聚阳离子水溶性共聚物和将聚阴离子大分子跨生物屏障传递的方法

专利名称：聚阳离子水溶性共聚物和将聚阴离子大分子跨生物屏障传递的方法
将聚阴离子大分子跨生物屏障传递的方法发明背景1.发明领域本发明涉及跨越生物屏障传递生物活性物质。更具体地说，本发明涉及强化聚阴离子大分子例如DNA，RNA，反义寡核苷酸和它们的类似物跨越生物屏障传递。
2.技术背景它们治疗或治愈多种疾病的可能性高度促进了基因治疗和反义技术。基因治疗有可能治疗很多病毒疾病和遗传症状。已经发现了在原先不能治疗的疾病例如癌症，自身免疫疾病，囊纤维变性等起着作用的很多基因。随着发现涉及的基因，研究人员确定通过阻断超量表达的基因或通过提供功能障碍基因拷贝能治疗疾病。这些治疗经常需要施用DNA，RNA，反义寡核苷酸，和它们的类似物，来实现期望的细胞内作用。
证明这些治疗策略阻断基因表达或者在细胞培养物中产生需要的蛋白质。但是，这些有希望的治疗的主要问题是体内应用它们的自适应。对于一种是体内有效的药物的化合物，该化合物一定要容易送递给患者，不从体内很快地清除，具有可耐受的毒性水平，并且能达到需要它在体内达到的位点。
但是，大分子例如DNA，RNA，反义寡核苷酸和它们的类似物都具有相似的显著的药学问题。如果口服时这些化合物一般没有毒性，但是因为它们被消化和代谢而达不到期望的位点。注射这些聚阴离子大分子延长分子在体内的时间，但是不靶向需要的特定区域。此外，使它们在血液中快速降解并且从体内清除。
因为DNA，RNA，和寡核苷酸是聚阴离子大分子，它们不容易跨越生物屏障。将这些材料传递到活细胞中是它们作为治疗药物的用途的主要障碍。需要有效基因和寡核苷酸送递系统与合适的细胞结合，通过胞吞作用内在化，从溶酶体释放，并且最后将完整游离的DNA或寡核苷酸送递给细胞核或原生质。换句话说，因为基因治疗和反义治疗大大依赖于实现核酸足量送递，来校正作用位点，和为了期望的时间结构。
对于有效送递基因和寡核苷酸，已经尝试过很多不同的策略，包括病毒和非病毒系统。这些策略的每一个都有不同程度的成功。但是，它们中没有一个安全并有效到足以临床使用。毒性，转染效率，核酸(NA)降解和自由NA释放是对于所有的当前非病毒基因送递系统的引起争论的问题，包括脂质体和阳离子聚合物。
在NA/载体复合体的稳定性和载体在靶细胞中释放NA的能力之间平衡非病毒送递系统的特殊问题。NA/载体复合体一定足以稳定来保持在循环系统中的稳定性，但是还不足以稳定到在靶位点释放自由NA。
被用来使聚阴离子大分子进入细胞胞质的一个途径是使聚阴离子大分子复合成高聚阳离子聚合物，例如PEI。PEI是高聚阳离子聚合物。多年来在在普通方法中例如纸生产，洗发剂生产，和水纯化中使用它。最近，PEI变成在寡核苷酸和DNA送递中使用的最成功的聚阳离子载体之一。
已经证明PEI在体外和体内是送递寡核苷酸和质粒的高效载体。PEI是线性和支化形式。因为它的高正电荷密度，作为PEI的铵基和核酸的磷酸根基团之间的协同静电相互作用的结果，PEI自发形成内聚电解质络合物(聚离子络合物)。充分确立了PEI转染各种各样的细胞的能力。与其他聚阳离子载体相比，证明PEI在保护胞吞作用之后抗核酸降解和将核酸释放到胞质中是好得多的。
不同的实验室已经揭示了转染机理，但是仍然不十分清楚。络合物或PEI缓冲溶酶体的酸性pH，保护核酸降解并且引起囊泡的渗透性溶胀/破裂。囊泡破裂将核酸释放到胞质中。假设细胞聚阴离子分子置换作用一般促进游离核酸从阳离子聚合物离解。相信PEI的质子化导致聚合物网路由于分子内电荷排斥而膨胀。
但是，PEI不是完美的转染试剂。例如，PEI/NA络合物通常在生理缓冲液中产生严重的聚集作用。此外，络合物在血清的存在下表现出有限的稳定性，并且在全身施用之后从血液中快速清除。此外，始终发现PEI在体外和体内都是有毒性的。这些性质显著限制了PEI的生物医学应用。
为了部分克服PEI的毒性作用和PEI/NA络合物在生物缓冲液中的聚集问题，将聚合物与亲水性和疏水性基团偶联或者接枝。用PEG对PEIs接枝产生在含水缓冲液中能形成相对稳定的DNA复合体的共聚物。但是，这些系统的转染活性比没有修饰的PEI(25kDa)的转染活性低得多。部分丙酰基酰化的线性PEI(50kDa和200kDa)也表现出低毒性，但是这种修饰危害转染活性。结合靶向基团，例如转铁蛋白，甘露糖，和半乳糖，提高向靶组织的转染效率，但是仍然没有解决与高分子PEIs相关的内在毒性问题，因为高分子PEIs被用作获得有效转染活性的前体。小的PEIs毒性小得多，但是令人遗憾的是发现低分子量PEIs(小于2,000道尔顿)在各种条件下不产生或者产生非常低的转染活性。
着眼于上述情况，提供将聚阴离子大分子送递到靶细胞的方法在本领域是一个进步。提供一种能有效地运输聚阴离子大分子跨越生物屏障的载体分子是另一个进步。如果载体分子与现行可获得的化合物相比具有减小的毒性，则实现进一步的进步。如果载体/大分子复合体稳定表现出血清稳定性，则是另一个进步。如果载体/大分子复合体在靶细胞中容易解离，则是另一个进步。提供能定向于特定组织或细胞类型的载体分子是另一个进步。
本发明概述本发明提供一类新的能用作将聚阴离子大分子送递给细胞的载体分子的聚阳离子接枝生物相容共聚物。两个或多个聚阳离子聚合物片段通过连接基团(linkers)与生物相容亲水性主链聚合物共价连接。与主链聚合物键合的聚阳离子聚合物片段的数目可以在大约4至大约100范围内。发现大约8至大约15范围内聚阳离子片段的数目能被成功地用来结合聚阴离子大分子，并且运送聚阴离子大分子跨越生物屏障，例如细胞壁或质膜。很多种生物相容聚合物可以被用作主链聚合物。主链聚合物可以是，例如，聚乙二醇(PEG)，聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)，或者其共聚物。同样各种各样的聚阳离子聚合物可以连接主链聚合物。聚阳离子聚合物可以是，例如，聚烷基胺(PAM)，聚氮丙啶(PEI)，聚赖氨酸(PL)，多肽，壳聚糖，多糖，或者其共聚物。
载体分子还可以包括至少一个与生物相容亲水性主链或者与聚阳离子聚合物连接的靶向部分(targeting moiety)。可以选择靶向部分来结合特定生物物质或位点。因此，可以以它与特定细胞类型或特定组织中表达的分子结合的能力为基础来选择靶向部分，使得聚阴离子大分子选择性送递给细胞或组织。这样的靶向部分可以包括配体，抗原，半抗原，生物素，凝集素，半乳糖，半乳糖胺，蛋白质，组蛋白，多肽，脂质，碳水化合物，维生素，和它们的组合。
载体分子还可以包括至少一种与生物相容亲水性主链或者与聚阳离子聚合物连接的裂解剂。可以选择裂解剂分解生物膜，例如细胞，内体，或者核膜，从而使聚阴离子大分子释放到细胞的胞质或细胞核中。这样的裂解剂可以包括病毒肽，细菌毒素，溶菌作用肽(lyticpeptide)，aleveolysin，bifermentolysin，boutulinolysin，capriciolysin，cereolysin O，chauveolysin，histolyticolysinO，肺炎球菌溶血素，sealigerolysin，septicolysin O，sordellilysin，streptoslysin O，tenaolysin或苏云金菌溶素O，及其活性片段。
如上所述，聚阳离子聚合物通过连接基团与生物相容主链聚合物共价连接。靶向部分和裂解剂还可以通过连接基团与主链共聚物共价连接。这样的连接基团可以是烃链，PEG片段，多肽，含有酯键的线性聚合物，含有酰胺键的线性聚合物，含有二硫键的线性聚合物，含有腙键(hydrozone bond)的线性聚合物，含有肟键的线性聚合物，或者它们的组合。连接基团可以是化合物或酶能裂解以从主链聚合物释放聚阳离子聚合物，靶向部分，或裂解剂的生物可降解肽。这样的生物可降解肽的例子是GlyPheLeuGly(SEQ.ID.NO.1)和GlyPhePheGly(SEQ ID.NO.2)。连接基团可以具有大约2至大约100个原子的长度。也能使用具有大约3至大约30个原子长度的连接基团。
生物相容亲水性主链可以具有经选择使聚阴离子大分子送递给细胞最佳化的分子量。因此，在一些实施方案中，主链聚合物具有大约1,000至大约1,000,000范围内的分子量，也可以使用具有大约5,000至大约100,000范围内的分子量的主链聚合物。也可以使用具有大约20,000至大约40,000的分子量的生物相容亲水性主链来将聚阴离子大分子送递给细胞。
还可以选择聚阳离子聚合物的分子量来优化聚阴离子大分子向靶细胞的送递。分子量可以是大约100至大约100,000范围内。或者聚阳离子聚合物的分子量可以是大约200至大约10,000范围内。可以使用具有大约400至大约2,000范围内的分子量的聚阳离子聚合物来将聚阴离子大分子送递给细胞。
本发明还涉及将聚阴离子大分子送递给细胞的复合体。该复合体可以如上所述带有与聚阴离子大分子络合的载体分子。可以对动物体内或者对细胞培养物给予这种复合体。复合体使聚阴离子大分子送递给动物或细胞培养物中的细胞。
可以从用于治疗疾病或者实验室实验的多种大分子中选择聚阴离子大分子。在复合体的一些构型中，聚阴离子大分子是核酸，例如RNA，DNA，或者其组合或衍生物，核酸可以是例如基因组DNA，质粒DNA，合成DNA，或RNA。可以与本发明的载体分子使用的核酸的其他类型是，例如，反义寡核苷酸，核酶，DNA酶，嵌合RNA/DNA寡核苷酸，硫代磷酸酯寡核苷酸，2’-O-甲基寡核苷酸，DNA-PNA偶联物，DNA-吗啉代-DNA偶联物，及其组合。
本发明还提供运送聚阴离子大分子跨越细胞的生物屏障的方法。生物屏障可以是细胞壁，质膜，或类细胞膜。细胞可以是例如细胞培养物中的细胞。或者，细胞可以是多细胞生物体例如植物或动物细胞。细胞可以是来自生物体的细胞，例如肝细胞，肝细胞，肾细胞，脑细胞，骨髓细胞，神经细胞，心脏细胞，脾细胞，干细胞和上述细胞的共同培养物。此外，细胞可以来自建立的细胞系，如HepG Hep G2和Hela细胞。运送聚阴离子大分子跨越屏障的方法包括聚阴离子大分子与本发明的载体分子络合产生复合体。然后细胞接触载体分子，将聚阴离子大分子送递给细胞。然后通过例如胞吞作用，细胞吸收复合体，然后释放到细胞胞质中。
附图的简要说明参照后面附图中详细说明的具体实施方案更具体地描述上文简要描述的本发明。这些附图只是描述本发明的典型实施方案，并且不认为限制其范围。通过利用附图，更具体而详细地描述和解释本发明，其中


图1A是本发明的聚阳离子接枝生物相容共聚物的一个实施方案的合成的图示说明。
图1B是本发明的聚阳离子接枝生物相容共聚物的另一个实施方案的合成的图示说明。
优选实施方案的详细描述本发明提供了新类型的能用作将聚阴离子大分子送递给细胞的载体分子的聚阳离子接枝生物相容共聚物。两个或多个聚阳离子聚合物片段通过连接基团随机共价连接生物相容亲水性主链聚合物。与主链聚合物结合的聚阳离子聚合物片段的数目可以是大约4至大约100的范围内。发现大约8至大约15范围内聚阳离子片段的数目能被成功地用来结合聚阴离子大分子并且运送聚阴离子大分子跨越生物屏障。如这里使用的，生物相容指具有有限免疫原和变应原能力的物质。生物相容还意指物质不引起显著的不期望的生理反应。生物相容物质可以被生物降解。如这里使用的，生物可降解意思是物质例如主链聚合物或聚阳离子聚合物在体内能被化学或酶学裂解或降解。生物可降解物质当分解时可以形成无毒成分。此外，生物可降解物质可以是生物中性的，意思是它没有特异结合性质或生物识别性质。
各种各样的生物相容聚合物可以被用作主链聚合物。主链聚合物可以是，例如，聚乙二醇(PEG)，聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)，或者其共聚物。同样，各种聚阳离子聚合物可以连接主链聚合物。聚阳离子聚合物可以是，例如，聚烷基胺(PAM)，聚氮丙啶(PEI)，聚赖氨酸(PL)，多肽，壳聚糖，多糖，或者其共聚物。
PEG具有很多性质，使得它成为与本发明的载体聚合物使用的所期望的生物相容主链聚合物。首先，PEG商业上可获得低分散度的各种分子量(Mw/Mn＜1.1)。以它们的分子大小为基础，任意地将PEG聚合物分类为低分子量PEG(Mw＜20,000)和高分子量PEG(Mw＞20,000)。最近的研究发现给药之后PEG的肾清除随着分子量的提高而降低，静脉给予后，MW是30,000时发生最大变化。血液中循环的PEG的半衰期(t1/2)也表现出伴随的大的增加。例如，随着分子量从6,000增加至50,000，PEG的t1/2从大约18分钟延长至16.5小时。结果，抗癌药物与20,000或更大分子量的PEG偶联能防止PEG-偶联物质的快速消除，并且使被动肿瘤堆积。
载体分子还可以包括至少一个与生物相容亲水性主链或者与聚阳离子聚合物连接的靶向部分。可以选择靶向部分，与特定生物物质或者这里称作受体的位点结合。因此，以它与特定细胞类型或特定组织中表达的受体分子结合的能力为基础选择靶向部分，使得聚阴离子大分子选择性送递给细胞或组织。靶向部分可以是被细胞膜受体识别的任何信号元件。因此，在一些实施方案中，靶向部分是含有与肝细胞或肝细胞瘤细胞特异性结合的糖的半乳糖。含有糖的半乳糖可以选自乳糖和半乳糖。
靶向部分指与特定生物物质或位点结合的那些部分。认为生物物质或位点是与之结合的靶向部分的靶物。配体是靶向部分的一个类型。配体对于已知为受体的另一种物质具有选择性(或特异性)亲和性。因为配体对于受体具有特异亲和性，配体选择性结合受体不而是其他分子。因此，当与本发明的载体聚合物结合使用配体时，设计载体聚合物与特定细胞类型上的受体结合。这种选择性结合使得聚阴离子大分子选择性送递给靶细胞。适合靶细胞的配体的例子是抗原，半抗原，生物素，生物素衍生物，凝集素，半乳糖，半乳糖胺，维生素和岩藻糖基胺部分，受体，底物，辅酶和辅因子。
当对本发明的聚阳离子接枝共聚物应用时，配体包括能被其相应的抗体或者其活性部分结合或者能与之结合的抗原或半抗原。还包括病毒抗原或血细胞凝集素和神经氨酸酶和核衣壳，包括来自任何DNA病毒，RNA病毒，HIV，肝炎病毒，腺病毒，α病毒，沙粒病毒，冠状病毒，黄病毒，疱疹病毒，粘液病毒，致癌RNA病毒，乳多空病毒，副粘病毒，细小病毒，小RNA病毒，痘病毒，呼肠孤病毒，弹状病毒，鼻病毒，披膜病毒，和viriods。配体可以选自任何细菌抗原，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，acinetobacter，无色杆菌，拟杆菌，梭状芽孢杆菌，衣原体，肠杆菌，嗜血杆菌，乳酸杆菌，奈瑟氏菌，葡萄球菌，和链球菌的那些。其他合适的配体包括任何真菌抗原，例如曲霉属，念珠菌属，球孢子菌属，霉菌属(mycoses)，藻状菌和酵母的那些。其他抗原，例如支原体属抗原，立克次氏体抗原，原虫抗原，和寄生虫抗原，在本发明的一些实施方案中是合适的配体。人抗原包括血细胞，病毒感染细胞，遗传标记，致癌蛋白质，血浆蛋白质，补体因子，α胎蛋白，前列腺特异抗原(PSA)，恶性肿瘤标记，和类风湿病因子的那些也可以作为合适的配体。
有很多可以用作指导载体共聚物定向靶细胞的合适的配体的很多其他物质。这些物质其中有蛋白质，组蛋白，激素，维生素，类固醇，前列腺素，合成的或天然的多肽，碳水化合物，脂质，抗生素，药物，地高辛，杀虫剂，镇静剂，和神经递质。配体还指对于通过重组DNA，遗传工程和分子工程产生的物质具有选择性亲和性的各种物质。
在靶细胞的配体的选择中重点考虑配体的受体。受体也可以称作ligator，结合体，或者结合配偶体。这些受体作为选择性结合配体的生物识别分子类型而起受体功能。受体是，一般情况下但是不是必须地，比结合它的配体大的分子。受体可以是蛋白质，例如抗体或非蛋白结合体。如这里使用的，抗体指所有类型的抗体，包括单克隆抗体，嵌合抗体，Fab部分，及其衍生物。适合定向的其他受体包括特异性结合激素，维生素，药物，抗生素，癌标记，遗传标记，病毒，和组织相容性标记的天然存在的受体，血细胞凝集素，和细胞膜和核衍生物。另一组受体包括RNA和DNA结合蛋白。用于定向的其他可能有用的受体是细胞表面酶例如神经氨酸酶，血浆蛋白质，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，抑素，cavitands，甲状腺球蛋白，内在因子，球蛋白，螯合剂，表面活性剂，有机金属物质，葡萄球菌蛋白质A，蛋白质G，核糖体，噬菌体，细胞色素，凝集素，一些树脂，和有机聚合物。受体还包括各种物质，例如对于通过重组DNA，遗传工程和分子工程产生的配体具有选择性亲和性的任何蛋白质。
载体分子还可以包括至少一种与生物相容亲水性主链或者与聚阳离子聚合物连接的裂解剂。裂解剂可以是任何膜融合肽或蛋白质。可以选择裂解剂分解生物膜，例如细胞，内体，或者核膜，从而使聚阴离子大分子释放到细胞的胞质或细胞核中。作为存在裂解剂的结果，膜经历裂解作用，融合作用，或者两者。这样的裂解剂可以包括病毒肽，细菌毒素，溶菌作用肽，aleveolysin，bifermentolysin，boutulinolysin，capriciolysin，cereolysin O，chauveolysin，histolyticolysin O，肺炎球菌溶血素，sealigerolysin，septicolysin O，sordellilysin，streptoslysin O，tenaolysin或苏云金菌溶素O，及其活性片段。溶菌作用肽是渗透膜从而丧失膜的结构组织化和完整性的化学基团。裂解剂还包括能裂解生物膜的病毒和合成化合物。本发明还可以使用提供内体逃脱活性的上述裂解剂的片段。已知其他肽和蛋白质引起生物膜或融合体的分解，并且可以用作本发明范围内的裂解剂。Jahn，R.&Sudhof，T.，Annu.Rev Biochem68863-911(1999)；Pecheur，E.I.，等，J Membrane Biol.1671-17(1999)。
如上所述，聚阳离子聚合物通过连接基团与生物相容主链聚合物共价连接。靶向部分和裂解剂也可以通过连接基团与主链聚合物或键合的聚阳离子聚合物共价连接。这样的连接基团可以是烃链，PEG片段，多肽，含有酯键的线性聚合物，含有酰胺键的线性聚合物，含有二硫键的线性聚合物，含有hydrozone键的线性聚合物，含有肟键的线性聚合物，或者它们的组合。连接基团可以是生物可降解连接基团或非生物可降解连接基团。生物可降解连接基团的例子是短肽和二硫键连接基团(-(CH2)xSS(CH2)x-，其中x是2至8的整数)。非生物可降解连接基团包括烃连接基团，例如-(CH2)n-或-(CH2CH2O)n-，其中n是2至50的整数。连接基团可以具有大约2至大约100个原子的长度。也可以使用具有大约3个原子至大约30个原子长度的连接基团。
可以组装用来共价连接聚阳离子聚合物和主链聚合物的连接基团，使得从载体缓释复合的聚阴离子大分子。缓释指仅通过用来合成载体的连接基团的裂解而从共聚物载体复合体释放核酸或者其他聚阴离子大分子。因此，缓释不包括通过扩散直到键被裂解的聚阴离子大分子的释放。
生物可降解连接基团包括但不限于两类键。第一类包括二硫键和酯键。二硫键和酯键对于药物化合物与聚合物的共价偶联是已知的。但是，这类键对于体内送递药物化合物具有有限的价值，因为这些键在血液中裂解。第二类包括在进入细胞之后一般裂解(胞内裂解)的键。这类连接基团在象溶酶体中发现的那些酸性条件下或者通过酶而可裂解，使得药物化合物在细胞内释放。
酸性条件下裂解的键已知是酸敏感或酸可处理的键。酸敏感键的一个例子是腙键。Greenfield，等，Cancer Res.506600-6607(1990)。酶敏感连接基团包括包含使得多肽呈疏水性的氨基酸序列的多肽。这些多肽通过特异酶例如主要在细胞中发现的组织蛋白酶裂解。这样的多肽可以是合成的或天然存在的肽。合适的生物可降解多肽连接基团的例子是GlyPheLeuGly(SEQ.ID.NO.1)和GlyPhePheGly(SEQ.ID.NO.2)。另一种类型的生物可降解键是空间上抑制硫醇盐离子反应的″有位阻的″或″被保护的″二硫键。偶联剂S-4-琥珀酰亚胺基氧羰基-.α-.硫代硫酸甲基苄酯(SMBT)和4-琥珀酰亚胺基氧羰基-.α-.甲基-.α.-(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)中发现这样的被保护二硫键。
生物相容亲水性主链可以具有经选择使聚阴离子大分子送递给细胞最佳化的分子量。因此，在一些实施方案中，主链聚合物具有大约1,000至大约1,000,000范围内的分子量。也可以使用具有大约5,000至大约100,000范围内的分子量的主链聚合物。也可以使用具有大约20,000至大约40,000的分子量的生物相容亲水性主链来将聚阴离子大分子送递给细胞。
还可以选择聚阳离子聚合物的分子量来优化聚阴离子大分子向靶细胞的送递。分子量可以是大约100至大约100,000范围内。或者聚阳离子聚合物的分子量可以是大约200至大约10,000范围内。可以使用具有大约400至大约2,000范围内的分子量的聚阳离子聚合物来将聚阴离子大分子送递给细胞。
本发明还涉及将聚阴离子大分子送递给细胞的复合体。该复合体一旦送递给细胞，载体分子就使得复合体跨越细胞壁和其他生物屏障，并且获得进入细胞内部。该复合体可以如上所述带有与聚阴离子大分子络合的载体分子。可以对动物体内或者对细胞培养物给与这种复合体。复合体使聚阴离子大分子送递给动物或细胞培养物中的细胞。
可以从用于治疗疾病或者实验室实验的多种大分子中选择聚阴离子大分子。在复合体的一些构型中，聚阴离子大分子是核酸，例如RNA，DNA，或者其组合或衍生物。核酸可以是例如基因组DNA，质粒DNA，合成DNA，或RNA。可以与本发明的载体分子使用的核酸的其他类型是，例如，反义寡核苷酸，核酶，DNA酶，嵌合RNA/DNA寡核苷酸，硫代磷酸酯寡核苷酸，2’-O-甲基寡核苷酸，DNA-PNA偶联物，DNA-吗啉代-DNA偶联物，及其组合。
本发明还提供运送聚阴离子大分子跨越细胞的生物屏障的方法。细胞可以是例如细胞培养物中的细胞。或者，细胞可以是多细胞生物体例如植物或动物细胞。细胞可以是来自生物体的细胞，例如肝细胞，肝细胞，肾细胞，脑细胞，骨髓细胞，神经细胞，心脏细胞，脾细胞，干细胞和上述细胞的共同培养物。此外，细胞可以来自建立的细胞系，如HepG Hep G2和Hela细胞。
运送聚阴离子大分子给细胞的方法包括聚阴离子大分子与本发明的载体分子络合产生复合体。然后细胞接触复合的载体分子，将聚阴离子大分子送递给细胞。然后通过例如胞吞作用，载体复合体进入细胞，然后从囊泡释放，使得进入细胞胞质中。如果靶细胞在体外细胞培养物中，则通过提供含有聚阴离子大分子/载体复合体的生长培养基的细胞或者通过向生长培养基中加入含有聚阴离子大分子/载体复合体的溶液，能使细胞接触复合的载体分子。如果靶细胞在生物体内，通过将复合体置于生物体中使得它进入靶细胞，可以发生接触。例如，通过将含有复合体的溶液注射到生物体的循环系统中，可以施用复合体。连接靶向部分的载体分子可以使得复合体定向于靶细胞，靶物相应于靶向部分。通过肌内，腹膜内，腹部内，皮下，静脉内和动脉内送递，可以对生物体施用聚阴离子大分子/载体复合体。施用复合体的其他方法包括肠胃外，局部，经皮，跨粘膜，吸入，插入到体腔中例如通过眼，阴道，口腔，经尿道，直肠，鼻，口服，肺，和耳给药。
当本发明的聚合物载体分子与核酸或其他药物复合时，它们形成聚合物微胶粒。静脉内给药之后，发现这样的聚合物微胶粒具有延长的全身循环时间。这种延长的循环时间是由于它们小的尺寸和亲水性外壳，它使单核噬吞细胞系统的吸收最小化，和由于它们的高分子量，它防止肾排泄。加有聚合物微胶粒的药物可以在肿瘤中累积到比自由药物更大的程度，并且表现出减少分布到没有定向的区域例如心脏。聚合物微胶粒在恶性或炎症组织中的积累可能由于提高的血管渗透性和减小的淋巴系统排泄。肿瘤脉管更容易泄漏并且与正常的脉管选择透性更小。几项体内研究表明聚合物微胶粒能改善抗癌药物抗白血病和实体肿瘤的效力。研究表明PEG对于任何器官没有表现出特异亲和性，并且与聚合物的分子量和肿瘤所在位点无关，其在肿瘤组织中的积累主要受渗透性过高的肿瘤血管水平的支配(增强的渗透性保持或EPR作用)。
认为EPR作用是被动靶向方法，但是通过与靶向部分例如抗体或糖结合或者通过引导聚合物对温度或pH变化的灵敏性能变化的药物靶向。靶向微胶粒或pH灵敏微胶粒能用来将药物送递给肿瘤，炎症组织或内体区室(compartment)，因为它们全都与比正常组织低的pH相关。
可以对培养的细胞或身体施用含有核酸或其他聚阴离子大分子的接枝共聚物溶液。载体分子有用性中的一个重要的考虑是有多少药物能被加载到载体中。应该考虑载体共聚物上氮与核酸上磷酸酯的摩尔比(N/P比)。大多数情况下，载体聚合物和核酸分子复合体中N/P之比在大约1至大约50的范围内。更具体地说，预计对于大多数应用，复合体中的N/P之比在大约2至大约30之间的范围内。给出的这些范围不排除本发明可以应用的N/P之比。只要保持功能，这些范围之外的加载量落在本发明的范围内。
参照图1A，详细描述了本发明的载体共聚物的一般合成。获得平均分子量的聚乙二醇(PEG)。PEG具有其主链上随机接枝的侧链丙酸基团(PA)的″m″数。PEG-mPA和无水二氯甲烷在氩气保护下反应。然后向溶液中加入对-硝基苯酚和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。加入1-[3-二甲基氨基丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)，生成澄清的溶液。然后将乙酸加到澄清的混合物中。然后在氩气保护下将澄清的反应混合物与聚氮丙啶(PEI)的无水二甲基甲酰胺(DMF)溶液混合。在旋转蒸发器上将混合物浓缩，去除大部分DMF溶剂。将得到的产物纯化并浓缩得到蜡状产物。将蜡状粗产物在凝胶过滤柱上进一步纯化，得到纯化的PEG-mPA-PEI。
参照图1B，详细描述了本发明的另一种载体共聚物的一般合成。这种载体共聚物通过生物可降解多肽连接基团，GFLG，由PEG主链与PEI偶联而形成。PEG-mPA作为原材料而获得。然后将PEG-mPA转化为PEG-mPA-ONp。通过在无水二氯甲烷中溶解PEG-mPA来合成PEG-mPA-ONp。然后加入对-硝基苯酚和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。然后加入1-[二甲基氨基丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)。接着向溶液中加入乙酸。然后加入对甲苯磺酸一水合物来中和DMAP催化剂。反应得到白色产物，是PEG-mPA-ONp。
然后将PEG-mPA-ONp产物和GFLG四肽溶解于无水DMF。向该溶液中加入N，N-二异丙基乙基胺(DIPEA)。然后将反应混合物浓缩去除过量溶剂。加入冷的乙醚将产物沉淀。然后纯化PEG-mPA-GFLG产物。PEG-mPA-GFLG产物与聚氮丙啶反应形成pEG-mPA-GLFG-pEI。
实施例给出下面的实施例详细描述本发明范围内的各种实施方案。下面的实施例即不是彻底的也不是穷举众多类型的实施方案，它们可以根据本发明来制备。
材料和一般方法室温下真空下将侧链有丙酸基团的PEG(PRG-8PA PEG-10PA，和PEG-15PA，Mw＝～20KD，SunBio，Inc.，Anyang City，South Korea)干燥过夜。PEI600(Mw＝600)，PEI1200(Mw＝1,200)，PEI2K(Mw＝1,800)和PEI10K(Mw＝10,000)购自Polysciences，Inc.ofWarrington，PA。PEI400(Mn＝423)，PEI800(Mw＝800)和PEI25K(Mw＝25,000)购自Aldrich Chemical Company，Inc.of Milwaukee，WI。其他化学品购自Aldrich或VVR并且在得到之后不用进一步纯化即可使用。在装备有Waters RI检测器和Phenomenex Polysep-GPC-P3000柱的Waters系统上进行HPLC分析。在Varian 400 MHz机上记录1H-NMR。
实施例1-PEG20K-15PA-PEI400(15 PEI 400接枝PEG-20K)的合成氩气保护下向干燥的50ml一口烧瓶中加入1.3g带有15个侧丙酸基团的平均分子量大约20,000的聚乙二醇(PEG20K-15PA)(～0.75毫摩尔侧-COOH，在P2O5干燥器中真空干燥过夜)和10ml无水二氯甲烷。向烧瓶中加入大约0.15g(1.1毫摩尔)对硝基苯酚和大约0.015g的4-二甲基氨基吡啶。室温下搅拌混合物，形成澄清的溶液。然后一次加入大约0.20g(1.0毫摩尔)的细粉末1-[3-二甲基氨基丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)。在室温下将混合物再搅拌大约2小时，接着溶解EDC。然后向澄清的混合物加入大约0.18ml(3.2毫摩尔)的乙酸。将混合物在室温下又搅拌30分钟。澄清的反应溶液在氩气保护下在剧烈搅拌下与20毫升无水二甲基甲酰胺(DMF)中20毫升线性PEI400(Aldrich 46，853-3，Mn＝～423)的溶液混合。将混合物在室温下搅拌大约4小时，然后在旋转蒸发器上浓缩，去除大部分DMF溶剂。油混合物然后用水稀释并且在凝胶过滤柱(Sephacryl S-100，2.5×90cm)上纯化。HPLC分析之后将期望的共聚物级分合并在一起。获得大约1.5g的纯产物。1H-NMR分析表明，共聚物含有大约10％(w/w)PEI，表明共聚物的平均分子量是大约23,444，假设起始PEG15PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，·3.4-3.8(m，100(任意设置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，12，PEI的-CH2CH2N-)。
实施例2-PEG20K-15PA-PEI800(15 PEI 800接枝PEG20K)的合成根据实施例1的方法，1.0g带有大约15个侧丙酸基团的平均分子量是大约20,000的聚乙二醇(PEG20K-15PA)与平均分子量是大约800的聚氮丙啶(PEI800，20克)反应，得到大约1.1克的PEI20K-15PA-PEI800。1H-NMR分析表明共聚物含有大约30％(w/w)PEI，表明共聚物的平均分子量是大约28,400，假设起始PEG15PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，·3.4-3.8(m，100(任意设置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，43.0，PEI的-CH2CH2N-)。
实施例3-PEG20K-8PA-PEI800(8 PEI 800接枝PEG-20K)的合成根据实施例1的方法，1.0g带有大约8个侧丙酸基团的平均分子量是大约20,000的聚乙二醇(PEG20K-8PA)与平均分子量是大约800的聚氮丙啶(PEI800，20克)反应，得到大约1.2克的PEI20K-8PA-PEI800。1H-NMR分析表明共聚物含有大约11.5％(w/w)PEI，表明共聚物的平均分子量是大约22,607，假设起始PEG-8PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，·3.4-3.8(m，100(任意设置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，13.3，PEI的-CH2CH2N-)。
实施例4PEG-10PA-PEI1200(10PEI1200接枝PEG20K)的合成氩气保护下向干燥的1000ml一口烧瓶中加入5.0g PEG20K-10PA(带有10个侧丙酸基团的平均分子量大约20,000，在P2O5干燥器中干燥过夜)，0.56g对硝基苯酚和50毫升无水吡啶。向澄清的混合物加入0.77g 1-[二甲基氨基丙基]-3-乙基碳化二亚胺(EDC)。在室温下将混合物搅拌大约5小时。加入乙酸(0.6ml)，在室温下又搅拌30分钟。室温下混合物与200ml的无水吡啶中的100ml的PEI1200(Mw＝1,200)反应过夜。在旋转蒸发器中将混合物浓缩，去除吡啶溶剂。用去离子水将粘稠的溶液稀释至大约1000ml。将溶液超滤至大约60ml，接着在装有10K NMWC膜盒的Pall Filtron Minim渗滤系统(PallCorporation，East Hills，NY)上用2000ml去离子水渗滤。在旋转蒸发器上浓缩终产物，获得大约4.5g蜡状固体。通过从甲醇乙醚沉淀两次进一步纯化蜡状产物，获得大约4.1g白的粉末PEG-10PA-PEI1200。1H-NMR分析表明，共聚物含有大约20％(w/w)PEI，表明共聚物的平均分子量是大约24,963，假设起始PEG10PA的平均分子量是20,000道尔顿。1H-NMR(D2O，400MHz)，·3.4-3.8(m，100(任意设置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，29，PEI的-CH2CH2N-)。
实施例5-PEG20K-8PA-PEI12K(8 PEI 1800接枝PEG-20K)的合成根据实施例1的方法，1.0g带有大约8个侧丙酸基团的平均分子量是大约20,000的聚乙二醇(PEG20K-8PA)与平均分子量是大约1800的聚氮丙啶(PEI2K，20克)反应，得到大约1.1克的PEI20K-8PA-PEI2K。1H-NMR分析表明共聚物含有大约27％(w/w)PEI，表明共聚物的平均分子量是大约27,490，假设起始PEG-8PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，·3.4-3.8(m，100(任意设置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，38.3，PEI的-CH2CH2N-)。
实施例6-PEG20K-15PA-GFLG-PEI400(带有GFLG连接基团的15PEI400接枝PEG20K)的合成现在参照图1B，根据图示说明合成PEG20K-15PA-GLFG-PEI400。通过在大约20ml无水二氯甲烷中溶解带有大约15个侧丙酸基团的平均分子量大约20,000的聚乙二醇(PEG)(PEG20K-15PA)(2.0g，～1.5毫摩尔-COOH，)来合成PEG20K-15PA-ONp。然后向溶液中加入大约292mg(2.1毫摩尔，Fw＝139)对硝基苯酚和大约26mg(0.2毫摩尔)4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。将混合物在室温下搅拌，形成澄清溶液。然后加入大约402mg(2.1毫摩尔)的细粉末1-[二甲基氨基丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)。将混合物在室温下搅拌大约3小时。接着，加入大约0.4ml的乙酸，将混合物再搅拌30分钟。加入大约400mg(2.1毫摩尔，Fw＝190.22)对甲苯磺酸一水合物来中和DMAP催化剂。室温下搅拌混合物直到所有的固体都溶解。向溶液中加入大约40ml异丙醇。然后在旋转蒸发器上真空去除大约20ml溶剂。从水浴中移开烧瓶，随着在真空下冷却旋转的烧瓶，产品固化。然后在冰浴上将悬浮液冷却1小时。氩气保护下通过真空过滤收集白色固体。用总共20ml冰冷的10％甲醇/异丙醇接着用10ml室温乙醚洗涤滤饼。将潮湿的产物溶解于20ml甲醇，然后在冰浴上缓慢加给40ml的冰冷的异丙醇。将白色固体过滤，用10ml冰冷的10％甲醇/异丙醇和10ml室温乙醚洗涤。氩气流下将产物简要干燥之后在P2O5干燥器中真空干燥过夜。获得2.0g的白色PEG-15PA-ONp产物，通过UV吸光度测定，产物每个PEG-20K分子含有大约9.9ONp基团(·401.5nm＝18,400，在0.1N NaOH溶液中)。
将大约2.0g(1.0毫摩尔ONp酯)的无水PEG20K-15PA-ONp和608mg(1.2当量的ONp酯)的无水GFLG四肽(TFA盐)溶解于20ml的无水DMF。向溶液中加入大约0.48ml(2.76毫摩尔，2当量的GFLG)的N，N-二异丙基乙基胺(DIPEA)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物浓缩至大约10ml。向残余物加入大约100ml的冷乙醚，沉淀产物。滤出白色固体，得到大约4g的粗产物。在凝胶过滤柱上纯化(2.0×80cm的Sephadex G25，用0.1mM三乙胺/乙酸缓冲液洗涤(pH＝10))，得到1.75g的纯产物。1H-NMR表明各个PEG20K共聚物分子含有大约9个GFLG四肽1H-NMR(D2O，400MHz)，7.2(d，2.62，Phe的ArH)，3.4-3.8(m，100(任意设置)，PEG的-CH2CH2O-)，0.78(d，38.3，Leu的CH3)。
纯化的PEG30K-15PA-GFLG产物与PEI400反应，生成PEG20K-15PA-GFLG-PEI400。大约1.0g的PEG20K-15PA-GFLG与大约20g的平均分子量大约400的聚氮丙啶(PEI400)如实施例1所述反应。得到大约1.1g的PEG20K-15PA-GFLG-PEI2K。1H-NMR表明各个共聚物分子含有2,000 PEI和9.0分子的GFLG连接基团，假设起始PEG15PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，87.2(m，2.5，Phe的ArH)，3.4-3.8(m，100(任意设置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，10，PEI的-CH2CH2N-)，0.78(d，2.6，Leu的CH3)。
实施例7-PEG20K-15PA-GFLG-PEI800(带有GFLG连接基团的15PEI800接枝PEG20K)的合成根据实施例5的方法，PEG20K-15PA与GFLG和聚氮丙啶800(PEI800)反应，产生PEG20K-15PA-GFLG-PEI800。1H-NMR表明各个共聚物分子含有4,400PEI和9.0分子的GFLG连接基团，假设起始PEG15PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，87.2(m，2.5，Phe的ArH)，3.4-3.8(m，100(任意设置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，22，PEI的-CH2CH2N-)，0.78(d，2.6，Leu的CH3)。
实施例8-PEG20K-8PA-GFLG-PEI400(带有GFLG连接基团的8PEI400接枝PEG20K)的合成根据实施例5的方法，PEG20K-8PA与GFLG和聚氮丙啶400(PEI400)反应，产生PEG20K-8PA-GFLG-PEI400。1H-NMR表明各个共聚物分子含有1,087 PEI和3.8分子的GFLG连接基团，假设起始PEG-8PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，87.2(m，1.1，Phe的ArH)，3.4-3.8(m，100(任意设置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，5.6，PEI的-CH2CH2N-)，0.78(d，1.1，Leu的CH3)。
实施例9-PEG20K-8PA-GFLG-PEI800(带有GFLG连接基团的8PEI800接枝PEG20K)的合成根据实施例5的方法，PEG20K-8PA与GFLG和聚氮丙啶800(PEI800)反应，产生PEG20K-8PA-GFLG-PEI800。1H-NMR表明各个共聚物分子含有2,207 PEI和3.8分子的GFLG连接基团，假设起始PEG15PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，87.2(m，1.1，Phe的ArH)，3.4-3.8(m，100(任意设置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，11.3，PEI的-CH2CH2N-)，0.78(d，1.1，Leu的CH3)。
实施例10-PEG20K-8PA-GFLG-PEI12K(带有GFLG连接基团的8PEI 12K接枝PEG20K)的合成根据实施例5的方法，PEG20K-8PA与GFLG和平均分子量是1800的聚氮丙啶(PEI12K)反应，产生PEG20K-8PA-GFLG-PEI2K。1H-NMR表明各个共聚物分子含有6,297PEI和3.8分子的GFLG连接基团，假设起始PEG-8PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，87.2(m，1.1，Phe的ArH)，3.4-3.8(m，100(任意设置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，26，PEI的-CH2CH2N-)，0.78(d，1.1，Leu的CH3)。
实施例11-使用共聚物将质粒DNA转染给培养细胞HT1080细胞接种到6-孔组织培养板中。在含有10％FBS的1.0ml的HyQ MEM/EBSS培养基中对每个孔接种大约100,000个细胞。培养板在37℃ 5％CO2温育箱中温育过夜。接着，吸除培养基并且向各个孔加入900微升新鲜培养基。
制备含有本发明的DNA和载体共聚物的复合体的转染培养基，得到载体共聚物溶液。在PBS缓冲液中将载体共聚物浓度标准化成大约0.6mg/mlPEI。接着向无菌试管中的大约100微升无血清培养基加入大约2.0微升至大约20微升范围体积的载体共聚物溶液。得到的溶液在室温下温育大约10分钟。然后将溶液与大约2.0微升的1.0微克/微升绿色荧光蛋白DNA(GFP)或红色荧光蛋白DNA(RFP)溶液混合并且在室温下温育20分钟，得到DNA/载体共聚物复合体。
向6孔板中的细胞滴加DNA/载体共聚物复合体。向细胞加复合体时，在所有的方向轻轻摇动平板，是复合体与生长培养基混合。然后在37℃ 5％CO2温育箱中将细胞温育至少24小时。用荧光显微镜或FACS细胞分离仪检查细胞。吸除去除转染培养基并且向保留的细胞加入新鲜培养基。表1说明使用本发明的各种载体和对照物和质粒GFP DNA的转染实验的结果。加号表示成功转染，减号表示没有转染。
实施例12-使用共聚物将寡核苷酸转染给培养的细胞在96孔组织培养板上每孔接种大约2,500个细胞。在37℃ 5％CO2温育箱中将细胞温育过夜。然后吸出去除旧的培养基，并且加入50微升含有10％FBS的新鲜培养基。
制备含有本发明的寡核苷酸和载体共聚物的复合体的转染培养基。得到载体共聚物溶液。在PBS缓冲液中将载体共聚物浓度标准化成大约0.6mg/mlPEI。接着，向一定体积的无血清培养基加入大约2.0微升至大约20微升范围体积的载体共聚物溶液，使得无菌试管中总的溶液体积为50微升。得到的溶液在室温下温育大约10分钟。
然后将溶液与大约2.0微升的0.1mM寡核苷酸溶液(22-链节，～0.7mg/ml)混合。含有的寡核苷酸是带有3’反转和5’荧光标记的22-链节磷酸二酯寡核苷酸。然后在室温下将得到的转染培养基温育20分钟。向96孔板的孔中加入转染培养基。然后在37℃ 5％CO2温育箱中将细胞温育大约6小时。然后吸出去除转染培养基，并且用大约100微升无菌PBS将细胞洗涤两次。
洗涤之后，向孔中加入大约100微升新鲜培养基，并且在荧光显微镜下观察细胞。荧光表明细胞已经成功转染了寡核苷酸。表1给出使用本发明的不同载体和对照物和寡核苷酸的转染实验的结果。加号表示成功转染，减号表示没有转染。
表1.共聚物结构及其它们对质粒DNA和寡核苷酸的转染活性的总结。在Varian 400MHz仪上用1H-NMR仔细表征化学结构。通过所描述的凝胶位移分析测试DNA和寡核苷酸结合稳定性。使用含有GFP报告基因的质粒DNA测试基因转染。使用带有3’-末端反转和5’-末端荧光标记的22-链节磷酸二酯寡核苷酸测试寡核苷酸转染。
总结总之，本发明提供新类型的聚阳离子接枝聚合物载体分子。新的聚阳离子接枝共聚物表现出大的水溶性和低水平毒性。本发明的一些实施方案使用PEG作为PEI片段或者其他聚阳离子聚合物片段与之连接的主链聚合物。PEG是具有很多有用性质的线性聚合物，象好的溶解性和好的排泄动力学。另外，PEG是生物相容的，因为它毒性小，免疫原性和抗原性小。这些性质使得PEG成为药学研究中研究得最充分的药物载体，FDA已经批准国内用药。通过使聚阳离子聚合物与生物相容聚合物例如PEG偶联，聚阳离子聚合物能使得更可溶并且毒性更小。另外，小的聚阳离子聚合物片段毒性比大分子量阳离子聚合物毒性低得多，并且容易从体内清除。因此，通过使小阳离子聚合物与生物相容主链聚合物偶联能产生载体共聚物，该载体共聚物能将治疗药物例如聚阴离子大分子送递给细胞。
本发明的载体聚合物还提供增强的复合的DNA/载体共聚物稳定性。还证明本发明的载体聚合物与其他DNA载体聚合物相比具有增强的转染活性。和当与核酸复合时形成聚集的沉淀物的没有修饰的聚阳离子不一样，本发明的共聚物通过离子相互作用结合核酸，形成象核心外壳一样的微胶粒结构。由于通过生物相容主链聚合物形成的中性亲水性外壳，这种结构在生物条件下是稳定的和可溶的。该复合体在生物缓冲剂中是稳定的，即使在血清的存在下。作为结果，转染活性比没有修饰的聚阳离子载体，例如PEI，PLL或壳聚糖高得多。
本发明的载体能被用来对特定靶向细胞或组织送递药物和其他治疗药物。所述共聚物载体被用于核酸向细胞的缓释和定向送递。此外，通过靶向特定细胞或器官能提高药物的药效，从而减少药物在健康组织中的积累并且使其毒性最小。这样的特异靶向使得要施用的治疗药物剂量更高，如果需要，对非靶向细胞没有不期望的作用。
序列表<110>萨卢斯治疗公司<120>聚阳离子水溶性共聚物和将聚阴离子大分子跨越生物屏障传递的方法<130>3302.2.1.1<150>09/996,507<151>2001-11-28<160>2<170>Patont In version 3.0<210>1<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>1Gly Phe Leu Gly1<210>2<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>2Gly Phe Phe Gly11权利要求
1.运送聚阴离子大分子跨越细胞生物屏障的载体，包括生物相容亲水性主链聚合物；和两种或几种通过连接基团与生物相容亲水性主链聚合物共价连接的聚阳离子聚合物。
2.权利要求1的载体，其中所述生物相容亲水性主链选自聚乙二醇(PEG)，聚(N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺)，及其共聚物。
3.权利要求2的载体，其中所述聚阳离子聚合物是聚氮丙啶(PEI)。
4.权利要求1的载体，其中所述聚阳离子聚合物选自聚烷基胺(PAM)，聚氮丙啶(PEI)，聚赖氨酸(PL)，多肽，壳聚糖，多糖，和其共聚物。
5.权利要求1的载体，进一步包括至少一个与生物相容亲水性主链或者与两个或几个聚阳离子聚合物中的一个连接的靶向部分。
6.权利要求5的载体，其中所述靶向部分选自配体，抗原，半抗原，生物素，凝集素，半乳糖，半乳糖胺，蛋白质，组蛋白，多肽，脂质，碳水化合物，维生素，和它们的组合。
7.权利要求1的载体，进一步包括至少一个与生物相容亲水性主链或者与两个或几个聚阳离子聚合物中的一个连接的裂解剂。
8.权利要求7的载体，其中所述至少一种裂解剂选自病毒肽，细菌毒素，溶菌作用肽，aleveolysin，bifermentolysin，boutulinolysin，capriciolysin，cereolysin O，chauveolysin，histolyticolysin O，肺炎球菌溶血素，sealigerolysin，septicolysin O，sordellilysin，streptoslysin O，tenaolysin或苏云金菌溶素O，及其活性片段。
9.权利要求1的载体，其中所述连接基团具有大约2至大约100个原子的长度。
10.权利要求9的载体，其中所述连接基团选自烃链，PEG片段，多肽，含有酯键的线性聚合物，含有酰胺键的线性聚合物，含有二硫键的线性聚合物，含有腙键的线性聚合物，含有肟键的线性聚合物。
11.权利要求9的载体，其中所述连接基团的长度在大约3个原子至大约30个原子的范围内。
12.权利要求1的载体，其中所述生物相容亲水性主链具有大约1,000至大约1,000,000范围内的分子量，并且聚阳离子聚合物具有大约100至大约100,000范围内的分子量。
13.权利要求12的载体，其中所述生物相容亲水性主链的分子量是大约5,000至大约100,000范围内。
14.权利要求12的载体，其中所述生物相容亲水性主链的分子量是大约20,000至大约40,000范围内。
15.权利要求12的载体，其中所述聚阳离子聚合物的分子量是大约200至大约10,000范围内。
16.权利要求12的载体，其中所述聚阳离子聚合物的分子量是大约400至大约2,000范围内。
17.权利要求1的载体，其中所述生物相容亲水性主链是聚乙二醇并且所述聚阳离子聚合物是聚氮丙啶。
18.权利要求17的载体，其中大约4至大约100个聚阳离子聚合物通过连接基团与生物相容亲水性主链聚合物共价连接。
19.权利要求17的载体，其中大约8至大约15个聚阳离子聚合物通过连接基团与生物相容亲水性主链聚合物共价连接。
20.权利要求17的载体，其中所述生物相容亲水性主链的分子量是大约20,000至大约40,000范围内。
21.权利要求17的载体，其中所述聚阳离子聚合物的分子量是大约400至大约2,000范围内。
22.权利要求17的载体，其中所述连接基团选自烃链，PEG片段，多肽，含有酯键的线性聚合物，含有酰胺键的线性聚合物，含有二硫键的线性聚合物，含有腙键的线性聚合物，含有肟键的线性聚合物。
23.权利要求17的载体，进一步包括至少一个与生物相容亲水性主链或者与两个或几个聚阳离子聚合物中的一个连接的靶向部分。
24.权利要求23的载体，其中所述靶向部分选自配体，抗原，半抗原，生物素，凝集素，半乳糖，半乳糖胺，蛋白质，组蛋白，多肽，脂质，碳水化合物，维生素，和它们的组合。
25.权利要求17的载体，进一步包括至少一个与生物相容亲水性主链或者与两个或几个聚阳离子聚合物中的一个连接的裂解剂。
26.权利要求25的载体，其中所述至少一种裂解剂选自病毒肽，细菌毒素，溶菌作用肽，aleveolysin，bifermentolysin，boutulinolysin，capriciolysin，cereolysin O，chauveolysin，histolyticolysin O，肺炎球菌溶血素，sealigerolysin，septicolysin O，sordellilysin，streptoslysin O，tenaolysin或苏云金菌溶素O，及其活性片段。
27.权利要求17的载体，其中所述连接基团是生物可降解肽。
28.权利要求1的载体，其中大约4至大约100个聚阳离子聚合物通过连接基团与生物相容亲水性主链聚合物共价连接。
29.权利要求1的载体，其中大约8至大约15个聚阳离子聚合物通过连接基团与生物相容亲水性主链聚合物共价连接。
30.权利要求25的载体，其中所述生物可降解肽选自GlyPhePheGly和GlyPheLeuGly。
31.运送聚阴离子大分子跨越细胞生物屏障的复合体，包括用于将聚阴离子大分子送递给细胞的载体分子，所述载体分子包括生物相容亲水性主链聚合物和两个或几个通过连接基团与生物相容亲水性主链聚合物连接的聚阳离子聚合物；和与载体分子复合的聚阴离子大分子。
32.权利要求31的复合体，其中所述聚阴离子大分子是核酸。
33.权利要求32的复合体，其中所述聚阳离子聚合物是PEI。
34.权利要求33的复合体，其中所述生物相容亲水性主链聚合物是PEG。
35.权利要求33的复合体，其中所述生物相容亲水性主链聚合物是HPMA。
36.权利要求32的复合体，其中所述核酸选自基因组DNA，质粒DNA，合成DNA，和RNA。
37.权利要求32的复合体，其中所述核酸选自反义寡核苷酸，核酶，DNA酶，嵌合RNA/DNA寡核苷酸，硫代磷酸酯寡核苷酸，2’-O-甲基寡核苷酸，DNA-PNA偶联物，DNA-吗啉代-DNA偶联物，及其组合。
38.权利要求31的复合体，其中所述生物相容亲水性主链具有大约1,000至大约1,000,000范围内的分子量，并且聚阳离子聚合物具有大约100至大约100,000范围内的分子量。
39.权利要求38的复合体，其中所述生物相容亲水性主链的分子量是大约20,000至大约40,000范围内。
40.权利要求39的复合体，其中所述聚阳离子聚合物的分子量是大约400至大约2,000范围内。
41.权利要求31的复合体，其中所述连接基团选自烃链，PEG片段，多肽，含有酯键的线性聚合物，含有酰胺键的线性聚合物，含有二硫键的线性聚合物，含有腙键的线性聚合物，含有肟键的线性聚合物。
42.权利要求31的复合体，其中所述生物相容亲水性主链选自聚乙二醇(PEG)，聚(N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺)，及其共聚物。
43.权利要求42的复合体，其中所述聚阳离子聚合物选自聚烷基胺(PAM)，聚氮丙啶(PEI)，聚赖氨酸(PL)，多肽，壳聚糖，多糖，和其共聚物。
44.权利要求31的复合体，进一步包括至少一个与生物相容亲水性主链或者与两个或几个聚阳离子聚合物中的一个连接的靶向部分，所述靶向部分选自配体，抗原，半抗原，生物素，凝集素，半乳糖，半乳糖胺，蛋白质，组蛋白，多肽，脂质，碳水化合物，和它们的组合。
45.权利要求31的复合体，进一步包括至少一个与生物相容亲水性主链或者与两个或几个聚阳离子聚合物中的一个连接的裂解剂，至少一种所述裂解剂选自病毒肽，细菌毒素，溶菌作用肽，aleveolysin，bifermentolysin，boutulinolysin，capriciolysin，cereolysinO，chauveolysin，histolyticolysin O，肺炎球菌溶血素，sealigerolysin，septicolysin O，sordellilysin，streptoslysinO，tenaolysin或苏云金菌溶素O，及其活性片段。
46.权利要求31的复合体，其中大约4至大约100个聚阳离子聚合物通过连接基团与生物相容亲水性主链聚合物共价连接。
47.权利要求31的复合体，其中大约8至大约15个聚阳离子聚合物通过连接基团与生物相容亲水性主链聚合物共价连接。
48.运送聚阴离子大分子跨越细胞生物屏障的方法，包括使聚阴离子大分子与载体分子复合产生复合体，所述载体分子包括生物相容亲水性主链聚合物和两个或几个通过连接基团与生物相容亲水性主链聚合物共价连接的聚阳离子聚合物；并且使细胞接触复合体。
49.权利要求48的方法，其中所述生物相容亲水性主链选自聚乙二醇(PEG)，聚(N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺)，及其共聚物。
50.权利要求49的方法，其中所述聚阳离子聚合物选自聚烷基胺(PAM)，聚氮丙啶(PEI)，聚赖氨酸(PL)，多肽，壳聚糖，多糖，和其共聚物。
51.权利要求48的方法，进一步包括至少一个与生物相容亲水性主链或者与两个或几个聚阳离子聚合物中的一个连接的靶向部分，所述靶向部分选自配体，抗原，半抗原，生物素，凝集素，半乳糖，半乳糖胺，蛋白质，组蛋白，多肽，脂质，碳水化合物，和它们的组合。
52.权利要求48的方法，进一步包括至少一个与生物相容亲水性主链或者与两个或几个聚阳离子聚合物中的一个连接的裂解剂，至少一种所述裂解剂选自病毒肽，细菌毒素，溶菌作用肽，aleveolysin，bifermentolysin，boutulinolysin，capriciolysin，cereolysinO，chauveolysin，histolyticolysin O，肺炎球菌溶血素，sealigerolysin，septicolysin O，sordellilysin，streptoslysinO，tenaolysin或苏云金菌溶素O，及其活性片段。
53.权利要求48的方法，其中所述连接基团具有大约2至大约100个原子的长度。
54.权利要求53的方法，其中所述连接基团选自烃链，PEG片段，多肽，含有酯键的线性聚合物，含有酰胺键的线性聚合物，含有二硫键的线性聚合物，含有腙键的线性聚合物，含有肟键的线性聚合物。
55.权利要求53的方法，其中所述连接基团是生物可降解肽。
56.权利要求55的方法，其中所述生物可降解肽选自GlyPhePheGly和GlyPheLeuGly。
57.权利要求48的方法，其中所述生物相容亲水性主链具有大约1,000至大约1,000,000范围内的分子量，并且聚阳离子聚合物具有大约100至大约100,000范围内的分子量。
58.权利要求57的方法，其中所述生物相容亲水性主链的分子量是大约20,000至大约40,000范围内。
59.权利要求57的方法，其中所述聚阳离子聚合物的分子量是大约400至大约2,000范围内。
60.权利要求57的方法，其中所述生物相容亲水性主链是聚乙二醇，而且所述聚阳离子聚合物是聚氮丙啶。
61.权利要求60的方法，其中所述生物相容亲水性主链的分子量是大约20,000至大约40,000范围内。
62.权利要求60的方法，其中所述聚阳离子聚合物的分子量是大约400至大约2,000范围内。
63.权利要求48的方法，其中大约4至大约100个聚阳离子聚合物通过连接基团与生物相容亲水性主链聚合物共价连接。
64.权利要求48的方法，其中大约8至大约15个聚阳离子聚合物通过连接基团与生物相容亲水性主链聚合物共价连接。
全文摘要
本发明提供具有大的水溶性和低毒性的聚阳离子接枝共聚物。所述共聚物被用来将药物和其他治疗物质送递给特异靶向细胞。
文档编号A61K48/00GK1617928SQ02827640
公开日2005年5月18日 申请日期2002年6月26日 优先权日2001年11月28日
发明者王来新 申请人:萨卢斯治疗公司