专利名称：厌氧短小棒状杆菌药用成分的分离方法、药用用途及药物制剂的制作方法
技术领域：
本发明提供一种厌氧短小棒状杆菌药用成分的分离方法，并提供了其药用用途及药物制剂，属于生物工程技术分离纯化工艺技术领域。
背景技术：
现有的厌氧短小棒状杆菌(以下简称CP)制剂为全菌体制剂，商品名“长生利康”，是一种免疫治疗制剂，该项制剂在生产过程中异种蛋白含量过高，致使产品在使用中副作用大，包括发热，注射局部疼痛，使患者难以接受，限制了其推广应用。
发明内容
本发明提供一种厌氧短小棒状杆菌(CP)药用成分的分离方法。
本发明还提供了该杆菌的药用用途及药物制剂。
本发明的技术解决方法包括以下步骤取CP菌株用1-2ml生理盐水稀释，接种于4-5g碎肉培养基中，37℃厌氧培养4-5天，传至抗氧化剂培养基中，厌氧培养，再传至肝透析液培养集中，厌氧培养3-7天，收集菌体，用生理盐水稀释成250亿-500亿/ml，加入2-3倍的脱水剂(冷-20～-60℃丙酮)，置4℃冰箱过夜，收集菌体，用冷丙酮洗2-3次，将沉淀物至37℃干燥成菌粉，研磨后备用。
取1-3克菌粉加入50-100ml生理盐水制成悬液，用蛋白酶消化(胰糜蛋白酶0.1-0.6mg/ml，胰蛋白酶0.1-0.6mg/ml，37℃-55℃消化3-6小时)，然后升高温度80-120℃终止消化，用PBS洗涤，收集沉淀，该消化重复两次以上为佳；离心收集沉淀，加入RNAse 70-200μg/ml，DNAse 50-150μg/ml，蛋白酶0.1-0.6mg/ml在0.2M Tris液中20-37℃消化12-36小时，高速离心，洗涤，取沉淀物重复消化过程一次，离心，生理盐水洗涤2次，然后进行脱脂杀菌处理用乙醚/乙醇0.5-1.5/1-2(V/V)脱脂24-72小时，2-4次，收集沉淀用氯仿脱脂24-72小时2-4次，收集沉淀，用氯仿/甲醇3-1/0.5-2(V/V)24-72小时，2-4次然后生理盐水洗涤，冷冻干燥制成厌氧短小棒状杆菌的药用成分纯化物。
抗氧化剂包括硫乙醇酸钠。
脱水剂包括丙酮。
消化蛋白酶胰糜蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶。
经过药理学实验筛选，上述提取物具有以下特征1、促进脾单核细胞酸性磷酸酶的活性。
2、促使单和吞噬细胞功能增强。
3、激活骨髓多能干细胞。
4、对免疫细胞有明显的激活作用。
通过对其机理的研究，上述提取物具有抗肿瘤、抑制转移的药理活性。
上述提取物还具有对银屑病的治疗作用。
具有对妇女外阴白斑的治疗作用。
本发明的药物组合物含有治疗有效量的上述提取物为活性成分，以及含有一种或多种药学上可以接受的载体。
本发明的提取物和组合物可用于制备治疗癌症的药物。
同时还可制备具有治疗银屑病、妇女外阴白斑疾病的药物。
上文的载体是指药学领域常规的药物载体，包括稀释剂、赋形剂，填充剂，粘合剂，湿润剂，崩解剂，吸收促进剂，表面活性剂，吸附载体。
本发明可以组合物的形式通过口服、直肠、静脉、肌肉注射或胃肠外给药方式施用于这种治疗的患者。按照药学领域的常规生产方法制备各种剂型如片剂、颗粒剂、冲剂、胶囊、栓剂、喷雾剂、缓释剂和注射剂。也可使其活性成分与一种或多种载体或药物混合，制成所需剂型。
本发明的药物组合物优选重量比为0.1％～99.5％活性成分，优选含有10-90％，更优选20-80％，最好为70％的本发明提取物。
本发明的施药量可根据用药途径、患者年龄、体重、疾病类型和严重程度等变化，日剂量为0.01～10mg/kg。
下述的药理实验证实了本发明提取物药理活性一、纯化制剂动物实验结果用体重18-20g的C57小鼠，实验组和对照组各10只，雌雄各半.将样品稀释为0.8-2.4mg/ml，给实验组腹腔注射0.5ml/只，对照组腹腔注射生理盐水0.5ml/只，14天处死，称体重，脾重，计算脾激活指数，其值不应低于1.5，该实验重复三次得到类似结果，统计学处理结果表明实验组和对照组相比有显著性差异(p＜0.01)。
表1纯化制剂脾指数测定结果
二、通过临床研究1.对癌症治疗效果(1)抗肿瘤，抑制转移对癌症治疗有较好的疗效，特别对癌性胸腹水效果达95％以上；对于肺癌手术患者，随机分组，18例作为实验组，术前皮下注射CP制剂，18例做为对照组皮下注射生理盐水。结果表明，与对照组相比，实验组癌细胞有明显变性，癌巢周围有明显的纤维增生，免疫活性细胞聚集，随访一年半，对照组4例死亡，6例复发，；而治疗组均活存并复发。
表2 CP对中早期肺癌术后抗复发作用
统计学处理结果P＜0.01
(2)能延长化疗放疗使用时间，延长存活期有明显效果表3短棒状制剂与化疗合用的疗效
统计学处理结果P＜0.05.
2.妇女外阴白斑治疗观察，对于来自白求恩医大二院，哈尔滨医科大学附属一院，中国医大三院，河北中医院共522例患者治疗结果表明，痊愈率15％，总有效率92％，无效7.2％。
3.银屑病观察对于来自鞍山市矿泉研究所，白求恩医科大学二院，东北输油管理局，职工疗养院，沈阳市第七人民医院患者共466例总有效率87.7％，治愈率35％，无效17％。
本发明的积极效果在于提供了厌氧短小棒状杆菌药用成分的分离方法，为除去热源物质，降低副作用，保留其有效成分，纯化制剂，获得更新换代的产品，为患者提供更安全有效的产品。
具体实施例方式实施例1取CP菌株用2ml生理盐水稀释，接种于4g碎肉培养基中，37℃厌氧培养5天，传至硫乙醇酸钠抗氧化剂培养基中，厌氧培养，再传至肝透析液培养集中，厌氧培养5天，收集菌体，用生理盐水稀释成300亿-450亿/ml，加入3倍的脱水剂(-46℃冷丙酮)，置4℃冰箱过夜，收集菌体，用冷丙酮洗2次，将沉淀物至37℃干燥成菌粉，研磨后备用。
取3克菌粉加入100ml生理盐水制成悬液，用胰糜蛋白酶0.1-0.6mg/ml，胰蛋白酶0.1-0.6mg/ml，37℃-55℃消化3-6小时，然后升高温度80-120℃终止消化，用PBS洗涤，收集沉淀，在同上重复消化一次；离心收集沉淀，加入RNAse 70-200μg/ml，DNAse 50-150μg/ml，蛋白酶0.1-0.6mg/ml在0.2M Tris液中20-37℃消化12-36小时，高速离心，洗涤，取沉淀物重复消化过程一次，离心，生理盐水洗涤2次，然后进行脱脂杀菌处理用乙醚/乙醇0.5-1.5/1-2(V/V)脱脂24-72小时，2-4次，收集沉淀用氯仿脱脂24-72小时2-4次，收集沉淀，用氯仿/甲醇3-1/0.5-2(V/V)24-72小时，2-4次然后生理盐水洗涤，冷冻干燥制成CP药用成分纯化物。
实施例2取实施例1制备的CP药用成分纯化物20克，加人赋形剂药用淀粉20克，混合均匀，造粒整粒压片，制得片剂，每片含CP的药用成分纯化物200毫克。
实施例3制备本发明胶囊制剂取实施例1制备的厌氧短小棒状杆菌的药用成分纯化物20克，加人赋形剂药用淀粉30克，充分混合均匀，装入胶囊，每粒含厌氧短小棒状杆菌的药用成分纯化物200毫克。
实施例4
粉针注射剂将实施例1所得产物用甲醇重结晶得本发明纯品。
CP药用成分纯化物 15克氯化纳 75克注射用水 1000ml制备过程将CP药用成分纯化物、氯化纳溶解与适量的注射用蒸馏水中，用1～5％的氢氧化钠溶液调PH8.5，加注射用水至1000ml，通过0.2μm的微孔滤膜过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓶，冷冻干燥。
权利要求
1.一种厌氧短小棒状杆菌药用成分的分离方法，其特征包括以下步骤取CP菌株用1-2ml生理盐水稀释，接种于4-5g碎肉培养基中，37℃厌氧培养4-5天，传至抗氧化剂培养基中，厌氧培养，再传至肝透析液培养集中，厌氧培养3-7天，收集菌体，用生理盐水稀释成250亿-500亿/ml，加入2-3倍的脱水剂(冷-20～-60℃丙酮)，置4℃冰箱过夜，收集菌体，用冷丙酮洗2-3次，将沉淀物至37℃干燥成菌粉，研磨后备用。取1-3克菌粉加入50-100ml生理盐水制成悬液，用蛋白酶消化(胰糜蛋白酶0.1-0.6mg/ml，胰蛋白酶0.1-0.6mg/ml，37℃-55℃消化3-6小时)，然后升高温度80-120℃终止消化，用PBS洗涤，收集沉淀，该消化重复两次以上为佳；离心收集沉淀，加入RNAse 70-200μg/ml，DNAse 50-150μg/ml，蛋白酶0.1-0.6mg/ml在0.2M Tris液中20-37℃消化12-36小时，高速离心，洗涤，取沉淀物重复消化过程一次，离心，生理盐水洗涤2次，然后进行脱脂杀菌处理用乙醚/乙醇0.5-1.5/1-2(V/V)脱脂24-72小时，2-4次，收集沉淀用氯仿脱脂24-72小时2-4次，收集沉淀，用氯仿/甲醇3-1/0.5-2(V/V)24-72小时，2-4次然后生理盐水洗涤，冷冻干燥制成CP的药用成分纯化物。
2.根据权利要求1所述的分离方法制得的药用成分纯化物。
3.根据权利要求1药用成分纯化物在制备抗肿瘤、抑制转移作用药物中的应用。
4.根据权利要求1药用成分纯化物在制备治疗银屑病药物中的应用。
5.根据权利要求1药用成分纯化物在制备治疗妇女外阴白斑药物中的应用。
6.用于制备抗肿瘤、抑制转移作用的药物组合物，其中含有治疗有效活性成分的权利要求1药用成分纯化物和药学上可接受的载体。
7.用于制备治疗银屑病的药物组合物，其中含有治疗有效活性成分的权利要求1药用成分纯化物和药学上可接受的载体。
8.用于制备治疗妇女外阴白斑病的药物组合物，其中含有治疗有效活性成分的权利要求1药用成分纯化物和药学上可接受的载体。
9.根据权利要求6～8所述的药物组合物，优选重量比为0.1％～99.5％活性成分，优选含有10-90％，更优选20-80％，最好为70％。
10.根据权利要求3～8所述的药物，其特征在于所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。
全文摘要
本发明公开一种厌氧短小棒状杆菌药用成分的分离方法，并提供了其药用用途及药物制剂，采用本发明对厌氧短小棒状杆菌的药用成分进行分离，可除去热源物质，降低副作用，保留其有效成分，纯化制剂，获得更新换代的产品，为患者提供更安全有效的产品。对癌症治疗有较好的疗效，特别对癌性胸腹水效果达95％以上；对妇女外阴白斑治疗的痊愈率15％，总有效率92％；对银屑病治疗观察治愈率35％，总有效率87.7％。
文档编号A61K35/74GK1439381SQ03110879
公开日2003年9月3日 申请日期2003年1月17日 优先权日2003年1月17日
发明者张静华, 万金会, 邰桂香 申请人:张静华