专利名称：能够抵抗幽门螺旋杆菌的乳酪的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)(后文有时用L.gasseri代表)的天然乳酪，这种乳酪具有抵抗幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)(后文有时用H.pylori代表)的能力和/抵抗H.pylori感染的保护性能。具体地说，本发明涉及一种即使保存在低温环境中六个月或更长时间仍然保持L.gasseri高存活量的天然乳酪。
背景技术：
自从1983年Warren等人发现H.pylori是一种存活于胃中的细菌以后(Lancet，I.1273(1983))，H.pylori和慢性胃炎，胃溃疡以及十二指肠溃疡之间的关系得到关注。近年来，发现没有给予任何致癌物质，感染H.pylori的蒙古沙鼠出现了胃腺癌(Watanabe et al.，Gastroenterology，115，642(1988))，由此暗示H.pylori作为病原菌和胃癌之间的关系。另外，进一步明朗了H.pylori呈阳性的胃溃疡患者可以通过消灭H.pylori抑制胃溃疡的复发。已经研究了许多抵抗胃内的H.pylori的方法。
为了不使用抗生素抵抗胃内的H.pylori，建议一种使用加氏乳酸杆菌OLL 2716(L.gasseri OLL 2716)高效抵抗H.pylori(2000年1月14日以登计号BP-6999保存在National Institute of Bioscience andTechnology，Agency of Industrial Science and Technology(Higashi 1-1-3，Tsukuba，Ibaraki，Japan)[现在的名称为International Patent OrganismDepositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)](也称为“LG21”)的方法。加氏乳酸杆菌OLL 2716是从人肠道分离的大量乳酸杆菌中筛选得到的，具有以下特征(1)高度耐受胃酸；(2)低pH环境中有效生长；(3)高度抑制H.pylori附着于人胃癌细胞MKN45；(4)有效抑制H.pylori混合物中H.pylori的协同培养；(5)有效抵抗服用H.pylori的模型小鼠体内的H.pylori；(6)当应用于食品时，存活率高，口感好，外形美观。特别地，此菌株在发酵乳的制备中具有很好的产业化性质(保存、口感和外观)，优选添加此菌株至发酵乳中。因此，使用乳酸杆菌的抗菌作用抵抗H.pylori可认为是一种方便有效的方法，且没有任何副作用。但是，由于发酵乳的食品性质，发酵乳保质期相对短，只有2星期左右。2星期保存期后，乳酸杆菌数量几乎降低至保存期之前的一半。也就是说，发酵乳不适合长期保存。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种食品，这种食品中具有高效抵抗H.pylori能力和抵抗H.pylori感染保护性能的L.gasseri，在长时间保存中存活量仍然很高，可以作为日常饮食的一部分而没有不便之处。
本发明涉及以下(1)～(8)(1)一种天然乳酪，其特征在于含有一种具有抵抗幽门螺旋杆菌能力，属于加氏乳酸杆菌的乳酸杆菌。
(2)根据(1)的天然乳酪，其中乳酸杆菌能够耐受低pH环境。
(3)根据(1)或(2)的天然乳酪，其中乳酸杆菌是加氏乳酸杆菌OLL 2716(FERM BP-6999)或其突变体。
(4)根据(1)至(3)中任意一项的天然乳酪，其中乳酸杆菌在10℃或以下保存6个月时，其存活量在107cfu/克或以上。
(5)一种含有(1)至(4)中任意一项的天然乳酪的食品。
(6)一种制备(1)至(4)中任意一项的天然乳酪的方法，特征在于包括在乳成分凝结成块前加入酵母提取物，和/或在成形和压榨后进行熟化乳凝块。
(7)根据(6)的制备方法，其中乳凝块成形和压榨之后的熟化不需要冷却。
(8)根据(6)或(7)的制备方法，其中乳凝块在20到35℃中熟化16-26个小时。
(9)根据(6)至(8)中任意一项所的制备方法，其中具有抵抗幽门螺旋杆菌能力，属于加氏乳酸杆菌的乳酸杆菌作为酵母加到原料乳中。
(10)根据(6)至(9)中任意一项的制备方法，其中乳酸杆菌是加氏乳酸杆菌OLL 2716(FERM BP-6999)或者其突变体。
附图简要说明
图1表明含有L.gasseri的切达乳酪中细菌数量变化(实施例1)。
图2表明含有L.gasseri的高达乳酪中细菌数量变化(实施例2)。
图3表明含有L.gasseri的强化高德乳酪中细菌数量变化(实施例3)。
图4表明含有L.gasseri的细绳乳酪中细菌数量变化(实施例4)。
图5表明含有L.gasseri的乳酪的抗H.pylori作用(实施例5)，其中■和△分别代表含L.gasseri的乳酪和H.pylori经过协同培养，存活的H.pylori和L.gasseri的数量；◆代表不含L.gasseri的乳酪和H.pylori经过协同培养，存活的H.pylori的数量(对比例)。
图6表明L.gasseri的耐盐性(试验例1)。
图7表明不同乳酸杆菌在酸性环境中的生长情况(试验例2)。
图8表明胃内容物中H.pylori的数量(试验例3)。
图9表明抗H.pylori抗体的滴度(试验例4)。
本发明的最佳实施方式除非说明书中特别指明，％代表重量百分比。
为了解决上述问题，发明人进行了认真研究。结果，他们发现，作为新组分，天然乳酪中的L.gasseri能够长时间以有效量生长，并高浓度存活，其中存在于天然乳酪中存活的L.gasseri OLL 2716细胞具有高效抵抗H.pylori能力和抵抗H.pylori感染的保护性能。而且，首次发现，在乳酪常规制备过程中另外添加酵母提取物和/或成形压榨后进行乳凝块熟化，乳酪中L.gasseri的生长和存活意外的远超过乳酸杆菌的数量。因此，本发明是以上述发现为基础完成的。
以下具体描述本发明。
本发明的天然乳酪优选固态或半固态的天然乳酪，例如切达乳酪，高达乳酪，伊顿乳酪，细绳乳酪以及意大利乳酪。
本发明用于制备天然乳酪的原料乳选自于制作乳酪的常规用料。例子包括哺乳动物如母牛、山羊、绵羊、水牛、马以及牦牛的乳；源自乳的物质如奶油、脱脂乳、半脱脂乳、全脂乳、炼乳、脱脂炼乳、还原乳、脱脂乳等溶解在水中得到的还原乳以及乳清等。这些物质可以单独使用或者联合使用。
本发明的天然乳酪含有一种具有抵抗H.pylori(后文用“本发明的L.gasseri”表示)能力，属于加氏乳酸杆菌的乳酸杆菌。本发明的L.gasseri具有抵抗H.pylori的能力，优选具有高效抵抗H.pylori能力的L.gasseri。这种抵抗H.pylori的能力是指L.gasseri具有能够抑制H.pylori的生长，优选当给于这种L.gasseri进入存在H.pylori的胃内，胃内容物中H.pylori的数量降至检测限如1×103个菌落单位(后文用“cfu”表示)以下。
本发明的L.gasseri优选能够耐受低pH环境的。具体地说，本发明的L.gasseri能够高度耐受人或动物胃内的胃酸，在低pH环境中生长良好，通过以天然乳酪形式给于的本发明的存活gasseri细胞能够抵抗H.pylori并且保护机体免受H.pylori的感染，防止胃炎、胃溃疡或十二指肠溃疡的发作或复发。虽然通常使用的乳酸杆菌的优选pH值为6到7，是为了抵御人体胃肠道的酸性环境，本发明的L.gasseri需要耐受pH2和pH7间的酸性环境。有证据表明本发明的乳酪所含的L.gasseri能在pH 5到7环境中生长和存活。此外，本发明的L.gasseri优选口服后有高存活数量的，如107cfu/克乳酪，更优选109cfu/克乳酪。
本发明的乳酸杆菌优选L.gasseri OLL 2716(FERM BP-6999)。此外，本发明的乳酸杆菌包括L.gasseri OLL 2716(FERM BP-6999)的突变体，只要这种突变体具有抵抗H.pylori的能力，并且对人或非人动物无毒。这种突变体可通过给于L.gasseri OLL 2716合适的突变处理得到，例如紫外线照射、X光照射或辐射，和诱变化合物(如亚硝基胍、吖啶染料)的化学处理，以及核苷的插入、删除或取代，和自发突变。
本发明的天然乳酪保存在10℃或以下的温度中6个月后，其中本发明的L.gasseri的存活数量尤其在107cfu/g或以上。本发明的天然乳酪优选在10℃或以下的温度中成熟，更优选2℃-10℃的温度，如果必要，在无氧环境中冷却。成熟时间根据乳酪的种类确定。同时，6个月从成形压榨后的乳凝块熟化结束后的日期开始计算。自然，本发明包括天然乳酪，这种天然乳酪经过10℃或以下温度保存6个月以上，其中存活的L.gasseri存活数量为107cfu/g以上。更进一步说，本发明的L.gasseri无安全问题，因此其最大存活量无特别限制。
通常，天然乳酪的制备步骤与所有类型的乳酪一致，即包括原料乳的标准化和杀菌等预处理、乳凝块的制备和随后的完成步骤。酵母类型、发酵条件、乳凝块的处理、加盐方式和保存等根据乳酪的种类不同而有所区别。本发明的天然乳酪的制备中，优选加入L.gasseri作为酵母，也可将L.gasseri酵母和乳酸杆菌酵母同时应用于乳酪中。除了制作不同种类乳酪的常规步骤外，还需要在乳成分形成凝块前添加酵母提取物，和/或在乳酪凝块成形压榨后进行熟化。乳凝块形成前的乳成分可以是上述的原料乳，或含有任何添加剂，只要乳凝块尚未形成即可。
L.gasseri酵母是一种属于L.gasseri的乳酸杆菌，具有上述抵抗H.pylori的作用，优选L.gasseri OLL 2716(FERM BP-6999)。
L.gasseri OLL 2716(FERM BP-6999)可通过存贮培养工艺获得，包括制备种子酵母和生产用酵母(bulk starter)等多个步骤。另外，还可以使用含菌量高的浓缩酵母(冷冻或冷冻干燥产品)，这种浓缩酵母可不经过制备种子酵母而直接接种制备生产用酵母或产品。
加入原料乳中的L.gasseri酵母数量可根据使用目的(预防、保健或治疗)和制备条件来选择。当目的是用于抵抗H.pylori时，优选每天摄入的天然乳酪中含大约109cfu(9.0 log cfu)的存活细菌。因此，能够确定加入原料乳的L.gasseri酵母量，使得每个人或非人动物每天摄入的细菌量符合上文描述的水平。优选本发明实施例描述的方法制备的L.gasseri酵母和乳酸杆菌酵母均以0.5到5％千克原料乳的量加入，更优选1％，使L.gasseri和乳酸杆菌存活细胞最终量大约为106到107cfu。优选冷却后立即将L.gasseri酵母添加到乳成分中，因为加入越早，L.gasseri越多。
接下来以切达乳酪为例具体描述本发明天然乳酪的制备方法。
一种常规制备切达乳酪的方法是已知的，其中有(1)原料乳的标准化，消毒和冷却；(2)乳酸杆菌酵母加至(1)的原料乳中，随后混合；(3)氯化钙和凝乳酶加入到(2)的混合物中使乳凝结成块；(4)将(3)的乳凝块切割和蒸煮去除乳清；(5)制备切达乳酪后，将乳凝块研磨，乳凝块中加入干盐，随后搅拌；和(6)乳凝块成形，真空包装并成熟。
基于上述方法，本发明的天然乳酪可以通过例如下面的方法制备，这种方法其中有(1)原料乳40千克63℃灭菌30分钟，随后冷却至32℃；(2)乳酪用乳酸杆菌酵母400克(德氏乳酸杆菌德氏亚种(Lactobacillus lactis subsp.Lactis))和400克L.gasseri酵母加至(1)的原料乳中；(3)氯化钙4克和凝乳酶0.1克加入至(2)的混合物中，静置45分钟；(4)由此得到的乳凝块切成8毫米见方的小块，搅拌20m分钟，40℃加热40分钟，搅拌60分钟，沉淀5分钟，去除乳清15分钟；(5)经过2小时切达乳酪的制备过程后，将乳凝块研磨成拇指大小的小块，加入80克盐；(6)将乳凝块装入2个2千克大小的模具中压榨2小时，随后真空包装，成熟。在此过程中，特别优选在乳凝块形成之前的步骤(1)到(3)中加入酵母提取物，和/或步骤(6)乳凝块经过成形压榨后进行熟化。
本发明的一个实施例中描述了一种制备上述的乳酪用乳酸杆菌和生产用酵母L.gasseri的方法。首先，将一种乳酪用乳酸杆菌株和L.gasseri原种分别置于含酵母提取物的10％脱脂乳培养基中活化并预培养超过3代。其次，这种乳酪用乳酸杆菌酵母以1％的比例接种到10％脱脂乳培养基中，同时L.gasseri酵母以1％的比例接种到含10％脱脂乳粉的乳培养基中，这种乳培养基含0.1％的酵母提取物。乳酸杆菌在25℃环境中培养16小时，同时L.gasseri酵母在35℃环境中培养24小时，由此分别得到各自的生产用酵母。
天然乳酪中L.gasseri的生长较乳酪用乳酸杆菌占优势，酵母提取物优选乳凝块压榨之前加入，更优选乳成分形成乳凝块之前加入。每升乳成分加入的酵母提取物的量优选0.05到0.2％，更优选0.08到0.15％。任何属于“酵母提取物”产品分类的市售产品都可以使用。例如，Asahi Breweries有限公司生产的商品名为“meast P2G”可以使用。
进一步说，经过成形压榨的乳凝块的熟化过程能提高天然乳酪中L.gasseri的存活率。这种熟化过程优选进行，例如成形压榨后无需冷却立即进行。更进一步说，这种熟化过程在20到35℃环境中进行16到26小时，优选在22到28℃中进行19到24小时。
本发明优选的天然乳酪在成形压榨之前，其中的L.gasseri存活数量为108到109cfu/克天然乳酪，且数量不会由于成形压榨而改变。
这种天然乳酪制备中，乳酪凝块或乳酪表面加氯化钠，或者用盐水浸渍。盐水浸渍过程是对乳酪熟化步骤的补充，在熟化步骤后进行。以高德乳酪为例，步骤如下1)乳凝块的形成2)成形3)压榨4)乳凝块的熟化5)通过盐水浸渍加入氯化钠，和6)保存。天然乳酪中氯化钠的含量还影响L.gasseri的存活率。由于L.gasseri的存活率受高浓度氯化钠的抑制，因此氯化钠的浓度优选每克乳酪3％或以下，更优选2％或以下。
类似的，L.gasseri的存活率受氧气存在的抑制。由此优选乳酪真空包装后成熟和保存，惰性气体吹扫-净化后包装或者用蜡、塑料膜将乳酪表面封住以及其他方法。
本发明的天然乳酪还可能含有能够添加至乳酪中的食物或液体，例如甜味剂、成酸剂、调味剂、辛香料、香料、维生素，以及其它可以加入至乳酪中的食品添加剂。
这样得到的产品中，乳酪中的L.gasseri以足够量生长，成熟和保存后以高浓度存在。因此，根据本发明能够得到具有抵抗H.pylori能力的乳酪。
本发明参考实施例和试验例进一步具体解释，但是本发明并不限至与此。
实施例1含L.gasseri的切达乳酪的制备方法L.gasseri OLL 2716(FERM BP-6999)和市售的乳酪用乳酸杆菌混合物(O-180，购自Hansen)分别以1％的比例接种至10％的脱脂乳培养基中。然后L.gasseri37℃培养17小时，而O-18025℃培养17小时，由此得到生产用酵母。随后，将100千克经过73℃，15秒灭菌的乳调节至30℃，以1％比例接种上文描述的L.gasseri和O-180生产用酵母。然后采用常规方法制备长宽约为30厘米、高10厘米的切达乳酪10千克。这种切达乳酪采用Eval聚乙烯尼龙膜层(MitsubishiPlastics，Inc.制造)真空包装并保存在5℃和10℃中。乳酪制备过程中的每一步以及制备完成后6个月内每隔1个月都对其中的L.gasseri和其它细菌的数量根据下列细菌检测方法(表1和2)进行检测。以后的细菌检测均采用同样方法进行。对切达乳酪菌的中心和表面(距离表面5毫米深度)进行细菌检测。
结果表明，L.gasseri最多达到5×108cfu/克(8.7 log cfu/克)，当乳酪保存在5℃中3个月或者10℃中1个月，细菌数量保持在108cfu/克(8.0 log cfu/克)或以上。当乳酪保存在5℃或10℃6个月，存活的细菌数量为107cfu/克(7.0 log cfu/克)或以上(表2，图1)。由于乳酪的一次摄入量大约10克左右，因此乳酪以10克为一个包装(包装单位)，从乳酪的制备后3个月相应的细菌数量最多能达到2×109cfu/包装(9.3 log cfu/包装)，而制备后6个月相应的细菌数量最多能达到4×108cfu/包装(8.6 log cfu/包装)。因此证明10克左右这种乳酪的摄入能够维持足够的细菌数量抵抗H.pylori和/或保护抵抗H.pylori的感染。这样得到的切达乳酪含42％水分、28％脂肪、26％蛋白质和0.9％氯化钠。因此它含有一点咸味和酸味。乳酪成熟后，还带有轻微苦味，但不会引发严重的问题(表3)。
细菌检测方法培养基100ml水中溶解6克BL琼脂培养基(Eiken Chemical Co.，Ltd.制造)，高压灭菌器中121℃灭菌15分钟。随后冷却至50℃。无菌状态下加入马去纤维蛋白血(Nippon Biotest制造)，达到5％浓度。混和后，将这种混合物分配至培养皿用于检测细菌数量。
稀释方法乳凝块溶解在10倍体积的2％磷酸氢二钠溶液后，乳酪样品直接用生理盐水稀释。除乳酪外的其它样品直接用生理盐水稀释至所需的浓度。然后0.1ml每种样品加至上文描述的装有马去纤维蛋白血液的BL-培养皿中，有氧环境35℃培养3天。随后测定存活的L.gasseri和其它细菌的数量。
菌落的计数标准(1)L.gasseriL.gasseri克隆呈圆形或不规则圆形，棕黑色，外形粗糙且菌落较大。
(2)其它细菌其它细菌克隆稍微隆起，黑棕色，外形光滑且菌落较小。这些细菌是指除了L.gasseri计数之外的所有细菌的总和。
表1含L.gasseri OLL 2716的切达乳酪制备过程中细菌数量的变化
注意1)不检测(后文同指)表2含L.gasseri OLL 2716的切达乳酪保存过程中细菌数量的变化
LGL.gasseri表3含L.gasseri OLL 2716的切达乳酪的成分和口味
实施例2含L.gasseri的高德乳酪的制备方法L.gasseri OLL 2716和市售的乳酪用乳酸杆菌混合物(CHN-01，购自Hansen)分别以1％的比例接种至10％的脱脂乳培养基中。然后L.gasseri37℃培养17小时，CHN-01 25℃培养17小时，由此产生生产用酵母。随后，将100千克经过73℃，15秒灭菌的半脱脂乳(SNF 8.5％，脂肪3％)调节至32℃，分别以1％比例接种L.gasseri和CHN-01生产用酵母。然后采用常规方法制备10千克长宽均约为30厘米、高约10厘米的高德乳酪。表4表明各个阶段细菌的数量。这样得到的高德乳酪含43％水分、24％脂肪、25％蛋白质和1.7％氯化钠。经过Eval聚乙烯尼龙膜层真空包装，保存在5℃和10℃环境中。真空包装后6个月内每隔1个月对高德乳酪中的L.gasseri和其它细菌数量进行检测。这种高德乳酪中，L.gasseri最多也达到6×108cfu/克(8.8 log cfu/克)。当乳酪保存在10℃中3个月或者5℃中6个月，乳酪中心部位细菌数量保持108cfu/克(8.0 lo克cfu/克或以上的水平。当乳酪10℃保存6个月，存活的细菌数量为107cfu/克(7.0 log cfu/克)或以上。乳酪表面(距离表面5毫米深度的部位)细菌数量下降很快，1个月后降至107cfu/克(7.0 log cfu/克)，6个月后降至106cfu/克(6.0 log cfu/克)或以下(表5，图2)。高德乳酪的口味不存在任何需要关注的问题。
表4含L.gasseri OLL 2716的高德乳酪制备过程中细菌数量的变化
表5含L.gasseri OLL 2716的高德乳酪保存过程中细菌数量的变化
LGL.gasseri表6含L.gasseri OLL2716的高德乳酪的成分和口味
实施例3L.gasseri-强化高德乳酪(2)的制备方法L.gasseri OLL 2716以1％的比例接种至含0.1％酵母提取物(Difco制造)的10％脱脂乳培养基中，同时市售的乳酪用乳酸杆菌德氏乳酸杆菌德氏亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)(CHN-01分离得到，购自Hansen)以1％的比例接种至10％的脱脂乳培养基中。然后L.gasseri37℃培养24小时，L.lactis25℃培养17小时，由此得到生产用酵母。随后，将20千克经过73℃，15秒灭菌的半脱脂乳(SNF8.5％，脂肪3％)调节至32℃，分别以1％比例接种L.gasseri和L.lactis生产用酵母。接着，进一步加入20克酵母提取物。然后通过常规方法得到的乳凝块在模具中25℃成形压榨24小时。乳酪从模具中取出后浸泡在10℃的20％盐溶液中24小时。由此得到2千克直径大约20厘米、高8厘米的环形高德乳酪。表7表明各个步骤中L.gasseri和其它细菌的数量。这种高德乳酪采用Eval聚乙烯尼龙膜层真空包装并保存在5℃和10℃环境中。包装后6个月内每隔1个月对L.gasseri和其它细菌的数量进行检测。
结果表明，L.gasseri从制备之日起显著增加。证实6个月内含L.gasseri的乳酪中心部位细菌数量保持108cfu/克(8.0 log cfu/克)或以上。乳酪制备之日L.gasseri的数量和其它细菌几乎一样。但是制备后接下来的3个月内，只有L.gasseri的数量增加且维持在较之其它细菌较高的水平。也就是说，证实除了实施例2中制备高德乳酪的过程，在乳凝块形成之前添加酵母提取物以及乳凝块压榨后的熟化能有效促进L.gasseri的生长。由此获得的高德乳酪含40％水分，26％脂肪，26％蛋白质和1.5％氯化钠。这种乳酪不存在口味上需要关注的任何问题(表9)。
表7制备强化L.gasseri OLL 2716的高德乳酪过程中细菌数量的变化
表8L.gasseri OLL 2716-强化高德乳酪保存过程中细菌数量的变化
LGL.gasseri表9强化L.gasseri OLL 2716的高德乳酪的成分和口味
实施例4含L.gasseri的细绳乳酪的制备方法实施例3得到的2千克乳酪凝块制备完成后第二天，浸入盐水之前，切成2厘米见方的小块，倒入细网孔金属篮中浸泡在60℃的10千克水中5分钟。然后将乳酪从水中取出，手捏粘成块。随后将凝块做成圆柱形并水平拉成直径为3厘米的圆柱形凝块。然后立即浸入2℃的20％的盐水中1小时以固定纤维。由此得到纤维性乳酪(细绳乳酪)。然后采用Eval聚乙烯尼龙膜层真空包装这种纤维性乳酪。包装后3个月内每隔一个月检测L.gasseri和其它细菌的数量。这样证实制备完成后的3个月内L.gasseri的量保持在108cfu/克(8.0 log cfu/克)或以上的水平(图4)。细绳乳酪具有上佳的口味和纤维质地。
表10强化L.gasseri OLL 2716的高德乳酪的成分和口味
实施例5含L.gasseri乳酪的抵抗H.pylori的效果实施例3制备的含L.gasseri乳酪5克，其采用Eval聚乙烯尼龙膜层真空包装，5℃保存5个月，加入45克生理盐水，用搅拌机(商品名Lab-Blender 400，购自A.J.Seward)混合均匀。取5ml这种液体混合物，分别加入pH调节至6的布鲁氏肉汤50ml，FCS(小牛血清)2.5ml以及5ml单独培养的H.pylori，在37℃略酸性环境中培养。作为对照，将另外一种未加入L.gasseri，以同样方式保存的高德乳酪采用同样方法处理。培养开始后的0、24和48小时分别测定H.pylori和L.gasseri的量。当用含L.gasseri乳酪培养，作为结果H.pylori的数量降至检测极限以下(图5)。
试验例1L.gasseri的耐盐试验试管中加入一定量的10％脱脂乳培养基，其中氯化钠浓度在2到10％之间(高压灭菌后与氯化钠混合)，接种L.gasseri OLL 2716至浓度为2×107cfu/克。35℃静态培养24小时后测定其中的细菌数量。当氯化钠浓度为2％时，细菌的增长正常。当氯化钠浓度在3到4％之间，细菌增长速度缓和。当氯化钠浓度为5％，细菌几乎处在静止状态。当氯化钠浓度在6％以上，细菌数量下降。以乳酪中氯化钠/水分的比例表示，上述结果意味着当乳酪中氯化钠含量为0.5％时，细菌增长正常，当浓度在1％时，细菌生长速度放慢，当浓度在1.25％时，细菌几乎保持静止状态，当浓度在1.5％或以上，细菌数量下降。因此证明高德乳酪中加入的盐水的量优选控制在氯化钠含量在2％或以下(图6.)。
试验例2酸性条件下不同菌类的生长各种乳酸杆菌均通过置MRS肉汤中37℃培养18小时两次，活化。各取10μl接种至改良的MRS肉汤中，这种改良MRS肉汤是在MRS肉汤中溶解0.2％的NaCl和0.35％胃蛋白酶(1∶5000，Tokyo Kasei KogyoCo.生产)并调节pH值至4.0得到，随后在37℃有氧环境中培养细菌。培养开始时以及9小时后测定每种培养基的浊度(OD650)，由此检测浊度(ΔOD650)的增加。
在此方法中，在低pH值下测试对人工胃液高耐受的类细菌菌株的生长。结果表明，L.gasseri OLL 2716和L.gasseri 6号的生长情况良好，而L.gasseri OLL 2716的生长最好。
图7表明试验的结果。
试验例3L.gasseri对感染H.pylori小鼠的作用无菌小鼠(BALB/c)口服给予H.pylori NCTC 11637，每天一次，每次1×109cfu/只，连续三天。4星期后，感染H.pylori的小鼠再分别口服给予L.gasseri OLL 2716、L.gasseri 6号以及L.salivarius WB1004连续7星期，每星期一次，每次1×109cfu/只。给于乳酸杆菌8个星期后测定小鼠胃内的H.pylori数量并化验血清中抗H.pylori抗体的滴度。
给于乳酸杆菌8个星期后，仅给予H.pylori的对照小鼠胃内容物中H.pylori数量为1×105cfu/克，而分别给予L.gasseri OLL 2716和L.salivarius的小鼠胃内容物中H.pylori数量降至检测极限以下(1×103cfu/克胃内容物)。给予L.gasseri OLL 2716的小鼠血清中抗H.pylori抗体滴度最低。
因此，观察到知L.gasseri OLL 2716对感染H.pylori的小鼠胃内H.pylori的抵抗作用最强。
图8和图9表明试验结果。
虽然参考本发明的具体实施例，本发明得以详尽描述，但对本领域的普通技术人员来说，明显可以在不脱离本发明的精神和范围内进行各种改变和改良。引证的所有参考文件全部结合在此作为参考。
本申请基于2002年4月12日提交的日本申请2002-111083号和2002年7月23日提交的日本申请2002-21338号，它们的全部内容在此作为参考。
工业实用性根据本发明，能够得到一种含乳酸杆菌的天然乳酪，这种能够高效抵抗H.pylori的乳酸杆菌属于L.gasseri，能耐受低pH环境，具有高存活率。这种天然乳酪中存活的L.gasseri能够保持很长时间。而且与普通乳酪一样可以口服。因此，适合健康人群以及儿童、婴儿、老人、体弱多病的人以及处于康复期的病人等长时期服用，并能有效预防和/或治疗胃炎、胃溃疡等。
如上文所述，通过在乳酪的制备和保存中按照制备和保存的标准进行，L.gasseri的数量能够维持在足够的水平上。而且，在上述的制备过程中增加添加酵母提取物步骤和/或乳凝块成形压榨后的熟化步骤，能进一步加强L.gasseri的繁殖活性和存活率。因此，乳酪中L.gasseri的生长较其它乳酸杆菌占优势，且能长时间保存细菌数量。所以甚至只摄入一小块乳酪就能获得所需细菌数量的L.gasseri。从这点出发，本发明被认为具有广阔的应用前景。
权利要求
1.一种天然乳酪，其特征在于含有一种具有抵抗幽门螺旋杆菌能力，属于加氏乳酸杆菌的乳酸杆菌。
2.根据权利要求1所述的天然乳酪，其特征在于所述乳酸杆菌能够耐受低pH环境。
3.根据权利要求1或2所述的天然乳酪，其特征在于所述乳酸杆菌是加氏乳酸杆菌OLL 2716(FERM BP-6999)或其突变体。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的天然乳酪，其特征在于所述乳酸杆菌在10℃或以下保存6个月时，其存活量在107cfu/g或以上。
5.一种含有权利要求1至4中任意一项所述的天然乳酪的食品。
6.一种制备权利要求1至4中任意一项所述的天然乳酪的方法，特征在于包括在乳成分凝结成块前加入酵母提取物，和/或在成形和压榨后进行熟化乳凝块。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述乳凝块成形和压榨之后的熟化不需要冷却。
8.根据权利要求6或7的制备方法，其特征在于所述乳凝块在20到35℃中熟化16-26个小时。
9.根据权利要求6至8中任意一项所述的制备方法，其特征在于所述具有抵抗幽门螺旋杆菌能力，属于加氏乳酸杆菌的乳酸杆菌作为酵母加到原料乳中。
10.根据权利要求6至9中任意一项所述的制备方法，其特征在于所述乳酸杆菌是加氏乳酸杆菌OLL 2716(FERM BP-6999)或者其突变体。
全文摘要
含有加氏乳酸杆菌的天然乳酪，这种乳酪具有抵抗幽门螺旋杆菌的能力，和制备这种天然乳酪的方法。
文档编号A61P31/04GK1646026SQ0380831
公开日2005年7月27日 申请日期2003年4月11日 优先权日2002年4月12日
发明者林俊次, 相泽茂, 竹友直生, 中坪正, 松永典明, 木村胜纪 申请人:明治乳业株式会社