专利名称：用pde11a抑制剂治疗糖尿病的方法
技术领域：
本发明涉及通过施用抑制PDE11A的化合物治疗糖尿病及其相关疾病的方法。
背景技术：
糖尿病的特点是葡萄糖代谢功能受损，在糖尿病患者中特别表现为血糖水平升高。糖尿病按照根本的病因主要分为两类1型和2型。1型糖尿病，或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，因患者的胰腺中缺少产生胰岛素的β细胞而发生。2型糖尿病，或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，因患者的β细胞功能受损以及胰岛素功能改变而发生。
目前对1型糖尿病患者的治疗方法是注射胰岛素，而对大多数2型糖尿病患者则是采用刺激β细胞功能的药剂或增强患者对胰岛素的组织敏感性的药剂进行治疗。目前用于治疗2型糖尿病的药物包括α-葡糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂、胰岛素促分泌剂、二甲双胍以及胰岛素。
随着时间的推移，三分之一以上的2型糖尿病患者失去了对口服药物的反应。胰岛素治疗是在饮食、锻炼以及口服治疗不能充分控制血糖的情况下开始的。胰岛素治疗的缺陷是需要进行药物注射，可能发生低血糖症以及体重增加。
治疗糖尿病的另一策略是基于环磷腺苷(cAMP)信号机制及其对胰岛素分泌的影响。葡萄糖代谢会促进ATP-依赖型K+通道关闭，这会导致细胞去极化以及随后的Ca++通道打开。这又会使得胰岛素颗粒发生胞吐作用。cAMP是由葡萄糖刺激的胰岛素分泌的主要调节剂。不过，cAMP的作用是葡萄糖依赖性的，也就是说，在葡萄糖浓度低时，cAMP对胰岛素分泌即使有作用也是很小的作用(Weinhaus，A.，等，Diabetes471426-1435(1998))。cAMP对胰岛素分泌的作用被认为可通过蛋白激酶A路径调节。
内源性促分泌剂采用cAMP系统在葡萄糖依赖性方式中控制胰岛素的分泌(Komatsu，M.等，Diabetes461928-1938(1997))。这种内源性促分泌剂的实例包括垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)、血管活性肠多肽(VIP)、以及类胰升血糖素肽-1(GLP-1)。
PACAP是从胰腺β-细胞进行葡萄糖依赖性胰岛素分泌的强效促进剂。已记载有三种不同的PACAP受体类型(R1、R2和R3)(Harmar，A.等，Pharmacol.Reviews 50265-270(1998))。PACAP的促胰岛素活性由GTP结合蛋白Gs调控。细胞内的cAMP的聚集又可激活β-细胞中的非选择性阳离子通道，增加[Ca++]，促进含有胰岛素的分泌颗粒的胞吐作用。
血管活性肠肽(VIP)是一个有28个氨基酸的肽，该肠肽第一次是从猪上部小肠中分离得到的(Said and Mutt，Science1691217-1218，1970；美国专利3,879,371)。VIP的生物作用由偶合在细胞内cAMP信号系统的膜结合受体蛋白的活化来调控。
餐后GLP-1从肠L-细胞释放出来，并作为内分泌激素发挥作用(即，其促进葡萄糖诱导胰岛素从胰腺β-细胞中释放)。GLP-1是具有37个氨基酸的肽，由胰升血糖素基因根据组织类型进行不同的表达。支持提高β-细胞中cAMP水平的有益效果的临床数据用GLP-1收集。向控制很差的2型糖尿病患者中注入GLP-1可使患者的空腹血糖水平正常化(Gutniak，M.，等，New Eng.J.Med.3261316-1322，(1992))，且注入时间越长，越能提高正常患者的β-细胞的功能(Rachman，J.，等，Diabetes451524-1530，(1996))。一份近来的报告表明GLP-1提高了对葡萄糖耐受损伤的患者体内β-细胞对葡萄糖反应的能力(Byrne M.，等，Diabetes471259-1265(1998))。
采用这些内源性促分泌剂治疗2型糖尿病也具有一些缺陷。例如，这些化合物的肽的性质要求必须注射给药。此外，内源性促分泌剂的作用很短暂，因为肽的保存寿命很短。
由于目前治疗中的问题，还需要治疗2型糖尿病的新的治疗方法。特别是，需要保持正常(葡萄糖依赖性的)胰岛素分泌的新的治疗方法。这样的新的药物应具有下列特性1)促进胰岛素分泌时对葡萄糖的依赖性，即只有在血糖浓度升高时才会促进胰岛素分泌的化合物，这样发生低血糖的可能性就很小；2)低的第一次和第二次失效率；和3)保持小岛细胞功能。本发明通过抑制磷酸二酯酶11A(PDE11A)从而控制cAMP信号系统而达到了上述的需要。
磷酸二酯酶(PDEs)是cAMP和/或将3’，5’-环核苷酸单磷酸酯裂解为5’-核苷酸单磷酸酯的cGMP-水解酶的集合。PDEs已知涉及调控cAMP系统。具体说，PDE11A是水解cAMP和cGMP的磷酸二酯酶，其Km值大约为1-5μM(Fawcett等，Proc Natl Acad Sci USA，2000Mar 28；97(7)3702-7(2000)；Hetman等，Proc Natl Acad Sci USA，2000 Nov 7；97(23)12891-5(2000)；Yuasa等，Eur J Biochem，2001 Aug；268(16)4440-8(2001))。至少四种PDE11A的剪接变异体已被描述为其C-末端催化区相同，而分子的N-末端部分的尺寸不同。Yuasa等，Eur J Biochem.，(2001)，268(16)，4440-4448；Yuasa等，J.Bio.Chem.(2000)，275(40)，31469-31479。
发明简述本发明涉及通过施用有效量的PDE11A抑制剂治疗哺乳动物糖尿病，特别是2型糖尿病的方法。本发明的其它方法涉及通过施用PDE11A抑制剂治疗与糖尿病有关的其它疾病，如X综合症、糖耐量受损以及空腹血糖受损。本发明还涉及通过施用有效量的PDE11A抑制剂刺激哺乳动物的胰腺细胞释放胰岛素的方法。所述胰岛素释放的方法可响应哺乳动物血糖浓度的升高。在本发明的方法中，PDE11A抑制剂还可与其他糖尿病治疗药物一起使用，如α-葡糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖)、胰岛素增敏剂(例如噻唑烷二酮类)、降低肝糖产量的化合物(例如二甲双胍)、胰岛素促分泌剂(例如磺酰脲类)、β3-激动剂以及胰岛素。而且，PDE11A抑制剂还可以与一种或多种减少体重的药剂，如赛尼可(xenical)、西布曲明、β3-激动剂或CB-1拮抗剂结合使用。最后，在另一实施方案中，本发明的方法提供了PDE11A抑制剂与HMGCoA还原酶抑制剂、尼古丁酸、胆酸螯合剂、纤维酸(fibricacid)衍生物或抗高血压药物的联合使用。
在本发明的其它方法中，PDE11A抑制剂可用于治疗痴呆症或泌尿生殖道疾病。泌尿生殖道疾病包括但不限于失禁、压力性尿失禁、良性前列腺增生、勃起功能障碍、女性性功能障碍以及前列腺肥大。在本发明其它方法中，PDE11A抑制剂可用于治疗心血管疾病，如高血压、缺血性心脏病、心肌梗塞、稳定和不稳定的绞痛、外周闭合性疾病以及缺血性休克。
本发明由此提供了通过施用PDE11A抑制剂抑制PDE11A来治疗糖尿病的方法。本发明的这些方面以及其它方面可由如下附图、说明书以及权利要求更清楚地了解到。
图1A-1C表示PDE11A在岛细胞中的表达。
图1A表示以胰岛cDNA为模板用F2/R1引物组合物产生的PCR产物。
图1B表示以胰岛cDNA为模板用For3/R2引物组合物产生的PCR产物。
图1C表示以胰岛cDNA为模板用F4/Rev2引物组合物产生的PCR产物。
在图中，箭头表示具有预期尺寸的PCR产物。电泳泳道标志如下1Kb＝1Kb DNA标准标记物，胰岛＝胰岛cDNA模板，-DNA＝负的DNA对照，PDE11A＝用含有PDE11A的质粒作为模板的阳性对照，Neg＝用含有不相关的基因的质粒作为模板的阴性对照。
发明详述本发明提供了通过施用PDE11A抑制剂，治疗糖尿病及其相关疾病，特别是2型糖尿病和/或刺激胰岛素从胰腺细胞释放的方法。这种方法通过施用PDE11A抑制剂，治疗任何在空腹或餐后血糖水平升高的疾病。在胰岛的岛细胞中已鉴别到PDE11A。PDE11A将cAMP水解为AMP，由此降低了细胞内cAMP浓度。通过抑制PDE11A的活性，细胞内的cAMP水平升高，由此增加了含有胰岛素的分泌颗粒的释放并因而增加了胰岛素的分泌。如文中所述，在岛细胞测试中抑制PDE11A活性的化合物也刺激胰岛素的分泌。还如本文所述，PDE11A抑制剂可用于治疗痴呆、心血管疾病或泌尿生殖道疾病。
治疗方法本发明的方法可用于治疗疾病如糖尿病，包括1型糖尿病和2型糖尿病。这些方法还可以延迟糖尿病的发作以及糖尿病并发症。用本发明的方法可治疗或预防的其它疾病和病症包括青年发病的成年型糖尿病(Maturity-Onset Diabetes of the Young，MODY))(Herman等，Diabetes4340(1994))、成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LatentAutoimmune Diabetes Adult，LADA)(Zimmet等，Diabetes Med.11299(1994))、糖耐量受损(IGT)(糖尿病分类专家委员会，DiabetesCare22(Supp.1)S5(1999))、空腹血糖受损(IFG)(Charles等，Diabetes40796(1991))、妊娠期糖尿病(Metzger，Diabetes40197(1991))以及X代谢综合症。
本发明的方法还可用于治疗糖尿病的次级诱因(糖尿病分类专家委员会，Diabetes Care22(Supp.1)S5(1999))。这种次级诱因包括糖皮质激素过量、出长激素过量、副神经节瘤以及药物诱发的糖尿病。可能诱发糖尿病的药物包括但不限于pyriminil、尼古丁酸、糖皮质激素、苯妥英、甲状腺素、β-肾上腺素药剂、α-干扰素以及治疗HIV感染的药物。
cAMP调节的胰岛素的释放还取决于存在的刺激性的葡萄糖浓度。本发明的一个方法涉及通过施用PDE11A抑制剂刺激胰岛细胞释放胰岛素。因此用非肽化合物进行葡萄糖依赖型刺激胰岛素分泌可降低血糖浓度而不会导致低血糖。
本发明的方法可单独使用或与本领域技术人员已知用于治疗糖尿病及相关疾病的其它疗法和/或其它化合物联合使用。或者，在联合疗法中，可部分或完全使用PDE11A抑制剂。
PDE11A抑制剂还可与其它已知治疗糖尿病的药物联合使用，这些药物包括PPAR激动剂、磺酰脲类药物、非磺酰脲类促分泌剂、α-葡糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂、胰岛素促分泌剂、使肝糖产出降低的化合物以及胰岛素。这些药物可在PDE11A抑制剂给药前、与之同时或在给药后给药。胰岛素包括长期和短期作用形式以及胰岛素的制剂。PPAR激动剂可包括任何PPAR亚型的激动剂或其组合。例如，PPAR激动剂可包括PPAR-α、PPAR-γ，PPAR-δ的激动剂或任意两种或三种PPAR亚单位的组合。PPAR激动剂包括例如罗格列酮和匹格列酮。磺酰脲类药物包括例如格列本脲、格列美脲、氯磺丙脲和格列吡嗪。当使用PDE11A抑制剂治疗糖尿病同时还可使用的α-葡糖苷酶抑制剂包括阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖。当使用PDE11A抑制剂治疗糖尿病同时还可使用的胰岛素增敏剂包括噻唑烷二酮类和非噻唑烷二酮类。当使用PDE11A抑制剂治疗糖尿病同时还可使用的使肝糖产出降低的化合物包括二甲双胍，如甲福明和甲福明XR。当使用PDE11A抑制剂治疗糖尿病同时还可使用的胰岛素促分泌剂包括磺酰脲类和非磺酰脲类药物GLP-1、GIP、PAC/VPAC受体激动剂、胰泌素、纳格列奈、美各里替尼、瑞格列奈、格列本脲、格列美脲、氯磺丙脲、格列吡嗪。GLP-1包括半衰期比GLP-1本身更长的GLP-1衍生物，如GLP-1的脂肪酸衍生物和exendin。在本发明的一个实施方案中，PDE11A抑制剂与胰岛素促分泌剂联合使用以增加胰腺β细胞对胰岛素促分泌剂的敏感度。
PDE11A抑制剂可与减肥药联合使用。减肥药包括β-3激动剂、CB-1拮抗剂、食欲抑制剂，如西布茶明(西布曲明)和脂肪酶抑制剂，如奥利司他(赛尼可)。
PDE11A抑制剂还可与常用于治疗糖尿病人的脂质代谢紊乱的药物联合使用。这样的药物包括但不限于HMG-CoA还原酶抑制剂、尼古丁酸、胆酸螯合剂以及纤维酸(fibric acid)衍生物。本发明的方法还可与抗高血压药物，如β-阻断剂和ACE抑制剂联合使用。
这种联合治疗法可任意与两种或多种药物(例如，PDE11A抑制剂与胰岛素增敏剂和减肥药联合用药)联合用药。这种联合治疗法可以药用组合物的形式给药，如上文所述。
本发明的其它方法涉及用PDE11A抑制剂治疗痴呆。Shimamoto等，Mechanisms of Aging Development(1976)，5(4)241-250；Nicholson等，Trends Pharmacological Sciences(1991)，12(1)19-27。
本发明的另一方法涉及用PDE11A抑制剂治疗泌尿生殖道疾病。所述泌尿生殖道疾病包括但不限于失禁、压力性尿失禁、良性前列腺增生、勃起功能障碍、女性性功能障碍(包括女性性兴奋障碍)以及前列腺肥大。Ballard等，J Urology159(6)2164-2171(1998)；EP1211313A2(关于PDE11A对精子发生的作用)。
本发明的另外一个方法涉及用PDE11A抑制剂治疗心血管疾病，如高血压、缺血性心脏病、心肌梗塞、稳定和不稳定的绞痛、外周闭合性疾病以及缺血性休克。PDE11族类包括负责各个组织中的cAMP和cGMP降解的酶(Fawcett等，PNAS(2000)97，3702-3707)。而且，PDE11的表达可在心脏中检测到(Yuasa等，Eur.J.Biochem.(2001)268，4440-4448)。环GMP(cGMP)和环AMP(cAMP)是重要的第二信使，涉及调节血管平滑肌紧张性(tone)。可溶且结合膜的鸟苷酸环化酶的活化可使得细胞内cGMP水平升高且诱导血管舒张。激活各种在血管平滑肌细胞中表达的G蛋白-偶合受体(GPCRs)(例如肾上腺髓质素和CGRP受体)导致腺苷酸环化酶活化，产生细胞内cAMP且血管舒张。3’5’-环核苷酸磷酸二酯酶(PDEs)催化3’5’-环核苷酸水解为其各自的核苷酸5’-单磷酸酯。由于所有以上的原因，PDE11A很可能在心血管系统中起一定的作用。
药物组合物在本发明的方法中使用的PDE11A抑制剂可以化合物本身的形式给药。或者，PDE11A抑制剂可与可药用载体一起以药用组合物的形式给药。可药用的载体必须与组合物中的其它成分相容且不能对服用者有不可忍受的害处。载体可以是固体或液体，或两者的混合，并且优选与化合物配制成单元剂量组合物，如片剂，其中可含有基于剂型总重量约0.05％-约95％重量的活性化合物。也可存在其它的药理活性物质，包括其它可用于治疗糖尿病的化合物。
在本发明的方法中使用的PDE11A抑制剂可以任何适当的途径给药，优选以适合这种给药途径的药用组合物形式，且具有治疗所需要的治疗有效剂量。PDE11A抑制剂可以例如口服给药、舌下给药、经鼻给药、肺部给药、粘膜给药、胃肠道外给药、静脉内给药、腹膜内给药、皮下给药、肌肉内给药或局部用药。单位剂量制剂，特别是可口服给药的单位剂量制剂如片剂或胶囊，通常含有例如约0.001mg-约500mg，优选约0.005mg-约100mg，更优选约0.01mg-约50mg的活性成分。对于可药用盐，上述活性成分的重量指的是从盐中得到的可药用活性离子的重量。
口服给药时，药用组合物可以是例如片剂、胶囊、悬浮液、乳剂、糊剂、溶液、糖浆或其它液态形式。药用组合物优选制成含特定量的活性成分的剂量单位形式。如果口服给药，化合物可与例如乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、明胶、阿拉伯胶、藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、和/或聚乙烯醇混合，然后为了方便给药进行压片或装入胶囊。
PDE11A抑制剂的口服给药可包括本领域公知的剂型，这些剂型通过多种机制立即、或延迟或持续向胃肠道释放药物。立即释放的剂型包括但不限于口服溶液、口服悬浮液、速溶片或胶囊、舌下含片、崩解片等。延迟或持续释放的剂型包括但不限于来自基于小肠pH值变化的剂型的活性成分的pH敏感性释放、片剂或胶囊的缓慢侵蚀、基于制剂的物理性质在胃中的保留、剂型对肠道粘膜层的生物粘附、或剂型中活性药物的酶释放。预期的效果是通过控制剂型延长作用时间，使得活性药物分子被运送到作用位点。这样，肠溶性的和肠溶控释的制剂就可用于本发明的方法中。合适的肠溶包衣包括醋酸纤维邻苯二甲酸酯、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯和甲基丙烯酸以及甲基丙烯酸甲酯的阴离子聚合物。
适于口服的药用组合物可以不连续的单元存在，如胶囊、扁胶剂、锭剂或片剂，其各含有预定量的至少一种本发明的化合物；粉末或颗粒形式；含水或不含水的溶液或悬浮液；水包油型或油包水型乳剂。如文中所示，这种组合物可用药学上任何合适的方法制备，包括将抑制剂与载体(其中可含有一种或多种辅料)混合起来。一般来说，组合物通过将抑制剂与液态或磨碎的固态载体、或两者一起均匀紧密地混合起来制得，然后，如果必要的话，可使该产物成形。例如，片剂可通过将抑制剂粉末或颗粒任选与一种或多种辅料压制或铸模而得。压制的片剂可通过在适当的机器中，挤压自由流态的化合物，如粉末状或颗粒状的化合物，任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性/分散剂的混合物而得。铸模片剂可通过例如将粉末状化合物在适当的机器中铸模而得。
口服的液态剂型可包括可药用的含有本领域常用的惰性稀释剂如水的乳剂、溶液、悬浮液、糖浆以及酏剂。这种组合物还可含有辅剂如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、以及甜味剂、矫味剂和芳香剂。
适于口腔(舌下)给药的药用组合物包括含有处于矫味基中的PDE11A抑制剂的锭剂，所述矫味基通常为蔗糖、阿拉伯胶或黄芪胶，和在惰性基中如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中含有抑制剂的软锭剂。
肠道外给药的制剂可以是例如含水或不含水的等渗无菌注射溶液或悬浮液形式。这些溶液和悬浮液可从具有一种或多种前文中提到用于制备口服制剂的载体或稀释剂的无菌粉末或颗粒制得。可将PDE11A抑制剂溶于水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、氯化钠和/或各种缓冲液。其它辅剂和给药方式在药学领域是众所周知的。
可药用载体包括所有前述物质及其类似物。用于本发明方法中的含有PDE11A抑制剂的药用组合物可用药学中任何公知的技术制备，如将组分混合。上述关于有效剂型以及给药方法所考虑的事项都是本领域熟知的，并且在标准教科书中有述。
本发明方法中使用的PDE11A抑制剂的剂量通常为约0.001mg-约10000mg/天，优选为约0.005mg-约1000mg/天。以mg/kg每日剂量为基准，或者单次或者多次给药，剂量范围一般为约0.001/75mg/kg-约10000/75mg/kg，优选为约0.005/75mg/kg-约1000/75mg/kg。
每一抑制剂的总的每日剂量可一次性或分成多次亚剂量(subdose)给病人服用。一般地，按亚剂量可每日2-6次给药，优选每日2-4次，甚至更优选每日2-3次。药剂可以是足够有效的立即释放或持续释放形式，以有效控制糖尿病病症。
用本发明的结合物和组合物预防、治疗、缓解或减轻糖尿病病症或疾病、或以其他方式防治或治疗糖尿病的剂量方式是根据多种因素选择的。这些因素包括但不限于患者的糖尿病类型、年龄、体重、性别、饮食和医疗状况、疾病的严重程度、给药途径、药理学因素如所采用的特殊抑制剂的活性、效力、药动学和毒理学曲线特征，是否采用了药物传输系统、和抑制剂是否与其它活性成分一起给药。因此，实际采用的剂量方式可有很大的不同，因而可能偏离上文给出的优选剂量方式。
在本发明的方法中可用作PDE11A抑制剂的化合物的可药用盐包括常用于形成碱金属盐或形成游离酸或游离碱的加成盐的盐。盐本身的性质并不重要，只要是可药用的盐即可。合适的可药用酸加成盐可由无机酸或有机酸制备。无机酸的例子为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。合适的有机酸可选自脂肪酸、环脂肪酸、芳香酸、杂环酸、羧酸和有机磺酸。有机酸和有机磺酸的例子包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、甲磺酸(mesylic)、水杨酸、4-羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、恩贝酸(embonic，pamoic)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、2-羟基乙磺酸、对甲苯磺酸、对氨基苯磺酸、环己基氨磺酸、硬脂酸、algenic酸、N-羟基丁酸、水杨酸、galactaric酸和半乳糖醛酸及其组合物。
用于本发明的PDE11A抑制剂还可以以发现具有抑制PDE11A活性的化合物的可药用盐、被保护的酸、共轭酸、互变异构体、前药或立体异构体的形式给药。互变异构体包括例如羟基互变异构体。被保护的酸包括但不限于被保护的酸如酯、羟胺衍生物、酰胺类和磺酰胺类。前药的形成在本领域中公知，其目的在于增强母体化合物的性质；所述性质包括溶解度、吸收度、生物稳定性和释放时间(见“Pharmaceutical Dosage Form and Drug Delivery Systems”(第六版)，由Ansel等编辑，Williams&Wilkins出版，27-29页(1995)，在此引入作为参考)。通常使用的前药设计为利用主要的药物生物转化反应，也被认为在本发明的范围之内。主要的药物生物转化反应包括N-去烷基化、O-去烷基化、脂肪族羟基化、芳香族羟基化、N-氧化、S-氧化、去氨基化、水解反应、葡萄糖醛酸化、硫酸化和乙酰化(见Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics(第九版)，主编Molinoff等，McGraw-Hill出版，11-13页(1996)，在此引入作为参考)。
除了用于治疗人类疾病，PDE11A抑制剂还可用于伴侣动物(例如马、狗、猫等)、外来动物(exotic animal)和农场动物的兽医治疗。尽管本发明是根据人类生物学描述的，本领域的普通技术人员应当理解本发明还可应用于其它哺乳动物。
表达模式图PDE11A在胰腺岛细胞中的表达由PCR校验。PCR由来自岛细胞cDNA库且具有下列识别PDE11A基因不同区域的引物组合的DNA模板进行
F2(5’-CATACCATGCAACATGTTCA-3’)+R1(5’-CAGTTTCACGTTGACCTTCA-3’)，其会产生具有928个碱基对的预期产物。
For3(5’-AAAAGCGGCCGCCCACCATGAGCCCAAAGTGCAGT GCTGA-3’；要注意的是该引物包括另外的用于克隆目的的序列)+R2(5’-CTGACAAGTTCAAAGAATTCA-3’)，其会产生具有1060个碱基对的预期产物。
F4(5’-CGCTGTACTTTGAGAGGAGA-3’)+Rev2(5’-AAAAAAGCTTGTTTAGTTCCTGTCTTCCTT-3’；要注意的是该引物包括另外的用于克隆目的的序列)，其会产生具有474个碱基对的预期产物。
将50μl PCR反应如下所述进行汇编5μl 10x放大缓冲液(与聚合酶一起供给)5μl 10x PCR强化因子(与聚合酶一起供给)1μl 50mM MgSO48μl 各1.25mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP1μl 100μM正向引物1μl 100μM反向引物1μl 岛细胞cDNA27μl H2O1μl PLATINUM Pfx DNA聚合酶(生命技术)反应在Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600热循环器中使用下列参数进行循环95℃ 2分钟/35x(95℃ 30秒/55℃ 30秒/72℃ 2分钟)/72℃ 10分钟将1μl Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)加入反应中，在72℃再反应10分钟，然后将反应冷至4℃。
将反应装载到1％的琼脂TBE胶上于150V进行电泳20分钟。PCR产物在溴乙啶染色(ethidium bromide staining)后通过UV照射进行观察。
选择F2/R1反应的PCR产物通过DNA排序进一步表征，因为该产物对应于PDE11A基因编码催化区的部分。简言之，将PCR段从凝胶上切下，用Qiagen Gel萃取试剂盒纯化，按照随该试剂盒提供的规程进行。纯化的PCR产物插入pcDNA3.1/V5/His-TOPO基质中，随后用Eukaryotic TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)按照制造者所述方法将TOP10活性的细菌细胞转化。将五个菌落挑入2ml LB肉汤中与100μg/ml的羧苄青霉素于37℃培养过夜。从过夜的培养基中制备Miniprep DNA，通过限制酶分析验证PCR产物插入物的存在。该插入物经DNA测序鉴定PDE11A结果为阳性。
图1A-1C表示用上文所述引物组合物产生的PED11A PCR产物。如图中所示，在岛细胞中发现了PDE11A。PDE11A在岛细胞中的表达表明PDE11A在调控胰岛素分泌/血糖浓度中可能起一定作用。
PDE11A抑制测定法将化合物加入人重组酶的测试缓冲液中，点在96孔白板(whitewall)/透明底等板(isoplate)(Wallac)上。反应通过加入3H-cAMP(Amersham)或3H-cGMP(Amersham)引发反应。在室温下45分钟后，通过加入SPA硅酸钇珠(Amersham)中止反应。30分钟后，在Microbeta(Wallac)中以SPA模式读板30秒。数据表达为对照的百分比的形式。以PDE2、PDE3A、PDE4B和PDE11A、3H-cAMP做底物。以PDE5、3H-cGMP为底物。
化合物被识别为抑制PDE11A的活性，其IC50值为1μM或更小。化合物包括下列化合物 在测定抑制PDE2、PDE3A、PDE4B和PDE5的方法中应用这些相同的化合物。在这些方法中，发现化合物的IC50值比抑制PDE11A法中的IC50值高10倍。因此这些化合物对PDE11A有选择性。
这些化合物可以本发明的方法给药。此外，它们的立体异构体、可药用盐、互变异构体、被保护的酸以及共轭酸和/或前药都可以本发明的方法给药。
岛细胞测定法胰腺岛细胞的分离用戊巴比妥钠(60mg/kg，i.p.)麻醉Lean大鼠(Sprague-Dawley，雄性，200-250g)，打开大鼠腹部，露出肝脏和胰腺。通过将Hank’s溶液注入胆管使胰腺胀大，然后在Hank’s溶液中用剪刀切下胰腺并将之切碎。在用缓冲液清洗组织后，用胶原酶消化胰腺10分钟，清洗，以Ficoll梯度法从碎片中分离岛细胞。用缓冲液清洗分离的岛细胞部分，并在显微镜下手选出岛细胞。在3mM的葡萄糖中将岛细胞预培养30分钟，然后转入含有适当条件的介质中再培养30分钟。然后用ELISA试剂盒(Alpco Diagnostics，Windham，NH)测定介质中胰岛素的含量。
在上述PDE11A抑制测定法中被识别为PDE11A抑制剂的化合物在该岛细胞测定法中进行了测试。这些化合物也被发现可刺激胰岛素释放，与基本胰岛素释放相比至少为1.5倍。
体内测试将Lean大鼠(Wistar，雄性，250-300g)禁食过夜并分成两组基质处理组和化合物处理组(每组8只大鼠)。基质或化合物为经口管饲给药(1.5ml/只)。两小时后，将葡萄糖溶液(30％，2g/kg体重)腹膜内注射入大鼠体内。在注射葡萄糖溶液后0、15、30和60分钟收集尾部血样，用葡萄糖计(Bayer Diagnostics，Mishawaka，IN)测定血糖浓度。
在上述PDE11A抑制测定法中被识别并在上述岛细胞测定法中进行了测试的化合物当在本方法中测试时预计具有降低血糖作用。
本发明可以用不偏离其要旨或基本特征的其它具体形式实施。前文所述实施例仅用于阐明本发明。因此，本发明的范围仅受所递交权利要求的限定。
权利要求
1.治疗或预防选自下列病症或疾病的方法糖尿病、青年发病的成年型糖尿病(MODY)、成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)、糖耐量受损(IGT)、空腹血糖受损(IFG)、妊娠期糖尿病以及X代谢综合症，包括给哺乳动物施用有效量的PDE11A抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述糖尿病是2型糖尿病。
3.权利要求1的方法，还包括将PPAR-激动剂、胰岛素增敏剂、磺酰脲、胰岛素促分泌剂、降低肝糖产量的化合物、α-葡糖苷酶抑制剂或胰岛素与所述PDE11A抑制剂联合用药。
4.权利要求3的方法，其中所述PPAR-激动剂选自罗格列酮和匹格列酮。
5.权利要求3的方法，其中所述磺酰脲选自格列本脲、格列美脲、氯磺丙脲和格列吡嗪。
6.权利要求3的方法，其中所述胰岛素促分泌剂选自GLP-1、GIP、PAC/VPAC受体激动剂、胰泌素、纳格列奈、美各里替尼、瑞格列奈、格列本脲、格列美脲、氯磺丙脲和格列吡嗪。
7.权利要求3的方法，其中所述α-葡糖苷酶抑制剂选自阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖。
8.权利要求3的方法，其中所述降低肝糖产量的化合物为二甲双胍。
9.权利要求1的方法，还包括将HMG-CoA还原酶抑制剂、尼古丁酸、胆酸螯合剂、纤维酸衍生物、抗高血压药物或减肥药与所述PDE11A抑制剂联合用药。
10.权利要求9的方法，其中所述减肥药选自β-3激动剂、CB-1拮抗剂和脂肪酶抑制剂。
11.治疗或预防糖尿病的次级诱因的方法，包括给哺乳动物施用有效量的PDE11A抑制剂，其中所述糖尿病的次级诱因选自糖皮质激素过量、生长激素过量、副神经节瘤和药物引发的糖尿病。
12.增强胰腺β细胞对胰岛素促分泌剂的敏感性的方法，包括给哺乳动物施用有效量的PDE11A抑制剂。
13.权利要求12的方法，其中所述胰岛素促分泌剂选自GLP-1、GIP、PAC/VPAC受体激动剂、胰泌素、纳格列奈、美各里替尼、瑞格列奈、格列本脲、格列美脲、氯磺丙脲和格列吡嗪。
14.治疗或预防痴呆的方法，包括给哺乳动物施用有效量的PDE11A抑制剂。
15.治疗或预防心血管疾病的方法，包括给哺乳动物施用有效量的PDE11A抑制剂，所述心血管疾病选自高血压、缺血性心脏病、心肌梗塞、稳定和不稳定的绞痛、外周闭合性疾病以及缺血性休克。
16.治疗或预防泌尿生殖道疾病的方法，包括给哺乳动物施用有效量的PDE11A抑制剂，所述泌尿生殖道疾病选自失禁、压力性尿失禁、良性前列腺增生、勃起功能障碍、女性性功能障碍以及前列腺肥大。
17.权利要求16的方法，其中所述女性性功能障碍是指女性性兴奋障碍。
全文摘要
本发明的方法涉及通过施用PDE11A抑制剂治疗糖尿病，特别是2型糖尿病，及其相关疾病的方法。这种PDE11A抑制剂可与α－葡糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂、胰岛素促分泌剂、降低肝糖产量的化合物、β－3激动剂或胰岛素联合用药。这种PDE11A抑制剂还可与减轻体重的药剂联合用药。本发明的其它方法涉及通过施用PDE11A抑制剂刺激胰腺细胞分泌胰岛素，特别是响应血糖浓度升高的胰岛素分泌。
文档编号A61PGK1697661SQ03805986
公开日2005年11月16日 申请日期2003年3月14日 优先权日2002年3月14日
发明者H·瓦萨瓦达 申请人:拜尔药品公司