专利名称：可调控的肿瘤活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种肿瘤活疫苗，具体涉及一种其安全性和免疫效应可调控的肿瘤活疫苗及其制备方法。
肿瘤疫苗(Cancer Vaccine)的提出已有100余年的历史。通过体外制备各种形式的肿瘤疫苗注射到肿瘤患者体内，能使机体T淋巴细胞致敏、活化，生成肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，专一性地结合并杀伤肿瘤细胞。肿瘤疫苗种类众多，大致可分为基因修饰的疫苗；抗独特型抗体疫苗；DNA疫苗和树突状细胞疫苗等。目前，对于树突状细胞疫苗的研究成果最为引人注目。
树突状细胞(dendritic cells，DC)是机体免疫系统中功能最强的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APC)，高表达MHCI、MHCII类分子、共刺激分子和粘附分子，能有效摄取、加工和提呈肿瘤抗原，激发T细胞增殖，诱导CTL对肿瘤的杀伤作用。因而DC在以细胞免疫为主的抗肿瘤反应中有着举足轻重的地位。迄今为止，DC疫苗已在恶性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌等的实验研究和临床I、II期试验中取得了结果。DC疫苗包括(1)、肿瘤抗原肽修饰或抗原基因转染的DC；(2)、肿瘤细胞提取物致敏DC；(3)、肿瘤细胞总RNA冲击DC；(4)、凋亡肿瘤细胞刺激DC；(5)、肿瘤细胞与DC的融合细胞疫苗等。其中融合疫苗可表达来源于DC和肿瘤细胞表面的全部标志物，能显著增强疫苗的免疫原性，诱导宿主产生强烈的抗肿瘤免疫应答，为当今肿瘤免疫基因治疗的一大热点。
目前绝大多数肿瘤的特异性肿瘤抗原仍不明确，且针对单一抗原的治疗往往效果不佳，因而将DC与肿瘤细胞融合作为疫苗，产生针对全部抗原的免疫反应，为肿瘤的治疗提供了一条捷径。Gong等的研究表明，人卵巢癌与人DC融合细胞能表达CA-125抗原和源于DC的MHC-II分子、共刺激分子，有效地刺激T细胞增殖，引起并CTL肿瘤杀伤反应，导致肿瘤消退。
自杀基因是来自某些病毒或细菌的基因，可编码特定的酶，正常哺乳动物细胞缺乏这种基因。如果将自杀基因导入靶细胞中，可使无毒性的前体药物转化为细胞毒性代谢产物从而导致靶细胞死亡。常用的自杀基因系统有HSV1-TK/GCV、CD/5-FC及TK/CD双自杀基因等。
各种肿瘤疫苗的实验和临床研究表明，肿瘤疫苗在抗肿瘤方面有广阔而良好的应用前景。但携带肿瘤抗原的肿瘤疫苗回输体内后存在潜在的致瘤性问题，也是始终是人们所关注的疫苗安全性问题。既往的研究通常将疫苗在体外经60Co照射或是丝裂霉素灭活处理，即以死疫苗回输体内，目的在于降低由疫苗引起肿瘤生长的可能。这样同时也降低了疫苗的抗原性，刺激机体产生的免疫效应较活瘤苗所形成的弱而短暂。肿瘤活疫苗能够持久有效地刺激机体产生强烈的抗肿瘤免疫效应，这与安全性之间地矛盾就亟待解决。
本发明将自杀基因系统引入到肿瘤活疫苗，籍此来调控肿瘤活疫苗的安全性和免疫效应。本发明以细胞因子诱导大鼠骨髓前体细胞获得树突状细胞，并加以纯化和扩增；再与已转导有自杀基因的肿瘤细胞融合制成活疫苗。所述疫苗在进入体内时为活疫苗，在完成活疫苗的作用后可接受自杀基因的控制而死亡，既可杜绝活疫苗在体内持续生长所导致的不良影响，又可象一般疫苗一样细胞解体，从而彻底释放免疫物质。
所述的自杀基因系统是HSV1-TK/GCV、CD/5-FC及TK/CD双自杀基因。
所述的肿瘤活疫苗包括树突状细胞疫苗，基因修饰的疫苗，DNA疫苗和抗独特型抗体疫苗，优选是妇科肿瘤活疫苗，最优选是卵巢癌肿瘤活疫苗。
本发明通过下述技术方案和步骤进行
(1)、树突状细胞分离、培养和生物免疫特性鉴定从大鼠骨髓前体细胞中分离树突状细胞，再体外以细胞因子诱导并扩增树突状细胞；流式细胞仪和激光共聚焦进行表型鉴定；采用本领域常规的实验方法检测其免疫功能，包括LDH释放法检测CTL活性、3H渗入法检测混合淋巴细胞反应和RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法检测细胞因子IFN-γ。
(2)、以逆转录病毒或腺病毒为载体介导自杀基因转导入肿瘤细胞。
(3)、以PEG法将树突状细胞与转导有自杀基因的肿瘤细胞相融合。
(4)、体外给予自杀基因的底物，控制活疫苗在体内的存活状态。
本发明从F344大鼠股骨骨髓中分离出单核细胞，再以GM-CSF、IL-4诱导并大量扩增出树突状细胞，每只大鼠可获树突状细胞5～10×107×107；倒置显微镜下逐日观察树突状细胞生长状态；Gimsa染色、免疫组化和扫描、透射电镜显示典型树突状细胞形态；荧光标记抗体流式细胞仪作树突状细胞表型鉴定，结果显示树突状细胞未成熟时表面抗原低表达，成熟时高表达MHC class II、共刺激分子和粘附分子。混合淋巴细胞反应证实培养第6天的F344大鼠的树突状细胞能轻度刺激T细胞增殖；而培养第9天的树突状细胞促进T细胞增生的能力大幅度提高，差异显著。
本发明以本领域常规使用的逆转录病毒为载体将自杀基因TK基因或腺病毒为载体将自杀基因CD转导入F344大鼠卵巢癌细胞株NUTU-19，筛选出稳定的阳性克隆。阳性克隆经RT-PCR、WesternBlot、MTT法鉴定证实转导有TK基因或CD基因，且能够被HSV1-TK的底物GCV或Cd的底物5-FC高效地杀伤。
将培养至第8-10天的树突状细胞与NUTU-19用PEG法融合，经流式细胞仪、激光共聚焦和荧光显微镜证实获得双阳性的树突状细胞与肿瘤融合细胞。融合细胞经RT-PCR、Western Blot、MTT法鉴定证实也转导有TK基因或CD基因，且能够被HSV1-TK的底物GCV或CD的底物5-FC高效地杀伤。以LDH释放法检测CTL活性、3H渗入法检测混合淋巴细胞反应和RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法检测细胞因子IFN-γ，以此证实融合疫苗能有效提高免疫功能。
以NUTU-19腹腔接种和皮下接种F344大鼠均获得类似人卵巢癌的病程经过，并经病理证实为上皮性卵巢癌。将融合活疫苗以一周为间隔二次免疫F344大鼠，一周后皮下接种肿瘤细胞NUTU-19，观察疫苗对抗肿瘤攻击的保护性作用。实验组在接种肿瘤细胞后一周再腹腔给予自杀基因的底物，观察肿瘤的生长状态。结果显示，实验组大鼠的肿瘤发生时间晚，肿瘤体积小，大鼠的生存期明显延长，证实本发明疫苗对抗肿瘤攻击有保护性作用。
图5是激光共聚焦显示融合细胞为双阳性，图6是树突状细胞Gimsa染色，图7是荧光显微镜显示融合细胞为双阳性。
复苏逆转录病毒包装细胞TK/VPC，传代后，取携带有TK基因的逆转录病毒上清液与F344大鼠卵巢癌细胞株NUTU-19共孵育，3天后G418筛选，克隆形成后转板、扩增。阳性克隆经RT-PCR、WesternBlot、MTT法鉴定证实有TK基因整合，且能够被HSV1-TK的底物GCV高效地杀伤。
将培养至第8-10天的树突状细胞与NUTU-19用PEG法融合。融合前NUTU-19经的红色荧光染料Dil染色，融合后的融合细胞在以绿色荧光FITC标记的抗MHC class II抗体OX6标记。融合细胞经流式细胞仪、激光共聚焦和荧光显微镜证实为双阳性细胞。融合细胞经RT-PCR、Western Blot、MTT法鉴定证实有TK基因整合，且能够被HSV1-TK的底物GCV高效地杀伤。以LDH释放法检测CTL活性、3H渗入法检测混合淋巴细胞反应和RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法检测细胞因子IFN-γ，结果均提示融合疫苗能有效提高免疫功能。
动物实验共6组，每组6只分为融合活疫苗加GCV组、融合活疫苗、灭活的融合疫苗组、DC和NUTU-19分别注射组、空白对照组、GCV对照组。疫苗均从双足垫皮下免疫F344大鼠，每周一次，共两次。免疫后一周皮下接种肿瘤细胞NUTU-19，观察疫苗对抗肿瘤攻击的保护性作用。实验组与GCV对照组在接种肿瘤细胞后一周再腹腔给予HSV1-TK的底物GCV，继续观察肿瘤的生长状态。结果显示，实验组大鼠的肿瘤发生时间晚，肿瘤体积小，大鼠的生存期明显延长。
表1是树突状细胞促进T细胞增生结果。表1DC∶Tc＝1∶10SamGroupSI(Xple Cpm(X±SD)(n) ±SD)2347.83±431.21±DC(第6天)123.76 0.23DC(第10天) 12 15976.67±1034.7*9.49±0.68**与6dDC相比，p＜0.01。
实施例2从F344大鼠股骨骨髓中分离出单核细胞，以双蒸水溶解红细胞，接种24孔板，每孔加mrGM-CSF、mrIL-4，隔天半量换液，培养8-10天，每只大鼠可获树突状细胞5～10×107；倒置显微镜下观察到典型的树突状细胞成集落生长；Gimsa染色、免疫组化和扫描、透射电镜显示典型树突状细胞形态。荧光标记抗体流式细胞仪作树突状细胞表型鉴定，结果显示树突状细胞未成熟时表面抗原低表达OX6(MHCclass II)为45.22％，B7-2为32.76％；成熟时高表达OX6为89.21％，B7-2为56.33％。以腺病毒为载体将自杀基因CD转导入F344大鼠卵巢癌细胞株NUTU-19，筛选出阳性克隆后转板、扩增。克隆经RT-PCR、Western Blot、MTT法鉴定证实有CD基因软染成功，且能够被CD的底物5-FC高效地杀伤。
将培养至第8-10天的树突状细胞与转到有CD的NUTU-19用PEG法融合。融合前NUTU-19经的红色荧光染料Dil染色，融合后的融合细胞在以绿色荧光FITC标记的抗MHC class II抗体OX6标记。融合细胞经流式细胞仪、激光共聚焦和荧光显微镜证实为双阳性细胞。融合细胞经RT-PCR、Western Blot、MTT法鉴定证实也有CD基因整合，且能够被CD的底物5-FC高效地杀伤。以LDH释放法检测CTL活性、3H渗入法检测混合淋巴细胞反应和RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法检测细胞因子IFN-γ，结果均提示此融合疫苗能有效提高免疫功能。
动物实验共6组，每组6只分为融合活疫苗加GCV组、融合活疫苗、灭活的融合疫苗组、DC和NUTU-19分别注射组、空白对照组、GCV对照组。疫苗免疫F344大鼠，每周一次，共两次。免疫后一周腹腔接种肿瘤细胞NUTU-19，观察疫苗对抗肿瘤攻击的保护性作用。
实验组与GCV对照组在接种肿瘤细胞后一周再腹腔给予HSV1-TK的底物GCV，继续观察肿瘤的生长状态。结果显示，实验组大鼠的生存期明显延长(P＜0.1)。
权利要求
1.可调控的肿瘤活疫苗，其特征是将自杀基因系统引入到肿瘤活疫苗，调控肿瘤活疫苗安全性和免疫效应。
2.按权利要求1所述的可调控的肿瘤活疫苗，其特征是所述的自杀基因系统是HSV1-TK/GCV、CD/5-FC及TK/CD双自杀基因。
3.按权利要求1所述的可调控的肿瘤活疫苗，其特征是所述的自杀基因系统是HSV1-TK/GCV自杀基因。
4.按权利要求1所述的可调控的肿瘤活疫苗，其特征是所述的自杀基因系统是CD/5-FC自杀基因。
5.按权利要求1所述的可调控的肿瘤活疫苗，其特征是所述的肿瘤活疫苗包括树突状细胞疫苗，基因修饰的疫苗，DNA疫苗和抗独特型抗体疫苗。
6.按权利要求1所述的可调控的肿瘤活疫苗，其特征是所述的肿瘤活疫苗是妇科肿瘤活疫苗。
7.按权利要求1所述的可调控的肿瘤活疫苗，其特征是所述的肿瘤活疫苗是卵巢癌肿瘤活疫苗。
8.按权利要求1所述的调控肿瘤活疫苗的方法，其特征是通过下述技术方案和步骤进行(1)、树突状细胞的分离、培养和生物免疫特性鉴定；(2)、以逆转录病毒或腺病毒介导自杀基因转导入肿瘤细胞；(3)、PEG法将树突状细胞与转导有自杀基因的肿瘤细胞融合；(4)、体外给予自杀基因的底物，控制活疫苗体内存活状态。
9.按权利要求7所述的调控肿瘤活疫苗的方法，其特征是所述的自杀基因的底物，其中HSV1-TK的底物是GCV，CD的底物是5-FC。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种安全性和免疫效应可调控的肿瘤活疫苗及其制备方法。本发明将自杀基因系统引入肿瘤活疫苗，所述疫苗在进入体内时为活疫苗，在完成活疫苗的作用后可接受自杀基因的控制而死亡，既杜绝活疫苗在体内持续生长所导致的不良影响，又可象一般疫苗细胞解体，彻底释放免疫物质。动物实验结果显示，本发明使实验动物肿瘤发生时间晚，体积小，实验动物生存期明显延长，证实本发明疫苗对抗肿瘤攻击有保护性作用，能调控肿瘤活疫苗的安全性和免疫效应。
文档编号A61K48/00GK1476900SQ03141560
公开日2004年2月25日 申请日期2003年7月10日 优先权日2003年7月10日
发明者徐丛剑, 康玉 申请人:复旦大学附属妇产科医院