专利名称：截短表达的猪圆环病毒Ⅱ型衣壳蛋白抗原及其应用的制作方法
技术领域：
本项发明是利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达了猪圆环病毒II型Cap基因的羧基端部分，作为猪圆环病毒感染诊断用抗原和制备亚单位疫苗。
上述的截短表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白抗原的应用，该截短的重组衣壳蛋白抗原可应用于琼扩诊断技术(AGIP)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)，免疫荧光抗体检测(IF)及免疫印渍试验(Western Blot)。
截短表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白抗原的应用，该截短的重组衣壳蛋白抗原可应用于检测猪圆环病毒感染后产生的抗体。
一种截短表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白的应用，体外表达该截短的重组衣壳蛋白可用于制备抗猪圆环病毒感染的亚单位疫苗。本发明的有益效果及其所得到的新的本发明产品性能的测定1.经用PCV阳性血清检测，表达的部分衣壳蛋白具有良好的抗原反应性，可作为诊断抗原应用于琼扩诊断技术，酶联免疫吸附试验，斑点酶联免疫吸附试验，免疫荧光检测等检测PCV-2感染产生的抗体，此外，表达的衣壳蛋白可进一步配以佐剂制备亚单位疫苗。
2.国内对PCV-2的流行病学调查仍主要是利用多聚酶链式反应(PCR)进行病原学检测，其可信性受到由PCR的高度敏感性带来的假性结果的影响，而酶联免疫吸附试验成为优于病毒分离和PCR的血清学检测方法。
3.PCV-2 ORF1编码与复制相关的Rep蛋白，ORF2编码目前已知唯一的结构蛋白--壳蛋白Cap。通过肽扫描(PEPSCAN)分析认定，PCV-2的型特异性特征决定于ORF2编码的Cap蛋白，尤其在近羧基端的393个碱基中，本发明正是在这一点上取得了进步。
4.该重组蛋白具有显著的抗原反应活性，通过对疑似患PMWS猪的淋巴组织经PK15细胞系培养后，从总DNA中扩增出PCV-2病毒基因组，以及ORF1、ORF2基因。在测定全病毒基因组核苷酸序列的基础上，利用原核融合表达载体pGEX-6p-1，表达PCV-2的部分ORF2基因，并通过与PCV-2感染猪血清的酶联免疫吸附试验，验证了重组蛋白的抗原反应活性，具体过程见实施例。
截短表达的猪圆环病毒衣壳蛋白作为诊断抗原的具体过程将重组菌诱导大量表达后，PBS重悬菌体，超声波破碎。将初步纯化的表达产物包被酶标反应板，37℃吸附2小时。PBST(0.01mol/L PBS+0.05％Tween20)洗涤3次，每次10分钟。用含5％脱脂乳或10％小牛血清的PBST 37℃封闭2小时，同上洗涤。将PCV-2阳性猪血清和SPF猪阴性血清分别用PBS作一系列稀释后加入孔中，37℃水浴2小时，同上洗涤。辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体(1∶3000)作用1.5小时，同样洗涤。加底物显色缓冲液(10ml磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH5.0，5mg OPD和0.15ml 3％H2O2)，避光显色。显色5-10分钟后，每孔加50μl 2mol/L H2SO4终止反应。酶标检测仪492nm波长下读数。结果发现重组蛋白能与PCV阳性血清发生很强的反应，与阴性血清无反应。本项发明可以取代全病毒抗原用于PCV-2感染抗体的检测。
本产品的蛋白抗原活性a.PCV病毒分离与PCR样品处理 取通过鉴别PCR证明有PCV-2感染的淋巴组织匀浆后，接种无PCV污染的PK15细胞。37℃培养12h后，用Hank’s碱性盐溶液配制的300mmol/L葡萄糖氨作用30分钟，再培养72小时后冻融3次，留作种毒；以1/10体积比接种新鲜50％融合生长的PK15细胞。检测时用胰蛋白酶消化成单细胞，PBS洗涤，溶于TNE缓冲液(0.1mol/L NaCl，10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0)，其中蛋白酶K和SDS的终浓度分别为100μg/ml和1％。50℃作用2小时，苯酚、苯酚∶氯仿各抽提1次，无水乙醇沉淀2小时后，溶于适量TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)作为PCR模板。
2.引物的设计与合成 根据GenBank中公布的序列(序列号AF201311)，设计一对特异性引物，由大连宝生物工程公司合成，扩增PCV-2 CAP基因全序列(编码Cap蛋白)。Cap上游引物5’GGGGGA TCCTAT TAT TCA TTA AGG GTT AAG 3’，Cap下游引物5’AGCAAG CTTCTT TCG TTT TC 3’，扩增18nt-742nt。其中上游引物中包含BamHI位点，下游引物中包含HindIII位点，加下划线表示，使用浓度为10pmol/μl。
3.Cap基因的扩增及其克隆Cap基因的扩增条件PCR反应总体积为50μl，在0.5ml PCR管中依次加入去离子水31μl，上、下游引物各2μl，dNTP5μl(各成分2.5mmol/L)，10×ExTaq缓冲液5μl，ExTaq 0.5μl，模板5μl。95℃变性5分钟后，94℃变性1分钟、50℃退火1分钟、72℃延伸90秒钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。同时以去离子水作空白对照。取5μlPCR产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。扩增产物用华舜公司的胶回收试剂盒回收，依据T-A原理，按照载体说明书与pMD18T载体连接，通过X-gal和IPTG、氨苄青霉素抗性以及限制性内切酶筛选重组克隆。获得的阳性重组质粒命名为pPRO-Cap。
4.Cap羧基端部分基因的克隆与表达 利用Cap基因内部393位的EcoRI位点和pMD18T载体上的SalI位点，将pPRO-Cap中的Cap基因羧基端部分(约393bp)切下与表达载体pGEX-6p-1连接，转化BL21感受态菌。通过氨苄青霉素抗性和限制性内切酶鉴定重组质粒，得到的重组克隆命名为pGEX-ΔCAP。
5.重组质粒的表达及SDS-PAGE电泳 将含有重组质粒的大肠杆菌在新鲜培养基(LB)中振荡培养，当菌液OD600值达0.6-0.8时，加入无菌IPTG，使终浓度为0.6mmol/L。3-4小时后停止培养，离心收集菌体，PBS洗涤，按1/10体积比浓缩，与等体积的凝胶上样缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，200mmol/L DTT，4％SDS，0.2％溴酚兰，20％甘油，pH6.8)混合，煮沸5分钟变性。利用BioRAD公司的蛋白质电泳装置做SDS-PAGE。分离胶的丙烯酰胺浓度为10％，0.25％考马斯亮兰染色。同时以载体转化菌同样诱导表达作阴性对照。截短的Cap蛋白表达量占菌体蛋白总量19.6％。
实施例2上述的截短表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白抗原的应用，该截短的重组衣壳蛋白抗原可应用于琼扩诊断技术(AGIP)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)，免疫荧光抗体检测(IF)及免疫印渍试验(Western Blot)。
实施例3截短表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白抗原的应用，该截短的重组衣壳蛋白抗原可应用于检测猪圆环病毒感染后产生的抗体。
实施例4截短表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白的应用，体外表达该截短的重组衣壳蛋白可用于制备抗猪圆环病毒感染的亚单位疫苗。
截短表达的猪圆环病毒衣壳蛋白作为免疫原制备亚单位疫苗的具体过程将含有重组质粒的大肠杆菌在新鲜培养基(LB)中振荡培养，当菌液OD600值达0.6-0.8时，加入无菌IPTG，使终浓度为0.6mmol/L。3-4小时后停止培养，离心收集菌体，PBS重悬菌体，超声波破碎，经过分子筛柱层析纯化或不纯化直接配以适当的佐剂制备成亚单位疫苗，肌肉注射用于预防猪圆环病毒感染。
PCV-2 HT02株全基因序列1 CTTTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTTATTATTCATTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTA 61 AGATTAAATTCTCTGAATTGTACATACATGGTTACACGGATGTTGTATTCCTGGTCGTAT121 ATACTGTTTTCGAACGCAGTGCCGAGGCCTACGTGGTCTACATTTCCAGCAGTTTGTAGT181 CTCAGCCACAGCTGATTTCTTTTGTTGTTTGGTTGGAAGTAATCAATAGTGGAATCTAGG241 ACAGGTTTGGGGGTAAAGTAGCGGGAGTGGTAGGAGAAGGGCTGGGTTATGGTATGGCGG301 GAGGAGTAGTTTACATAGGGGTCATAGGTGAGGGCTGTGGCCTTTGTTACAAAGTTATCA361 TCTAGAATAACAGCACTGGAGCCCACTCCTCTGTCACCCTGGGTGATTGGGGAGCAGGGC421 CAGAATTCAACCTTAATCTTCCTTATTCTGTAGTATTCAAAGGGCACAGAGCGGGGGTTT481 GAGCCCCCTCCTGGGGGAAGAAAGTCATTAATATTGAATCTCATCATGTCCACCGCCCAG541 GAGGGCGTTTTGACTGTGGTTCGCTTGATAGTATATCCGAAGGTGCGGGAGAGGCGGGTG601 TTGAAGATGCCATTTTTCCTTCTCCAGCGGTAACGGTGGCGGGGGTGGACGAGCCAGGGG661 CGGCGGCGGAGGATCTGGCCAAGATGGCTGCGGGGGCGGTGTCTTCTTCTCCGGTAACGC 721 CTCCTTAGATACGTCATATCTGAAAACGAAAGAAGTGCGCTGTAAGTATTACCAGCGCAC 781 TTCGGCAGCGGCAGCACCTCGGCAGCACCTCAGCAGCAACATGCCCAGCAAGAAGAATGG841 AAGAAGCGGACCCCAACCCCATAAAAGGTGGGTGTTCACTCTGAATAATCCTTCCGAAGA901 CGAGCGCAAGAAAATACGGGATCTTCCAATATCCCTATTTGATTATTTTATTGTTGGCGA961 GGAGGGTAATGAGGAAGGACGAACACCTCACCTCCAGGGGTTCGCTAATTTTGTGAAGAA1021 GCAGACTTTTAATAAAGTGAAGTGGTATTTGGGTGCCCGCTGCCACATCGAGAAAGCGAA1081 AGGAACAGATCAGCAGAATAAAGAATACTGCAGTAAAGAAGGCAACTTACTGATGGAGTG1141 TGGAGCTCCTAGATCTCAGGGACAACGGAGTGACCTGTCTACTGCTGTGAGTACCTTGTT1201 GGAGAGCGGGAGTCTGGTGACCGTTGCAGAGCAGCACCCTGTAACGTTTGTCAGAAATTT1261 CCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGAGCGGGAAAATGCAGAAGCGTGATTGGAAGAC1321 TAATGTACACGTCATTGTGGGGCCACCTGGGTGTGGTAAAAGCAAATGGGCTGCTAATTT1381 TGCAGACCCGGAAACCACATACTGGAAACCACCTAGAGACAAGTGGTGGGATGGTTACCA1441 TGGTGAAGAAGTGGTTGTTATTGATGACTTTTATGGCTGGCTGCCCTGGGATGATCTACT1501 GAGACTGTGTGATCGATATCCATTGACTGTAGAGACTAAAGGTGGAACTGTACCTTTTTT1561 GGCCCGCAGTATTCTGATTACCAGCAATCAGACCCCGTTGGAATGGTACTCCTCAACTGC1621 TGTCCCAGCTGTAGAAGCTCTTTATCGGAGGATTACTTCCTTGGTATTTTGGAAGAATGC1681 TACAGAACAATCCACGGAGGAAGGGGGCCAGTTCGTCACCCTTTCCCCCCCATGCCCTGA1741 ATTTCCATATGAAATAAATTACTGAGT 截短的Cap基因梭基端序列1 GAATTCTGGC CCTGCTCCCC AATCACCCAG GGTGACAGAG GAGTGGGCTC CAGTGCTGTT61 ATTCTAGATG ATAACTTTGT AACAAAGGCC ACAGCCCTCA CCTATGACCC CTATGTAAAC121 TACTCCTCCC GCCATACCAT AACCCAGCCC TTCTCCTACC ACTCCCGCTA CTTTACCCCC181 AAACCTGTCC TAGATTCCAC TATTGATTAC TTCCAACCAA ACAACAAAAG AAATCAGCTG241 TGGCTGAGAC TACAAACTGC TGGAAATGTA GACCACGTAG GCCTCGGCAC TGCGTTCGAA301 AACAGTATAT ACGACCAGGA ATACAACATC CGTGTAACCA TGTATGTACA ATTCAGAGAA361 TTTAATCTTA AAGACCCCCC ACTTAACCCT TAA
权利要求
1.一种截短表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白抗原，其特征是利用原核表达系统克隆表达猪圆环病毒2型(PCV-2)衣壳蛋白基因(Cap)羧基端393bp部分，表达的产物经纯化后用作诊断PCV感染的抗原，Cap基因被截短，只保留靠近羧基端393bp部分，并在大肠杆菌中表达。
2.一种上述的截短表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白抗原的应用，该截短的重组衣壳蛋白抗原可应用于琼扩诊断技术(AGIP)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)，免疫荧光抗体检测(IF)及免疫印渍试验(Western Blot)。
3.一种截短表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白抗原的应用，该截短的重组衣壳蛋白抗原可应用于检测猪圆环病毒感染后产生的抗体。
4.一种截短表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白的应用，体外表达该截短的重组衣壳蛋白可用于制备抗猪圆环病毒感染的亚单位疫苗。
全文摘要
截短表达的猪圆环病毒II型衣壳蛋白抗原及其应用。PCV－2基因组含ORF1和ORF2，ORF1编码病毒的复制酶，ORF2编码病毒衣壳蛋白，也是研究诊断和疫苗的唯一靶抗原。本发明利用原核表达系统克隆表达PCV－2衣壳蛋白基因(Cap)羧基端393bp部分，表达的产物经纯化后用作诊断PCV感染的抗原或制备亚单位疫苗。经用PCV阳性血清检测，表达的部分衣壳蛋白具有良好的抗原反应性，可作为诊断抗原应用于琼扩诊断技术，酶联免疫吸附试验，斑点酶联免疫吸附试验，免疫荧光检测等检测PCV－2感染产生的抗体，此外，表达的衣壳蛋白可进一步配以佐剂制备亚单位疫苗。
文档编号A61K39/12GK1458167SQ0313241
公开日2003年11月26日 申请日期2003年6月2日 优先权日2003年6月2日
发明者童光志, 韩凌霞, 陈艳, 崔尚金, 王云峰, 仇华吉 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所