专利名称：一种基于透明质酸的双靶向纳米复合物药物制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明公开了一种能够携载抗肿瘤药物的新型双靶向纳米复合物，所述纳米复合物由不同分子量改性透明质酸和胆烷酸构成。本发明同时还公开了所述的新型纳米复合物的制备方法及其作为肿瘤靶向药物的应用，属于生物医药材料、药物制剂领域。
背景技术：
世界卫生组织近期发表的《世界癌症报告》显示2020年全世界癌症发病率将比现在增加50%，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。当前调查研究表明，恶性肿瘤发病率逐年升高，已经由1993年的1%。上升至2011年的3%。，老龄化、城镇化、工业化及生活习惯改变是发病的主要原因。2010年城市和农村居民恶性肿瘤死亡人数占所有死亡人数比例分别为27.01%和24.26%，均排名第一位。目前，化疗、手术治疗、放疗是治疗癌症的主要手段。化疗是利用化学药物杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的生长繁殖和促进肿瘤细胞的分化的一种治疗方式，它是一种全身性治疗手段并对原发灶、转移灶和亚临床转移灶均有治疗作用。紫杉烷类药物是一类通过促进微管组装、抑制微管解聚而使细胞周期停滞，抑制肿瘤细胞增殖的抗肿瘤药物。目前临床使用的紫杉烷类药物以紫杉醇和多西紫杉醇为主，前者是分离自红豆杉的天然产品，1992年经FDA批准上市；后者由非细胞毒性前体化合物10-脱乙酰基巴卡亭合成，1996年获美国FDA批准上市，其对微管的亲和力是紫杉醇的2倍，微管稳定剂和组装促进剂活性比紫杉醇大2倍，在相同的毒性剂量下抗微管解聚的能力较紫杉醇高约I倍，体外抗肿瘤活性是紫杉醇的1.3-12倍，体内实验中对所有移植瘤株活性亦优于紫杉醇，抗瘤谱更广，在常见实体瘤中仅对肾和结肠直肠癌无效。天然植物类抗肿瘤药在我国临床使用的抗肿瘤药物中所占的比重最大，其中又以紫杉烷类(紫杉醇和多西他赛等)名列前茅。2007年上半年植物类抗肿瘤药中，紫杉醇以44.1%的份额占据了市场的第一位，多西他赛紧跟其后，占据了 39.7%的份额。多西紫杉醇未在中国申请专利，相关产品的行政保护申请也未获得我国政府批准。中性粒细胞减少是紫杉烷类药物最常见的不良反应，而且较严重。而过敏反应、皮肤反应、体液潴留和胃肠道反应等也有不同比例的病例发生。开发新型靶向载体系统，改善紫杉醇类等抗肿瘤药物在体内的代谢动力学特性，增加药物定向富集到肿瘤部位甚至肿瘤细胞内，提高疗效，降低毒副作用，是近年来抗肿瘤药物制剂领域研发热点。纳米技术在制剂领域的优势主要表现在增加药物的稳定性，提高生物利用度，改变药物的体内过程，降低毒性，提高药物作用的靶向性等。如聚合物胶束可以提高药物的生物可降解性和降低排斥反应，同时可以作为难溶性药物的输送载体。透明质酸(Hyaluronicacid, HA)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖，单糖间以β -1, 3-糖苷键相连，双糖单位之间由β-1，4-糖苷键相连。以HA为基础构建的药物投送系统应用于丝裂霉素C、紫杉醇、表阿霉素和阿霉素，以及小分子肽类药物的制备已有报道。研究表明透明质酸(Hyaluronic acid, HA)为基础构建的纳米药物投送系统具有多种优点:免疫原性低、生物相容性良好、可降解等优点；分子中含有多种基团可供药物结合；HA与CD44高表达的肿瘤细胞特异性结合，引导纳米颗粒在肿瘤细胞中主动蓄集，实现靶向给药；封装药物在透明质酸酶降解HA后释放，减少药物全身性扩散造成的毒副作用，同时也改善了药物的水溶性，延长了药物的血浆半衰期。然而，HA对强酸、强碱、热、自由基及透明质酸酶敏感、降解速度快等性质限制了其在组织工程和医药领域的应用。现有技术制备的HA药物投送系统制备过程复杂，肿瘤靶向等理化性能难以有效控制。大量研究显示两亲性嵌段共聚物在极性溶剂中聚团形成的胶束具有“核-壳”结构、低临界胶束浓度、药物缓释等特性，是各类药物尤其是疏水性药物良好的载体。自组装形成的载药纳米胶束可承载不同性质的药物，亲水外壳可逃避单核巨噬细胞的吞噬，延长药物在循环系统中的循环时间。同时药物与聚合物胶束结合的方法可选用非共价键包埋的物理方法，避免了接枝步骤，方便制备，而药物释放时无需通过化学键降解，释放速度较快，利于药物的迅速起效。
发明内容
本发明的目的之一在于制备一系列生物相容性好，对肿瘤细胞具有靶向性，低免疫原性，低细胞毒性和高抗癌疗效的双靶向纳米载体。本发明的目的之二在于应用所述新型的纳米复合物载体包载抗肿瘤药物，减少抗肿瘤药物副作用，增加其靶向性，用 提高抗肿瘤药物的肿瘤靶向治疗效果。本发明目的可以通过以下技术方案实现:一种双靶向药物载体，其特征在于:该药物载体为胆烷酸修饰透明质酸而成，位于中心核的为胆烷酸，最外端为透明质酸，胆烷酸上的-NH2和透明质酸上的-COOH之间脱水形成-NH-CO-键，而使胆烷酸和透明质酸结合。 在本发明的较佳实施例中，透明质酸分子中，每100个糖残基结合5-50个胆烷酸。更佳地，每100个糖残基结合8-20个胆烷酸。最佳地，每100个糖残基结合10个胆烷酸.。在本发明的较佳实施例中，所述的透明质酸分子量为16000 236000道尔顿。在本发明的较佳实施例中，所述的透明质酸的未结合胆烷酸的基团被修饰或未被修饰。这里所指的基团主要是指-CH20H，该基团的修饰为现有技术，如可将其修饰为CH20-间隔分子。本发明的又一技术方案为:一种基于透明质酸的双靶向纳米复合物药物，其特征在于，所述纳米复合物药物包括，前述技术方案一中的双靶向纳米载体部分和抗癌药物部分，两部分之间通过静电吸附或物理包裹结合，并特异性靶向高表达CD44受体的肿瘤细胞，表面修饰或不修饰聚乙二醇(PEG)。在本发明的较佳实施例中，所述的抗癌药物选自紫杉烷和喜树碱中的一种。在本发明的较佳实施例中，所述的抗癌药物为紫杉醇。在本发明的较佳实施例中，纳米药物的粒径为300_350nm.
前述的双靶向纳米复合物药物的制备方法，包括如下步骤:第一步:活化5β_胆烷酸(Cholic acid，CA)的羧基，琥珀酰化CA溶于DMF中，缓慢加入无水乙二胺溶液中，密闭反应过夜，加入过量蒸馏水生成白色沉淀，真空干燥，获得白色粉末状CA-NH215低分子量HA加入到甲酰胺中，加入EDC，将不同质量的CA-NH2溶于DMF中，缓慢滴加入HA和EDC混合液中，反应过夜，蒸馏水透析，冷冻干燥获得白色粉末HA-CA，低温保存待用；第二步:超声搅拌作用下HA-CA溶于去离子水，将药物(如紫杉醇，多西紫杉醇等)溶于二甲亚砜(DMSO)中，超声搅拌作用下缓慢滴加入HA-CA水溶液,利用疏水相互作用，把紫杉烷类药物装载进入HA-CA纳米胶束的疏水内核，反应过夜，蒸馏水透析，冷冻干燥获得白色粉末即HA-CA/紫杉烷类药物，避光保存。本发明装载药物的HA-CA以冻干粉的方式存储或使用，或者经注射用水稀释并过滤除菌以静脉注射，或者以适当吸附剂吸附掺入其他辅料进一步加工成颗粒剂、丸剂或胶囊。本发明采用胆烷酸(Cholic acid, CA)对HA进行疏水改性，优化HA机械强度、降解速度、粒度大小及稳定性等性质并提高HA肿瘤靶向性能。胆烷酸分子因其良好的生物相容性、手性和自组装能力等性质在构建具有独特性能的双亲性聚合物材料中广泛应用。本发明将透明质酸进行疏水改性形成两亲性聚合物，可在水溶液中形成粒度可控的自组装胶束，成为紫杉醇类药物载体。利用透明质酸与肿瘤细胞表面CD44受体的主动靶向作用，降低药物在非肿瘤部位的滞留，从而多方面增加肿瘤局部的药物浓度，减轻紫杉醇类药物的不良反应。同时，还可增加药物在体内的稳定性，提高药物的缓释效果及生物利用度。本发明的靶向纳米复合物具有如下优点:1.药物载体材料均为可降解生物材料，具有高的生物相容性，低的免疫原性和细胞毒性；2.药物载体结构大小可控，药物装载效率高，理化性能稳定；3.被动靶向 和主动靶向结合而实现对肿瘤细胞的高度靶向性能，提高靶向效率，实现肿瘤的高效低毒治疗。4.亲水高分子表面性能实现纳米复合物的血液长效循环，增强药物的水溶性进而增强其在血液中的稳定性；5.本发明所涉及的方法仪器设备要求简单、制备过程简单可控、易规模化。因此适于制备紫杉醇、多西紫杉醇、喜树等价格昂贵且水溶性差、生物利用度差的抗肿瘤药物纳米载药系统，作为抗肿瘤药物新剂型有着广阔的市场前景和潜在的肿瘤临床治疗价值。
图1为本发明HA-CA纳米颗粒制备路线一；图2为本发明HA-CA纳米颗粒制备路线一；图3为本发明HA-CA纳米颗粒制备路线一；图4 为 HA (A),HA-TBA (B)，EtCA (C)和 HA-CA (D)的 H-NMR 图谱，在 0.5-1.0ppm之间出现HA-CA的吸收峰，证明了制备方法的成功；图5为HA-CA/PTX纳米复合粒子的原子力显微镜图；图6为HA-CA/PTX纳米复合粒子粒度分布(左图)及电位(右图)；图7为HPLC分析PTX标准品的图谱(A)，PTX标准曲线(B)，HPLC分析HA-CA/PTX的图谱(C)和HA-CA的包封率和载药率(D)；图8为在细胞水平上比较HA-CA/PTX与PTX，Abraxane的活性能力测试。
具体实施方式
:下列实施例更详细地说明本发明，但是并不是要将本发明限定为实施例。实施例1.
1.HA-CA两亲性透明质酸共聚物的制备方法一(图1):透明质酸钠在去离子水中透析24小时。冻干后将透明质酸(5mg，Immol羧基)溶解于I毫升去离子水中。将10g5P-胆烷酸(CA)溶于50mL甲醇，加入1.80mL浓盐酸，容器薄膜封口，磁力搅拌下60° C恒温反应6小时，加入过量蒸馏水生成白色沉淀，水洗3次，真空干燥，获得白色粉末状胆烷酸甲酯。9g胆烷酸甲酯溶于50mL DMF (二甲基甲酰胺)中，缓慢加入EDA (0.9μπιο1)，乙二胺)，磁力搅拌反应6小时，磁力搅拌下130° C恒温反应6小时，加入过量蒸馏水生成白色沉淀，水洗3次，真空干燥，获得白色粉末状CA-NH2。HA (120mg, 0.51 μ mol)溶解于甲酸胺(Formamide)中，力卩入 EDC(72.8mg, 379.8 μ mol, 1- (3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺),室温下反应30min,而后加入 NHS (羟基琥珀酰亚胺 43.7mg, 37 9.7 μ Μ)。将(39.8mg，98.8 μ mol) CA-NH2 溶于 48mLDMF，并缓慢滴入到HA/EDC/NHS反应液中，在40° C下，磁力搅拌反应过夜。反应后的体系依次在乙醇，乙醇/水(1/1)，纯水(含12.5mg/ml的氯化钠)和纯水中充分透析,每次透析12小时。充分透析除去有机溶剂后，冷冻干燥获得白色粉末HA-CA，低温保存待用。2.HA-CA两亲性透明质酸共聚物的制备方法二(图2):透明质酸钠在去离子水中透析24小时。冻干后将透明质酸(400mg，Immol羧基)溶解于5毫升去离子水中，加入650 μ I (Immol)四丁基氢氧化铵(tetrabutylammoniumhydroxide, TBA)在 60。C 下揽拌过夜。在60° C搅拌条件下，将120毫克HA-TBA溶解于12毫升二甲基亚砜(DMSO)中，而后加入 5 β -胆烷酸(CA, 39.8mg, 98.8 μ mol), )EDC (72.8mg, 379.8 μ mol)和 NHS (43.7mg,379.7 μ Μ)。待各个试剂溶解后，将反应置于40° C下搅拌过夜。反应后的体系依次在甲醇，甲醇/水(1/1)，纯水(含12.5mg/ml的氯化钠)和纯水中充分透析，每次透析12小时。充分透析除去有机溶剂后，冷冻干燥获得白色粉末HA-CA，低温保存待用。3.PEG-HA-CA 的制备方法(图 3):透明质酸钠在去离子水中透析24小时。冻干后将透明质酸(5mg，Immol羧基)溶解于I毫升去离子水中。将10g5P-胆烷酸(CA)溶于50mL甲醇，加入1.80mL浓盐酸，容器薄膜封口，磁力搅拌下60° C恒温反应6小时，加入过量蒸馏水生成白色沉淀，水洗3次，真空干燥，获得白色粉末状胆烷酸甲酯。9g胆烷酸甲酯溶于50mL DMF中，缓慢加入EDA(0.9 μ mol)，磁力搅拌反应6小时，磁力搅拌下130° C恒温反应6小时，加入过量蒸馏水生成白色沉淀，水洗3次，真空干燥，获得白色粉末状CA-NH2。HA-CA (2.5g)溶于 20mL 磷酸盐缓冲液，加入 EDC，HOBt,M-PEG-NH2，在 EDC 和 HOBt作用下，PEG (5000)与HA-CA形成氨酰键，获得PEG-HA-CA共聚物。通过调整PEG和HA配比的改变，使HA分子中的每100个糖残基结合10个5β-胆烷酸。4.PEG-HA-CA或HA-CA装载紫杉醇制备靶向抗癌药物纳米复合物的方法超声作用或者在高压搅拌器作用下PEG-HA-CA或HA-CA溶于去离子水(5mg/ml终浓度)，将一定量的紫杉醇溶于二甲基甲酰胺(DMF，4mg/ml )，超声搅拌作用下缓慢滴加入HA-CA水溶液，利用疏水相互作用，把紫杉醇(PTX)装载进入PEG-HA-CA或HA-CA纳米胶束的疏水内核，在蒸馏水中透析，冷冻干燥获得白色粉末即PEG-HA-CA/PTX或HA-CA/PTX，避光保存，备用。上述合成步骤中的所使用的其它化学物质为市售商品。实施例2.
紫杉烷类纳米复合物的表征及性能测试1.核磁共振检测证明了 HA-CA共聚物的成功合成。分别将Img透明质酸(HA)，胆烷酸(EtCA)以及胆烷酸修饰的透明质酸(HA-CA)溶解于含有1:1比例的D2O的相应溶液中，而后进行核磁共振图谱检测分析，结果如图4所示，HA-CA成功合成。2.应用电镜、原子力显微镜对改性透明质酸构建的载药纳米复合物HA-CA/PTX进行形貌表征。将HA-CA/PTX溶解于去离子水中，而后修饰到云母片中，进行原子力显微镜分析。如图5原子力显微镜所示，纯水中分散的HA-CA/PTX纳米复合粒子，表明制备的纳米复合粒子在水相溶剂中可单一分散，粒度大小较为均匀。3.应用电位粒径测试 仪对水相溶液中分散的改性透明质酸构建的载药纳米复合物HA-CA/PTX进行粒径和电位测试。分别将Img的HA和HA-CA溶解于Iml去离子水溶液中，利用电位粒径测试仪测量，每次检测扫描三次，结果显示各个样品复合物表面为负电荷，粒度分布较窄，结果见图6所
/Jn ο4.应用高效液相色谱(HPLC)对HA-CA/PTX纳米复合粒子进行药物装载及释放行为测试。载药的HA-CA在乙醇作用下纳米复合物结构破坏，从而释放出携载的PTX，从而被HPLC检测。结果显示85%以上的PTX能有效装载入HA-CA纳米胶束。a)色谱条件:分析柱为C18 (5 μ m, 120 A，250X4.6mm);流动相为乙腈-水(45:55，含0.1%三氟乙酸)；流速为l.0ml/min，进样量为20 μ 1，检测波长为227nm，室温操作。b) PTX标准液配制和标准曲线:精确称取紫杉醇标准品lmg，用2ml甲醇溶解，得到0.5mg/ml标准液，并用甲醇以2倍梯度分别稀释至0.25，0.125，0.0625，0.03125，0.015，
0.0075mg/ml的标准样品。之后由稀至浓进行HPLC分析，以峰面积(A)对浓度(C)作图，得到回归方程，在0.0075 0.5mg/ml浓度范围内线性关系良好，(图7)。c) PTX包封率和载药率的测定精确称取HA-CA/PTX纳米冻干复合物lmg，加入Iml甲醇超声辅助溶解，而后加入等量的去离子水配成0.5mg/ml的样品溶液，用高效液相色谱检测，根据公式计算载药纳米颗粒的包封率和载药率。包封率％=载药纳米复合物的紫杉醇质量/紫杉醇的投药量*100%载药量％=载药纳米颗粒的紫杉醇质量/载药纳米复合物总质量*100%
5.体外培养肿瘤细胞(黑色素瘤细胞MDA-MB-435)，应用MTT法检测HA-CA/PTX纳米复合粒子体外抑制肿瘤细胞生长作用。a)收集对数期MDA-MB-435细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μ 1，铺板使待测细胞调密度1000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。b)5%C02，37°C孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，分别加入浓度梯度稀释的HA-CA/PTX，PTX和蛋白溶剂型紫杉醇(Abraxane)，每孔lOOul，设3个复孔。c) 5%C02, 37°C孵育24小时，倒置显微镜下观察。d)每孔加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，继续培养 4h。e)小心吸去孔内培养液,每孔加入150 μ I 二甲基亚砜,置摇床上低速振荡IOmin,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪0D490nm处测量各孔的吸光值。f)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜)。结果显示，在相同浓度下HA-CA/PTX纳米复合粒子体外抗瘤细胞增殖效果显著高于PTX和Abraxane (图8)，但不影响正常细胞的增殖生长作用。PEG-HA-CA/PTX纳米复合物是本发明人研制出的一种新的肿瘤靶向紫杉醇纳米制齐U，与现有紫杉醇药物相比 ，改善了紫杉醇抗肿瘤药物在体内的代谢动力学特性，增加了药物定向富集到肿瘤部位甚至肿瘤细胞内，提高了抗肿瘤疗效并降低毒副作用。本发明所述的PEG-HA-CA/PTX纳米复合物制备过程简便，特别是药物装载率高、载体组成成分生物可降解、价格便宜更加有利于在临床上推广应用。本发明所用疏水性药物还可以包括:紫杉醇，紫杉醇衍生物以及喜树碱等，其它更多可选疏水性药物包括并不限于紫杉醇衍生物等，制备方法类似。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种双靶向药物载体，其特征在于:该药物载体为胆烷酸修饰透明质酸而成，位于中心核的为胆烷酸，最外端为透明质酸，胆烷酸上的-NH2和透明质酸上的-COOH之间脱水形成-NH-CO-键，而使胆烷酸和透明质酸结合。
2.如权利要求1所述的双靶向纳米载体，其特征在于，透明质酸分子中，每100个糖残基结合5-50个胆烷酸。
3.如权利要求1所述的双靶向纳米载体，其特征在于，透明质酸分子中，每100个糖残基结合8-20个胆烷酸。
4.如权利要求1所述的双靶向纳米载体，其特征在于，所述的透明质酸分子量为16000 236000道尔顿。
5.如权利要求1所述的双靶向纳米载体，其特征在于，所述的透明质酸的未结合胆烷酸的基团被修饰或未被修饰。
6.一种双靶向纳米复合物药物，其特征在于，所述纳米复合物药物包括，权利要求1所述的双靶向纳米载体部分和抗癌药物部分，两部分之间通过静电吸附或物理包裹结合，并特异性靶向高表达CD44受体的肿瘤细胞，表面修饰或不修饰聚乙二醇。
7.如权利要求6所述的双靶向纳米复合物药物，其特征在于，所述的抗癌药物选自紫杉烷和喜树碱中的一种。
8.如权利要求6所述的双靶向纳米复合物药物，其特征在于，所述的抗癌药物为紫杉醇。
9.如权利要求6所述的双靶向纳米复合物药物的制备方法，包括如下步骤: 第一步:活化5 β -胆烷酸的羧基，琥珀酰化CA溶于DMF中，缓慢加入无水乙二胺溶液中，密闭反应过夜，加入过量蒸馏水生成白色沉淀，真空干燥，获得白色粉末状CA-NH2。低分子量HA加入到甲酰胺中，加入EDC，将不同质量的CA-NH2溶于DMF中，缓慢滴加入HA和EDC混合液中，反应过夜，蒸馏水透析，冷冻干燥获得白色粉末HA-CA，低温保存待用； 第二步:超声搅拌作用下HA-CA溶于去离子水，将紫杉烷类药物溶于二甲亚砜中，超声搅拌作用下缓慢滴加入HA-CA水溶液，利用疏水相互作用，把紫杉烷类药物装载进入HA-CA纳米胶束的疏水内核，反应过夜，蒸馏水透析，冷冻干燥获得白色粉末即HA-CA/紫杉烷类药物，避光保存。
全文摘要
本发明涉及一种基于透明质酸的双靶向纳米复合物药物及其制备方法。透明质酸纳米聚合物结构中包含疏水基团胆烷酸形成两亲性聚合物并在水溶液中自发形成胶束，胶束中可以进一步引入聚乙二醇提高复合物分散性及稳定性。抗肿瘤药物可通过静电吸附或物理包裹进入纳米载体形成纳米药物复合物。该纳米药物复合物利用透明质酸与肿瘤细胞表面CD44受体的主动靶向作用选择性地浓集于肿瘤细胞，同时利用被动的渗透于蓄积效应(EPR)促进肿瘤组织对纳米载药复合物的摄取。改性透明质酸聚合物包裹抗肿瘤药物后，具有提高药物的生物利用度、增强靶向性、降低毒副作用、延长药物半衰期，且可稳定储存等优点，从而在多方面提高肿瘤靶向治疗效率。
文档编号A61K31/4745GK103143027SQ20131006891
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月28日 优先权日2013年2月28日
发明者朱雷, 崔起荣, 陈小元, 刘刚 申请人:厦门大学