专利名称：TGF－β特异性共价闭合反义分子的制作方法
发明的背景1、发明的领域本发明涉及生物技术领域，特别涉及用靶向TGF-β的共价闭合反义分子进行的反义治疗。本发明还涉及向细胞传递反义分子的方法。本发明还涉及治疗由TGF-β的产生所引起的疾病的方法。
2、本领域的一般背景和状况肾小管间质性纤维化(Renal tubulointerstitial fibrosis)的特征是积累细胞外基质蛋白(ECM)，是进行性肾病的一般性结果(Kuncio等，Kidney Int.39，550-556(1991))。具单侧输尿管阻塞(UUO)的受阻肾是为研究肾小管间质性纤维化伴随肾损伤而建立的一种动物模型系统(Klahr等.，Kidney Int.54，286-300(1998))。由输尿管结扎所产生的机械干扰会导致肾盂积水，肾实质损失和小管改变，如扩张、萎缩和凋亡(Gonzalez-Avila等，Pathobiology66，196-204(1998)；Truong等，Kidney Int.50，200-207(1996))。虽然并没有完全阐明肾小管间质性纤维化的进展机制，但已暗示许多细胞因子在UUO肾中作为背小管间质性纤维化的介体。在这些细胞因子中，转化生长因子β1(TGF-β1)在肾纤维化中起重要的作用，如在血管球硬化(glomerulosclerosis)和痛小管间质性纤维化中所证明的那样(Schiffer等，J.Clin.Invest.108，807-816(2001)；WANG等，Kidney Int.60，96-105(2001))。TGF-β1参与对组织损伤正常修复起反应的ECM的积累，且通过异常地过量产生ECM，如蛋白聚糖、胶原、纤连蛋白和糖蛋白而引起纤维变性的改变(Branton等，Microbes Infect.1，1349-1365(1999)；Okuda等，86，453-462(1990))。TGF-β1还通过上调蛋白酶抑制剂和下调基质降解蛋白酶的合成来抑制新合成的基质蛋白的降解。因此，对TGF-β1的合成和作用进行有效阻断似乎是一种防止纤维变性条件的有希望的方法，如几篇报道所提示的那样(Border等，Nature，360，361-364(1992)；Akagi等，Kidney Int.50，148-155(1996)；Isaka等，Nat.Med.2，418-423(1996)；Isaka等，Kidney Int.55，465-475(1999))。
反义寡核苷酸(AS寡核苷酸)通过以序列特异性方式降低基因表达在研究基因产物的功能方面具有价值，然而，使用寡核苷酸仍然存在几个关键的问题，如对核酸酶不稳定、序列非特异性和弱的细胞吸收。已经开发了各种化学修饰的寡核苷酸，如硫代磷酸脂和甲基磷酸酯寡核苷酸以增强对核酸酶的稳定性。但是，每种修饰的寡核苷酸各自都存在问题，如缺乏序列特异性、对RNaseH不敏感和延长部分血栓形成时间。而且，担心在DNA修复和复制期间，循环水解的修饰核苷酸可掺入基因组中，在基因组DNA中引起突变。我们以前报道了具有共价闭合结构的带型反义(RiAS)寡核苷酸，其在特异性切除靶c-myb mRNA方面非常稳定和有效，而且几乎没有与其它修饰的AS寡核苷酸相关的问题(Moon等，J.Biol.Chem.275，4647-4653(2000)和PCT/KR00/00305)，在此全文纳入作为参考。
美国专利号.5,683,874披露了形成的一种共价闭合型的核酸序列，但需要平行的和反平行的核酸序列存在于环的对边以形成三螺旋结构。然而，这种结构主要是用于结合基因组启动子区域，且不结合由RNase H靶向降解的互补mRNA，因此，该’874专利没有披露和提示且有或没有这种平行或反平行序列的共价封闭反义结构可有效切除靶核酸表达。
通过与脂质体形成复合体可以增强反义寡核苷酸的细胞吸收。虽然脂质体具有一些优点，如低毒性、缺乏免疫原性和生产简单，但是脂质体表现出相对差的细胞吸收。已经表明，与人免疫缺陷病毒(HIV)的tat多肽的蛋白转导区域融合的蛋白能有效地传递到鼠的所有组织中，包括脑(Schwarze等，Science 285，1569-1572(1999))。
tat肽在脂质体表面上共价结合增加了细胞内的传递(Torchilin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98,8786-8791(2001))，另外，tat蛋白的一个小区域，含有2个赖氨酸和6个精氨酸的残基49-57具有核定位特性。
继续需要制备具有特异性、安全和有效的治疗性反义分子以及有效传递反义分子的系统。
发明概述本发明满足了上述需要。
本发明的一方面涉及以RiAS分子特异性靶向TGF-β1(TGF-β1 RiAS)。本发明的另一方面，设计了TGF-β1 RiAS并测试其防止肾纤维化和组织损伤的反义活性。本发明的又一方面，本发明涉及反义分子传递混合物以改进细胞吸收。具体地，将TGF-β1 RiAS与tat样肽混合，然后与脂质体复合体，发现TGF-β1 RiAS、tat或tat样肽与阳离子脂质体形成的三复合体能有效阻断UUO肾中的TGF-β1表达和保持组织完整。
本发明涉及特异性抑制TGF-β1表达的纯化的共价闭合反义分子。该共价闭合反义分子可以有至少两个被茎结构分开的环，其中至少一个环包含抑制TGF-β表达的靶反义序列。具体地，该TGF-β可以是TGF-β1。
上述讨论的共价闭合反义分子可以包含与SEQ ID NO1大体相似的序列。
本发明还涉及制备上述反义化合物的方法，该方法包括将至少两个线性反义分子与茎环结构相互连接，该茎环结构具有彼此充分互补的5’或3’末端。这样制备了一种共价闭合分子。在这个方法中，线性反义分子可以特异于同一靶核酸或不同的核酸。在一方面，该互补区域可以是大约1-100个碱基、1-50个碱基、1-20个碱基等，但是并不限制序列的长度。
本发明还涉及抑制TGF-β表达的方法，包括将含有TGF-β表达细胞的样品与上述共价闭合反义分子接触。
本发明还涉及治疗由TGF-β表达所引起的疾病的方法，包括用上述共价闭合反义分子向需要的患者给药，所述疾病非限制地可以是纤维化、肾纤维化、肾小管间质性纤维化、肝纤维化或肺纤维化。
本发明涉及治疗单侧输尿管阻塞(unilateral ureteric obstruction)的方法，包括用含有上述共价闭合反义分子的组合物给药。
本发明还涉及预防在损伤部位积累细胞外基质蛋白的方法，包括用上述共价闭合反义分子给药。
本发明涉及含有共价闭合反义分子、tat或tat样肽和载体组分的组合物。该载体可以是脂质体，且共价闭合反义分子可以靶向TGF-β。
本发明还涉及传递共价闭合反义分子到细胞的方法，包括用含有共价闭合反义分子、tat或tat样肽和载体组分的组合物与该细胞接触。本发明的一方面，tat或tat样肽和载体组分可以在接触细胞前混合。
通过对本发明的描述，参考附图和所附的权利要求书，本发明的这些和其它目的将会得到更充分的了解。
图的简要说明通过下文的详细描述和附图，本发明将会得到更充分的了解，仅是以说明的方式描述，因此并不限制本发明。其中
图1显示对TGF-β1(TGF-β1 RiAS)的带型反义分子的示意图，具体地是116mer(SEQ ID NO3)。已假设TGF-β1单体寡核苷酸(SEQ ID NO1)形成茎环结构，该茎环由各寡核苷酸的两末端互补序列形成。茎的5’末端有5’-GATC-3’的4个碱基的单链突出端。两个TGF-β1单体分子连接以产生具有二重对称的共价闭合分子。RiAS寡核苷酸由两个环和间插茎组成，各个环含有对TGF-β1的反义序列。
图2显示了TGF-β1 RiAS寡核苷酸对核酸外切酶III的抗性。在15％的变性聚丙稀酰胺凝胶上分析寡核苷酸，第1泳道58merTGF-β1 AS寡核苷酸；第2泳道116merTGF-β1 RiAS；第3泳道58mer用核酸外切酶III处理的TGF-β1 AS寡核苷酸；第4泳道116mer用用核酸外切酶III处理的TGF-β1 RiAS。
图3A-3B显示了TGF-β1 RiAS引起的TGF-β1 mRNA的特异性减少。用寡核苷酸(0.1或0.3μg)-tat-脂质体的三复合体转染细胞，然后用于RT-PCR分析。(A)进行RT-PCR以检测TGF-β1 RiAS的反义活性。(B)下面的图显示的带是用内源杂交引物探测的Southern印迹的结果。第1泳道对照；第2泳道0.1μg TGF-β1 RiAS；第3泳道0.3μg TGF-β1 RiAS；第4泳道0.4μg SC RiAS；第5泳道0.3μg SCRiAS。
图4A-4B显示了反义寡核苷酸通过输尿管传递入肾。用FITC在3’末端标记的反义寡核苷酸，在输尿管结扎后通过输尿管将其灌注到左肾中。将灌注固定的肾组织块冷冻切片，用合成的包埋剂封固该组织用于显微观察(放大250倍)。A，与tat肽和脂质体络复合的FITC-寡核苷酸；B，仅是FITC-寡核苷酸。
图5显示了2只代表性兔的UUO肾的纵解剖图。将雄性SD兔麻醉，通过输尿管给予TGF-β1 RiAS或对照灌注。在第5天，检测动物，分析纵解剖后的形态变化。A未灌输；B仅UUO；CUUO+PBS；DUUO+SC RiAS；EUUO+TGF-β1 RiAS。
图6A-6E显示了采用抗-TGF-β1抗体进行的TGF-β1的免疫组织化学。用肾的冷冻切片组织进行免疫组织化学检测，用合成的包埋剂封固该固定的脱水组织用于显微观察。棕色染色显示了存在TGF-β1。A未灌输；B仅UUO；CUUO+PBS；DUUO+SC RiAS；EUUO+TGF-β1 RiAS。
图7A-7E显示了用TGF-β1 RiAS处理的UUO肾中的小管萎缩和扩张的组织学观察。在PAS染色的组织切片中显示出小管的萎缩和扩张。用TGF-β1 RiAS、SC RiAS、PBS或仅输尿管阻塞处理后，肾的切片显示出小管萎缩和扩张。A未灌输；B仅UUO；CUUO+PBS；DUUO+SC RiAS；EUUO+TGF-β1 RiAS。
图8A-8E显示了用TGF-β1 RiAS处理的UUO肾中凋亡细胞的检测。进行了TUNEL测定来检测肾小管细胞的凋亡程度。用TGF-β1 RiAS、SC RiAS、PBS或仅输尿管阻塞处理的UUO肾。A未灌输；B仅UUO；CUUO+PBS；DUUO+SC RiAS；EUUO+TGF-β1 RiAS。
优选实施方案的详细描述在本申请中，所用“一”和“一种”既指单个也指多个对象。
如本文所用，“反义”或“AS”指反义核酸(DNA或RNA)及其类似物，且指具有一系列核苷酸碱基序列的一系列化学形式，核苷碱基序列通过氢键与靶序列的核苷碱基相互作用从而识别多核苷酸靶序列或序列部分。靶序列可以是单链或双链RNA，或者是单链或双链DNA。
这种RNA或DNA类似物包括但不限于2’-烷基糖修饰物，甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲缩醛(formacetal)、3’-硫代甲缩醛(thioformacetal)、砜、氨基磺酸盐和硝基氧主链修饰物，酰胺和类似物，其中碱基部分已经修饰。另外，分子的类似物可以是糖基部分经修饰或被另一合适部分取代而形成的聚合物，该形成的聚合物包括但不限于吗啉代类似物和肽核酸(PNA)类似物。这种类似物包括上述与糖或碱基的连接基团和/或结构修饰有关的修饰物的各种组合，以便改进RNaseH-介导的靶RNA的破坏，结合亲和性、核酸酶抗性和/或靶特异性。
如本文所用“反义治疗”是通用术语，包括含有在体内或体外使靶基因失活或使靶RNA序列切除的反义片断的共价闭合反义核酸分子的特异性结合。
如本文所用，“细胞增殖”是指细胞分裂。本文中所用的术语“生长”既包括由于较快细胞分裂和由于较慢细胞凋亡速度，如细胞死亡而增加的细胞数量。不受控制的细胞增殖是癌性或异常细胞类型的标志。正常的、非癌性细胞以用于特定类型的细胞的频率特价有规律地分裂。例如，当细胞转化成癌性状态时，细胞分裂和增殖就不受控制。而且，在损伤后，细胞外的细胞基质过度生长。增殖或生长的抑制作用调节细胞的失控分裂或厚组织的形成。
如本文所用，“纤维化”是指随以前的组织损伤或疾病而产生的厚的、坚硬的伤痕组织。
如本文所用，“基因”既指基因的完整核苷序列，也或指基因的序列部分。
如本文所用，术语“抑制”和“减少”可交替地用来表示基因表达或细胞增殖或组织生长或任何其它表型特征的降低。
如本文所用，“基本互补”是指与自身互补并特异性结合靶RNA的反义化合物具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的反义序列。一般来说，并不需要绝对互补。具有足够互补性而与靶核酸形成稳定二聚体或三聚体的任何反义分子都被认为是合适的。因为稳定的二聚体形成依赖于杂交反义分子的序列和长度以及反义分子与靶序列之间的互补程度，在与比常规使用的大约13-30个碱基的短线状寡核苷酸更长的寡核苷酸互补时，系统能耐受更小的保真度。
如本文所用，“基本相似”是指与另一种核酸具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的核酸序列。对于与具有相同靶的另一种反义分子具有基本相似序列的反义分子，该基本相似分子的作用能力是重要的，只要基本相似分子显示靶抑制活性。
当三聚体结构的形成包含在本发明的范围之内时，应了解这种形成并不需要实施和取得本发明的有利特征。例如，不需要如美国专利号5,683,874公开的在环的对边设计带有平行或反平行序列的寡核苷酸环结构。
如本文所用，“靶”或“靶的”是指针对其制备反义分子的特定单个基因。在某些上下文中，“靶的”是指使反义分子与内源表达的转录子结合或使内源表达的转录子与反义分子结合，从而消除靶基因的表达。该靶核苷序列可以选自与各种恶性有关的基因，包括与各种疾病的引发和进展有关的基因，如免疫疾病、传染病、代谢性疾病、遗传病和纤维变性病或由基因，包括属于TGF-β超家族的基因，具体的是TGF-β1的异常表达所引起的任何其它疾病。
在生物化学和生物活性方面，发现本发明的反义分子优于常规的线性合成的AS-寡核苷酸。常规的AS-寡核苷酸能用DNA合成仪容易地合成，但它们需要选择靶位点。选择靶位点的过程有时称为“AS-寡核苷酸设计”。该过程耗时且常不确定。另外，合成的AS-寡核苷酸对核酸酶不稳定，经常有序列错误，生产成本高，甚至在与脂质体复合后表现出差的细胞吸收。
如本文所用，“tat肽”和“tat-样肽”是相关的术语。具体地，tat肽是指带有可能修饰的tat蛋白的一部分，tat-样肽指以与tat肽相似的方式促进核酸插入细胞的肽。在一方面，tat-样肽可以与tat肽具有序列相似性。在另一方面，tat-样肽可以是三聚体或与tat肽具有电荷相似性，只要本发明的反义化合物可以容易地转运入细胞。在本申请中，如果提到tat肽能促进反义分子转运入细胞，那么可假定tat-样肽也可以使用。
TGF-β1TGF-β1是25kDa的同型二聚体，由两个通过二硫键连接在一起的12.5kDa亚基组成。TGF-β1最初用其使兔成纤维细胞的表型转变的能力来定义。TGF-β1是具有细胞-和剂量-依赖活性的多能细胞因子。虽然TGF-β1是大多数细胞类型的生长抑制剂，但是它能作为一些细胞类型的刺激剂。TGF-β1的分布普遍存在。关于TGF-β1的综述，参见Massague，J.Ann.Rev.Cell Biol.6，597.(1990)；Letterio等，Ann.Rev.Immunol.16，137(1998)。经证实，TGF-β1对大量的细胞型具有调节作用，月调节胚胎发育、骨形成、乳房发育、伤口愈合、血细胞形成、血管发生、细胞周期进展和细胞外基质的产生。就免疫系统而论，TGF-β1抑制T和B细胞增殖并在体内和体外起消炎分子的作用。TGF-β1抑制巨噬细胞成熟和激活，还抑制自然杀伤细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的活性并阻断细胞因子的产生。
事实上，所有的细胞都具有TGF-β1受体，其在这些细胞中调控各种功能。到目前为止，已鉴定了9种与TGF-β1结合的膜蛋白(参见第8页中的综述)，分布最广泛的是TGF-β1受体I和II，分子量分别为53kDa和70kDa的蛋白，I和/或II型受体的丧失与细胞对TGF-β1反应的丧失相关。已经克隆了II型受体，证实其含有一功能性丝氨酸/苏氨酸激酶区域。体内产生的TGF-β1是无活性的，由成熟的25kDa二聚体组成的潜活形式，与其75kDa的前肽二聚体(一种潜伏型相关前肽)非共价连接，TGF-β1与鼠、牛、猪和恒河猴细胞发生种交叉反应。
转化生长因子-β(TGF-β1)超家族转化生长因子-β超家族包括一组结构相关的蛋白，这些蛋白对胚胎发育期间的各种分化过程有影响。该家族包括但不限于缪勒氏管抑制物(MIS)，其是正常雄性发育所需的(Behringer等，Nature，345167，1990)；果蝇Decapentaplegic(DPP)基因产物是背腹轴形成和成虫盘(imaginal disks)的形态发生所需的(Padgett等，Nature，32581-84，1987)；爪蟾(Xenopus)Vg-1基因产物定位于卵的植物极(Weeks等，Cell，51861-867，1987)；活化素(Mason等，Biochem，Biophys.Res.Commun.，135957-964，1986)能诱导爪蟾胚胎中胚层和腹面结构的形成(Thomsen等，Cell，63485，1990)和骨形态发生蛋白(BMP，如BMP-2、3、4、5、6、7和8，成骨素，OP-1)能诱导软骨和骨重新形成(Sampath等，J.Biol.Chem，26513198，1990)。TGF-β1基因产物能影响各种分化过程，包括脂肪形成、肌发生、软骨形成、血细胞生成和上皮细胞分化(综述参见Massague，Cell 49437，1987)，在此全文纳入作参考。
TGF-β超家族的蛋白最初是合成为一个大的前体蛋白，随后该前体蛋白在C末端大约110-140个氨基酸的一串碱性残基处受到蛋白酶剪切。蛋白的C末端区域在结构上都是相关的，基于它们的同源性程度，将不同的家族成员分成不同的亚组。虽然在具体亚组内的同源性为70-90％的氨基酸序列同一性，但在亚组间的同源性明显较低，一般仅为20％-50％。在各种情况下，活性的种似乎是C末端片断的二硫键连接的二聚体。已对大多数家族的成员进行研究，发现同源二聚体种具有生物活性，但对其它家族成员，如抑制素(Ung等，Nature，321779，1986)和TGF-β’s(Cheifetz等，Cell，48409，1987)，也检测了异源二聚体，比各自的同源二聚体似乎具有不同的生物学特性。
TGF-3基因超家族的成员包括但不限于TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4(小鸡)、TGF-β1、TGF-β5(爪蟾)、BMP-2、BMP-4、果蝇DPP、BMP-5、BMP-6、Vgr1、OP-1/BMP-7、果蝇60A、GDF-1、爪蟾Vgf、BMP-3、抑制素-βA、抑制素-βB、抑制素-α和MIS。这些基因在Massague，Ann.Rev.Biochem.67753-791，1998中有讨论，在此全文纳入作参考。
优选地，TGF-β蛋白超家族的成员是TGF-β。更优选地，成员是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7或BMP-8.更优选地，成员是人或猪TGF-β。更优选地，成员是人或猪TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3.最优选地，成员是人或猪TGF-β1。
共价闭合的反义寡核苷酸在反义治疗领域中，使用长的反义分子的常规方法已经令人失望，因为AS-寡核苷酸越长其特异性就越小，就越难合成且细胞吸收效率低。的确，化学修饰的第二代AS-寡核苷酸，如硫代磷酸脂修饰的寡核苷酸随着其长度的延伸序列特异性降低。而且，随着AS-寡核苷酸长度的增加，线性AS-寡核苷酸的合成变得越来越困难且序列保真度显著降低。另一方面，共价闭合的反义寡核苷酸分子表现出较大的稳定性，即使分子较长，且与短线性寡核苷酸相比该分子含有额外的靶位点。
本发明的RiAS可以通过连接至少两个含有反义序列的线性寡核苷酸来制备，反义序列以相同或不同基因为靶，或在单一线性寡核苷酸内有多个靶。该连接可以发生在末端，优选发生在磷酸化的5’末端，其中在该5’末端有几个碱基彼此基本互补，于是发生杂交和连接，导致带型寡核苷酸的形式。该分子的长度不限于，具体可以是约20-1000个核苷，约20-700个核苷，约20-600个核苷，约20-500个核苷，约20-400个核苷，约20-300个核苷，优选约20-150个核苷，更优选约20-120个核苷。
在本发明的特定具体实施方案中，TGF-β1 mRNA的带型反义分子表现出以序列特异性方式消除靶mRNA并能缓解UUO肾中的球组织损伤。这项研究的结果表明，TGF-β1 RiAS寡核苷酸可以用作治疗剂来治疗与组织纤维化或UUO有关的各种肾病。这项研究的结果证实了带型反义分子具有增强特性。将TGF-β1 RiAS有效地传递入小管上皮细胞中能有效地抑制小管TGF-β1的表达，因而能阻止随之发生的小管损伤，如UUO肾的萎缩、扩张和凋亡。
Tat和Tat样肽一般地，由于在其聚合骨架上带负电荷，因此反义寡核苷酸表现出差的细胞吸收。当与脂质体复合时，寡核苷酸的细胞吸收显著提高(Wheeler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，11454-11459(1996))。然而，含有脂质体的非病毒传递载体对许多类型的细胞不提供令人满意的吸收效率，特别是对初级培养物的细胞。因此，研制出一种改良的转染试剂对于体外细胞系研究和体内应用都有利。我们设计出一种简单的混合系统，该系统包含反义寡核苷酸、tat-样肽和脂质体或任何其它载体以提高RiAS寡核苷酸的细胞吸收。已经表明tat蛋白的一短片段具有核酸浓缩、膜渗透和核定位的特性。这些特性可以用来增强核苷酸分子和结合蛋白的细胞吸收(Efthymiadis等，J.Biol.Chem.273，1623-1628(1998)；Schwartz等，Curr.Opin.Mol.Ther.2，162-167(2000))。发现该tat肽比具有相似特性的可比短肽，如SV40大T抗原肽更有效(数据在别处报导)。
在本申请中，具体举例的tat肽具有氨基酸序列RKKRRQRRRPPQC(SEQ ID NO4)。但是，应了解其它的序列也包括在本发明的tat肽的范围之内。例如也可使用RKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO5)(tat蛋白的49-59)。此外，还可以使用86tat蛋白。对tat蛋白进行修饰是允许的，例如但不限于RKKRRQRRRPPQ的羧基修饰(如tat-RGD)。另外，其它的序列也可以使用，如tat蛋白的第一外显子(48-72氨基酸)部分。
在本发明的另一方面，可以使用其它的tat-样肽，例如但不限于Antp、W/R、NLS，AlkCWK16、DiCWK18、转运子(Transportan)、K16RGD、VP22、SCWKn、(LARL)n、HA2、RGD、L-低聚体、SV40等，只要肽有利于将反义化合物插入细胞中。
在本发明的一个具体实施方案中，载体可以与tat或tat-样蛋白或任何其它的载体肽共价连接，且可以与tat或tat-样蛋白或任何其它可用的载体复合或混合。
TGF-β1相关疾病本发明涉及治疗或预防由TGF-β1表达引起的任何病症或TGF-β1在部位停止表达引起的任何病症，该治疗和预防是有益的，且能治疗或缓解疾病的症状。这些疾病可以包括但不限于皮肤损伤，如硬皮病；骨髓纤维化，如骨髓增生性疾病，肾纤维化，肝纤维化，肺纤维化，化学疗法/放射疗法诱发的纤维化，狭窄，移植(异体移植物排斥)，北洛尼氏病，慢性胰腺炎，血管病，肝硬化(酒精、HCV)，哮喘，肺气肿，肠疾病，克隆氏病，高雪氏病，血管病，心脏纤维化，系统性硬化等。
肾小球硬化和纤维化TGF-β1在UUO肾中的主要产源是间质成纤维细胞和小管上皮细胞(Isaka等，Kidney Int.58，1885-1892(2000))。当通过输尿管灌注寡核苷酸复合体时，我们检测到小管上皮细胞中的荧光信号。以前报道，用HVJ脂质体将反义寡核苷酸通过输尿管反向灌注会导致间质成纤维细胞的选择性转染(Tsujie等，Kidney Int.57，1973-1980(2000))。在另一报道中，当用导管将与HVJ/脂质体复合的SV40大T抗原基因通过肾动脉导入肾时，在颈动脉球细胞中检测到基因表达(Tomita等，Biochem.Biophys.Res.Commun.15，129-134(1992))。研究了脂质体(DOTMA/DOPE)-介导的基因传递的三种不同途径，包括肾内骨盆逆行(intra-renalpelvic retrograde)、实质注射和肾动脉注射(Lai等，Gene Ther.4，426-431(1997))。通过骨盆逆行和肾动脉注射，而不通过实质注射检测皮质和骨髓外细胞中的β-半乳糖苷酶活性。我们和其它人的观察都证明传递途径和载体向性是检测肾中靶细胞类型的重要因素。
在本研究中，用TGF-β1 RiAS处理显著降低了肾中的TGF-β1表达和小管凋亡，因而改善了球状组织损伤。由于组织纤维化是发生在肾、肝和肺中的许多类型的人疾病进展的关键特性，因此，可以预期在这些疾病中，施用针对TGF-β1的带型反义寡核苷酸可以治疗这些器官的纤维化损伤。
单侧输尿管阻塞(UUO)UUO是临床性疾病，由许多先天性或获得性疾病过程引起。其与受阻肾的功能显著降低有关(Klahr，S.Kidney Int.54，286-300(1998))。鉴别介导小管损伤的因子在受伤肾的保护和恢复方面具有价值，机械阻塞导致UUO肾过度产生前纤维变性和促凋亡的介体，特别是TGF-β1(Kaneto等，Kidney Int.44，313-321(1993))。已有报道，TGF-β1主要在皮层和外骨髓的肾小管细胞中表达，但在管周间质细胞中也表达(Fukuda等，Am.J.Physiol.Renal Physiol.281，F513-F521(2001))。TGF-β1也参与暴露于机械牵张的小管细胞的凋亡(Miyajima等，Kidney Int.58，2301-2313(2000))。
治疗组合物在一具体实施方案中，本发明涉及治疗各种疾病，其特征是过量形成细胞外基质，如纤维化或任何其它疾病，其中TGF-β超家族的一个成员正常或异常地表达，在这场合需要抑制基因的表达。这样，可以用本发明的治疗化合物向病人或易患病的人给药，通过提供该化合物抑制TGF-β超家族一个成员的表达。具体地，该疾病与肾、肝和肺及其它的纤维化有关。
治疗化合物的配制一般是本领域已知的，且可方便地参考《雷明顿制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第17版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，USA。例如，每千克体重可以给予的0.05μg-20mg。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗效果。例如，每天可以给予几个均分剂量或者根据治疗情况的紧急性按比例减少剂量。活性化合物可以以便利的方式给予，如通过口服、静脉内(如水溶性)、肌肉内、皮下、鼻内、皮内或栓剂途径或植入(如使用低释放分子通过腹腔途径或使用细胞，如体外敏化的单核细胞或树状细胞并过继地转移到受体)。根据给药途径，可能需要将肽包被在一种材料中以保护其免受酶、酸和其它可能使成分失活的自然条件的作用。
例如，反义分子的低亲脂性会使它们在胃肠道中被能剪切肽键的酶破坏，和在胃中被酸水解。为了用除胃肠外给药的方式给予反义分子，将其用能防止其失活的材料包被或与能防止其失活的材料一起给药。例如，反义分子可在辅剂中给药或与酶抑制剂共给药或在脂质体中给药。本文设想的辅剂包括间苯二酚，非离子型表面活性剂，如聚氧乙烯油基醚和n-十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰腺胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(diisopropylfluorophosphate)(DEP)和抑胰肽酶。脂质体包括水包油包水(water-in-oil-in-water)CGF乳液和常规的脂质体。
活性化合物也可以非肠道或腹腔注射方式给药。也可以在甘油液态聚乙二醇、其混合物和油中制备分散液。在保存和使用的一般条件下，这些制剂含防腐剂以防止微生物的生长。
适合注射使用的药物形式包括无菌的水溶液(如果水溶性)或分散体和用于即时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。在所有的情况下，该形式必须是无菌且必须是可容易注射的流体形式。在制造和贮存条件下其必须稳定且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，该溶剂或分散介质含有如水、乙醇、多羟基化合物(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。合适的流动性可以通过如下方法维持，如使用包衣，如卵磷脂，维持分散体需要的颗粒大小和使用表面活性剂(superfactant)。可以使用各种抗细菌和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如氯丁醇、苯酚、山梨酸、theomersal等。在许多情况下，优选使用等渗剂，如糖或氯化钠。通过使用延迟吸收的试剂组分，如单硬脂酸铝和明胶可以延长注射组合物的吸收。
无菌注射液通过将所需量的活性化合物掺入具有上述各种其它成分的合适溶剂来制备，如果需要，接着行过滤消毒。一般地，分散体是通过将各种无菌活性成分掺入含有碱性分散介质和上述所需的其它成分的无菌载体来制备。对于用来制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些技术从其以前无菌过虑溶液中产生活性成分的粉末加上任何其它所需的成分。
当反义分子如上所述被合适地保护时，该活性成分可以口服给药，如与惰性稀释剂或与可吸收的食用载体一起给药，或者可以将其封装在硬或软壳明胶胶囊中，或者将其压制成片剂，或者与饮食的食品直接混合。对于口服给药，可以将活性化合物与赋形剂混合并用于可摄入的片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、包药干胶片等。
这些组合物和制剂应至少含有1％重量的活性化合物。当然，该组合物和制剂的百分比可以变化，合适地可以是单位重量的约5-80％。在该治疗用组合物中的活性化合物的量是获得的合适剂量。本发明制备的优选组合物或制剂的口服剂量单位形式含有约0.1μg-2000mg的活性化合物。
上述片剂、丸剂、胶囊等还可以含有下列物质粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶，赋形剂，如磷酸二钙，崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等，润滑剂，如硬脂酸镁；还可以加入甜味剂，如蔗糖、乳糖或糖精，或调味剂，如胡椒、冬青油或樱桃味调味品。当剂量单位形式是胶囊时，其除了含有上述物质外，还含有液态载体。其它的各种物质可以用作包衣，或者以不同方式改良剂量单位的物理形式。例如，可以用虫胶糖或两者包被片剂、丸剂或胶囊。糖浆或酏剂也可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的甲基羟苯丙酯、颜料和调味剂，如樱桃味或柑桔味。当然，在制备任何剂量单位形式中使用的任何材料应该是使用量的药学上纯的和实质上无毒性的。另外，活性化合物可以掺入持续释放制剂和制成物中。
在本文中使用的“药学上可接受的载体和/或稀释剂”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这些介质和试剂对于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除了与活性成分不相容外，可以在治疗组合物中使用任何常规介质或试剂。也可以将补充的活性成分掺入组合物中。
配成剂量单位形式的肠胃外组合物特别有益于方便给药和剂量的均一性，本文使用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量以向待治疗的哺乳动物给药的物理分散单位；每单位含有计算的预定量的活性材料以产生与所需药物载体结合的所需治疗效果。本发明剂量单位形式的规格直接依赖于(a)活性材料的独特性质和达到的特定治疗效果；和(b)在混合用于治疗活受试者疾病的活性材料的现有技术中原有的局限性，活受试者患有疾病且其身体健康受到损害。
在剂量单位形式中，有效量的主要活性成分与合适的药学上可接受的载体混合，以使给药方便和有效。例如，剂量单位形式可含有主要活性成分的量的范围大约为0.5μg-200mg，以比例形式表示即活性成分一般以允0.5μg/mL的载体存在。在组合物含有辅助活性成分的情况下，参考通常剂量和所述成分的给药方式确定剂量。
共价闭合的反义分子传递载体本发明的反义传递载体可以包括有利于将本发明的该反义化合物传递到感兴趣细胞的各种化合物或方法。本发明中使用的核苷酸传递方法或载体可以包括但不限于阳离子脂质体、PEG-脂质、PEG、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、树状聚合物、聚(D，L-乳酸)、病毒体、电穿孔、磁转染(magnetofection)、裸DNA、脂质-聚阳离子-DNA(LPD)、叶酸结合纳米颗粒、与整合素α，β3-靶向配体结合的阳离子纳米颗粒(NP)、(经改良的)DNA结合病毒、短的两亲肽、基因激活基质(GAM)、聚(α-(4-氨基丁基)-L-羟乙酸)(PAGA)、含有咪唑的聚合物、脱乙酰壳多糖、明胶、非端胶原、聚((D)，(L)-乳酸-共-羟乙酸)(PLGA)、基于环式糊精的聚合物体、组氨酸和赖氨酸(HK)聚合物、糖靶向传递系统、多孔聚合微球体等。
各种传递系统是已知的，且可以用于施用本发明化合物，如用脂质体封装、微颗粒、微胶囊、能表达反义化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用、构建作为逆转录病毒部分的核酸或其它载体等。导入方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服路径。化合物或组合物可以以任何方便的途径给药，如灌输或推注，通过上皮或粘膜与皮肤的衬层(mucocutaneouslinings)(如口粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并可以与其它生物活性剂一起给药。给药可以是全身的或局部的。另外，还可以将本发明的药物化合物或组合物通过任何合适途径，如心室内和鞘内注射而导入中枢神经系统，可以通过心室内导管进行心室内注射，如与贮器连接的导管，如Ommaya贮器。还可以使用肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，且具有雾化剂的制剂。
在特定的实施方案中，将本发明的药物反义化合物或组合物局部给药到需要治疗的区域是理想的，其实施的方式例如但不限于在外科手术、局部应用期间进行局部灌输，如与外科手术后的伤口敷料结合灌输，通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入。所述的植入可以是多孔的、非多孔的或胶状材料，包括膜，如sialastic膜或纤维。优选地，当用蛋白质，包括本发明的抗体或多肽给药时，必须注意要使用蛋白质不吸附的材料。在另一个实施方案中，化合物或组合物可在小泡中传递，具体是在脂质体中。在又一个实施方案中，化合物或组合物可在控释系统中传递。在一实施方案中，可使用泵。在另一实施方案中，可使用聚合材料。在又一实施方案中，可将控释系统置于治疗靶，如脑的附近，因此仅需要全身剂量的一部分。
如果其给药可被受体动物耐受并适合于向该动物给药，那么该化合物就是所述的“药物学上或生理学上可接受的”。如果给药的量是生理学上有意义的，那么该试剂就是所述的以“治疗有效量”给药。假如其存在导致受体患者生理学上的可检测改变，那么该试剂是生理学上有意义的。
本申请详细描述的具体实施方案并不对本发明的范围进行限制。事实上，除了本文所描述的外，根据上述说明和附图，本发明的各种改进对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些改进属于本发明的权利要求范围之内。下实施例仅用来对本发明进行说明，并不限制本发明。
实施例实施例1-细胞系和动物大鼠肝癌细胞系H4-IIE从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，37°c、维持在含有10％热激活胎儿牛血清(JBI，Daegu，Korea)和青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)的EMEM培养基中，置于5％CO2增湿培养箱。。
雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由SLC(Hamamatsu，Shizuoka，Japan)提供。6个一组在标准食物和水情况下自由圈养。在这些实验中使用的雄性SD鼠体重为200-250g。用戊巴比妥(5mg/100g体重)腹腔内注射麻醉后，切开腹部中线使左肾暴露。将鼠靠近左肾的输尿管结扎，接着用24-规格导管注射器逆向注射TGF-β1RiAS或对照寡核苷酸。
实施例2-大鼠TGF-β1 RiAS的构建用自动DNA合成仪ExpediterTM8909(Applied Biosistems，Foster City，CA)合成寡核苷酸。用DNAsis程序(Hitachi Software，San Bruno，CA)通过二级结构的顺序重叠模拟选择AS寡核苷酸的靶位点(Matsuda等，Mol.Biol.Cell 7，1095-1106(1996))，TGF-β1的反义序列和颠倒(scrambled)寡核苷酸的序列如下反义序列5’-GAT CCA GGA CTG TGT GTG ATG TCT TTG GTT TTG TCA TAG ATT GCGTTG TTG CGG CCT G-3’(SEQ ID NO1)；和反颠倒序列5’-GAT CCG CTG TCG TGCTGG TCT TGA GTT AAT TCG TTG TTG TTG TCT GAG TTG GTA TGC G-3’(SEQ ID NO2)。见表1。
表1源于TGF-β1序列的带型反义寡核苷酸的序列
*搜索TGF-β1 RiAS寡核苷酸的靶位点来寻找在二级结构外的TGF-β1序列区域。以连续重叠的方式进行二级结构的模拟。
有假设认为TGF-β1反义寡核苷酸和颠倒寡核苷酸都形成茎环状结构。由各个寡核苷酸两端的互补序列形成茎。茎的5’端有单链序列5’-GATC-3’的4个碱基。将具有茎环结构的两个TGF-β1反义低聚体连接，通过该分子5’端存在的4个互补碱基序列形成带型反义分子。加入1单位的T4 DNA连接酶(Takara Shuzo，Kyoto，Japan)，产生具有二联体对称的共价连接分子。因此，TGF-β1 RiAS由两个环和一个中间茎组成。各个环含有TGF-β1反义序列。在15％变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳RiAS寡核苷酸，检测它们对核酸外切酶III的抗性和在丙烯酰胺凝胶上的延迟。将两个颠倒寡核苷酸也共价连接，形成带型对照寡核苷酸，其表示SC RiAS以方便实验。
实施例3-通过脂质体/tat肽复合体转染RiAS向含有Opti-MEM悬液、tat肽和反义寡核苷酸的管中加入溶于100ul Opti-MEM(GibcoBRL，Rockville，MD)的4微克DOTAP/DOPE(Avanti，Alabaster，AL)。混合物温育10min。在96孔板的每个孔中装入10,000个细胞，用100μl寡核苷酸-tat-脂质体的三重复合体处理。使用的反义寡核苷酸的量为0.1μg或0.3μg。37℃在5％CO2培养箱中培养H4-IIE细胞5h。然后向细胞中加入i00μl Opti-MEM和20％FBS，37℃继续培养16h后用于测试。
实施例4-RNA的分离和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)用TripureTM分离试剂(Roche，Indianapolis，IN)分离总RNA。收集细胞，且添加0.4ml的Tripure试剂、10μl糖原(1mg/ml)和80μl氯仿，获得总RNA。用AccessTMRT-PCR试剂盒(Promega，Madison，WI)在单个反应管中进行RT-PCR。将RNA、PCR引物、禽成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶(5单位/μl)、Tfl DNA聚合酶(5单位/μl)、dNTP(10mM，1μl)和MGSO4(25mM，2.5μl)加到PCR管中，加入水，将最后体积调节到50μl。48℃合成cDNA 45min，在DNA热循环仪(MJ Research，Watertown，MA)中扩增30循环(94℃，30s；56℃，1min；68℃，2min)。在1.5％的琼脂糖凝胶上证实扩增的PCR产物，用凝胶文件编制程序(Bio-Rad，Hercules，CA)进行定量。将PCR产物转移到硝化纤维膜上，与用荧光素-11-dUTP(Amersham，Arlington Heights，IL)标记的内部寡核苷酸杂交。用ECL检测试剂盒检测信号。
实施例5-将FITC-寡核苷酸传递入肾中根据制造商的推荐，用LabelITTM荧光素核酸标记试剂盒(Mirus，Madison，WI)使线性寡核苷酸标记上荧光素。将含有FITC标记的寡核苷酸复合体、tat多肽和DOTAP/DOPE的混合液通过输尿管灌输到左肾中。24h后摘除左肾，液氮下将其包埋在Tissue-TekTMOCT化合物(Miles，Elkhart，IL)中。将灌输固定肾的组织块切成10um厚的冷冻切片，且封固在Poly-PrepTM玻片(Sigma，St.Louise，MO)上。用合成的MountantTM(Shandon，Pittsburgh，PA)封固该组织以用于显维镜观察。用荧光显微镜观察肾的冷冻切片，估算基因转移的效率。
实施例6-用于检测凋亡的TUNEL测试为了检测UUO肾细胞中的片段DNA，用微注改进的原位细胞死亡检测试剂盒(Roche)进行TUNEL测试。将玻片去石蜡，用溶于甲醇的0.3％H2O2处理30min以淬灭内源过氧化酶活性。在10mM柠檬酸盐缓冲液中煮沸水玻片10min，用PBS清洗，与带有荧光素-dUTP的脱氧核苷酸转移酶(TdT)温育1h。用终止缓冲液终止反应。然后用PBS洗玻片，且与抗荧光素抗体连接的碱性磷酸酶室温温育30min，冲洗除去未结合的酶纵合物后，将玻片用NBT/BCIP(Sigma)显色1-5min。在高功率显微镜(400×)下对阳性肾管状细胞计数。
实施例7-对TGF-β1的免疫染色连续地将低温切片在4℃下与Bouin’s固定剂温育5min，在-20℃下与丙酮温育10min，与甲醇温育15min，与2％低聚甲醛温育2min，与4％低聚甲醛温育4min，与7％乙醇温育10min，然后与梯度乙醇再水合。用PBS洗组织切片，与含有0.3％H2O2的甲醇温育30min以除去内源过氧化酶活性。在含有10％PBS的PBS中进行阻断反应1h，将组织切片面与溶于含有0.5％BSA和2％FCS的PBS抗TGF-β1抗体(SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)4℃温育过夜。第二天，将组织切片与抗兔HRP缀合物(Sigma)室温温育1h。组织切片与联苯胺二胺(Sigma)温育5min，与乙醇水合，用合成的MountantTM封固，然后显微镜观察。
实施例8-统计分析结果表示为平均数±标准偏差(SD)，用斯图顿特测试确定统计学意义，认为P＜0.05就是显著的。
实施例9-结果实施例9.1-TGF-β1的稳定RiAS寡核苷酸的构建信使RNA在细胞质中形成二级或三级结构。在其自身碱基中发生碱基配对并与RNA结合蛋白结合使得mRNA的这些结构复杂。因此，在设计反义寡核苷酸中选择有效的靶位点被认为是重要的步骤。我们以前已经证明，以连续和重叠的方式模拟二级结构可以有效地用于沿着靶mRNA寻找反义靶序列(Moon等，J.Biol.Chem.275，4647-4653(2000)；Matsuda等，Mol.Biol.Cell 7，1095-1106(1996))。检测TGF-β1 mRNA的整个长度试图寻找能容易地接近反义分子的反义靶位点。
上述TGF-β1特异性反义寡核苷酸形成在5’端具有GATC的突出端序列的茎环结构。两个相同的AS寡核苷酸共价连接，形成带型反义分子，称为TGF-β1 RiAS(图1)。如预见的那样，与单聚体的线状前体(图2)相比，该二聚体TGF-β1 RiAS寡核苷酸在变性的聚丙烯酰胺凝胶上表现出延迟。该RiAS寡核苷酸对核酸外切酶III具有抗性，在聚丙烯酰胺凝胶上(第4泳道)形成主要带(116mer)。相反，TGF-β1RiAS的线状前体在2h内被核酸外切酶III完全降解(第3泳道)。这些结果证明TGF-β1 RiAS具有带型闭合结构，没有核酸外切酶可攻击的开口端。
实施例9.2-在体外由TGF-β1 RiAS导致的TGF-β1 mRNA的特异性减少我们接着测试了TGF-β1 RiAS是否能以序列特异性的方式有效地清除靶mRNA。将TGF-β1 RiAS与tat肽和脂质体复合以提高转染效率。用TGF-β1 RiAS或SC RiAS分别以0.1或0.3μg的浓度转染H4-IIE大鼠肝癌细胞，培养24h。从转染细胞中分离总RNA，用RT-PCR扩增TGF-β1 mRNA以检测TGF-β1 RiAS的反义活性。用TGF-β1RiAS处理过的H4-IIE细胞显示在0.1μg时TGF-β1 mRNA减少了约30％，在0.3μg时减少70％以上(图3A)。相反，当用SC RiAS处理H4-IIE细胞时，TGF-β1的表达并没有受到明显的影响。如该图的下图所显示，作为对照的GAPDH表达不受TGF-β1 RiAS处理的影响。用DNA寡核苷酸与扩增的DNA片断的中间杂交进行的Southern印迹也证实了这些结果(图3B)。
实施例9.3-RITC标记的AS寡核苷酸有效传递入肾组织为了成功地获得体内的反义活性，需要使靶组织有效地吸收反义寡核苷酸。用FITC标记TGF-β1 RiAS的58mer线性前体分子，且用于组织体内吸收。用26-规格导管将10μg下ITC标记的反义寡核苷酸通过输尿管灌输道左肾中。在反义处理6h后收集肾，检测细胞吸收。当反义寡核苷酸与tat肽和脂质体复合时，在管状上皮细胞中观察到强荧光信号(图4A)。但是，当单独使用反义寡核苷酸而不使用载体脂质体时，组织中未检测到荧光信号(图4B)。作假处理的对照肾显示没有荧光信号。
实施例9.4-TGF-β1 RiAS使组织损伤明显缓解在观察到TGF-β1 mRNA在体外遭有效清除和FITC标记的反义寡核苷酸在体内被有效吸收后，在动物模型中测试了TGF-β1 RiAS预防肾损伤的效果。单侧输尿管阻塞(UUO)迅速产生肾损伤，UUO肾是建立的适于临床的动物模型系统。
表2.
用TGF-β1 mRNA处理后，患UUO的左肾的重量比率的变化(肾重/体重)
将6只SD大鼠的左侧近端输尿管结扎，接着通过该近端输尿管灌输TGF-β1RiAS，在第5天，收采集左肾和右肾。将它们称重并检查形态。肾重表达为肾重/体重的百分比，一般对照为0.47％±0.03，UUO肾为0.99％±0.1.在UUO步骤后肾重有显著增加。当用TGF-β1 RiAS通过输尿管注射处理UUO肾时，肾重/体重明显地降到0.68％±0.09(P＜0.005)，但仅用PBS处理则为0.95％±0.08，用颠倒RiAS处理为1.07％±0.12。将6只大鼠的结果取平均值±SD。在TGF-β1 RiAS+UUO组对仅UUO、PBS+UUO和SC RiAS+UUO组中，#P＜0.005(表2)。在各组间，对照肾没有显示有意义的差别。用TGF-β1 RiAS处理的肾比仅用UUO或UUO加其它对照处理的肾显现出小得多的肿胀(图5)。而且，RiAS处理大鼠的UUO肾的纵切面显现出肾结构的总体保存，但对照组的UUO肾显示在肾的髓和乳头(medullar andpapillary)部分中，肾实质的失。
实施例9.5-通过免疫组织化学和组织学分析显示对肾微结构的保存我们检测了序列特异性反义活性和肾微观结构的改变，且观察到TGF-β1 RiAS明显改善对肾的总体损伤。从用TGF-β1 RiAS、SC RiAS处理的各组和假处理的对照组中各取两只有代表性大鼠，从中采集肾。进行免疫组织化学分析来检测TGF-β1 RiAS处理是否能使UUO肾中的TGF-β1表达降低(图6A-6E)。TGF-β1的免疫组织化学分析显示在受阻肾中有阳性棕色染色，这表明在病变组织中TGF-β1的表达提高。在用PBS和SC RiAS处理的UUO肾中同样检测到TGF-β1蛋白的阳性染色。相反，发现在用TGF-β1 RiAS处理后UUO肾中TGF-β1减少很多。
UUO肾的明显物理特征是小管萎缩和扩张，被认为是受到TGF-β1表达的介导。用光学显微镜观察UUO肾的PAS染色的肾切片，发现皮层和髓的间隙区以快速和进行性方式增加。随后大量的肾小管擅长，在一些小管中上皮细胞变平(图7A-7E)。用PBS、SC RiAS或假处理的对照处理UUO对照肾的切片表现出大量的小管萎缩和扩张，用TGF-β1 RiAS处理的组表现出萎缩和扩张显著减少。期望的那样，假处理鼠的对照肾的切片表现正常。
实施例9.6-用原位TUNEL测试检测凋亡细胞死亡的减少因为UUO肾表现出球萎缩和肾小管扩张，所以我们检测肾小管细胞是否发生凋亡。当用TGF-β1 RiAS处理UUO肾时，发现与其它对照处理相比，肾小管细胞中的凋亡细胞要少得多(图8A-8E)。然而，正常肾显示凋亡阳性细胞为3±3.3个细胞/显微视野，假处理的肾显示凋亡280.9±24.6个阳性细胞(400×)。用TGF-β1RiAS处理使小管凋亡减少到21.3±12.1个细胞/显微视野(P＜0.001)。相反，用SCRiAS处理的UUO组小管凋亡升高到236.8±29.6个细胞，用PBS处理则升高到260.4±41.3个细胞。
在本申请中所有的参考文献全文纳入作为参考。
本领域的技术人员能够理解或能够明白，仅仅采用常规实验方法就有许多等同于本文特别描述的发明的具体实施方案。这些等同包含在权利要求所覆盖的范围之内。
序列表<110>维尔精股份有限公司(WELGENE，INC.)<120>TGF-β特异性共价闭合反义分子<130>57354-10CN<150>PCT/IB02/05685<151>2002-12-30<150>KR 10-2001-0086765<151>2001-12-28<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>58<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1gatccaggac tgtgtgtgat gtctttggtt ttgtcataga ttgcgttgtt gcggcctg 58<210>2<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>颠倒序列<400>2gatccgctgt cgtgctggtc ttgagttaat tcgttgttgt tgtctgagtt ggtatgcg 58<210>3<211>116<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>对TGF-β1特异的带型反义分子<400>3gatccaggac tgtgtgtgat gtctttggtt ttgtcataga ttgcgttgtt gcggcctgga 60tccaggactg tgtgtgatgt ctttggtttt gtcatagatt gcgttgttgc ggcctg 116<210>4<211>13<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys1 5 10<210>5<211>12<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln1 5 10
权利要求
1.一种纯的共价闭合反义分子，其特异性地抑制TGF-β的表达。
2.如权利要求1所述的共价闭合反义分子，其特征是，该分子至少有两个由茎结构分开的环，其中至少一个环含有抑制TGF-β表达的靶反义序列。
3.如权利要求2所述的共价闭合反义分子，其特征在于，所述的TGF-β是TGF-β1。
4.如权利要求3所述的共价闭合反义分子，其特征在于，其含有与SEQ ID NO1大体相似的序列。
5.一种制备如权利要求2所述的化合物的方法，该方法包括将至少两个线性反义分子与茎环结构相连，该茎环结构具有彼此互补而形成共价闭合反义分子的5’或3’末端。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的线性反义分子可以特异于相同的靶核酸或不同的核酸。
7.一种抑制TGF-β表达的方法，该方法包括将含有TGF-β表达细胞的样品与如权利要求1所述的共价闭合反义分子接触。
8.一种治疗由TGF-β表达引起的疾病的方法，该方法包括将如权利要求1所述的共价闭合反义分子施用给需要的患者。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的疾病是纤维化。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的纤维化是在肾中。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的纤维化是小管间质性纤维化。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的纤维化是在肝中。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的纤维化是在肺中。
14.一种治疗单侧输尿管阻塞的方法，该方法包括用将如权利要求1所述的共价闭合反义分子的组合物施用给需要的患者。
15.一种预防在损伤位点积累细胞外基质蛋白的方法，该方法包括将如权利要求1所述的共价闭合反义分子施用给需要的患者。
16.一种含有共价闭合反义分子、tat或tat样肽和载体组分的组合物。
17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述的载体是脂质体。
18.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述的共价闭合反义分子靶向TGF-β。
19.一种传递共价闭合反义分子到细胞的方法，该方法包括用共价闭合反义分子、tat或tat样肽和载体组分与细胞接触。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，在接触细胞之前将所述的tat或tat样肽和载体组分混合。
全文摘要
本申请描述了特异性地抑制TGF－β表达的纯的共价闭合反义分子。本申请还描述了含有共价闭合反义分子(相对于任何序列)和tat或tat样肽的组合物，用于反义分子的传递。
文档编号A61P13/00GK1622994SQ02828394
公开日2005年6月1日 申请日期2002年12月30日 优先权日2001年12月28日
发明者朴钟九, 文翊宰, 崔英国, 朴官奎 申请人:维尔精股份有限公司