专利名称：两个人工合成prrs病毒多表位串联核苷酸序列及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人工合成两个分别含3个串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)表位(MES-1)和5个串联的PRRSV表位(MES-2)的核苷酸序列，并在大肠杆菌表达系统中表达，表达的多肽用作诊断抗原或制备疫苗。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS)俗称“兰耳病”，1987年首次在美国北卡罗来纳州等地暴发，主要是以引起妊娠母猪流产、产死胎和木乃伊胎以及仔猪出现呼吸道症状和死亡为特征的一种传染病。该病毒传播速度极快，仅在1988-1992四年间就传遍了整个北美洲和欧洲，现在几乎遍布了所有养猪国家。PRRSV主要侵害免疫系统，并可造成感染畜群的持续感染，因此在猪病中高居首位。随着养猪业的迅速发展、国际贸易的日益扩大，PRRS发生的可能性也在不断增加，目前该病已经成为引起最大经济损失的传染病。我国1995年在北京郊区的某猪场中首次发现本病，并分离到PRRS病毒，命名为CH-1a株，现已证明该毒株属于北美洲型。
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，该病毒与马动脉炎病毒(EAV)、猴出血热病毒(SHFV)以及鼠乳酸脱氢酶增高症病毒(LDV)同归属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属。其基因组大小约为15kb，含有8个开放阅读框架(ORFs)，分别编码2种非结构蛋白和6种结构蛋白，其位于5′末端的ORF1a和ORF1b编码病毒的RNA聚合酶，ORF2～7编码病毒的结构蛋白。其中PRRSV核衣壳蛋白(N蛋白)是由ORF7编码，大小约15KD，该蛋白中至少有5个抗原决定簇，包括对所有毒株保守的共同决定簇和北美洲型或欧洲型特异性决定簇。已有研究证实猪感染PRRSV后的早期免疫应答主要是针对N蛋白的，而且持续时间长，随后才是针对M蛋白和E蛋白的抗体应答，因此，N蛋白在PRRSV的诊断上具有较高的价值。ORF5编码GP5糖蛋白，是该病毒的主要保护性抗原蛋白，位于病毒粒子囊膜表面。
我国是养猪大国，而现在PRRS在我国的许多省、市、自治区都有不同程度的流行，且已造成了很大的经济损失，给我国的养猪业者带来了极大的困扰，毋庸置疑这也对我国的养猪业提出了挑战，而如何及时监测疫情、建立健全对PRRS的全面普查和及时监测的预警系统是防制本病的一个重要环节。虽然国内已有以全病毒为抗原的诊断技术涉，但是由于此方法涉及病毒培养和提纯等，不仅制作过程复杂，成本较高，而且存在散毒隐患，故不利于推广使用。因此建立简便、快捷、灵敏易于推广的PRRSV诊断方法，就成为我国急需解决的主要问题。
本发明的目的利用原核表达系统高效表达两个串联的PRRS病毒N基因和GP5基因抗原表位小肽，将此小肽作为抗原或免疫原用于PRRS病毒感染的抗体检测或疫苗制备。本发明的目的是这样实现的两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列，人工合成两个分别含3个串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)表位和5个串联的PRRSV表位的核苷酸序列，并在大肠杆菌表达系统中表达，表达的多肽用作诊断抗原或制备疫苗，所用的序列来源于PRRSV的囊膜糖蛋白基因(GP5)和核蛋白基因(N)。
所述两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列，所述的表位序列之间都是通过3个连续的甘氨酸串联在一起，或者所述的3个串联的PRRSV表位，其特征序列是PVLTHIV-GGG-RGKGPGKKNKKKSPEKP-GGG-VLVNANSNSSSHFQL，或者所述的5个串联的PRRSV表位，其特征序列是QLCQML-GGG-VLDGSVATPLTRVSAEQW-GGG-PEKPHFPLATEDDVRHH-GGG-SSIYAVCALAALICFV-GGG-VRLIRVTASPSA。
两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，3个串联的PRRSV表位与GST序列连接在一起进行融合表达，其表达产物纯化后可作为抗原用于检测PRRSV感染动物的血清抗体，或者所述的3个串联的PRRSV表位与GST序列连接在一起进行融合表达，其表达产物纯化后可制备抗PRRSV亚单位疫苗。
所述两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，所述的5个串联的PRRSV表位与GST序列连接在一起进行融合表达，其表达产物纯化后可作为抗原用于检测PRRSV感染动物的血清抗体。
所述两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，所述的5个串联的PRRSV表位与GST序列连接在一起进行融合表达，其表达产物纯化后可制备抗PRRSV亚单位疫苗。
所述两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，所述的3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位分别与GST序列连接在一起进行融合表达，将其表达产物分别纯化后混合可作为抗原用于检测PRRSV感染动物的血清抗体。
一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位分别与GST序列连接在一起进行融合表达，将其表达产物分别纯化后混合制备抗PRRSV亚单位疫苗。
一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，将3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位核苷酸序列分别克隆到一种真核表达质粒或分别克隆到两种真核质粒中可构建抗PRRSV的DNA疫苗。
一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，将3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位核苷酸序列克隆到一种含猪干扰素基因的真核表达质粒或分别克隆到两种含猪干扰素基因的真核表达质粒中可构建抗PRRSV的DNA疫苗。
一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，将3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位核苷酸序列克隆到一种含猪IL-2基因的真核表达质粒或分别克隆到两种含猪IL-2基因的真核表达质粒中可构建抗PRRSV的DNA疫苗。
具体的构建过程及其优点1.人工合成了两个分别含3个串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)表位(MES-1)和5个串联的PRRSV表位(MES-2)的核苷酸序列，并在大肠杆菌表达系统中表达，表达的多肽可以用作多种诊断抗原或制备多种疫苗。
2.通过对PRRS病毒分子生物学基础深入研究，使得借助于基因工程手段建立一种便于现地使用的特异性强、准确度高的检测方法，以达到及时监测PRRS的目的，其中在原核表达系统中高效表达核衣壳蛋白，就是用于生产诊断性抗原的一种新型方法，这一定会给人们在生产实践中及时预报疫情，从而进行积极预防和控制疫情的发生带来有益的帮助。
3.对本专利通过生物工程手段所完成的核苷酸的监测确认a，多表位的选取和设计 选取PRRSV ORF5和ORF7基因上最为保守的线性表位，各4个表位。将它们相互交叉后，表位之间以三个甘氨酸连接肽串联合成(序列见图)。在设计多表位基因时，前后除设计了起始密码子和终止密码子外，分别提供了合适的限制性内酶切位点，SmaI、EcoRI和BamHI、KpnI，以方便将其克隆在各种表达载体中。
b，原核表达载体的构建 将合成的8个表位序列用限制性内切酶PVUII切成两段，分别命名为MES-1和MES-2。MES-1含两个ORF5表位和一个ORF7表位，MES-2含两个ORF5表位和三个ORF7表位。将这两个片段分别连接到原核表达载体PGEX-6P-1中。
c，多表位基因的诱导表达 将含有重组质粒的BL-21菌种在含氨苄青霉素的LB平板上画线，37℃培养过夜，分别挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的液体LB中，37℃摇床培养至OD600为0.5-0.7之间时，加入诱导剂IPTG，终浓度为1mM，继续振摇培养3-6个小时，收获细菌。离心后将菌体用含0.5M NaCl、20mM Tris.Cl(PH＝7.6)缓冲液洗涤两次，然后用PBS悬浮细胞，经超声波裂解后进行SDS-PAGE蛋白电泳，考马斯亮兰染色，可见31Ku和35Ku的融合蛋白。薄层扫描分析，该蛋白占菌体蛋白总量的30％。
d，表达蛋白活性的鉴定 表达的蛋白经SDS-PAGE电泳后，转移至NC硝酸纤维素膜上，用猪繁殖-呼吸综合症病毒阳性血清进行Western-Blot分析，结果表明表达的蛋白具有良好的抗原反应性。
实施例1两个人工合成两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列，PRRS病毒多表位串联核苷酸序列，人工合成两个分别含3个串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)表位和5个串联的PRRSV表位的核苷酸序列，并在大肠杆菌表达系统中表达。
实施例2两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列，所用的序列来源于PRRSV的囊膜糖蛋白基因(GP5)和核蛋白基因(N)。
实施例3所述两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列，所述的表位序列之间都是通过3个连续的甘氨酸串联在一起。
实施例4两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列，所述的3个串联的PRRSV表位，序列是PVLTHIV-GGG-RGKGPGKKNKKKSPEKP-GGG-VLVNANSNSSSHFQL。
实施例5所述两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列，所述的表位序列之间所述的5个串联的PRRSV表位，其特征序列是QLCQML-GGG-VLDGSVATPLTRVSAEQW-GGG-PEKPHFPLATEDDVRHH-GGG-SSIYAVCALAALICFV-GGG-VRLIRVTASPSA。
实施例6两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，3个串联的PRRSV表位与GST序列连接在一起进行融合表达，其表达产物纯化后可作为抗原用于检测PRRSV感染动物的血清抗体。
实施例7两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，所述的3个串联的PRRSV表位与GST序列连接在一起进行融合表达，其表达产物纯化后可制备抗PRRSV亚单位疫苗。
实施例8原核两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，所述的5个串联的PRRSV表位与GST序列连接在一起进行融合表达，其表达产物纯化后可作为抗原用于检测PRRSV感染动物的血清抗体。
实施例9一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，所述的5个串联的PRRSV表位与GST序列连接在一起进行融合表达，其表达产物纯化后可制备抗PRRSV亚单位疫苗。
实施例10一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，所述的3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位分别与GST序列连接在一起进行融合表达，将其表达产物分别纯化后混合可作为抗原用于检测PRRSV感染动物的血清抗体。
实施例11一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位分别与GST序列连接在一起进行融合表达，将其表达产物分别纯化后混合制备抗PRRSV亚单位疫苗。
实施例12两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，将3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位核苷酸序列分别克隆到一种真核表达质粒或分别克隆到两种真核质粒中可构建抗PRRSV的DNA疫苗。
实施例13两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，将3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位核苷酸序列克隆到一种含猪干扰素基因的真核表达质粒或分别克隆到两种含猪干扰素基因的真核表达质粒中可构建抗PRRSV的DNA疫苗。
实施例14两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，将3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位核苷酸序列克隆到一种含猪IL-2基因的真核表达质粒或分别克隆到两种含猪IL-2基因的真核表达质粒中可构建抗PRRSV的DNA疫苗。
实施例15表达的MES-1和/或MES-2作为PRRSV诊断抗原的实施过程以表达的MES-1和/或MES-2作为抗原的ELISA检测方法1，将含有重组质粒的BL-21菌种在含氨苄青霉素的LB平板上画线，37℃培养过夜，分别挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的液体LB中，37℃摇床培养至OD600为0.5-0.7之间时，加入诱导剂IPTG，终浓度为1mM，继续振摇培养3-6个小时，收获细菌。离心后将菌体用含0.5MNaCl、20mM Tris.Cl(PH＝7.6)缓冲液洗涤两次，然后用PBS悬浮细胞，经超声波裂解后，通过分子筛柱层析，回收31Ku和35Ku的融合蛋白。2，用包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，PH9.6)将抗原做一系列稀释，包被96孔聚苯乙烯反应板，每孔100μl，其中奇数列孔加MES-1和/或MES-2抗原蛋白，偶数列孔加阴性抗原对照，4℃包被过夜。经PBST(含0.05％吐温20的0.01M磷酸盐缓冲液)洗涤3～5次，每次3分钟。用2种不同的封闭液(含3％脱脂乳的PBS；含1％马血清的PBS)37℃封闭2～3小时。如上洗涤，干燥后待用或于-20℃冰箱保存备用。将待检猪血清用PBS分别做一系列稀释，分别以每孔100μl加入反应板，每个样品平行做4孔(即重组蛋白抗原和阴性抗原对照各2孔)，同时将标准阳性和阴性血清同样处理加于反应孔中，分别在室温下和37℃作用45分钟、1小时，经PBST洗涤3～5次，加入用PBS稀释至工作浓度的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪抗体(购于SIGMA公司)，每孔100μl，作用温度与时间同上，如上洗涤，再加入新配制的OPD底物溶液(将邻苯二胺以终浓度为0.04％溶于0.16M的柠檬酸钠和0.02M的磷酸氢二钠缓冲溶液中，使用前按1∶2000倍稀释加入30％的H2O2即可)，室温下避光显色15～30分钟，最后每孔用50μl 2M的硫酸终止反应。用自动酶标测定仪在波长492nm处测定各孔的光吸收值(OD492值)。分别计算各被检样品和标准对照OD492的平均值，并按如下公式计算S/P值S/P＝(被检样品抗原孔OD492-同一样品的抗原对照孔OD492)/(标准阳性血清抗原孔OD492-同一血清的抗原对照孔OD492)。3，整个试验设以全病毒做抗原的ELISA为对照。结果判定是在标准阳性血清的重组蛋白包被孔OD492与同一血清的阴性抗原对照孔OD492的比值大于或等于2的前提下，当样品的S/P值大于或等于0.4时判为阳性，小于或等于0.33时判为阴性，小于0.4且大于0.33时可判为可疑，应重新检测一次。
实施例16原核表达的MES-1和/或MES-2蛋自制备亚单位疫苗的实施过程1，将含有重组质粒的BL-21菌种在含氨苄青霉素的LB平板上画线，37℃培养过夜，分别挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的液体LB中，37℃摇床培养至OD600为0.5-0.7之间时，加入诱导剂IPTG，终浓度为1mM，继续振摇培养3-6个小时，收获细菌。离心后将菌体用含0.5MNaCl、20mM Tris.Cl(PH＝7.6)缓冲液洗涤两次，然后用PBS悬浮细胞，经超声波裂解后，通过分子筛柱层析，回收31Ku(MES-1)或35Ku(MES-2)的融合蛋白。2，将层析纯化的MES-1和/或MES-2蛋白直接配以适当的佐剂制备成亚单位疫苗，肌肉注射用于预防猪繁殖与呼吸综合症。
实施例17利用MES-1和/或MES-2基因序列构建DNA疫苗的实施过程1，将MES-1和/或MES-2基因序列克隆到真核表达质粒载体中的CMV早期启动子下游，再将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21中大量扩增，提取质粒，直接给猪肌肉注射免疫，可诱导抗猪繁殖与呼吸综合症病毒的免疫反应。2，将MES-1和/或MES-2基因序列与猪γ干扰素基因同时或分别克隆到真核表达质粒载体中的CMV早期启动子下游，再将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21中大量扩增，提取含MES-1和/或MES-2基因及猪γ干扰素基因质粒，直接给猪肌肉注射免疫，或提取含MES-1和/或MES-2基因质粒及含猪γ干扰素基因质粒，混合后直接给猪肌肉注射免疫，可诱导抗猪繁殖与呼吸综合症病毒的免疫反应。3，将MES-1和/或MES-2基因序列与猪IL-2基因同时或分别克隆到真核表达质粒载体中的CMV早期启动子下游，再将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21中大量扩增，提取含MES-1和/或MES-2基因及IL-2基因质粒，直接给猪肌肉注射免疫，或提取含MES-1和/或MES-2基因质粒及含IL-2基因质粒，混合后直接给猪肌肉注射免疫，可诱导抗猪繁殖与呼吸综合症病毒的免疫反应。人工合成的多表位串联序列MES-1的核苷酸序列(A)和其编码的氨基酸序列(B)A B 人工合成的多表位串联序列MES-2的核苷酸序列(A)和其编码的氨基酸序列(B)A B
权利要求
1，一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列，其特征是人工合成两个分别含3个串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)表位和5个串联的PRRSV表位的核苷酸序列，并在大肠杆菌表达系统中表达，表达的多肽用作诊断抗原或制备疫苗，所用的序列来源于PRRSV的囊膜糖蛋白基因(GP5)和核蛋白基因(N)。
2，根据权利要求1所述两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列，其特征是所述的表位序列之间都是通过3个连续的甘氨酸串联在一起，或者所述的3个串联的PRRSV表位，其特征序列是PVLTHIV-GGG-RGKGPGKKNKKKSPEKP-GGG-VLVNANSNSSSHFQL，或者所述的5个串联的PRRSV表位，其特征序列是QLCQML-GGG-VLDGSVATPLTRVSAEQW-GGG-PEKPHFPLATEDDVRHH-GGG-SSIYAVCALAALICFV-GGG-VRLIRVTASPSA。
3，一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，3个串联的PRRSV表位与GST序列连接在一起进行融合表达，其表达产物纯化后可作为抗原用于检测PRRSV感染动物的血清抗体，或者所述的3个串联的PRRSV表位与GST序列连接在一起进行融合表达，其表达产物纯化后可制备抗PRRSV亚单位疫苗。
4，一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，所述的5个串联的PRRSV表位与GST序列连接在一起进行融合表达，其表达产物纯化后可作为抗原用于检测PRRSV感染动物的血清抗体。
5，一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，所述的5个串联的PRRSV表位与GST序列连接在一起进行融合表达，其表达产物纯化后可制备抗PRRSV亚单位疫苗。
6，一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，所述的3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位分别与GST序列连接在一起进行融合表达，将其表达产物分别纯化后混合可作为抗原用于检测PRRSV感染动物的血清抗体。
7，一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位分别与GST序列连接在一起进行融合表达，将其表达产物分别纯化后混合制备抗PRRSV亚单位疫苗。
8，一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，将3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位核苷酸序列分别克隆到一种真核表达质粒或分别克隆到两种真核质粒中可构建抗PRRSV的DNA疫苗。
9，一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，将3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位核苷酸序列克隆到一种含猪干扰素基因的真核表达质粒或分别克隆到两种含猪干扰素基因的真核表达质粒中可构建抗PRRSV的DNA疫苗。
10，一种两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列的应用，将3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位核苷酸序列克隆到一种含猪IL-2基因的真核表达质粒或分别克隆到两种含猪IL-2基因的真核表达质粒中可构建抗PRRSV的DNA疫苗。
全文摘要
两个人工合成PRRS病毒多表位串联核苷酸序列及其应用，即两个人猪繁殖与呼吸综合征病毒多表位串联核苷酸序列及其应用。根据PRRSV的GP5蛋白基因和N蛋白基因上的抗原表位，设计了8个串联的表位并进行人工合成，合成的核苷酸片段用PVUII酶切成两段，分别克隆到含GST基因的质粒载体中，并进行表达。两个分别含3个串联的PRRSV表位和5个串联的PRRSV表位的核苷酸序列在大肠杆菌表达系统中表达的多肽用作诊断抗原或制备疫苗。此两种表达产物单独和混合可作为检测PRRSV抗体的诊断抗原，也可制备亚单位疫苗或核酸疫苗。
文档编号A61P31/12GK1458280SQ0313241
公开日2003年11月26日 申请日期2003年6月2日 优先权日2003年6月2日
发明者童光志, 张春琳, 薛强, 仇华吉, 王云峰 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所