用于预防再狭窄的血液相容性涂层的制剂、方法和应用的制作方法

专利名称：用于预防再狭窄的血液相容性涂层的制剂、方法和应用的制作方法
发明详述本发明涉及多糖的应用，所述多糖含有用于制备医疗器械血液相容表面的糖构件N-酰基葡糖胺，还涉及用所述多糖进行表面血液相容涂层的方法，以及采用该血液相容表面的医疗器械。
在人体中，血液仅在损伤的情况下才与自然的血管内面以外的表面接触。因此，如果血液与外来的表面接触，血液凝血系统总是被激活，以减少出血并且防止威胁生命的血液流失。由于植入体也具有外来的表面，所有接受与血液永久接触的植入体的患者，在与血液接触期间，都使用抑制血液凝血的被称为抗凝血药物的药物进行治疗，因此必须部分考虑显著的副作用。
当应用被称为支架的导管支持器时，所述的血栓形成的危险，也作为供血血管中的危险因素之一随之发生。在由于例如动脉硬化，特别是冠状动脉的变化，使血管狭窄和封闭的情况下，支架被用于血管壁的扩张。它被固定在血管中被钙化的片段，来改善血管内的血液流动性，因为它使血管内部空间的表面变光滑。另外，支架产生对被扩张的血管部分的弹性回缩力的支撑力。它所用材料通常是医用不锈钢。
在心脏导管实验室中，低于百分之一的病例中发生以早期血栓形成的形式的支架血栓形成，而在住院恢复期中百分之二至五的病例中发生支架血栓形成。介入治疗引起的血管损伤的大约百分之五是由于动脉阻塞而导致的，并且由血管扩张引起假性动脉瘤的可能性也是存在的。另外，作为抗凝血药物的肝素的连续应用增加了出血的危险。
另一种经常发生的并发症是血管的再狭窄、再封闭。虽然支架将血管被重新封闭的危险减至最低程度，但至今它们仍不能够完全阻止再狭窄。在支架植入后再狭窄的发生率为大于30％，是患者再次到医院就诊的主要原因之一。
再狭窄确切概念的叙述在专业文献中未见报道。最常采用的形态学的再狭窄的定义是，在成功地PTA(经皮经腔的血管成形术)后，再狭窄被定义为血管直径缩小到正常的50％以下。这是以经验为主的定义值，它的血液动力学相关性，以及它与临床症状的联系缺乏大量的科学基础。在实践中，患者临床上的加重，经常被视作以前治疗过的血管部分的再狭窄信号。
在支架植入时引起的血管损伤引起炎症反应，它对于在第一个七天内的愈合过程起了重要作用。在此发生的过程还与生长因子的释放相关联，由此导致平滑肌细胞的增殖加强，并且由于不受控制的生长使血管在短期内再狭窄和重新封闭。还有几周后，在支架生长到血管组织中并且完全被平滑肌细胞围绕时，瘢痕形成可以是突出的(新内膜增生)，其不仅导致支架表面的覆盖而且导致支架的全部内部空间的封闭。
有人曾徒劳地试图通过用肝素的支架涂层来解决再狭窄的问题(J.Whrle等人，European Heat Journal(2001)22，1808-1816)。肝素作为抗凝血药物只不过是提到的第一个原因，而且肝素仅在溶液中才能够发挥其全部作用。所述第一个问题通过同时的抗凝血剂的药物应用几乎可以全部避免。现在正试图通过抑制位于支架上的平滑肌细胞的生长解决另一个问题。这是通过例如放射性支架或含有药物活性物质的支架来进行的。
因此，存在对非凝血酶原的、血液相容的材料的需要，它不被识别作为外表面，并在与血液接触的情况下不激活凝血系统和不导致血液凝结，这样对于再狭窄激发过程的一个重要因素被消除。支持器通过活性物质的添加应该保证抑制炎症反应或者应控制伴随愈合过程的细胞分裂。
在致力于能够如此减少再狭窄或全部消除再狭窄的支架方面，道路是艰辛的。其中不同的实施可能性被在大量的研究中进行检验。最普通的实施方案由使用适合的基质(通常为生物稳定的聚合物涂覆)的支架组成。该类基质包括抗增殖的或消炎的活性物质，它以受控的时间步骤释放，并且应抑制炎症反应和过度的细胞分裂。
美国专利US-A-5 891 108揭示了例如中空造型的支架，在其内部可以含有药物活性物质，它可以通过支架中的大量出口被释放。而欧洲专利EP-A-1 127 582叙述了一种在其表面有深度为0.1～1mm和长度7～15mm的沟的支架，它适合于作为活性物质的供给器具。与中空的支架出口相似，该活性物质储存器以精确地高浓度和相对长的时间周期释放含有的药物活性物质，它导致的事实是，平滑肌细胞再也不能或仅可以非常延迟地包住支架。因而，支架更长期地处于血液中，直至血栓形成再导致增加血管的封闭(Liistro F.，Colombo A.，Lateacute thrombosis after Paclitaxel eluting stent implantation.Heart(2001)86 262-4)。
一种解决该问题的方法是使用生物相容性的磷酸胆碱涂层(WO0101957)，此种磷酸胆碱，即红细胞细胞膜的一种成分，能在支架上作为涂覆的生物不可降解的聚合物层的成分而形成一个非凝血酶原的表面。在此取决于其分子量，活性物质被含有磷酸胆碱层的聚合物吸收或在表面被吸收。
本发明的目的是提供具有血液相容性涂覆的医疗器械以及用于血液相容性涂层的方法和血液相容性涂覆的医疗设备的应用，特别是支架，以防止或减少不希望的反应，如再狭窄。
本发明的目的特别是提供支架，它允许支架的连续受控的不长入，一方面借助经挑选的药剂和药剂组合物在植入后最初几天和几周对细胞反应的抑制，另一方面通过提供非凝血酶原的惰性的或生物相容性的表面，以保证随着药剂影响的减少不存在对外源表面的反应，该反应在较长的期间内亦可以导致并发症。
在血管血液一侧建立自然的非凝血酶原条件的接近完美的模拟是很困难的。欧洲专利EP-B-0 333 730叙述了用非凝血酶原内皮细胞表面多糖(HSI)的隐窝、粘连和/或修饰和锚定来生产血液相容性底物的方法。在生物学或人造表面上固定这种特异性内皮细胞表面硫酸乙酰蛋白肝素HSI使这样的经涂覆的表面与血液相容并适合于长期的血液接触。而不利方面是，对于HSI的该制备方法是以内皮细胞的培养为前提的，结果是该方法的经济适用性受到极大的限制，因为内皮细胞的培养是费时的，并且大量培养的内皮细胞只有用巨大的费用才可获得。
本发明通过提供具有某些多糖和紫杉醇表面涂层的医疗器械用来解决该问题。代替或者与紫杉醇一起的某些其它消炎以及抗炎药物分别为下述药剂组合物辛找他汀、2-甲基噻唑烷-2，4-二羧酸和相应的钠盐、大环低氧化物(MCS)及其衍生物、酪氨酸磷酸化抑制剂、D24851、胸腺素a-1、白细胞介素-1β抑制剂、活性蛋白质C(aPC)、MSH、延胡索酸和延胡索酸酯、PETN(季戊四醇四硝酸酯)、PI88、皮西丁蛋白、浆果赤霉素及其衍生物、克癌易(Docetaxel)和紫杉醇进一步的衍生物、他克莫司(tacrolimus)、pimecrolimus、曲匹地尔、α和β-雌二醇、sirolimus、秋水仙素、以及可以使用的促黑素细胞激素(α-MSH)。该血液相容性表面的生产方法在权利要求20～31中给出。优选的实施方案可在附属权利要求、实施例以及附图中找到。
本发明的主题是医疗器械，其表面至少部分地用血液相容层覆盖着，其中血液相容层包含至少一种式I的化合物式I 其中n是4～1050之间的整数，并且Y表示残基-CHO、-COCH3、-COC2H5、-COC3H7、-COC4H9、-COC5H11、-COCH(CH3)2、-COCH2CH(CH3)2、-COCH(CH3)C2H5、-COC(CH3)3、-CH2COO-、-C2H4COO-、-C3H6COO-、-C4H8COO-。
使用式I的任何盐类化合物也是可能的。可以将血液相容层直接涂覆到优选非血液相容性医疗器械的表面上或者附着在其它生物稳定和/或生物可降解层上。进一步在血液相容层上可以具有其它的生物稳定的和/或生物可降解的和/或血液相容层。除此之外，活性剂紫杉醇的血液相容层位于若干血液相容层之上、之间和/或之下。活性剂(紫杉醇)在此可以在血液相容层之上或之下形成自己的活性剂层，以及/或者可以将其加入到至少生物稳定、生物可降解和/或血液相容层之一中。优选采用通式I的化合物，其中Y为下述基团之一-CHO、-COCH3、COC2H5或-COC3H7。进一步优选的基团是-CHO、-COCH3、COC2H5，特别优选的基团是-COCH3.
通式I的化合物仅含有少部分游离氨基。因为用茚三酮反应不能检出游离氨基的事实，根据该测试的灵敏度，它可以意味着，少于2％的全部-NH-Y基团作为游离氨基存在，优选的少于1％，而更优选的少于0.5％，即，在该-NH-Y基团Y的低百分比之内的代表氢。
因为通式I的多糖含有羧基和氨基，因而该通式涵盖了对应多糖的碱金属以及碱土金属盐类。碱金属盐类，如钠盐、钾盐、锂盐或碱土金属盐类如镁盐或者钙盐。此外可以与氨形成伯胺、仲胺、叔胺和季胺、吡啶和吡啶衍生的铵盐，优选为烷基铵盐类和吡啶盐类。与多糖形成盐类的碱类，是无机和有机碱类，例如NaOH、KOH、LiOH、CaCO3、Fe(OH)3、NH4OH、氢氧化四烷基铵和类似的化合物。
根据公式I的多糖具有从2kD到15kD的分子量，优选为4kD～43kD，更优选为6kD～12kD，最优选为8kD～11kD。变量n是4～1050之间的整数。优选的n为9～400的整数，更优选的为14～260的整数，最优选的为19～210的整数。
通式I显示的是双糖，它应被视为是所用的多糖的基本单元并通过基本单元的n倍(许多)先后连接形成多糖。由两个糖分子组成的基本单元不能以通式I仅包括具有偶数数量的糖分子的多糖的方式被理解。该结构式当然也包括具有奇数数量的糖构成单元的多糖。多糖的末端基团由羟基表示。
特别优选的医疗器械，在其表面上直接含有由根据结构式I的化合物和其上的紫杉醇层组成的血液相容层。紫杉醇层可以部分地扩散到血液相容层中或者被血液相容层全部吸收。
如果至少一层生物稳定层存在于血液相容层之下，则是更优选的。另外，血液相容层可以用至少一层以上位于上层的生物稳定和/或生物可降解层，全部和/或部分涂覆。优选的是外部生物可降解或血液相容层。
更优选的实施方案在血液相容层之下或在生物稳定和血液相容层之间含有紫杉醇层，以致紫杉醇通过血液相容层缓慢地被释放。紫杉醇可以在血液相容层和/或生物稳定和/或生物可降解层之中和/或之上共价结合和/或粘附结合，其中优选为粘附结合。
可以用于生物可降解层的生物可降解物质如下聚戊内酯、聚-ε-癸内酯、聚内酯酸、聚乙醇酸、聚交酯、聚乙交酯、聚交酯和聚乙交酯的共聚物、聚-ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、羟基丁酸酯-戊酸酯共聚物、聚(1，4-二噁烷-2，3-二酮)、聚(1，3-二噁烷-2-酮)、聚-对-二噁烷酮、聚酐类如聚马来酸酐、聚羟基甲基丙烯酸酯、血纤维蛋白、聚氰基丙烯酸酯、聚己内酯二甲基丙烯酸酯、聚-b-马来酸、聚己内酯丁基丙烯酸酯、例如由寡己内酯二醇和寡二噁烷酮二醇产生的多嵌段聚合物、聚醚酯多嵌段聚合物如PEG和聚(亚丁基对苯二甲酸酯)、Polypivotolatone、聚乙醇酸三甲基碳酸酯、聚己内酯-乙交酯、聚(g-谷氨酸乙酯)、聚(DTH-亚氨基碳酸酯)、聚(DTE-共-DT-碳酸酯)、聚(双酚-A-亚氨基碳酸酯)、聚原酸酯、聚乙醇酸三甲基碳酸酯、聚碳酸三甲酯、聚亚氨基碳酸酯、聚(N-乙烯基)-吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚酰胺酯、甘醇化聚酯、多磷酸酯、聚磷腈、聚[(对-羧基苯氧基)丙烷]、多羟基戊酸、聚酐类、聚环氧乙烷-环氧丙烷、软聚氨基甲酸酯、在主链上有氨基酸残基的聚氨基甲酸酯、聚醚酯类如聚环氧乙烷、聚烯烃草酸酯、聚原酸酯类以及它们的共聚物、类脂、角叉菜聚糖类、血纤维蛋白原、淀粉、胶原蛋白、基于蛋白质的聚合物、聚氨基酸、合成的聚氨基酸、玉米醇溶蛋白、修饰过的玉米醇溶蛋白、聚羟基链烷酸酯、果胶酸、肌动蛋白酸、修饰过的和未修饰过的血纤维蛋白和酪蛋白、羧甲基硫酸酯、清蛋白，加之透明质酸、脱乙酰壳多糖和其衍生物、硫酸乙酰肝素和其衍生物、肝素、硫酸软骨素、葡聚糖、b-环糊精、PEG和聚丙二醇的共聚物、阿拉伯树胶、瓜尔胶、明胶、胶原蛋白、胶原蛋白-N-羟基琥珀酰亚胺、脂质、磷脂、上述物质的修饰物和共聚物和/或混合物。
可以用于生物稳定层的生物稳定物质如下聚丙烯酸和聚丙烯酸酯类如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、聚酰胺、聚醚酰胺、聚乙胺、聚酰亚胺、聚碳酸酯、聚碳氨基甲酸酯、聚乙烯基甲酮类、聚乙烯卤化物、聚亚乙烯卤化物、聚乙烯醚、聚异丁烯、聚乙烯芳香酯、聚乙烯酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚甲醛、聚四氢呋喃、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氨基甲酸酯、聚醚型氨基甲酸酯酯、硅氧烷聚醚型氨基甲酸酯酯、硅氧烷聚氨基甲酸酯、硅氧烷-聚碳酸酯-氨基甲酸酯、聚烯烃弹性体、聚异丁烯、EPDM树胶、氟硅氧烷、羧甲基脱乙酰壳多糖、聚芳基醚酮醚、聚醚酮醚、聚对苯二甲酸亚乙酯、聚戊酸酯、羧甲基纤维素、纤维素、嫘萦、嫘萦三乙酸酯、纤维素硝酸酯、纤维素乙酸酯、羟乙基纤维素、纤维素丁酸酯、纤维素乙酸酯丁酸酯、乙基乙烯基乙酸酯共聚物、聚砜、环氧树脂、ABS树脂、EPDM树胶、硅氧烷，如聚硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、聚乙烯卤化物及共聚物、纤维素醚、纤维素三乙酸酯、脱乙酰壳多糖以及这些物质的共聚物和/或混合物。
用具有在此披露的血液相容表面装备任何医疗器械，尤其是对于适合于短期或长期与血液或血液产品接触的那些，是可能的。上述的医疗器械是例如假体、器官、组织、主动脉、心脏瓣膜、管、器官的零件、植入体、纤维、中空纤维、支架、中空的针、注射器、膜、保藏容器、血液容器、滴定板、心脏起博器、吸附介质、层析介质、层析柱、透析器、连接部件、传感器、瓣膜、离心室、热交换器、内镜、过滤器、泵室。本发明特别涉及支架。
式I的多糖可以由肝素和/或硫酸乙酰肝素形成。这些物质是在结构形式上十分相似的化合物。硫酸乙酰肝素在哺乳动物的细胞表面上是普遍存在的。根据细胞的类型，它们在分子量、乙酰化程度和硫酸化程度上非常不同。例如，来自肝的硫酸乙酰肝素显示出大约50％的乙酰化系数，而来自内皮细胞的糖萼的硫酸乙酰肝素可以显示出大约90％和更高的乙酰化系数。肝素仅显示出约5％的乙酰化系数。来自肝的硫酸乙酰肝素和肝素的硫酸化系数是每个二糖单元约至2，在来自内皮细胞的硫酸乙酰肝素的情况下接近于0，在来自其它细胞类型的硫酸乙酰肝素中是每个二糖单元为0～2。
通式I的化合物的特征在于，每个二糖单元中硫酸基团的量少于0.05。进一步在该化合物中游离氨基的量基于全部-NH-Y基团少于1％。
下图展示了肝素或硫酸乙酰肝素的四糖单元，如肝素的一般情况，它具有硫酸基团的统计学分布并且具有每个二糖单元为2的硫酸化系数 所有硫酸乙酰肝素是与肝素的生物合成过程共同进行的。首先形成具有含有木糖结合区的核心蛋白质。它由木糖和与其连接的两个半乳糖残基构成。在最后两个半乳糖残基上，将葡糖醛酸和半乳糖胺交替连接，直到达到适当的长度为止。最后，进行全部硫酸乙酰肝素和肝素的共同多糖前体的若干步骤的酶修饰，继之以磺基转移酶和差向异构酶的方法，通过它们不同的转化完整性产生不同的硫酸乙酰肝素到肝素的宽谱。
肝素是分别由D-葡糖胺和D-葡糖醛酸或L-艾杜糖醛酸交替构成的，其中L-艾杜糖醛酸的量为75％。将D-葡糖胺和D-葡糖醛酸用β-1，4-糖苷酸连接或L-艾杜糖醛酸用α-1，4-糖苷酸连接与形成肝素亚基的双糖结合。再将这些亚基用β-1，4-糖苷的方法互相连接，产生肝素。磺酰基基团的位置是可变的。平均一个四糖单元含有4～5个硫酸基团。硫酸乙酰肝素，亦称为硫酸类肝素(Heparitinsulfat)，除来自肝的硫酸乙酰肝素外，与肝素相比，含有较少N-和O-连接的磺酰基基团，但替之以更多的N-乙酰基。与肝素比较，L-艾杜糖醛酸的量也较低。
根据

图1很明显的，通式的化合物(参阅作为实例的图1b)是与内皮细胞的天然硫酸乙酰肝素结构上相似的，但是避免了最初提及的内皮细胞硫酸乙酰肝素应用的缺点。
对于抗凝剂活性，某些五糖单元是起主要作用的，其可以在商业肝素制剂的大约每三个分子中发现。不同抗凝剂活性的肝素制剂可以使用特殊分离技术来生产。在高活性方面，例如通过抗凝血酶III亲和层析获得的制剂(“高亲和性”-肝素)，该活性序列在每个肝素分子中都会找到，然而，在“非亲和性”-制剂中没有特征性五糖序列，因而没有凝血活性抑制作用可以被检测到。借助与该五糖的相互作用，使抗凝血酶III的活性，凝血关键因子凝血酶的抑制剂，被基本上以指数倍提高(键合亲和性提高到2×103倍数)[Stiekema J.C.J.；ClinNephrology 26，Suppl.Nr 1，S3-S8，(1986)]。
将肝素的氨基几乎全部进行N-硫酸化处理或N-乙酰化处理。最重要的O-硫酸化位置是艾杜糖醛酸中的C2以及葡糖胺中的C6和C3。对于在细胞凝血途径上的五糖的活性，基本上由在C6上的硫酸基团起主要作用，在很少的比例上也由其它官能团起作用。
用肝素或硫酸乙酰肝素涂覆的医用植入体的表面通过涂层保持或者仅有条件地保持血液相容性。加到人工表面上的肝素或硫酸乙酰肝素以急剧的程度部分损失其抗凝血活性，其与由于抗凝血酶III与上述五糖的空间位阻现象所限制的相互作用有关。
因为该多阴离子物质的固定，在所有案例中观察到在肝素化表面上的血浆蛋白质的强烈吸附，这一方面抵消了肝素的、硫酸乙酰肝素的凝血抑制作用，而另一方面通过粘附了和因此经三级结构变化的血浆蛋白质(例如白蛋白、血纤蛋白原、凝血酶)以及其所粘附的血小板启动特异性凝血过程。
因此存在一种相互作用关系，一方面涉及到通过固定被限制的五糖单元与抗凝血酶III的相互作用，另一方面在医疗植入体的肝素、硫酸乙酰肝素层上发生血浆蛋白质的沉积，它导致涂层抗凝剂特性的损失并且甚至可以转向对立面，因为在几秒钟时间内发生的血浆蛋白质的吸附，导致抗凝表面的损失并且粘附的血浆蛋白质改变其三级结构，以致表面的抗凝血酶原性转向对立面，而产生凝血酶原的表面。意想不到的是，可以检测到，通式I的化合物，尽管与肝素，硫酸乙酰肝素的结构不同，可以一直显示出肝素的血液相容性质，另外在化合物的固定之后没有观察到显著的血浆蛋白质沉积，血浆蛋白质沉积意味着在凝血级链反应激活中的初始步骤。根据本发明的化合物在人造表面之上固定后也一直保持着其血液相容性质。
进一步地认为，肝素或硫酸乙酰肝素的硫酸基团对于与抗凝血酶III的相互作用是必需的，赋予了肝素或硫酸乙酰肝素抗凝作用。由于几乎完全脱硫酸化，化合物的硫酸基团去除到每个二糖单元的硫酸基团少于0.2，致使本发明的化合物不主动地抑制凝血，即抗凝血。
本发明通式的化合物可以通过将多糖首先基本上完全脱硫酸化，随后基本上完全N-乙酰化而由肝素或硫酸乙酰肝素产生。术语“基本上完全脱硫酸化”是指，脱硫酸化程度为90％以上，优选为95％以上，特别优选为98％以上。脱硫酸化系数可以根据指示游离氨基的所谓茚三酮试验测定。脱硫酸化的程度为用DMMB(二甲基亚甲蓝)不再获得有色反应。该色彩测试对于硫酸化多糖的指示是适合的，但是该检测的限度在技术文献中是不知道的。脱硫酸化可以通过例如在溶剂混合物中加热吡啶盐来进行。特别是DMSO、1，4-二噁烷和甲醇的混合物已经表明是有效的。
将硫酸乙酰肝素以及肝素借助完全水解进行脱硫酸化，接着再乙酰化。此后，用13C-NMR测定每个二糖单元的硫酸基团数量(S/D)。下面表1列出了关于肝素和已脱硫酸化的、再乙酰化的肝素(Ac-肝素)实例的这种结果。
表1用13C-NMR测试方法测定的肝素和Ac-肝素实例的每个二糖单元的官能团的分布
2-S、3-S、6-S硫酸基团分别在位置2、3、6NS 在氨基上的硫酸基团N-Ac 在氨基上的乙酰化基团NH2 游离氨基S/D 每个二糖单元的硫酸基团与在肝素中的大约2.5硫酸基团/二糖单元相比，在Ac-肝素中的硫酸盐含量大约0.03硫酸基团/二糖单元(S/D)是可重复获得的。
如上所述，在肝素或硫酸乙酰肝素中的硫酸基团含量上的差别，对于抗凝血酶III和所述化合物的抗凝血作用的活性方面具有重要的影响。它们的每个二糖单元硫酸基团的含量少于0.2，优选的少于0.07，更优选的少于0.05，尤其优选的每个二糖单元硫酸基团的含量少于0.03。
通过去除肝素的被认为是主动凝血抑制工作机理的硫酸基团，得到了适用于表面的血液相容的、凝血惰性的寡糖或多糖，它一方面在凝血过程中不具有主动作用，另一方面不被凝血系统作为外源表面而检测到。该涂层成功地模仿自然得到最高标准的血液相容性和相对于血液凝血的活性成分的钝化性。实施例3和4阐明，该表面，它用根据本发明的化合物涂覆，特别是共价涂覆，导致一种钝化的、非凝血酶原的和血液相容的涂层。这一点通过Ac-肝素的实施例明确地得到了证明。
基本上完全N-酰化是指N-酰化程度大于94％，优选大于97％，特别优选大于98％。酰化反应如此完全地进行，以致于用茚三酮反应对于游离氨基的检测不获得任何颜色反应。作为酰化剂优选使用羧酸氯化物、羧酸溴化物或羧酸酐。乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、乙酸氯化物、丙酸氯化物、丁酸氯化物是适合于制备根据本发明的化合物的实例。特别适合作为酰化剂的是羧酸酐。
作为溶剂，特别是用于羧酸酐的溶剂，使用去离子水，特别是与加入量为10～30体积百分比的助溶剂一起使用。适合作为助溶剂的是甲醇、乙醇、DMSO、DMF、丙酮、二噁烷、THF、乙酸乙酯和其它极性溶剂。在使用羧酸卤化物的情况下，优选使用极性无水溶剂，例如DMSO或DMF。
本发明的通式的化合物在糖分子的一半中具有羧酸酯基团而在另一半中包含N-酰基基团。
本发明叙述了通式I的化合物以及该化合物的盐类，作为涂层、特别是作为自然和/或人工表面的血液相容性涂层的应用。在“血液相容性的”方面，根据本发明的化合物的特征是指，不与凝血系统的物质或血小板相互作用，并且因此不会激发血液凝结的级链反应。
另外，本发明揭示了用于表面的血液相容涂层的多糖。优选的是在上面提及的分子量范围内的多糖。所用多糖的特征在于，其含有大量糖的构建单元N-酰基葡糖胺。这表示40～60％的糖构建单元是N-酰基葡糖胺，并且基本上剩余的每个糖构建单元具有羧基基团。在95％以上，优选的在98％以上的多糖中，多糖一般仅由两个糖的构建单元组成的，而一个糖的构建单元带有羧基基团并且另一个带有N-酰基基团。
多糖的一个糖的构建单元是N-酰基葡糖胺，优选的是N-乙酰基葡糖胺，并且对于另一个糖的构建单元，它是糖醛酸、葡糖醛酸和艾杜糖醛酸。
优选的是基本上由葡糖胺的糖组成的多糖，而糖构建单元的一半基本上带有N-酰基基团，优选的带有N-乙酰基基团，而葡糖胺构建单元的另一半带有直接通过氨基或者用一个或多个亚甲基基团连接的羧基基团。对于与氨基连接的所述羧酸基团优选为羧甲基或羧乙基基团。此外优选的多糖，其一半基本上由N-酰基葡糖胺组成，优选的是由N-乙酰基葡糖胺组成，同时另一半基本上由糖醛酸葡糖醛酸和艾杜糖醛酸组成。特别优选的是显示出N-酰基葡糖胺和两种糖醛酸之一的基本上交替的序列的多糖。
意想不到的是显示出对于根据本发明的应用，特别地脱硫酸化的和基本上N-酰化的肝素是特别适合的。N-乙酰化的肝素对于血液相容性的涂层是特别适合的。
术语“基本上”应当澄清，统计学的误差是被考虑进去的。糖构建单元的一个基本上交替序列意思是，一般是没有两个一样的糖构建单元互相连接，但是完全不排除上述缺陷连接。“基本上一半”是指几乎50％但允许少量变化，因为特别是对于用生物合成方法制备的大分子，理想的情况绝不会达到，某些变化总应被考虑到，因为酶不可能完美地工作，在催化方面总有某些错误率不得不被预计到。而对于天然的肝素，N-乙酰基葡糖胺和糖醛酸单元的严格交替序列是存在的。
此外揭示用于血液相容表面涂层的方法，它特别以直接的血液接触为目的。在使用该方法的情况下，提供了天然的和/或人工的表面并且将上述的多糖固定在该表面上。
多糖在所述表面上的固定可以借助与表面作用的疏水作用、范德华力、静电作用、氢键、离子作用、多糖的交联和/或共价键来完成。优选的是多糖的共价键(侧键(side-on)键合)，更优选的是共价的单点键(侧键键合)，最优选的是共价的端点键(端点(end-on)键合)。
在下面叙述了根据本发明的涂层方法。医疗器械生物的和/或人工的表面可以通过如下方法具有血液相容性涂层a)提供医疗器械的表面，和b)至少一种根据权利要求1的通式I的化合物作为血液相容性层涂覆于该表面上，和/或b’)生物稳定和/或生物可降解层涂覆于医疗器械的表面或血液相容性层上。
“涂覆”是指，用相应的化合物至少部分涂覆表面，其中将化合物沉积和/或固定或无论怎样锚定在下层表面之上和/或之中。
对“基本上剩余的糖构建单元”应理解为，糖构建单元的剩余的60～40％的93％，优选96％，更优选98％带有羧基基团。
优选准备未涂覆和/或非血液相容性的表面。“非血液相容性的”表面是指，可以激活血液凝结系统的表面，其或多或少是凝血原。
可替代的实施方案包括步骤如下a)提供医疗器械的表面，和b)至少涂覆一种本发明的根据式I的多糖，b’)涂覆生物稳定层于医疗器械表面上，和d’)进一步涂覆至少一种本发明的根据式I的多糖的血液相容性层。
即使例如在聚合物层和由此血液相容性外层的机械损坏的情况下，最后提到的实施方案确保表面涂层不丧失其血液相容特征。
“生物的或人工的”表面理解为人造医疗器械与人造部件的组合，例如带有人造心脏瓣膜的猪心脏。
单层优先地用浸渍或喷涂方法涂覆，然而也可以在涂覆医疗器械表面上的同时沉积紫杉醇，其就此分别在涂层中以共价键合和/或粘附结合的方式被包含。采用该方法，与血液相容性层涂覆于医疗器械表面上同时沉积活性物质紫杉醇是可能的。用于生物稳定或生物可降解层的物质已经在前面列举。
在此第一生物稳定和/或生物可降解或血液相容性层之上，可以进一步在非必须做的步骤c)中沉积紫杉醇活性物质层。在优选的实施方案中，将紫杉醇共价键合在下层上。亦优选通过浸渍或喷涂方法，将紫杉醇涂覆和/或沉积在血液相容性层或生物稳定层之上和/或之中。
在步骤b)或步骤c)之后，附加的步骤d)可以在血液相容性层或紫杉醇层上涂覆至少一个生物可降解层和/或至少一个生物稳定层。
相应于可替代的实施方案，可以在步骤b’)或步骤c)之后进行步骤d’)，其涂覆至少一种通式I的化合物于生物稳定和/或生物可降解层或紫杉醇层上作为血液相容性层。优选的是在步骤b’)后进行步骤d’)。
在步骤d)或步骤d’)之后，可以在至少一种生物可降解和/或生物稳定层或血液相容性层之中和/或之上进行紫杉醇的沉积。优选地将单层以及紫杉醇使用浸渍或喷涂方法涂覆和/或沉积于下层之上和/或之中。
根据优选的实施方案，将生物稳定层涂覆于医疗器械的表面上，并且完全或不完全地用与生物稳定层结合的(优选使用共价结合)血液相容性层覆盖。
优选地，血液相容性层由天然来源的肝素经区域选择性制备成不同硫酸化程度和酰化程度的衍生物组成，其分子量范围为对抗血栓形成活性有效的五糖至商购可得的肝素13kD，硫酸乙酰肝素及其衍生物、红细胞糖萼的寡糖和多糖、脱硫酸化的且再N-乙酰化的肝素、N-羧甲基化和/或部分N-乙酰化的脱乙酰壳多糖以及上述物质的混合物的标准分子量。
本发明的主题亦包括根据这里所述的方法之一涂覆血液相容性层的医疗器械。对于医疗器械优选为支架。
可以根据本发明的方法涂覆的传统的支架，由不锈钢、镍钛诺或其它金属和合金或者合成的聚合物构成。
将根据本发明的支架，用根据通式优选的共价结合的血液相容性层涂覆。第二层完全地或不完全地覆盖该第一血液相容性层。该第二层优选地与紫杉醇组成。支架的血液相容涂层一方面提供需要的血液相容性并由此减少血栓形成的危险，并同样遏制由于非内源性表面的侵入和存在而引起的炎症反应，而优选均匀地分布在支架的全部表面上的紫杉醇，以可控制的方法控制细胞的特别是平滑肌和内皮细胞的支架表面的生长，以使血栓形成反应和炎症反应的相互作用、生长因子的释放、在愈合过程中的细胞增生和迁移产生新的“修理过的”细胞层，它被称之为新血管内膜。
因而共价地或/和粘附地结合到下层或/和共价地或/和粘附地在至少一层中的紫杉醇的应用，保证该活性物质连续地且以小剂量地被释放，以至并不阻止支架表面的细胞生长，但是阻止了血管腔内细胞的过量生长和向内生长。这两种作用的组合赋予了根据本发明的支架在血管壁中快速融合同时减少再狭窄和血栓形成这二者的危险的能力。紫杉醇释放时间大约为1～12个月，优选为植入后1～3个月。
紫杉醇优选地包含在药物活性浓度为0.001～10mg/cm2的支架表面，更优选为0.01～5mg/cm2的支架表面，最优选为0.1～1.0mg/cm2的支架表面。其他的活性物质可以以相似的浓度包含在同一层或在血液相容性层中。
聚合物的应用量为0.01～3mg/层，优选为0.20～1mg/层，更优选为0.2～0.5mg/层。
这类经涂覆的支架可控制地且连续地释放活性物质紫杉醇，因此对于再狭窄的防止和减少是非常适合的。
具有血液相容涂层的上述支架如此制备，即准备好支架，并优选共价涂覆一层根据通式的血液相容性层，该层在活性物质释放和活性物质的影响衰退后永久地屏蔽植入体的表面。
根据本发明的支架的优选实施方案具有由至少两层组成的涂层。在此被称为第二层的是涂覆于第一层上的那一层。根据两层的设计，第一层是血液相容性层，它基本完全被由紫杉醇组成的以共价和/或粘附结合方式与第一层结合的第二层覆盖。
紫杉醇层被缓慢溶解，以使活性物质相应于溶解过程的速度释放。第一层的血液相容性层以活性物质被去除的程度保证支架必要的血液相容性。通过活性物质的释放，细胞在其上面的生长仅在特定的时间周期内被强烈地减弱，而使在外层已经普遍地降解的地方有目的地被控制的生长成为可能。最后，血液相容性层作为非凝血原性的表面保留，并且以这样一种方法屏蔽外源的表面，以致于没有危及生命的反应发生。
这类支架可以使用支架血液相容涂层的方法来生产，其方法基本如下a.支架的提供b.优选的共价结合的血液相容性层的涂覆c.通过浸渍或喷涂方法用抗增殖活性物质紫杉醇将血液相容性层基本完全覆盖。
根据本发明的支架既解决了在支架植入后急性血栓形成的问题，又解决了新血管内膜增生的问题。另外，本发明的支架因为其涂层特别地适用于连续释放一种或多种抗增生、免疫抑制活性物质。由于根据本发明经涂覆的支架具有以需要的量有目的地连续释放活性物质的能力，几乎完全防止了再狭窄的危险。
已经根据上述方法用上述多糖的血液相容性层涂覆的天然和/或人工表面，特别适合作为直接与血液循环系统和血液接触的植入体或器官替代部件，优选的是与抗增生活性物质联合的支架形式用于防止再狭窄，抗增生活性物质优选紫杉醇。
根据本发明经涂覆的医疗器械不仅特别适合于直接且永久的血液接触，而且也令人惊讶地显示出在此类涂覆的表面上减少或甚至防止蛋白质的粘附的特征。在血液接触下外源表面上血浆蛋白质的粘附，对于涉及血液系统识别和采取措施的进一步事件是基本的和初始的步骤。
例如，这在从体液的体外诊断中是很重要的。因而，本发明涂层的涂覆防止了或至少减少了例如在微滴定板或其它用于诊断检测方法的载体培养基上蛋白质的，非特异性粘附干扰通常敏感的测试反应并且可以导致分析结果的曲解。
通过在吸附介质或层析介质上应用根据本发明的涂层，亦防止或减少了蛋白质的非特异性粘附，因此可以实现较好的分离，同时可以获取较纯的产品。
附图简述
图1显示了具有硫酸基团的统计学分布的肝素或硫酸乙酰肝素的四糖单元，并且具有对于肝素典型的硫酸化系数2/二糖单元(图1a)。用于比较结构相似性，图1b显示了根据发明书中通式化合物的实例。
图2显示了在扩张的PVC管中，表面修饰过的不锈钢冠脉支架在血小板降低(PLT-降低)方面的影响。将未涂覆的不锈钢冠脉支架作为参照测量。在PVC管没有放置不锈钢冠脉支架的情况下血小板降低的水平被设定为零值。
因此，SH1是用肝素共价涂覆的支架，SH2是用硫酸软骨素涂覆的支架；SH3是用由红细胞糖萼获得的多糖涂覆的支架，而SH4是用Ac-肝素共价涂覆的不锈钢冠脉支架。
图3显示了用完全脱硫酸化并且再N-乙酰化的肝素(Ac-肝素)共价涂覆的支架和用红细胞糖萼的寡糖和多糖(红细胞糖萼的多糖)涂覆的支架与未涂覆支架和用聚丙烯酸(PAS)涂覆支架相比在植入猪体4周后的再狭窄率示意图。
图4定量冠脉血管造影通过含有支架的血管片段的横截面图像，其中一为用Ac-肝素涂覆支架(a.)，而另一为作为比较的未涂覆的支架(b.)。四周后，在动物实验(猪)中，可以观察到在形成的新血管内膜厚度方面明显不同。
图5来自支架(不含载体培养基)的紫杉醇洗提曲线图。
实施例实施例1脱硫酸化再乙酰化肝素的合成将100ml离子交换树脂IR-122阳离子交换树脂填充到直径2cm的柱中，用400ml 3M HCl转换为H+形式，之后用蒸馏水漂洗，直到洗出液不含氯化物且pH值呈中性。将1g肝素钠溶解在10ml水中，加载阳离子交换柱，之后用400ml水洗提。将洗出液滴加到有0.7g吡啶的容器中，此后用吡啶滴定至pH值为6，然后冷冻干燥。
将0.9g肝素吡啶盐与90ml DMSO/1，4二噁烷/甲醇的6/3/1混合物(v/v/v)一起加入到带有回流冷凝器的圆形烧瓶，之后于90℃加热24小时。然后加入823mg氯化吡啶，并于90℃另外加热70小时。随即用100ml水将其稀释，用经稀释的氢氧化钠滴定至pH值为9。将脱硫酸化的肝素用水渗析，然后冷冻干燥。
将100ml脱硫酸化的肝素溶解在10ml水中，冷却至0℃后，在搅拌下加入1.5ml甲醇。向该溶液中加入4ml OH-形式的Dowex 1×4阴离子交换树脂，此后加入150μl乙酸酐并且于4℃搅拌2小时。然后通过过滤去除树脂，将溶液用水渗析，然后冷冻干燥。
实施例2脱硫酸化N-丙酰化肝素的合成将100ml离子交换树脂IR-122阳离子交换树脂填充到2cm直径的柱中，用400ml的3M HCl转换为H+形式，之后用蒸馏水漂洗，直到洗出液不含氯化物且pH值呈中性。将1g肝素钠溶解在10ml水中，加载阳离子交换柱，之后用400ml水洗提。将洗出液滴加到有0.7g吡啶的容器中，此后用吡啶滴定至pH值为6，然后冷冻干燥。
将0.9g肝素吡啶盐与90ml DMSO/1，4二噁烷/甲醇的6/3/1混合物(v/v/v)一起加入到带有回流冷凝器的圆形烧瓶，之后于90℃加热24小时。然后加入823mg氯化吡啶，并于90℃另外加热70小时。随即用100ml水将其稀释，用经稀释的氢氧化钠滴定至pH值为9。将脱硫酸化的肝素用水渗析，然后冷冻干燥。
将100ml脱硫酸化的肝素溶解在10ml水中，冷却至0℃后，在搅拌下加入1.5ml甲醇。向该溶液中加入4ml OH-形式的Dowex 1×4阴离子交换树脂，此后加入192μl丙酸酐并且于4℃搅拌2小时。然后通过过滤去除树脂，将溶液用水渗析，然后冷冻干燥。
实施例3采用ISO 10933-4(体外研究)对根据通式的化合物的血液相容性的测定用于研究根据式I的化合物的血液相容性，将纤维素膜、硅管和不锈钢支架用根据式I的化合物共价涂覆，并且对比肝素以及对比相应的、在单独实验中使用的未涂覆的材料表面测定。
3.1.用脱硫酸化再乙酰化肝素(Ac-肝素)涂覆的纤维素膜(铜纺)用于研究在柠檬酸盐全血和Ac-肝素或肝素涂覆的铜纺膜之间的凝血生理相互作用，使用Sakariassen修饰的Baumgartner腔的开放灌注系统[Sakariassen K.S.等人；J.Lab.Clin.Med.102522-535(1983)]。该腔由四个构建部件同时加上密封圈和螺钉组成，它由聚甲基丙烯酸甲酯制造，允许两个经修饰的膜的平行检测，以使在每次运行中已经考虑了统计学覆盖率。该腔的结构允许准分层的灌注条件。
在37℃灌注5分钟后将膜取出，固定附着的血小板后测定血小板的占有率。相对于具有100％血小板占有率的作为阴性标准的高凝血酶原内皮下基质来确定各自的结果。在异源材料上血浆蛋白质层形成之后，血小板的粘附继发地发生。血浆蛋白质血纤蛋白原是作为血小板聚集的辅因子起作用。上述引起的血小板活化作用导致若干与凝血相关的血浆蛋白质，例如玻璃结合素、纤维结合素和在血小板表面的von Willebrand因子结合到血小板表面上。通过它们的影响，最终发生不可逆的血小板聚集。
由于上述相互作用，血小板占有率对于在异源表面接触血液的情况下的表面凝血酶原性呈现已被公认的量，可接受的数量。从这一事实出发，结果产生在经灌注的表面上血小板的占有率越低，则将要鉴定的检测过的表面的血液相容性越高。
所检测的涂覆肝素和涂覆Ac-肝素膜的结果清楚地表明，通过采用Ac-肝素的涂层，异源表面血液相容性得到改善。涂覆肝素的膜显示出45～65％的血小板占有率，而涂覆Ac-肝素的表面显示该值为0～5％(以100％血小板占有率的内皮下基质为参照)。
由于缺乏活化血小板所必需的血浆蛋白质，在Ac-肝素的表面上的血小板粘附非常困难。与此不同，涂覆肝素的表面很快开始吸附血浆蛋白质而对于血小板的活化、沉积和聚集提供了最佳前提；最后，血液经凝血级链的激活以相应的防御机理与所使用的异源表面起反应。到目前为止，Ac-肝素以比肝素更优越地满足了异源表面的血液相容性要求。
血浆蛋白质吸附和血小板占有率的相互作用，作为与针对血液提供的涂层有关的表面凝血原性的直接定量，通过其特别良好地显示体外测试结果。据此共价结合肝素作为抗血栓形成发生作用表面的利用，仅被强烈地限制乃至完全不可能。固定的肝素与血液的相互作用，在此自身转向不希望的对立面，即涂覆肝素的表面变得具有凝血原性。
很明显，肝素作为抗凝剂的突出意义是不能被转移到共价地固定的肝素上的。在溶解形式的系统应用中，它可以完全地呈现其特性。但是，如果肝素被共价固定，其抗凝剂特性，即使有，也仅仅是短期的。Ac-肝素(“非亲和”肝素)是不同的，由于脱硫酸化作用和再乙酰化作用，虽然完全丧失了初始分子的抗凝剂活性特性，但是，相反获得了显著的非凝血原的特性，其通过对于抗凝剂III的被动性和对于凝血的初始过程缺乏亲和力得以证明，并且在共价结合后仍保持这种特性。
因此，Ac-肝素和由此通式的化合物，整体上，对于与凝血系统接触的异源表面的掩蔽是最适宜的。
3.2.在硅上的固定化通过长1m内径3mm的硅管将乙醇/水比例为1/1(v/v)的混合物100ml泵入循环于40℃持续30分钟。然后加入2ml 3-(三乙氧基甲硅烷基)-丙胺，并于40℃在循环中另外持续15小时。之后，将其分别用100ml乙醇/水和100ml水漂洗2小时。
将3mg脱乙酰化且再乙酰化肝素(Ac-肝素)于4℃溶解在30mlpH值4.75的MES缓冲液中，并与30mg CME-CDI(N-环己基-N’-(2-吗啉代乙基)碳化二亚胺甲基-p-甲苯磺酸盐)混合。将该溶液通过所述管泵入循环于4℃持续15小时。之后用水、4M氯化钠溶液和水各漂洗2小时。
3.3血小板数量的检测(EN30993-4)在长1m内径3mm的硅管中放置两个2cm长的完全相符合的玻璃小管。然后用可收缩管将该管闭合成环路，并且借助注射器用0.154M氯化钠溶液在排除空气的情况下将其灌满。在此，一个注射器用于灌注溶液，另一个注射器用于排除空气。将溶液用健康测试者的柠檬酸盐全血使用这两个注射器在排除空气(无气泡)的情况下更换。然后，通过将玻璃小管推到其上将注射器的凹洞封闭，且将该管套到透析泵上。将血液以150ml/min的流速泵入达10分钟。在灌注之前和之后用库乐尔特颗粒计数器测定血液的血小板含量。对于未涂覆的硅管，血小板损失10％。与之相反，在根据实施例5.2涂覆的硅管中，损失为平均值0％(实验次数n＝3)。
同样在该动力学实验系统中表明，在涂覆Ac-肝素的表面上血小板的活化作用减少。同时可以确定，肝素的固定在使用的表面的血液相容性方面产生了负作用。与其相反，与其消极特性相符，Ac-肝素在与血小板接触时不起作用。
3.4在316 LVM不锈钢冠脉支架上的全血实验跟生物相容性实验一致，将31mm长的316 LVM不锈钢支架用Ac-肝素共价涂覆。在总表面2cm2和支架表面占有系数大约20pm/cm2的情况下，该支架的负载大约0.35μg Ac-肝素。作为比较在预防血栓形成的情况下，与之大不相同，通常每天的肝素应用率是20～30mg，这将相当于至少60000倍的值。
这些研究采用已建立的血液动力学Chandler回路系统进行[A.Henseler，B.Oedekoven，C.Andersson，K.Mottaghy；KARDIOTECHNIK 3(1999)]。将涂覆的和未涂覆的支架在长600mm和内径4mm的PVC管(医用级PVC)中扩张并测试。该实验的结果确认了讨论过的根据硅管的研究。最初由支架造成灌注液中的50％的血小板损失，而通过用Ac-肝素对支架表面的加工减少了80％以上的损失。
在管中扩张的、表面修饰的不锈钢冠脉支架对血小板损失的影响，是通过在45分钟全血灌注期间的进一步Chandler试验进行评价的。对此，首先研究无支架的PVC管，其结果设为零值。对于在标准误差只有3.6％的供体血液，空管显示出平均血小板损失为27.4％。以此基础值为基础，不同表面修饰的支架被在PVC管中扩张，并在类似条件下研究由它们导致的血小板损失。在这种情况下同样有这样的结果，通过只占总测试表面大约0.84％的支架覆盖的表面，引起在血小板含量方面显著的和可再现的作用。根据空管(基础值)，对于抛光的、未化学涂覆表面的支架的研究显示额外的平均22.7％的血小板损失。由此与PVC空管相比小于1％所测异源表面引起近似可比的血小板损失。直接结果是，作为支架材料使用的医用不锈钢316 LVM引起与医用级PVC的表面相比强大约100倍的血小板破坏，虽然该测试表面仅占总测试表面的大约0.84％。
被分析的在不锈钢冠脉支架上的表面涂层显示，能够非常显著地减少支架所引起的血小板破坏(见图2)。可用81.5％的Ac-肝素(SH4)得以最有效的证明。
如果考虑涂覆Ac-肝素的支架在血小板损失方面的作用，则获得良好一致的值。灌注液中的血小板损失以及血小板在所提供的表面的粘附的相关性显示了测试的可靠性。
3.4.1支架的共价血液相容性涂层将未扩张的医用不锈钢LVM 316支架用丙酮和乙醇在超声波中洗浴15分钟去除油脂，并于100℃在干燥箱中干燥。然后，将其在乙醇/水(50/50(v/v))的混合物中的2％的3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液中浸渍5分钟后，随后于100℃干燥5分钟。之后将支架用去离子水洗涤过夜。
将3mg脱硫的且再乙酰化的肝素于4℃在30ml pH值4.75的0.1M的MES缓冲液(2-(N-吗啉代)乙基磺酸)中溶解，并与30mgN-环己基-N’-(2-吗啉代乙基)碳化二亚胺甲基-对-甲苯磺酸盐混合。将10个支架在该溶液中于4℃搅拌15小时。然后，将它们用水、4M氯化钠溶液和水各漂洗2小时。
3.4.2用HPLC对经涂覆的支架的葡糖胺含量的测定水解将经涂覆的支架放入小水解管中，用3ml 3M氯化氢在室温放置正好一分钟。将金属样品移开，并将小管在密封后于干燥箱中100℃温育16小时。然后使其冷却，蒸发三次直至干燥，之后用1ml经脱气和滤过的水吸收，在HPLC中相对于同样水解的标准进行测定
实施例4经涂覆的冠脉支架的体内研究(图5)4.1.用Ac-肝素涂覆的冠脉支架的体内研究基于Ac-肝素在体外实验中提供的关于血液相容性方面的数据，研究Ac-肝素表面作为金属支架非凝血原性的涂层在体内的适用性(动物实验)。
实验的基本目的在于评价Ac-肝素涂层对支架引起的血管反应方面的影响。除可能的血栓事件的记录之外，将对于类似新生血管内膜面积、血管腔和狭窄程度等与再狭窄过程的有关的参数记录下来。
用于研究将使用6～9月大的家猪，这是一种用于评价支架的已建立了很长时间并被认可的动物模型。
如所期待的，在这些实验中，没有记录到急性、亚急性和晚期急性的血栓事件，其可以作为Ac-肝素非凝血原性质的评定证据。
四周后，将动物安乐死，取出放置支架的冠脉动脉片段进行组织形态学分析。在完整的实验阶段，特别是在组织学检测中没有被观察到，由于涂覆Ac-肝素支架的植入而可能引起的急性或亚慢性毒性、变态反应或其它进一步应激的迹象。在支架植入及随后的期间，得到冠脉血管造影数据组，如此可以评价血管对支架植入的反应。
在未涂覆的对照支架和涂覆Ac-肝素支架之间的不同是明显的。对于未涂覆的对照支架，可以非常明显地观察到新血管内膜层的显著产生。只四周后，未涂覆支架表面对周围组织的增生促进作用已经发生到这样的程度，以致于在支架的区域内产生血管阻塞的危险。
相反，对于涂覆Ac-肝素的支架，观察到明显较薄的新生血管内膜层，其支持了在保持宽敞通畅的血管腔的情况下良好调制支架的内生长。
详细的组织形态学的和冠脉血管造影的数据证实了该结论，正如可以一致地确定，借助于Ac-肝素涂层(SH4)，新血管内膜增生(“再狭窄”)与对照组未涂覆的支架相比被抑制了大约17～20％。
这种结果是意想不到的同时也是显著的。当然对于非凝血原性的表面没有更多的要求，其除了提供额外的血液相容特性之外还影响新血管内膜增生的过程，即预防再狭窄。
一方面，随着支架表面被Ac-肝素致密且永久地占据而防止了细胞直接与金属表面直接接触。因为在技术文献中，讨论某种金属离子向植入的邻近组织中的散发是作为再狭窄的可能原因之一，通过由涂层防止直接金属接触可能是抗再狭窄的原因。
另一方面，这类积极的负作用似乎是可能的，因为在钝化的没有血小板聚集的非凝血原性的支架表面还排除了释放的生长因子的增生作用。因此缺少从内腔面引发的重要的使新生血管内膜增生的促进因素。
实施例5通过喷涂方法用紫杉醇涂覆支架将根据实施例1和实施例2制备的未扩张支架称重且水平地悬挂在细金属棒(直径为0.2mm)上，将其固定在旋转推动器的旋转轴上，并以28转/分钟旋转。将支架如此装载，即使支架的内侧不接触棒。在推动波幅为2.2cm和推动速度为4cm/s以及在支架和喷嘴之间距离为6cm的情况下，用各种喷涂溶液喷涂支架。在室温下干燥(大约15分钟)和之后在通风柜中过夜，将其再次称重。
喷涂溶液的制备将44mg紫杉醇溶解在6g氯仿中。
实施例6PBS-缓冲液中洗提关系的测定在每个足够小的容器中的支架中加入2ml PBS-缓冲液，用帕拉胶膜密封并且在37℃在干燥箱中温育。在每种情况下选定时间间隔期满后，将上清液用移液管移出，之后测定其在306nm的UV吸收率。
权利要求
1.医疗器械，其表面的至少一部分直接或经至少一种处于中间的生物稳定和/或生物可降解层用包含至少一种式I的化合物及其盐类的血液相容性涂层涂覆， 其中n代表4～1050之间的整数，Y表示残基-CHO、-COCH3、-COC2H5、-COC3H7、-COC4H9、-COC5H11、-COCH(CH3)2、-COCH2CH(CH3)2、-COCH(CH3)C2H5、-COC(CH3)3、-CH2COO-、-C2H4COO-、-C3H6COO-、-C4H8COO-，且在血液相容性层之上、之中和/或之下有活性物质紫杉醇。
2.根据权利要求1所述的医疗器械，其中Y是残基-CHO、-COCH3、-COC2H5或-COC3H7，以及这些化合物的盐类。
3.根据权利要求2所述的医疗器械，其中Y是-COCH3。
4.根据前述权利要求之一的医疗器械，其中血液相容性层是直接位于医疗器械的表面上并在所述血液相容性层上涂覆紫杉醇或该活性物质的混合物。
5.根据前述权利要求之一的医疗器械，其中在血液相容性层之下或两个血液相容性层之间存在至少一层生物稳定和/或生物可降解层。
6.根据前述权利要求之一的医疗器械，其中将血液相容性层用至少另外一种、处在其上的生物稳定和/或生物可降解层完全或/和不完全涂覆。
7.根据前述权利要求之一的医疗器械，其中在生物稳定层和血液相容性层之间存在至少一个紫杉醇活性物质层。
8.根据前述权利要求之一的医疗器械，其中紫杉醇共价结合和/或粘附结合在血液相容性层和/或生物稳定和/或生物可降解层之间和/或之上。
9.根据前述权利要求之一的医疗器械，其特征在于，在生物可降解层应用下述物质作为生物可降解物质聚戊内酯、聚-ε-癸内酯、聚内酯酸、聚乙醇酸、聚交酯、聚乙交酯、聚交酯和聚乙交酯的共聚物、聚-ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、羟基丁酸酯-戊酸酯共聚物、聚(1，4-二噁烷-2，3-二酮)、聚(1，3-二噁烷-2-酮)、聚-对-二噁烷酮、聚酐类如聚马来酸酐、聚羟基甲基丙烯酸酯、血纤维蛋白、聚氰基丙烯酸酯、聚己内酯二甲基丙烯酸酯、聚-b-马来酸、聚己内酯丁基丙烯酸酯、例如由寡己内酯二醇和寡二噁烷酮二醇产生的多嵌段聚合物、聚醚酯多嵌段聚合物如PEG和聚(亚丁基对苯二甲酸酯)、Polypivotolatone、聚乙醇酸三甲基碳酸酯、聚己内酯-乙交酯、聚(g-谷氨酸乙酯)、聚(DTH-亚氨基碳酸酯)、聚(DTE-共-DT-碳酸酯)、聚(双酚-A-亚氨基碳酸酯)、聚原酸酯、聚乙醇酸三甲基碳酸酯、聚碳酸三甲酯、聚亚氨基碳酸酯、聚(N-乙烯基)-吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚酰胺酯、甘醇化聚酯、多磷酸酯、聚磷腈、聚[(对-羧基苯氧基)丙烷]、多羟基戊酸、聚酐类、聚环氧乙烷-环氧丙烷、软聚氨基甲酸酯、在主链上有氨基酸残基的聚氨基甲酸酯、聚醚酯类如聚环氧乙烷、聚烯烃草酸酯、聚原酸酯类以及它们的共聚物、类脂、角叉菜聚糖类、血纤维蛋白原、淀粉、胶原蛋白、基于蛋白质的聚合物、聚氨基酸、合成的聚氨基酸、玉米醇溶蛋白、修饰过的玉米醇溶蛋白、聚羟基链烷酸酯、果胶酸、肌动蛋白酸、修饰过的和未修饰过的血纤维蛋白和酪蛋白、羧甲基硫酸酯、清蛋白，加之透明质酸、脱乙酰壳多糖和其衍生物、硫酸乙酰肝素和其衍生物、肝素、硫酸软骨素、葡聚糖、b-环糊精、PEG和聚丙二醇的共聚物、阿拉伯树胶、瓜尔胶、明胶、胶原蛋白、胶原蛋白-N-羟基琥珀酰亚胺、脂质、磷脂、上述物质的修饰物和共聚物和/或混合物。
10.根据前述权利要求之一的医疗器械，其特征在于，在生物稳定层应用下述物质作为生物稳定物质聚丙烯酸和聚丙烯酸酯类如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、聚酰胺、聚醚酰胺、聚乙胺、聚酰亚胺、聚碳酸酯、聚碳氨基甲酸酯、聚乙烯基甲酮类、聚乙烯卤化物、聚亚乙烯卤化物、聚乙烯醚、聚异丁烯、聚乙烯芳香酯、聚乙烯酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚甲醛、聚四氢呋喃、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氨基甲酸酯、聚醚型氨基甲酸酯酯、硅氧烷聚醚型氨基甲酸酯酯、硅氧烷聚氨基甲酸酯、硅氧烷-聚碳酸酯-氨基甲酸酯、聚烯烃弹性体、聚异丁烯、EPDM树胶、氟硅氧烷、羧甲基脱乙酰壳多糖、聚芳基醚酮醚、聚醚酮醚、聚对苯二甲酸亚乙酯、聚戊酸酯、羧甲基纤维素、纤维素、嫘萦、嫘萦三乙酸酯、纤维素硝酸酯、纤维素乙酸酯、羟乙基纤维素、纤维素丁酸酯、纤维素乙酸酯丁酸酯、乙基乙烯基乙酸酯共聚物、聚砜、环氧树脂、ABS树脂、EPDM树胶、硅氧烷，如聚硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、聚乙烯卤化物及共聚物、纤维素醚、纤维素三乙酸酯、脱乙酰壳多糖以及这些物质的共聚物和/或混合物。
11.根据前述权利要求之一的医疗器械，使用一种代替活性物质紫杉醇的下述活性物质辛找他汀、2-甲基噻唑烷-2，4-二羧酸和相应的钠盐、大环低氧化物及其衍生物、活性蛋白质C(aPC)、PETN、曲匹地尔、β-雌二醇以及这些活性物质的混合物或者这些活性物质中的一种与紫杉醇的混合物。
12.根据前述权利要求之一的医疗器械，其特征在于，该医疗器械包括假体、器官、组织、主动脉、心脏瓣膜、管、器官的零件、植入体、纤维、中空纤维、支架、中空的针、注射器、膜、保藏容器、血液容器、滴定板、心脏起博器、吸附介质、层析介质、层析柱、透析器、连接部件、传感器、瓣膜、离心室、热交换器、内镜、过滤器、泵室。
13.根据权利要求12所述的医疗器械，其特征在于该医疗器械是支架。
14.根据权利要求13所述的支架，其中聚合物涂覆量为0.01mg～3mg/层，优选为0.20mg～1mg/层，更优选为0.2mg～0.5mg/层。
15.根据权利要求13或14所述的支架，其特征在于所使用的活性物质药物活性浓度为0.001～10mg/cm2支架表面和/层。
16.根据权利要求13～15之一所述支架在预防或减少再狭窄的应用。
17.根据权利要求13～16之一所述支架在连续释放紫杉醇、辛找他汀、2-甲基噻唑烷-2，4-二羧酸和相应的钠盐、大环低氧化物及其衍生物、活性蛋白质C(aPC)、PETN、曲匹地尔和/或β-雌二醇中的应用。
18.根据前述权利要求之一所述的医疗器械在与血液直接接触中的应用。
19.根据前述权利要求之一所述的医疗器械在预防或减少在医疗器械的涂覆表面上蛋白质的非特异性粘附和/或沉积中的应用。
20.根据权利要求18或19所述的应用，其特征在于医疗器械涂覆的血液相容性表面是用于诊断检测过程的微滴定板或其它载体介质的表面。
21.根据权利要求18或19所述的应用，其特征在于医疗器械涂覆的血液相容性表面是吸附介质或层析介质的表面。
22.用于医疗器械生物和/或人工表面的血液相容涂层的方法，它包括以下步骤a)提供医疗器械的表面，和b)根据权利要求1中通式I的至少一种化合物作为血液相容性层涂覆于该表面上，和/或b’)生物稳定和/或生物可降解层涂覆于医疗器械或血液相容性层的表面上。
23.根据权利要求22所述的方法，其中血液相容性层或生物稳定和/或生物可降解层是借助于浸渍或喷涂的方法用至少一层与紫杉醇以共价方式和/或粘附方式结合的生物可降解和/或生物稳定层涂覆。
24.根据权利要求22或23所述的方法，它包括进一步的步骤c)c.紫杉醇沉积于血液相容性层或生物稳定和/或生物可降解层之中和/或之上。
25.根据权利要求24所述的方法，其中紫杉醇是借助于浸渍或喷涂方法涂覆和/或填充在血液相容性层或生物稳定和/或生物可降解层之上和/或之中的，和/或是借助于共价方式和/或粘附方式与血液相容性层或生物稳定和/或生物可降解层结合的。
26.根据权利要求22～25之一所述的方法，它包括进一步的步骤d)或d’)d.将至少一个生物可降解层和/或至少一个生物稳定层分别涂覆于血液相容性层或是紫杉醇层上。或者d’)至少一种根据权利要求1通式I的化合物作为血液相容性层涂覆于生物稳定和/或生物可降解层或紫杉醇层上。
27.根据权利要求22～26之一所述的方法，它包括进一步的步骤e.)e.紫杉醇沉积于至少一个生物可降解层和/或生物稳定层或血液相容性层之中和/或之上。
28.根据权利要求27所述的方法，其中紫杉醇是借助于浸渍或喷涂方法涂覆和/或填充在至少一个生物可降解和/或生物稳定层或血液相容性层之上和/或之中的，和/或是借助于共价方式和/或粘附方式与至少一个生物可降解和/或生物稳定层或血液相容性层结合的。
29.根据权利要求22～28之一所述的方法，其中生物稳定和/或生物可降解层是共价结合和/或粘附结合在医疗器械表面上，并且血液相容性层是与生物稳定和/或生物可降解层共价结合的，并完全或不完全将其覆盖。
30.根据权利要求22～29之一所述的方法，其特征在于，血液相容性层包括在五糖分子量范围内不同硫酸化系数和酰化系数的区域选择性合成衍生的天然来源的肝素，它是抗血栓形成活性的主要原因，达到可买到的13kD肝素，硫酸乙酰肝素及其衍生物、红细胞糖萼的寡糖和多糖、脱硫酸化的且再N-乙酰化的肝素、N-羧甲基化和/或部分N-乙酰化的脱乙酰壳多糖以及上述物质的混合物的标准分子量。
31.根据权利要求22～30之一所述的方法，其特征在于，在生物可降解层应用下述物质作为生物可降解物质聚戊内酯、聚-ε-癸内酯、聚内酯酸、聚乙醇酸、聚交酯、聚乙交酯、聚交酯和聚乙交酯的共聚物、聚-ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、羟基丁酸酯-戊酸酯共聚物、聚(1，4-二噁烷-2，3-二酮)、聚(1，3-二噁烷-2-酮)、聚-对-二噁烷酮、聚酐类如聚马来酸酐、聚羟基甲基丙烯酸酯、血纤维蛋白、聚氰基丙烯酸酯、聚己内酯二甲基丙烯酸酯、聚-b-马来酸、聚己内酯丁基丙烯酸酯、例如由寡己内酯二醇和寡二噁烷酮二醇产生的多嵌段聚合物、聚醚酯多嵌段聚合物如PEG和聚(亚丁基对苯二甲酸酯)、Polypivotolatone、聚乙醇酸三甲基碳酸酯、聚己内酯-乙交酯、聚(g-谷氨酸乙酯)、聚(DTH-亚氨基碳酸酯)、聚(DTE-共-DT-碳酸酯)、聚(双酚-A-亚氨基碳酸酯)、聚原酸酯、聚乙醇酸三甲基碳酸酯、聚碳酸三甲酯、聚亚氨基碳酸酯、聚(N-乙烯基)-吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚酰胺酯、甘醇化聚酯、多磷酸酯、聚磷腈、聚[(对-羧基苯氧基)丙烷]、多羟基戊酸、聚酐类、聚环氧乙烷-环氧丙烷、软聚氨基甲酸酯、在主链上有氨基酸残基的聚氨基甲酸酯、聚醚酯类如聚环氧乙烷、聚烯烃草酸酯、聚原酸酯类以及它们的共聚物、类脂、角叉菜聚糖类、血纤维蛋白原、淀粉、胶原蛋白、基于蛋白质的聚合物、聚氨基酸、合成的聚氨基酸、玉米醇溶蛋白、修饰过的玉米醇溶蛋白、聚羟基链烷酸酯、果胶酸、肌动蛋白酸、修饰过的和未修饰过的血纤维蛋白和酪蛋白、羧甲基硫酸酯、清蛋白，加之透明质酸、脱乙酰壳多糖和其衍生物、硫酸乙酰肝素和其衍生物、肝素、硫酸软骨素、葡聚糖、b-环糊精、PEG和聚丙二醇的共聚物、阿拉伯树胶、瓜尔胶、明胶、胶原蛋白、胶原蛋白-N-羟基琥珀酰亚胺、脂质、磷脂、上述物质的修饰物和共聚物和/或混合物。
32.根据权利要求22～31之一所述的方法，其特征在于，在生物稳定层应用下述物质作为生物稳定物质聚丙烯酸和聚丙烯酸酯类如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、聚酰胺、聚醚酰胺、聚乙胺、聚酰亚胺、聚碳酸酯、聚碳氨基甲酸酯、聚乙烯基甲酮类、聚乙烯卤化物、聚亚乙烯卤化物、聚乙烯醚、聚异丁烯、聚乙烯芳香酯、聚乙烯酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚甲醛、聚四氢呋喃、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氨基甲酸酯、聚醚型氨基甲酸酯酯、硅氧烷聚醚型氨基甲酸酯酯、硅氧烷聚氨基甲酸酯、硅氧烷-聚碳酸酯-氨基甲酸酯、聚烯烃弹性体、聚异丁烯、EPDM树胶、氟硅氧烷、羧甲基脱乙酰壳多糖、聚芳基醚酮醚、聚醚酮醚、聚对苯二甲酸亚乙酯、聚戊酸酯、羧甲基纤维素、纤维素、嫘萦、嫘萦三乙酸酯、纤维素硝酸酯、纤维素乙酸酯、羟乙基纤维素、纤维素丁酸酯、纤维素乙酸酯丁酸酯、乙基乙烯基乙酸酯共聚物、聚砜、环氧树脂、ABS树脂、EPDM树胶、硅氧烷，如聚硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、聚乙烯卤化物及共聚物、纤维素醚、纤维素三乙酸酯、脱乙酰壳多糖以及这些物质的共聚物和/或混合物。
33.根据权利要求22～32之一所述的方法，其特征在于根据权利要求1通式I的多糖的涂覆是借助于疏水作用、范德华力、静电作用、氢键、离子间相互作用、交联和/或共价键来完成的。
34.根据权利要求22～33之一所述的方法，其中使用一种代替活性物质紫杉醇的下述活性物质辛找他汀、2-甲基噻唑烷-2，4-二羧酸和相应的钠盐、大环低氧化物、MCS衍生物、活性蛋白质C(aPC)、PETN、曲匹地尔、β-雌二醇以及这些活性物质的混合物或者这些活性物质中的一种与紫杉醇的混合物。
35.通过根据权利要求22～34之一所述的任何一种方法可得到的医疗器械。
全文摘要
本发明涉及包含糖构建单元N－酰基葡糖胺的多糖的应用，用于制备血液相容表面，以及使用所述多糖的表面血液相容涂层的方法，该多糖属于肝素和硫酸乙酰肝素的普通生物合成前体物质。本发明还涉及根据本发明涂覆的医疗器械，特别是支架，其包含作为抗增生活性物质的紫杉醇，以及所述支架用于预防再狭窄的应用。
文档编号A61K31/436GK1543362SQ03800770
公开日2004年11月3日 申请日期2003年4月15日 优先权日2002年5月9日
发明者R·赫勒斯, M·K·林森, M·霍夫曼, V·法斯特, E·霍夫曼, D·迪比阿斯, R 赫勒斯, 劝⑺, 固, 林森, 蚵 申请人:亨莫特克股份有限公司