考)、粒细胞集落刺激因子(参见美国专利号4,810,643、4,999,291、5,581,476、5,582,823和PCT公开号94/17185，包括附图在此引用以作参考)、白介素(参见美国专利号5,075,222，包括附图在此引用以作参考)、红细胞生成素(参见美国专利号4,703,008、5,441,868、5,618,698、5,547,933和5,621,080，包括附图在此引用以作参考)、干细胞因子(参见PCT公开号91/05795、92/17505和95/17206，包括附图在此引用以作参考)、破骨细胞形成阻碍因子(参见PCT公开号97/23614，包括附图在此引用以作参考)、新的血红素形成刺激蛋白(参见PCT公开号94/09257，包括附图在此引用以作参考)、肥胖蛋白(OB蛋白)(参见PCT公开号96/40912、96/05309、97/00128、97/01010和97/06816，包括附图在此引用以作参考)、巨核细胞生长分化因子(参见PCT公开号95/26746，包括附图在此引用以作参考)、肿瘤坏死因子结合蛋白(TNF-bp)、白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)、脑源神经营养因子(BDNF)、胶质细胞来源的神经营养因子(GDNF)、角化细胞生长因子(KGF)和血小板生成素。这里所用的术语蛋白质，包括肽、多肽、共有序列分子、类似物、衍生物或其组合。
一般来说，用在本发明中的EPO具有人红细胞生成素的序列，或是人红细胞生成素的密切相关类似物。EPO可以在体外由哺乳动物细胞产生，也可以从天然材料中分离。优选的EPO是如Lin的美国专利No.4,703,008中所述产生的重组人EPO(rHuEPO)，其内容在此引入以作参考。EPO的氨基酸序列如SEQ ID NO1所述。优选的宿主细胞是Lin的发明中实施例10所述的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。该技术领域中熟知的其他细胞，如初生仓鼠的肾细胞也可用于产生本发明中用到的EPO。而Lin的发明中实施例10的程序是产生rEPO的优选方法，可以用本技术领域中熟知的方法加对其以修改和变动。优选的EPO浓度是50IU/Ml～500,000IU/mL，更优选的是750IU/Ml～48,000IU/mL。
本发明的NESP是包含有两个额外糖基化位点的EPO超级糖基化类似物，每一位点有额外的糖链与之相结合。利用定点诱变技术构建NESP，并在哺乳动物宿主细胞中表达。共同享有的PCT申请No.US94/02957中提供了产生NESP的详细方法。通过改变DNA序列，使之编码多肽链中的氨基酸Asn-X-Ser/Thr，从而往rHuEPO中引入新的N-连接糖基化位点。将编码NESP的DNA转染进中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞，分析所表达的多肽中额外糖链的存在。在一个优选的实施方案中，NESP在残基30和88处具有两个额外的N-连接糖链。氨基酸序列的编号依据人红细胞生成素(EPO)的氨基酸序列而定。NESP的氨基酸序列如SEQ ID NO2所述。除了新的糖基化位点外，NESP还具有正常的N-连接糖基化和O-连接糖基化。优选的NESP浓度为1μg/mL～5000μg/mL，更优选的是10μg/mL～500μg/mL。
本发明的EPO和NESP还包括在SEQ ID NO1和2中一个或多个残基上的保守氨基酸改变。这些改变不添加糖链，对类似物的生物活性几乎没有影响。这些变化如下面的表1所示。参见Generally，Creighton，Proteins，Passim(W.H.Freeman and Company，N.Y.，1984；Ford et al.，蛋白质表达和纯化295-107(1991)，在此引入以作参考。
表1保守氨基酸替换
本发明中组合物的治疗用途取决于所用的生物活性物质。本技术领域中的熟练人员能够根据本发明使所需的生物活性物质适合于目的性治疗用途。这种试剂的治疗用途在下面的发表物中有更详细的介绍，包括附图在此引用以作参考。治疗用途包括但不局限于使用下列蛋白质干扰素共有序列(参见美国专利号5,372,808、和5,541,293，包括附图在此引用以作参考)、白介素(参见美国专利号5,075,222，包括附图在此引用以作参考)、红细胞生成素(参见美国专利号4,703,008、5,441,868、5,618,698、5,547,933、5,621,080、5,756,349和5,955,422，包括附图在此引用以作参考)、粒细胞集落刺激因子(参见美国专利号4,999,291、5,581,476、5,582,823、4,810,643和PCT公开号94/17185，包括附图在此引用以作参考)、巨核细胞生长分化因子(参见PCT公开号95/26746，包括附图在此引用以作参考)、干细胞因子(参见PCT公开号91/05795、92/17505和95/17206，包括附图在此引用以作参考)、OB蛋白(参见PCT公开号96/40912、96/05309、97/00128、97/01010和97/06816，包括附图在此引用以作参考)、新的血红素形成刺激蛋白(参见PCT公开号94/09257，包括附图在此引用以作参考)。另外，本组合物还用于生产一个或多个药物，以治疗或改善使用生物活性物质治疗的病情。
由于和NESP特别相关，本发明提供了一种提高或维持哺乳动物红细胞压积的方法，该方法包括使用存在于本发明药用组合物中的药用有效量的NESP。该方法中，要达到相当的目的红细胞压积，NESP的施用次数比等摩尔量的rHuEPO少。使达到病人最适红细胞压积范围的本发明的给药频率小于每周三次，或小于每周一次，比如每隔一周一次，每月一次或两个月一次。维持病人目的红细胞压积所需的给药频率小于每周三次。给药频率可以每周两次，每周一次，或小于每周一次，比如两周一次，每月一次或两个月一次。
对于血红细胞水平降低的任何情况都能使用本发明的组合物，这些情况包括和肾功能衰退或丧失(慢性肾衰)、骨髓抑制治疗、癌症、病毒感染、慢性疾病和手术过程中的过量失血等相关的贫血。
可以想象，为将溶液的pH维持在所需的范围内，本发明的制剂还含有缓冲试剂，如碱性盐(磷酸钠或磷酸钾；或磷酸氢二钠或磷酸氢二钾；或磷酸氢二钠或磷酸氢二钾)、柠檬酸钠/柠檬酸、醋酸钠/醋酸和其他药学上可接受、本技术领域所熟知的pH缓冲试剂。也可以使用这些缓冲试剂的混合物。用在组合物中的缓冲试剂的量主要依赖于所用的特定缓冲液和溶液的pH。举例来说，pH5的醋酸缓冲液比pH6的醋酸缓冲液更有效，因此用在溶液中时，pH5的醋酸缓冲液用量比pH6的醋酸缓冲液少。优选配方中优选的pH在5.0～7.0范围内，为了得到所需的pH，还包括调整pH的试剂，如盐酸、柠檬酸、氢氧化钠或相应的盐。
制剂还含有脱水山梨醇单-9-硬脂酸多聚(氧-1，2-乙二醛)衍生物，包括但不局限于聚山梨酯80或聚山梨酯20。其他衍生物是本技术领域中所熟知的。聚山梨酯20或80的用量在0.001％～0.1％(w/v)范围内。一次性使用和多剂量制剂中的优选用量是0.005％(w/v)。
为了提供具有更高稳定性的EPO和/或NESP药用制剂，制剂中包括游离L-甲硫氨酸。添加游离甲硫氨酸的量在0.05mM～50mM范围内。在含有HSA的制剂中，一次性使用制剂中优选的量是0.05mM～5mM，多剂量制剂中优选的量是1mM～10mM。在无HSA的制剂中，一次性使用制剂中优选的量是0.05mM～5mM，多剂量制剂中优选的量是1mM～10mM。
本发明多剂量制剂中考虑使用的防腐剂包括苯甲醇、苯扎氯铵、三氯叔丁醇、甲酚、酚和羟基苯甲酸酯。添加防腐剂的量在0％～2％(w/v)范围内，制剂中优选的量为1％(w/v)。
本发明的制剂还含有渗透压调节试剂，以保持溶液的等渗性，更便于注射。典型的渗透压调节试剂是本技术领域所熟知的，包括但不局限于氯化钠、甘露醇、甘氨酸和山梨醇。优选的试剂是浓度范围为0mM～200mM的氯化钠。
还可以考虑往本发明的制剂中添加其他抗氧化剂。在制剂中考虑使用的抗氧化剂包括甘氨酸和赖氨酸之类的氨基酸，EDTA和DTPA之类的螯合剂，山梨醇和甘露醇之类的自由基捕捉剂。
本发明中考虑使用的优选NESP制剂含有1～5000μg/mL NESP、10mM～30mM磷酸盐缓冲液、100mM～200mM NaCl、0.001％～0.1％(w/v)聚山梨酯80和0.5mM～50mM L-甲硫氨酸，pH5.0～7.0；更优选的是，含有10～500μg/mL NESP、20mM磷酸盐缓冲液、140mMNaCl、0.005％(w/v)聚山梨酯80和1mM～50mM L-甲硫氨酸，pH6.2。
本发明中考虑使用的优选EPO制剂含有50～500,000IU/mL EPO、0.01mM～5mM磷酸盐缓冲液、0.01mM～150mM NaCl、5mM～50mML-精氨酸或L-组氨酸或相应的盐、0.001％～0.1％(w/v)聚山梨酯80和0.5mM～50mM L-甲硫氨酸，pH5.0～7.0；更优选的是，含有750～48,000IU/mL EPO、2mM磷酸盐缓冲液、110mM NaCl、43.1mML-精氨酸盐酸、0.006％(w/v)聚山梨酯80和0.5、1、2、3或5mM～50mM L-甲硫氨酸，pH6.0。
抑制甲硫氨酸氧化考虑使用的方法还有氮气覆盖。可以在包装过程中，往小瓶或预先填充的注射器的口径处通氮气，实现氮气覆盖。
下面的实施例是为了更全面地说明本发明，对本发明的范围不作限制。
实施例1该实施例介绍了包含HSA和无HSA的一次性使用及多剂量制剂的EPO和NESP制剂的制备。如下文的材料与方法制备EPO和NESP蛋白制剂。
通过往蛋白制剂中加入0.1％～1％白蛋白、适当的缓冲试剂(如磷酸钠)和渗透压调节剂(如氯化钠)，获得具有所需浓度蛋白质和赋形剂的制剂，制备含有HSA的NESP和/或EPO制剂。将白蛋白替换成其他重组蛋白或药学上可接受的表面活化剂(如聚山梨酯20或80)，制备无HSA的NESP和/或EPO制剂。通过往含HSA或无HSA的配方中加入防腐剂(如苯甲醇)，制备多剂量制剂。
实施例2该实施例介绍的实验中，评价了游离L-甲硫氨酸对(光诱发的)NESP聚集的影响。虽然其机制尚不清楚，在极端条件下，光诱导NESP制剂发生显著聚集。该实验中使用按照实施例1所述制备的一次性使用的无HSA制剂。
将盛有蛋白质的玻璃小瓶置于UV光箱中，连续UV光照射过夜(16小时)。通过SEC-HPLC对样品进行分析。如图1所示，加入10mM的游离甲硫氨酸显著降低降解速率。
实施例3该实施例介绍的实验中，评价了有苯甲醇存在的条件下游离L-甲硫氨酸对NESP聚集的影响。虽然其机制尚不清楚，但即使在2～8℃保存期间，苯甲醇也诱导NESP制剂发生非常轻微的聚集。该实验中使用按照实施例1所述制备的多剂量、无HSA的制剂。
含有1％苯甲醇的多剂量制剂于2～8℃保存13个月，通过SEC-HPLC对样品进行分析。如图2所示，加入1mM～20mM游离的甲硫氨酸显著降低聚积速率。
实施例4该实施例介绍的实验中，验证了各种添加剂和处理对无HSA的NESP一次性使用制剂中甲硫氨酸氧化的抑制作用。该实验中使用按照实施例1所述制备的无HSA的NESP一次性使用制剂。
首先，通过过氧化氢穿刺实验(下文材料与方法中作有介绍)验证了各种抗氧化剂对NESP的保护作用。对游离氨基酸L-赖氨酸、甘氨酸和L-甲硫氨酸进行了试验，通过下文材料与方法中介绍的胰蛋白酶图谱分析法测定％氧化。结果有力地说明在过量过氧化氢存在的条件下，L-甲硫氨酸抑制NESP中Met-54的氧化(参见表1)。
表1抗氧化剂NESP中Met-54的氧化(％)甘氨酸 100赖氨酸 100甲硫氨酸37.3甘氨酸+赖氨酸 100甘氨酸+甲硫氨酸 35.3赖氨酸+甘氨酸+甲硫氨酸 32.9然后，验证各种添加剂和处理对NESP的保护作用。使用无HSA的NESP制剂作为对照。对20M L-甲硫氨酸、10mM组氨酸和0.1mMEDTA等添加剂进行试验。测定结果说明游离的L-甲硫氨酸、EDTA、组氨酸和/或氮气能够有效地抑制过氧化物、超氧离子等各种氧化试剂对无HSA的NESP制剂中Met-54的氧化作用(参见图3)。游离L-甲硫氨酸和EDTA或组氨酸的联合使用能够比单独使用添加剂更有效地抑制氧化作用(参见图3)。游离L-甲硫氨酸和口径处氮气覆盖的联用也比单独处理更有效(参见图3)。
实施例5该实施例介绍的实验中，验证了各种添加剂和处理对无HSA的EPO和/或NESP多剂量制剂中甲硫氨酸氧化的抑制作用。该实验中使用按照实施例1所述制备的无HSA的EPO和/或NESP多剂量制剂。
首先，如实施例2所述，通过过氧化氢穿刺实验验证了各种抗氧化剂对无HSA的NESP多剂量制剂的保护作用。对制剂含有的1％苯甲醇和浓度范围在0～20mM的游离L-甲硫氨酸进行了试验。样品在4℃或29℃保存56天。研究发现加入L-甲硫氨酸能够有效地抑制多剂量制剂中苯甲醇杂质诱发的氧化(参见表4和5)。
然后，评价了甲硫氨酸对无HSA的EPO制剂±苯甲醇的影响。图6比较了溶液中加和不加苯甲醇的EPO胰蛋白酶图谱，显然，大量苯甲醇的添加能够导致pH7.0溶液中EPO的完全氧化。但是，游离L-甲硫氨酸的加入能够完全抑制包含等量苯甲醇的溶液中EPO的氧化。
另外，测定结果表明往溶液中通氮气也能够显著降低苯甲醛诱发的Met-54的氧化速率(参见图7)。这表明游离的L-甲硫氨酸能够抑制解离的分子氧对NESP中Met-54的氧化作用。
实施例6该实施例介绍的实验评价了甲硫氨酸54的氧化对NESP生物活性的影响。首先，用0.01％过氧化氢氧化NESP制剂不同的时间，使NESP样品含有不同量的氧化型Met-54残基。测定结果表明甲硫氨酸54的氧化对NESP或EPO的生物活性没有负面影响。
表2活性(％)氧化(％) 体外 体内对照 121 1211592 1333995 1255790 10976102 100100 95 106
然后，加入足够浓度的过氧化氢，将样品孵育数天，使NESP溶液中所有的甲硫氨酸54残基都被氧化，即使在添加有游离L-甲硫氨酸的情况下也是如此。测定结果表明在极端氧化应激下，NESP丧失了生物活性，在不含有游离甲硫氨酸的样品中丧失显著生物活性(见表3)。
表3样品 甲硫氨酸氧化活性(％)(％)0mM Met，0.25％H2O2，6天100 375mM Met，0.25％H2O2，6天100 8510mM Met，0.25％H2O2，6天 100 9120mM Met，0.25％H2O2，6天 100 8540mM Met，0.25％H2O2，6天 100 77NESP的失活与其他氨基酸残基氧化的相关性比甲硫氨酸残基氧化的相关性还大。另外还鉴定到色氨酸、半胱氨酸和组氨酸也是氧化位点(见图8)。游离甲硫氨酸的加入通过保护这些关键氨基酸免受氧化而抑制NESP的氧化失活(表3)。
材料和方法本发明中使用的EPO根据上文引用作为参考的美国专利号为4,703,008(Lin)的方法加以制备。
本发明中使用的NESP根据上文引用作为参考的PCT公开号为94/09257的方法加以制备。
使用商品化的胰蛋白酶对蛋白质加以消化，然后通过反相HPLC将肽分离，进行NESP或EPO的胰蛋白酶图谱分析。典型的实验操作如下往180μL样品中加入pH8.2、包含20mM甲硫氨酸、500mMTris(碱)和5M脲的20μL胰蛋白酶消化缓冲液，然后加入4μL的1mg/mL胰蛋白酶溶液。室温消化18小时后，利用PhenomenexJupiter C18(250×4.6，300A)柱通过反相HPLC对消化的样品进行分析。
通过往待测样品中加入小量过氧化氢，进行过氧化氢穿刺实验。室温孵育预测定时间后，加入100mM过量的L-甲硫氨酸淬灭游离的过氧化物，终止反应。
从特定实施方案的角度介绍了本发明，这些实施方案含有实施本发明的优选模式。在特定的实施方案中，本技术领域中的普通熟练技术人员可以根据本发明内容，在不背离本发明目的性范围的条件下作出一定数目的修饰和改变。
序列表<110>Li，TianshengChang，ByeongSloey，Christopher<120>L-甲硫氨酸在无HSA的制剂中用作NESP/EPO的稳定剂<130>A-803<140>TBD<141>2001-08-30<160>2<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>165<212>PRT<213>人<400> 1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp165<210>2<211>165<212>PRT<213>人<400>2Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Asn Glu Thr20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp16权利要求
1.包括生物活性物质和甲硫氨酸的药用制剂，其中所述的制剂稳定性得到改进，并且不含人血清白蛋白。
2.根据权利要求1的制剂，其中所述的甲硫氨酸的浓度约0.5mM～50mM。
3.根据权利要求2的制剂，其中所述的活性物质选自肽、小分子、糖、核酸、脂、蛋白质和相应的类似物。
4.根据权利要求3的制剂，其中所述的活性成分是蛋白质。
5.根据权利要求4的制剂，其中所述的蛋白质是红细胞生成素(EPO)。
6.根据权利要求5的制剂，其中所述的EPO含SEQ ID NO1所述的氨基酸序列。
7.根据权利要求6的制剂，还包括使为pH约5至约7的pH缓冲试剂。
8.根据权利要求7的制剂，还包括用量具有稳定作用、浓度约0.001％～0.1％的脱水山梨醇单-9-硬脂酸多聚(氧-1，2-乙二醛)衍生物(w/v)。
9.根据权利要求4的制剂，其中所述的蛋白质是新的红细胞生成刺激蛋白(NESP)或其化学修饰物。
10.根据权利要求9的制剂，其中所述的NESP具有如SEQ IDNO2所述的氨基酸序列。
11.根据权利要求10的制剂，还包括使pH约5至约7的pH缓冲试剂。
12.根据权利要求11的制剂，还包括用量具有稳定作用、浓度约0.001％～0.1％的脱水山梨醇单-9-硬脂酸多聚(氧-1，2-乙二醛)衍生物(w/v)。
13.包括生物活性物质、防腐剂和甲硫氨酸的药用多剂量制剂，其中所述的制剂具有增强的稳定性，并且不有人血清白蛋白。
14.根据权利要求13的制剂，其中所述的甲硫氨酸浓度约0.5mM～50mM。
15.根据权利要求14的制剂，其中所述的活性物质选自肽、小分子、糖、核酸、脂、蛋白质和相应的类似物。
16.根据权利要求15的制剂，其中所述的活性成分是蛋白质。
17.根据权利要求16的制剂，其中所述的蛋白质是红细胞生成素(EPO)。
18.根据权利要求17的制剂，其中所述的EPO具有如SEQ IDNO1所述的氨基酸序列。
19.根据权利要求18的制剂，其中所述的防腐剂是苯甲醇，浓度约0％～2％(w/v)。
20.根据权利要求19的制剂，还包括使pH约5至约7的pH缓冲试剂。
21.根据权利要求20的制剂，还包括用量具有稳定作用、浓度约0.001％～0.1％的脱水山梨醇单-9-硬脂酸多聚(氧-1，2-乙二醛)衍生物(w/v)。
22.根据权利要求16的制剂，其中所述的蛋白质是新的红细胞生成素刺激蛋白(NESP)或其化学修饰物。
23.根据权利要求22的制剂，其中所述的NESP具有如SEQ IDNO2的氨基酸序列。
24.根据权利要求23的制剂，其中所述的防腐剂是苯甲醇，浓度约0％～2％(w/v)。
25.根据权利要求24的制剂，还包括使pH约5至约7的pH缓冲试剂。
26.根据权利要求25的制剂，还包括用量具有稳定作用、浓度约0.001％～0.1％的脱水山梨醇单-9-硬脂酸多聚(氧-1，2-乙二醛)衍生物(w/v)。
27.一种使由生物活性物质组成的药用组合物稳定的方法，该方法包括往所述组合物中加入甲硫氨酸，加入的量足以抑制所述生物活性物质氨基酸序列中的甲硫氨酸残基不被氧化；并且该制剂不含有人血清白蛋白。
全文摘要
本发明涉及包含生物活性物质和甲硫氨酸的一次性使用及多剂量药用配方，其中所述的制剂稳定性增强，且其中所述的制剂不含有人血清白蛋白。
文档编号A61K47/16GK1592629SQ02821709
公开日2005年3月9日 申请日期2002年8月29日 优先权日2001年8月30日
发明者T·李, B·S·常, C·斯勒伊 申请人:麒麟·安姆根有限公司