专利名称：包膜微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有外源核苷酸序列的微生物，借助其能表达有抗增生或细胞毒素作用的表达产物，此外本发明还涉及将这种微生物用于生产药物组合物的用途，一种质粒以及一种生产这种微生物的方法，以及这种微生物的应用。
背景技术：
和现有技术在基因治疗领域，毒性降低的微生物如基因修饰的病毒，或是毒性削弱的细菌，作为外源核酸序列的载体有着日益重要的意义。
出于基因治疗的目的，可以将外源核酸在体外引入到组织细胞中并让患者施用这些细胞，也可以将微生物注射到患者体内，希望这些微生物能作为基因载体将外源核酸传输到所需的组织细胞中。
微生物是颗粒。在注射到生物体中后，这些颗粒绝大多数都被所谓的网状内皮系统吸收了。为了在目标组织中仍然能对抗该消除机制而实现用作基因载体的微生物的富集，就要将微生物与细胞特异性的配体一起提供。但是至今，尽管采用了这种提供方法，但网状内皮系统对微生物的消除却只能在很小程度上降低。
基因治疗的主要研究目的就在于治疗增生性疾病——如肿瘤、白血病、慢性炎症、自身免疫病和器官移植的排异反应——尽管药物治疗是富有成效的，但是对它们的治疗还是显得不够。例如，尽管外科手术、放射疗法、化学疗法和免疫疗法在治疗肿瘤方面都是富有成效的，但是迄今为止却无法治晚期的头颈部、中枢神经系统、乳腺、肺部、胃肠道、肝部、胰腺、肾、皮肤、卵巢和前列腺的肿瘤。
对于肿瘤治疗缺乏成效的原因是多方面的，并且仍然还未能全面了解。但是主要的原因在于i)肿瘤细胞以先(最初)就存在着的抵抗体内所能达到的化学治疗剂、辐射或抵抗免疫治疗剂浓度的能力，ii)在治疗的反应过程中形成的抵抗各种治疗剂的能力。这种诱导出来的，即所谓继发抗性是由肿瘤细胞的遗传变异性引起的，这可能使得由于抵抗机理的作用，消除了肿瘤治疗剂的作用效果，iii)至今所采用的肿瘤治疗剂在药物代谢动力学和/或药物动力学方面还有不足，由于这个原因，无论其是否是原发肿瘤、复发肿瘤或转移肿瘤，每种肿瘤治疗剂浓度肯定过低，不足以消除肿瘤。肿瘤治疗剂的这些不足主要在于，iv)过高的分配体积，v)在肿瘤或肿瘤细胞上富集不足，vi)缺乏渗透入肿瘤的能力和/或vii)在整个生物体上存在着毒性作用，这种毒性作用就限制了为提高肿瘤上富集量而增加剂量的做法。
在过去曾应用不同的方法以试图在肿瘤上富集肿瘤治疗剂。
肿瘤细胞特异性的配体，例如连接在细胞抑制剂、有抗癌作用的细胞因子、细胞毒性蛋白质或同位素上的抗体或其分裂产物，虽然会使得细胞毒性作用物质富集在肿瘤而非普通组织上，但是这种富集程度在绝大多数情况下还不足以治疗肿瘤(参见Sedlacek等人，Contributions to Oncology 431-145，1992；Carter，Nature Reviews Cancer 1118-129，2001)。
结果是拟定出了扩增体系，借助这个体系就能提高各种活性物质在肿瘤上的浓度。
扩增体系的目的在于将某些酶带入到肿瘤中去，这些酶并通常不能进入到剩余的生物体内或者说对其是外源的，并且其又能在肿瘤中将处于无毒性的前期细胞抑制剂转化或分离为具有细胞毒性的细胞抑制剂。将酶带入肿瘤中的过程可以通过服用连接着这些酶的肿瘤细胞特异性的配体(例如以抗体衍生酶介导的前体药物治疗的形式；ADEPT)，或者是通过借助肿瘤细胞特异性或非特异性的载体而服用下针对这些酶的基因(基因衍生酶介导的前体药物治疗；GDEPT)来实现(Sedlacek等人，Contributions to Oncology 431-145，1992；Sedlacek，Critical Reviews in Oncology/Hematology 37169-215，2001；McCormick，NatureReviews Cancer 1130-141，2001；Carter，Nature Reviews Cancer 118-129，2001)。
但是现有以ADEPT或GDEPT进行的临床试验未提供满意的治疗效果。关键的问题在于i)异体酶的免疫原性，ii)抗体-酶结合体(ADEPT)的肿瘤定位率相对很小，iii)以可承受的成本并足量地制备出人源化体的抗体和人体酶组成的融合蛋白质的技术困难，iv)缺乏抗体-酶结合体或基因-载体的肿瘤渗透性和v)在体内极小的转导率，即可以表达酶基因的肿瘤结的肿瘤细胞数目，对于肿瘤治疗效果来说过小了。
另一种扩增体系是基于针对肿瘤细胞的免疫反应的诱导现象，其中特异性抗体形成性细胞和细胞毒性细胞的增生。为了诱导免疫反应，就要服用合适剂形的肿瘤抗原。其目的在于破坏明显地会在肿瘤患者身上存在的针对其肿瘤的免疫耐受性，和/或破坏肿瘤对于其自身免疫反应的抵抗力。
最近十年来，在临床上试验了大量通过将各种肿瘤抗原与佐剂相结合而得到的肿瘤疫苗接种的技术变形，但是没有给肿瘤治疗带来所期望的突破。虽然新方案，如免疫原性肿瘤特异性抗原与新型佐剂的组合施用，或者是带有肿瘤特异性抗原的树突细胞的施用，或者是编码肿瘤特异性抗原的核苷酸序列的施用首次获得了充满希望的临床效果，但是至今仍然不能说是在肿瘤治疗领域内取得了突破。
还发展了一种技术，该技术能将引入到细菌中的核酸序列的基因表达产物表达到这些细菌的细胞膜上，或者使其从这些细菌上分泌出来。这种技术的基础在于大肠杆菌(Escherichia coli)溶血素系统HlyAs，且其是革兰氏阴性菌的I型分泌系统的原型。借助HlyAs开发出一种分泌载体，该分泌载体能使蛋白质抗原有效地排出来，进入肠沙门氏菌(Salmonella enterica)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中。这种分泌载体含有任一种蛋白质抗原的cDNA，所述cDNA连接在针对HlyA-信号肽、溶血素-分泌器，hlyB和hlyD和hly特异性启动子的核苷酸序列上。借助这种分泌载体就可以将蛋白质表达到细菌的表面上。这种基因修饰的细菌能作为疫苗诱导出强于某些细菌的免疫力，所述的由被引入的核酸所表达的蛋白质停留在细胞内部(Donner等人EP1015023A，Gentschev等，Gene，179133-140，1996；Vaccine 192621-2618，2001，Hess等人PNAS 931458-1463，1996)。但是这种系统的缺点在于，由于使用了hly特异性启动子，表达到细菌外表面上的蛋白质量极其少。
还发展了一种技术，其能将质粒-DNA通过如沙门氏菌和单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)一类的载体细菌引入到哺乳动物细胞中去。被包含于这些质粒中的基因也能被表达到哺乳动物细胞中，倘若当它们处于真核启动子的控制之下时。将质粒引入到单核细胞增生利斯特氏菌中去，所述质粒含有一种针对任一抗原的核苷酸序列，其受到任一真核启动子的控制。通过引入针对特异溶菌基因的核苷酸序列，单核细胞增生利斯特氏菌就会溶解在抗原呈递细胞的细胞溶胶中，并释放出质粒，而这就会带来质粒编码的蛋白质的表达、加工和呈递并明显提高这些蛋白质的免疫原性(Dietrich等人，Nat.Biotechnol16181-185，1998；Vaccine 192506-2512，2001)。
还开发了一些本身能在细胞间繁殖的细菌的毒性削弱后的变体。例如，已将单核细胞增生利斯特氏菌，肠沙门氏菌(参见鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi))，以及这些细菌的BCG用作为能很好耐受的针对斑疹伤寒和结核病的活疫苗。这些细菌，包括它们弱化后的突变体，一般而言都是具有免疫刺激性的并能触发很好的细胞免疫反应。例如，特定量的单核细胞增生利斯特氏菌会通过TH1细胞的激活而刺激具细胞毒性的淋巴细胞增生到特定程度。这些细菌会将分泌出的抗原直接提供到抗原呈递细胞(APC，巨噬细胞和树突细胞)的细胞溶胶中，同时它们会表达具有协同刺激效应的分子并触发对T细胞的有效刺激。利斯特氏菌在吞噬体隔室内部分分解，并因此由这些载体细菌产生出来的抗原一方面能经由II类MHC分子呈递，从而诱导T-辅助细胞。另一方面利斯特氏菌会在从吞噬体中释放出来后在APCs的细胞溶胶中进行复制；于是，由这些细菌产生和分泌出来的抗原优选经由I类MHC途径呈递，由此就诱发了针对这些抗原的CTL反应。此外还能显示出，通过利斯特氏菌和巨噬细胞，天然杀伤细胞(NK)和噬中性粒细胞之间的相互作用，就能诱发这种细胞因子的表达(TNF-α，IFN-γ，IL-2，IL-12；Unanue，Curr.Opin.Immunol，935-43，1997；Meta和Paterson，J Immunol 1631449-14456，1999)，并且探测到所述细胞因子的抗肿瘤效果。因此可以通过服用被转导而用来表达肿瘤抗原的单核细胞增生利斯特氏菌来抗原特异性地抑制受试肿瘤的生长(Pan等人Nat.Med.1471-477，1995，Cancer Res.595264-5269，1999；Voest等人Natl.Cancer Inst.87581-586，1995；Beatty和Paterson，J.Immunol.1655502-5508，2000)。其中引入有针对肿瘤抗原进行编码的核苷酸序列且毒性减弱了的肠沙门氏菌，在作为肿瘤抗原表达性细菌载体口服后，能起到对于不同受试肿瘤具有特殊保护的作用(Medina等人，Eur.J.Immunol.30768-777，2000，Zoller和Christ J.Immunol.1663440-3450，2001；Xiang等人，PNAS 975492-5497，2000)。重组体沙门氏菌菌株也能起到作为预防病毒感染(HPV)的疫苗的作用(Benyacoub等人，Infect Immun 673674-3679，1999)，并且也能有效治疗由于肿瘤病毒而引起无限增殖化的小鼠肿瘤(Revaz等人，Virology 279354-360，2001)。为了治疗全身性肿瘤，就要挑选出特定的沙门氏菌菌株，该菌株能特别选择性地在肿瘤组织上繁殖(Murray等人，J.Bacteriol.1835554-5564，2001)。将编码选择的酶的核苷酸序列引入到这些沙门氏菌菌株以及大肠杆菌菌株中，并且这些细菌载体被卓有成效地在体外和体内用于受试的肿瘤系统的GEDPT(Pawelek等人Cancer Res 574537-4544，1997)。
炎症组织，特别是肿瘤组织的特征在于在大多数情况中在肿瘤中混乱进行增强血管发生。溶解的且为颗粒状的物质可以富集在这些新形成的血管中，只要它们具有较低的分配体积并因此也就具有较长的血液半衰期。这种富集过程(也即为被动导向目标)可用于治疗(Sedlacek，Critical reviews inOncology/Hematology 37169-215，2001)。
发明内容
本发明的技术目的本发明的目的在于提供一种药物组合物，该制剂在治疗增生疾病中，特别是在肿瘤治疗中能显示出更高的活性。
本发明的基本构思以及所依据的发现为解决该技术目的，本发明教导了一种有包膜的微生物，并且在其基因组中插入和表达以下成分I)一种核苷酸序列，用于对具直接或间接的、抗增生或细胞毒性活性的表达产物或对多个这种表达产物进行编码；II)一种核苷酸序列，该序列在微生物体内可激活活化序列控制下或是组成型活性地编码血浆蛋白；III)任选的一种核苷酸序列，所述序列在微生物体内可激活活化序列控制下或是组成型活性地编码细胞特异性配体；IV)一种运送系统核苷酸序列，该系统诱导成分I)和II)以及任选的III)的表达产物在微生物外表面上的表达，或者诱导成分I)的表达产物的分泌，并且诱导成分II)以及任选的III)的表达，优选具有组成型活性；V)任选的一种蛋白质的核苷酸序列，该蛋白质能将微生物溶解在哺乳动物细胞的细胞溶胶中，并且还能在细胞间释放质粒，其中至少一种或多种成分I)和VI)被包含在溶解的微生物中；以及VI)一种在微生物体内可激活的，和/或组织细胞特异性、肿瘤细胞特异性、功能特异性或非细胞特异性表达成分I)的活化序列，同时成分I)至VI)中的每个成分都可以相同或不同地出现一次或多次。
为了本发明的目的，在本发明内容中记载了优选作为基因信息载体的有包膜微生物，以及这种有包膜微生物用于预防和治疗增生疾病的用途。为此，本发明是基于以下经验和技术发展的。
因此，本发明的主题在于优选将有包膜的微生物作为治疗增生疾病的核苷酸序列的载体，其中将如下这些成分插入到微生物中I)至少一种核苷酸序列，用于对至少一种具直接或间接的、抗增生或细胞毒性活性的表达产物进行编码；II)至少一种核苷酸序列，该序列在至少一种能在微生物体内激活的活化序列的控制下对至少一种血浆蛋白进行编码；III)任选的至少一种核苷酸序列，用于在至少一种能在微生物体内激活的活化序列的控制下对至少一种细胞特异性的配体进行编码；IV)至少一种针对至少一种运送系统的核苷酸序列，该系统使得成分I)，II)和III)的表达产物在微生物外表面上表达，或者能分泌成分I)，II)和III)；V)任选的至少一种针对至少某一种蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质应能将微生物溶解在哺乳动物细胞的细胞溶胶中，并且还能在细胞间释放被包含在溶解的微生物中的质粒；以及VI)至少一种在微生物体内可激活的或至少一种组织特异性、肿瘤细胞特异性或非细胞特异性表达成分I)的活化序列。
本发明优选的实施方式成分I成分I)是至少一种核苷酸序列，用于对至少一种具直接或间接的、抗增生或细胞毒性活性的表达产物进行编码。具有直接抗增生活性的表达产物，在本发明范围内是指，例如，干扰素如IFN-α、IFN-γ、IFN-β，能抑制免疫细胞或肿瘤细胞的白细胞介素如IL-10、IL-12，前细胞凋亡(proapoptotic)肽或蛋白质，如TNF-α，FAS-配体，TNF相关的细胞凋亡诱导性配体(TRAIL)，抗体或是抗体片段，其对于引起肿瘤的免疫细胞、肿瘤细胞或组织细胞能起到抑制作用或是对其具有细胞毒性，比如那些针对如下物质的抗体i)与肿瘤相关的或是具有肿瘤特异性的抗原，ii)淋巴细胞上的抗原，如针对T-细胞受体、B-细胞受体、CD40配体的受体、B7.1或B7.2、白细胞介素如IL-1，-2，-3，-4，-5，-6，-7，-8，-9，-10，-11，-12，-13，-14，-15或-16的受体、干扰素的受体或是趋化因子如RANTES、MCAF、MIP-α、MIP-β、IL-8、MGSA/Gro、NPA-2或IP-10的受体，iii)组织特异性抗原，如针对乳腺、肾脏、痣、前列腺、甲状腺、胃粘膜、卵巢、子宫颈、膀胱细胞的组织特异性抗原，具有抗增生活性的蛋白质如成视网膜细胞瘤蛋白(pRb＝p110)或者是相关的p107和p130蛋白质或具有抗增生活性的这些蛋白质的突变体，p53蛋白质和类似蛋白质或是具有抗增生活性的这些蛋白质的突变体，p21(WAF-1)蛋白质，p27蛋白质，p16蛋白质，GAAD45蛋白质，Bc12族的具抗增生活性的蛋白质如bad或bak，细胞毒性蛋白质，如穿孔素、粒酶、制瘤素，抗反义RNA或核酶，特别是对于那些参与细胞生长或增生的mRNA，例如特别针对那些对受体、信号传送酶、参与细胞周期的蛋白质、转录因子或转运蛋白进行编码的mRNA。具有间接抗增生活性的蛋白质是，例如，急性炎症和免疫反应的诱导体，如趋化因子如RANTES(MCP-2)，单核细胞趋化活化因子(MCAF)，IL-8，巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1-α，-β)，嗜中性白细胞活化蛋白-2(NAP-2)，白细胞介素如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，人体白血病抑制因子(LIF)，IL-6，IL-7，IL-9，IL-11，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，细胞因子如GM-CSF，G-CSF，M-CSF，用以将无活性细胞毒性物质前体活化或分裂为细胞毒性物质的酶，并且这些酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶或裂解酶。这种酶的实例是β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、糖苷酶、醇脱氢酶、乳过氧化物酶、尿激酶、组织纤溶酶原激活物羧肽酶、胞嘧啶脱氨酶、脱氧胞嘧啶核苷激酶、胸苷激酶、脂肪酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、激酶、嘌呤核苷磷酸化酶、葡糖氧化酶、乳过氧化物酶、乳酸氧化酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、溶菌酶、β-内酰胺酶、氨肽酶、羧肽酶A，B或G2、硝基还原酶、细胞色素p450氧化酶。根据本发明，酶可以来自病毒、细菌、酵母、软体动物、昆虫或哺乳动物。优选使用的酶来自于人体。本发明范围内更为优选的是那些对细胞特异性配体与酶的融合产物进行编码的核酸构建体和/或抑制血管发生的蛋白质，比如纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、PAI-2或PAI-3，制管张素或血管内皮抑制素，干扰素-α，-β，或-γ，白细胞介素12，血小板因子4，血小板反应蛋白-1或-2，TGF-β，TNF-α，血管内皮细胞生长抑制剂(VEGI)。在本发明范围内，成分I)可以是一种或多种核酸序列，且其对一种或多种相同或不同的、具有直接或间接抗增生或细胞毒性活性的蛋白质进行了编码。优选结合使用那些具有辅助或协同效应的蛋白质。例如，如果使用了下述这些不同活性的蛋白质组合就能得到所期望的辅助或协同效应细胞毒性蛋白质和前细胞凋亡蛋白质，酶和细胞毒性和/或前细胞凋亡蛋白质，抗血管生成蛋白质和细胞毒性和/或前细胞凋亡蛋白质，发炎诱导体和酶或细胞毒性、前细胞凋亡和/或抗血管生成蛋白质。
成分II成分II)是一种核苷酸序列，用于在一种能在微生物中激活的活化序列的控制下对至少一种血浆蛋白质编码。优选使用的是人体血浆蛋白质，更确切地说是那些平均血液停留时间超过24小时的蛋白质。属于这种蛋白质的特别优选的例子是白蛋白(核苷酸1-2258，Hinchliffe等人，EP0248637-A，9.12.1987)，运铁蛋白(核苷酸1-2346，Uzan等人，Biochem Biophys ResCommunl 19273-281(1984)，Yang等人，PNAS-USA，812752-2756(1984))，血浆铜蓝蛋白(Baranov等人，Chromosoma 9660-66，(1987))，触珠蛋白(核苷酸1-1412，Raugei等人，Nucleic Acids Resll5811-5819，(1983)；Yang等人，PNAS-USA 805875-5879，(1983)；Brune等人，Nucleic Acids Res 124531-4538(1984))，血红蛋白α(核苷酸1-576；Marotta等人，PNAS-USA712300-2304(1974)Chang等人，PNAS-USA 745145-5149(1977))，血红蛋白β(核苷酸1-626；Marotta等人，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.19165-175(1976)；Marotta等人，J.Biol.Chem.2525019-5031(1977))，α2巨球蛋白(核苷酸1-4599；WO9103557-A，21.03.1991)。但属于此类的还有其他一些血浆蛋白，如α1脂蛋白，α2脂蛋白，β1脂蛋白。用本发明的微生物表达至少一种这些血浆蛋白的结果在于，在全身用药，特别是在注射入血液循环系统中之后，被吞噬细胞吸收的微生物量更为微小，这样它们就能更长时间地停留在血液中并能富集在肿瘤脉管系统或慢性炎症的脉管中。
成分III)成分III)是一种核苷酸序列，其在能在微生物中激活的活化序列的控制下对一细胞特异性配体进行编码。这种配体的特异性取决于要施用微生物的增生性疾病的种类，和微生物中成分I)应与其相接触从而获得疗效的细胞或组织。因此例如在肿瘤疾病中要使用肿瘤细胞的特异性配体，所谓的肿瘤细胞即是指与肿瘤相关或肿瘤特异性抗原或肿瘤内皮细胞，或者是产生各种肿瘤的组织细胞，例如甲状腺、前列腺、卵巢、乳腺、肾脏、胃粘膜、痣、子宫颈、膀胱的细胞；而如果是慢性炎症，细胞自身免疫病和器官移植排异反应，则所用的配体必须具有针对巨噬细胞、树突细胞、T-淋巴细胞的特异性，或者是具有针对活化内皮细胞的特异性。这些配体是，例如，特异性抗体，或是连有抗原的这种抗体的片段，生长因子，白细胞介素，细胞因子或选择性地连接在肿瘤细胞、白血病细胞、肿瘤内皮细胞、组织细胞、巨噬细胞、树突细胞、T-淋巴细胞或活化内皮细胞上的细胞粘附分子。
成分IV)成分IV)是一种针对运送系统编码的核苷酸序列，该系统使得成分I)和II)和/或III)的表达产物表达在微生物外表面上。这里，各个成分可任选地分泌出来或表达到微生物的膜上，即膜结合的。优选以膜结合的方式表达成分II)和III)。这种类型的运送系统优选是大肠杆菌的溶血素运送信号(含有HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列，并受到hly特异性启动子的控制，Gentschev等人Gene，179133-140，1996)。可以使用以下的运送信号在有HlyB和HlyD蛋白质存在的情况下，用于分泌的C末端HlyA-运送信号；在有HlyB蛋白质存在的情况下，用于膜结合表达的C末端HlyA运送信号；大肠杆菌的溶血素运送信号(含有HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列，并受到一种非hly特异性细菌启动子的控制)；针对新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)的S-层蛋白质(Rsa A)的运送信号；针对分泌和膜结合表达的C末端RsaA-运送信号(Umelo-Njaka等人Vaccine，191406-1415，2001)；针对大肠杆菌的TolC-蛋白质的运送信号(Koronakis等人(Nature，405914-919，2000)和Gentschev等人(Trends in Microbiology，1039-45，2002)对TolC-蛋白质的描述)；针对膜结合表达的N封端传输信号。
成分V)成分V)是一种对至少一种裂解蛋白编码的核苷酸序列，其中该蛋白质被表达到哺乳动物细胞的细胞溶胶中，并且溶解微生物以将质粒释放到宿主细胞的细胞溶胶中去。这种裂解蛋白(细胞内溶素)是，比如，利斯特氏菌属特异性的裂解蛋白如PLY551(Loessner等人Mol.Microbiol.161231-41，1995)，受到利斯特氏菌启动子控制的利斯特氏菌属特异性的Holin。本发明的一个优选实施方式是各种不同成分V)的组合，如裂解蛋白和Holin的结合。
成分VI)成分VI)是任一活化序列，该序列控制着成分I)的表达。要在微生物外表面上表达成分I)，成分VI)是技术人员公知的、且在细菌内能激活的活化序列。这种活化序列是，比如，有着组成型活性的启动子区，如带有大肠杆菌的β-内酰胺酶基因或tetA基因的“核糖体结合部位”(RBS)的启动子区(Busby和Ebright，Cell 79743-746，1994)，可诱导的启动子，优选那些在吸收入细胞中后还有活性的启动子。属于后者的有单核细胞增生利斯特氏菌的actA启动子(Dietrich等人，Nat.Biotechnol.16181-185，1998)或是S.monodytogenes的pagC启动子(Bumann，Infect.Immun.697493-7500，2001)。优选的活化序列会在将细菌载体的质粒释放到目标细胞的细胞溶胶中之后，在这些细胞内激活。例如可以使用CMV-增强子，CMV-启动子，SV40启动子或其他各个技术人员所公知的启动子序列或增强子序列。进一步优选的是细胞特异性或功能特异性的活化序列。细胞特异性或功能特异性活化序列的选择取决于这样的一些细胞或组织，在其中那些细菌载体或由细菌载体释放的质粒表达成分I)。这种活化序列是，例如，与肿瘤细胞有关的活化序列(属于这种活化序列的有Midkine、GRP、TCF-4、MUC-1、TERT、MYC-MAX、表面活性蛋白质、α-胎蛋白、CEA、酪氨酸酶、原纤酸蛋白、EGR-1、GFAP、E2F1、碱性髓磷脂、α-乳白蛋白、骨钙素、甲状腺球蛋白和PSA的基因活化序列(McCormick，Nature Reviews Cancerl130-141，2001))，内皮细胞特异性的活化序列(属于这些的有优选由内皮细胞表达的蛋白质的基因活化序列(Sedlacek，Critical Reviews in Oncology/Hematology 37169-215，2001)如VEGF、von Willebrand因子、脑特异性的内皮葡糖-1-转运蛋白、Endoglin、VEGF-受体，特别优选VEGF-R1、VEGF-R2和VEGF-R3、TIE-2、PDECGF-受体、B61、内皮素-1、内皮素-B、甘露糖-6-磷酸受体、VCAM-1和PECAM-1)，优选被表达到产生患者肿瘤细胞的组织细胞中的蛋白质的基因活化序列(属于此类的有被表达到胸部组织(如MUC-1，α-乳白蛋白)、甲状腺(如甲状腺球蛋白)、前列腺(如激肽释放酶-2，雄激素受体，PSA)、卵巢、痣(如酪氨酸酶)和肾脏细胞中去的蛋白质)，被表达到巨噬细胞、树突细胞或淋巴细胞中的蛋白质的基因活化序列，比如白细胞介素，细胞因子，趋化因子，粘附分子，干扰素，用于白细胞介素、细胞因子、趋化因子或干扰素的受体，缺氧时被激活的活化序列，如VEGF或促红细胞生成素的活化序列。
采用技术人员公知的分子生物学方法将成分I)至VI)插入到微生物体内。例如，如果使用细菌作为载体，则技术人员熟知如何将成分插入到合适的质粒中并将这些质粒引入到细菌中。
根据本发明，给患者施用这些微生物，用以预防或治疗增生性疾病，如肿瘤、白血病、慢性炎症、自身免疫病或器官移植后的排异反应。为治疗这类疾病，就要将本发明的微生物以适当的制剂形式局部或全身施用，比如对血液循环系统、体腔、器官、关节或结缔组织施用。为了在全身施用，特别是在对血液循环系统施用时，降低在成分II)的作用期间由所谓的网状内皮系统对微生物的不需要的吸收，同时也为了延长微生物的血液停留时间，可以将微生物悬浮在具有较长血液停留时间的物质溶液中。悬浮之后进行培养。微生物的悬浮和培养可以在比如血浆或血清中进行。但悬浮和培养过程优选在具有较长血液停留时间物质溶液或此种物质混合物的溶液中进行。属于这种物质的例如有白蛋白、运铁蛋白、前白蛋白、血红蛋白、触珠蛋白、α-1-脂蛋白、α-2-脂蛋白、β-1-脂蛋白、α-2-巨球蛋白、聚乙二醇(PEG)、PEG和天然或合成聚合物，如聚乙烯亚胺、右旋糖酐、polygeline、羟乙基淀粉的缀合物。
通过在这种溶液中的悬浮和培养，物质就会吸附到本发明的微生物表面上。但也可以通过缀合而将这种物质涂覆到微生物上去。缀合的各种方法汇总结在Sedlacek等人的Contributions to Oncology 321-132，1988中。
通过吸附而实现涂层的过程可以按如下方式进行，即将微生物悬浮于含有优选0.1至50％的涂层物质的溶液中，优选放置10分钟至24小时，并且温度优选为4℃。
根据本发明，优选作为微生物的是毒性降低了的细菌。进一步优选的细菌选自大肠杆菌、肠沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、霍乱弧菌、单核细胞增生利斯特氏菌、志贺氏菌属(shigella)。
更进一步地，本发明范围内的微生物是活着或存在着微生物的膜套，即所谓的空胞。这种膜套可以根据，比如，EPA0540525制备得到。
本
发明内容
还在于一种包含本发明微生物的药物组合物，以及这种药物组合物用来预防和/或治疗增生性疾病的用途。在本发明范畴内，所谓的增生性疾病是指有着细胞增生过度或不可控制症状的疾病，例如肿瘤疾病如癌或肉瘤，白血病，慢性炎症，自身免疫病或器官移植的排异反应。为预防或治疗疾病，就要对患者局部或全身施用本发明药物组合物中的微生物，并且剂量优选为100个微生物至10亿个微生物。
术语有包膜是指，在微生物膜的外侧面上可以如上所述地放置有大量相同或不同的分子(根据特征I)至III)的一个或多个表达和/或分泌的)，其中几何覆盖度可以在0.001和1之间，优选在0.01和1之间，例如在0.1和1之间。几何覆盖度可以从所有分子在微生物表面内的放射(以微生物的中心点计)投影总面积与微生物表面积之商计算得到。通常可以简化地假设微生物具有一球形表面并且能从微生物的体积计算得到。特征“包膜”适当时还是可选择的。
具体实施例方式
实施例实施例1构造用于对人体白蛋白和β-葡糖醛酸糖苷酶进行膜结合表达的菌株在本实施例中记载的是得到菌株St21-bglu的方法。这种经弱化的伤寒沙门氏菌Ty21a的菌株(允许用于人体的载体)利用大肠杆菌的hly分泌机构来表达人体β-葡糖醛酸苷酶和hylA以及人体白蛋白和hylA的膜结合融合蛋白。构造过程是根据已经公开的质粒pMOhlyl(Gentschev等人，Behring Inst.Mitt.57-66，1994)和pGP704(Miller和Mekalanos，JBacteriol.1702575-2583，1988)。该菌株使得可以通过被动导向目标(Bermudes等人，Adv.Exp.Med.Biol.46557-63，2000)在肿瘤上富集β-葡糖醛酸糖苷酶，并因此也能实现可被β-葡糖醛酸糖苷酶激活的前体药物局限在肿瘤组织上的分裂。
膜结合表达过程可以按以下方式进行，即在沙门氏杆菌中于HlyA分泌蛋白质的C端上融合蛋白质，条件是存在有HlyB蛋白，但不存在有完全功能化的HlyD蛋白。但是HlyD也不允许完全缺失，否则在分泌机构和外层膜上的TolC蛋白间不会形成连接(Spreng等人，Mol.Microbiol.311596-1598，1999)。在这些实施例中还描述了一种可能的HlyD蛋白质的改性，用以进行膜结合表达。因此首先要构造一个载体pMOhly DD，并其中不生产出功能化的HlyD蛋白质。为此就要从载体pMOhlyl中通过内切核酸酶DraIII和ApaI而去除出一部分hlyD基因。在限制酶切消化后，末端就被3’-5’外切核酸酶消化了，并再连接10923bps大的片段。接着在该载体内将β-葡糖醛酸糖苷酶基因符合读框地克隆入hlyA基因。为此就要通过聚合酶链反应(PCR)用以下引物来扩增选自cDNA库的bglu cDNA(GenBank Accession(Gb)M15182)bglu 5′ATGCATTGCAGGGCGGGATGCTGTACCbglu 3′ATGCATAAGTAAACGGGCTGTTTTCCAAAC互补于β-葡糖醛酸糖苷酶的cDNA的区域是加有下划线的部分，而所产生的NsiI位置的信息则以斜体表示(以下内容也应用了这种表示方法；此处及以下的寡核苷酸序列表示为5’-3’)。引物的选择要使得无需信号序列就能扩增基因。利用合适的“PCR克隆试剂盒”对产物(1899bps)进行亚克隆，然后经由NsiI消化提取出～1890bps片段。接着在NsiI切割的载体pMOhly DD中克隆NsiI片段，于是便形成了载体pMO DDbglu(
图1)。(如果在NsiI切割的载体pMOhlyl中克隆NsiI片段，则会形成质粒pMO bglu，其能分泌融合蛋白质)。在第二部分中制备出用于白蛋白-HlyA融合体的染色体整合的整合载体。第一步制备载体pMOhlyalb。该pMOhlyl基载体载带着白蛋白-cDNA与hlyA基因的融合体。为进行克隆，就要借助PCR和以下产生NsiI的引物扩增市售的cDNA库的白蛋白基因的cDNA(GbA06977)。
5′ATGCATGGGTAACCTTTATTTCCCTTC3′ATGCATAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-对1830bps大片段进行亚克隆并接着用NsiI对其切割。于是1824bps的片段就被连接在NsiI消化的pMohlyl中。因此制得的质粒pMOhly alb表达HlyB，HlyD和一种由白蛋白和HlyA构成的融合蛋白质。为试验停留时间，也可以在名称为pMO Ddalb的载体pMO DD中交替插入NsiI片段。在其他过程中则要使用用于在沙门氏菌染色体中进行整合的已有记载的克隆方法的修改方案(Miller和Mekalanos，J Bacteriol 1702575-2583，1988)。为此就首先要在载体pUC18中克隆沙门氏杆菌的aroA基因(用以下的引物进行PCR引物5′ATGGAATCCCTGACGTTACAACCC，引物3′GGCAGGCGTACTCATTCGCGC在pUC18的HincII界面内平端克隆1281bps的片段)。然后通过HincII消化和接着的再连接作用去除341bps大小并存在于aroA中的片段。该载体称作pUC18 aroA’。接着在载体pUC18aroA’中克隆alb-hlyA融合基因和位于pMOhly上的启动子序列。为此，用AacH和SwaI消化载体pMOhly alb并接着用3′-5′外切核酸酶进行处理。提取3506bps大小的平端片段并连接到HincII消化的pUC18 aroA’中，于是就得到了载体pUCaro-alb。再在载体pGP704中克隆位于aroA侧面的alb-hlyA片段以及来自于载体pUCaro-alb的全部激活剂序列。为此，用HindIII消化pUC aro-alb并接着用5’-3’外切核酸酶进行处理(平端的)。接着再用EcoRI消化，并将4497bps的片段连接到EcoRI/EcoRV(平端的)消化的载体pGP704(EcoRI/RV片段6387bps)中。于是也就形成了整合载体pGParo-alb(图2)。将载体转化入大肠杆菌菌株SM101pir。该菌株使得载体能够复制，因为其形成了用于复制所必需的p-蛋白。于是现在载体就经由接合作用而被转移到受体菌株伤寒沙门氏菌Ty21a中去，且该受体不允许对载体进行复制。因此通过四环素选择法只选择出了染色体整合了载体的细菌。对细胞质白蛋白产品的证实可以通过细菌溶解产物的蛋白质印迹分析法来进行。虽然该菌株，St21-alb，表达了alb-hlyA融合体，但是这种形式的融合体既不能分泌又不能进行膜结合表达。为此，对于膜结合表达，还必须另存在一种带有功能性的HlyB(如pMO DDbglu)或功能性的HlyB和HlyD(如pMObglu)的质粒。
在该实施例中使用质粒pMO DDbglu和菌株St21-alb。而这就能得到菌株St21-alb pMO DDbglu，且该菌株借助Hly分泌系统能以膜结合的方式表达人体白蛋白以及人体β-葡糖醛酸糖苷酶。然后再将该菌株用于符合本专利思想的前体药物的转化过程。
实施例2构造为白蛋白-HlyA融合体所包膜的细菌菌株，用以提供人体β-葡糖醛酸糖苷酶的遗传信息。
在该实施例中所描述的细菌菌株应该借助被动导向目标将对人体β-葡糖醛酸糖苷酶编码的DNA提供到肿瘤细胞上去，然后将该DNA表达到肿瘤细胞中去。为得到一种特别易于施用的菌株，在本实施例中使用了一种如实施例1中的略微改性的菌株来对白蛋白进行膜表达。该过程中既应编码白蛋白-hlyA的基因进行染色体整合，也应对hlyB的信息进行染色体整合。因此该菌株组成型表达膜结合的白蛋白。
为达到该目的，通过BsrBI和EcoRI消化上述的载体pMOhly alb，接着用5′-3′外切核酸酶进行处理。这种消化就产生了一种5815bps大小并带有平端的片段，且该片段含有完全的原核细胞生物的活化序列和基因hlyC，alb-hlyA和hlyB，但是不含有hlyD。可以将该片段平端插入到上述载体pUC18aroA’的HincII界面。这样就形成了载体pUCaro-alb-B。通过EcoRI-NruI消化就能再次将6548bps的片段插入到EcoRI-EcoRV消化的载体pGP704中(图3)。然后所进行的其他工艺步骤(在伤寒沙门氏菌Ty21a中复制和整合)与上述作法一致。所得的菌株St21-alb-B组成型表达膜结合的白蛋白-HlyA融合蛋白。如果转化对HlyD编码的载体，就能分泌出白蛋-hlyA融合蛋白来。用以提供对β-葡糖醛酸糖苷酶进行编码的DNA的质粒基于市售的载体pCMVβ(Clontech)。为进行构造，首先必须使用一种bglu基因和分泌信号的融合体。在该实施例中应使用tPA前体分子的信号肽。这种信号肽能得到特别有效的产品并实现分泌融合蛋白。为克隆融合体，在第一步中用以下引物在PCR上扩增tPA cDNA的5’UTR(GbE02027)直至信号肽编码区的末端(采用能产生平端的聚合酶进行扩增)5′GCGGCCGCAGGGAAGGAGCAAGCCGTGAATTT3′AGCTTAGATCTGGCTCCTCTTCTGAATC将所形成的166bp的片段连接到HindIII消化的，5′-3′外切核酸酶处理的，市售的载体pCDNA3(Invitrogen)中。这种连接反应沿着正后进行。由此，tPA信号序列编码区能通过NotI消化过程而完全从所形成的质粒pCDNAtp中分割出来。在NotI消化后，该237bps的片段与载体pCMVβ的3760bps的片段(含有载体主链)相连接。所形成的质粒pCMVtp(3972bps)能被用于表达异源融合蛋白。为产生质粒pCMV bglu，就要利用以下产生SpeI的引物来扩增选自合适的cDNA库的bglu基因(无信号肽的序列)的bps片段(Gb M15182)5′ACTAGTCAGGGCGGGATGCTGTACCCCCAG3′ACTAGTCTTGCTCAAGTAAACGGGCTGTTTTC.
在SpeI消化后将1899bps的片段连结入SpeI消化的载体pCMVtp中。现在所形成的质粒pCMVtp bglu会对N末端的tPA信号肽与β-葡糖醛酸糖苷酶的成熟蛋白质区的融合体进行编码。在确定了正确的位置后，质粒pCMVtp bglu(图4)转化菌株St21-alb-B。该菌株可以借助被动导向目标将DNA提供到肿瘤组织上去，并且，通过转染的肿瘤细胞而表达DNA的过程也实现了合适的前体药物的转变。
实施例3构造一种被白蛋-TolC融合体包膜的菌株，其能对FAS的细胞外结构域进行膜结合表达，并且提供一种转变前体药物的酶在本实施例中描述的菌株与实施例2中所描述的性质相符，即在(肿瘤)细胞上具有一个特定的导向目标，其能表达Fas-配体(FasL)。利用该种菌株就可以，比如在某些乳腺癌内攻击表达FasL的肿瘤细胞(Herrnring等人，Histochem Cell Biol 113189-194，2000)。可以将通过肿瘤细胞的FasL的表达假设为可能的用于解释免疫逃避的机理，因为这些细胞可以除去具有攻击活性且表达fas的淋巴细胞(Muschen等人，J.Mol.Med.78312-325，2000)。利用这里提及的菌株可以定向攻击那些治疗问题很大的肿瘤细胞，接着通过不依赖细胞凋亡的机理将其除去。在该实施例中，这种载体菌株基于一种白蛋白和大肠杆菌的TolC蛋白的融合体。由此就能实现对白蛋白的膜结合表达。Fas的胞外结构域的膜结合表达则通过质粒pMOhlyDD进行，并且将上述的质粒pCMV-bglu用于进行提供。第一步包括产生表达TolC-白蛋白的载体菌株。为此，首先要产生融合蛋白的基因，接着根据上述实施例将该基因经由连续的克隆整合入沙门氏菌基因组中的pUCaroA′和pGP704。大肠杆菌的TolC基因连同天然启动子都存在于质粒pBRtolC中。利用来源于载体pAX629(含有tolC基因，载体中对应于Gb X54049 Pos.18-1914的区域)的以下产生SaII的引物对它们进行扩增5′tolTAACGCCCTATGTCGACTAACGCCAACCTT，3′tolAGAGGATGTCGACTCGAAATTGAAGCGAGA.
在分裂后利用SalI将1701bps的片段逆向连接到载体pBR322(GbJ01749)的SalI界面内，由此断开tet基因。由于已知的TolC的结晶结构(Koronakis等人，Nature 405914-919，2000)，如果将异源性DNA插入到tolC基因的单个KpnI界面内，就能实现被编码的异源性融合蛋白以外膜上的细胞外环形式表达。为表达白蛋白，就要借助以下产生KprI的引物从cDNA(Gb A06977)扩增白蛋白基因5′GGTACCCGAGATGCACACAAGAGTGAGG3′GGTACCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC.
在KpnI消化了1770bps的片段后，就能将DNA插入KpnI切割的载体pBRtolC内。然后再反向定向(与tolC符合读框)就得到了载体pBRtolC-alb。tolC-白蛋白融合体的基因可以经由EcoRV和PshAI(片段3970bps)沿着相反的方向连接到载体pUCaroA’的HincII界面内。再用HindIII对所形成的载体pUCaro-alb-tol(7596bps)进行线性化，用5′-3′外切核酸酶处理并接着用EcoRI进行消化。然后将496lbps片段插入EcoRI-EcoRV消化的载体pGP704中(图5)。在经过接合后(根据实施例1)就得到了菌株St2l-tol-alb。现在，该质粒可用于借助大肠杆菌I型分泌机构的hlyB成分对Fas(CD95)-HlyA融合蛋白进行膜结合表达。对此，首先就要用以下产生NsiI的引物扩增Fas-基因(GbM67454)的对细胞外区域进行编码的片段5′ATGCATTATCGTCCAAAAGTGTTAATGC3′ATGCATTAGATCTGGATCCTTCCTCTTTGC.
用NsiI消化477bps片段并与HlyA基因符合读框地插入NsiI消化的载体pMOhly DD中。因此在转化入沙门氏菌菌株之后，所形成的载体pMO DD-fas(图6)就会产生一种膜结合的Fas-片段，其能在合适的折叠情况下连接到表达FasL的细胞上。由此，这些沙门氏菌就能富集在表达FasL的细胞上，比如肿瘤细胞。
现在，同样要将质粒pCMV bglu(实施例2)转染到沙门氏菌中去，用以杀死FasL肿瘤细胞。于是，就如上述实施例中一样，在通过肿瘤细胞表达出β-葡糖醛酸糖苷酶之后，就能实现一种借助前体药物-药物的肿瘤治疗方法。在本实施例中能否较之于先前的实施例获得更好的疗效，完全并且是很关键地取决于Fas细胞外结构域的正确折叠。作为对Fas的替代，也可以在此处所述的相同方法中应用单克隆抗体的FasL特异性Fab-片段(其本身在细菌中可以正确折叠)。本实施例表明，借助这种技术，通过使用合适的特殊Fab片段就能构造出具有几乎任意细胞特异性的菌株。
附图的简要说明图1载体pMO Dbglu图2载体pGParoalb图3pGParo-alb-B图4pCMVtp bglu图5pGParo-alb-tol图6pMO DD-fas
权利要求
1.微生物，在其基因组中插入和可以表达以下成分I)一种核苷酸序列，用于对一种具直接或间接的、抗增生或细胞毒性活性的表达产物或对多个这种表达产物进行编码；II)一种核苷酸序列，该序列在微生物体内可激活的活化序列控制下编码血浆蛋白，或是具有组成型活性的；III)任选的一种核苷酸序列，该序列在微生物体内可激活的活化序列控制下编码细胞特异性配体，或是具有组成型活性的；IV)一种运送系统核苷酸序列，该系统诱导成分I)和II)以及任选的III)的表达产物在微生物外表面上的表达，或者诱导成分I)的表达产物的分泌，并且诱导成分II)以及任选的III)的表达，优选它们是具有组成型活性的；V)任选的一种蛋白质的核苷酸序列，该蛋白质能将微生物溶解在哺乳动物细胞的细胞溶胶中，并且还能在细胞间释放质粒，其中至少一种或多种成分I)和VI)被包含在溶解的微生物中；以及VI)一种在微生物体内可激活的，和/或组织细胞特异性、肿瘤细胞特异性、功能特异性或非细胞特异性表达成分I)的活化序列，其中成分I)至VI)中的每个成分都可以相同或不同地出现一次或多次。
2.如权利要求1的微生物，其中的微生物是病毒、细菌或单细胞的寄生虫。
3.如权利要求1或2的微生物，其中微生物的毒性被削弱。
4.如权利要求1至3之一的微生物，其中微生物是革兰氏阳性或革兰氏阴性的细菌。
5.如权利要求1至4之一的微生物，其选自“大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、霍乱弧菌、单核细胞增生利斯特氏菌和霍乱弧菌”。
6.如权利要求1至5之一的微生物，其中的微生物是细菌的包膜。
7.如权利要求1至6之一的微生物，其中的成分I)对至少一种蛋白质进行编码，所述蛋白质选自“干扰素；白细胞介素；前细胞调亡蛋白质；抗体或是抗体片段，其对于引起肿瘤的免疫细胞、肿瘤细胞或组织细胞能起到抑制作用或是对其具有细胞毒性；具抗增生活性的蛋白质；细胞毒性蛋白质；炎症的诱导体，特别是白细胞介素、细胞因子或趋化因子；病毒、细菌的酶或来自酵母、软体动物、哺乳动物或人体的酶，用以将细胞抑制物质非活性前体活化或分解为细胞抑制物质；细胞特异性配体与酶的融合产物；和血管生成的抑制剂”。
8.如权利要求1至7之一的微生物，其中的成分II)对至少一种血浆蛋白进行编码，所述血浆蛋白选自“白蛋白、运铁蛋白、触珠蛋白、血红蛋白、α1脂蛋白、α2脂蛋白、β1脂蛋白和α2巨球蛋白”。
9.如权利要求1至8之一的微生物，其中的成分III)对至少一种对目标有机体有特异性的配体进行编码，该目标有机体选自“肿瘤细胞；肿瘤内皮细胞；引起肿瘤的组织细胞；活性内皮细胞；巨噬细胞；树突细胞；和淋巴细胞”。
10.如权利要求1至9之一的微生物，其中的成分III)对至少一种对组织的组织细胞种类有特异性的配体进行编码，这些组织选自“甲状腺、乳腺、唾液腺、淋巴腺、乳腺、胃粘膜、肾脏、卵巢、前列腺、子宫颈、膀胱和痣”。
11.如权利要求1至10之一的微生物，其中的成分IV)对大肠杆菌的溶血素运送信号；新月柄杆菌的S-层(Rsa A)蛋白质和/或大肠杆菌的TolC-蛋白质进行编码。
12.如权利要求1至11之一的微生物，其中的成分V)对一种革兰氏阳性细菌的裂解蛋白、单核细胞增生利斯特氏菌的裂解蛋白、单核细胞增生利斯特氏菌的PLY551和/或单核细胞增生利斯特氏菌的Holin进行编码。
13.如权利要求1至12之一的微生物，其上结合有具有很长的血液停留时间的物质，特别是至少一种物质，其选自于“白蛋白、运铁蛋白、前白蛋白、血红蛋白、触珠蛋白、α-1-脂蛋白、α-2-脂蛋白、β-1-脂蛋白、α-2-巨球蛋白、聚乙二醇(PEG)、PEG与天然或合成聚合物，如与聚乙烯亚胺、右旋糖酐、polygeline、羟乙基淀粉的缀合物和这些物质的混合物”，其中物质的结合通过物理吸附、化学吸附或共价形式实现。
14.质粒或表达载体，其含有成分I)、II)、IV)和VI)以及任选的一种或多种成分III)和V)。
15.用于制备如权利要求1至13任一项所述的有机体的方法，其中生产出根据权利要求14的质粒，并用这种质粒转化微生物。
16.如权利要求1至13之一的微生物用于制备药物组合物的应用。
17.将微生物用于制备药物组合物的用途，其中所述的药物组合物用于预防和/或治疗由如下原因引起的疾病，即不可控的细胞分裂，特别是肿瘤疾病，如前列腺癌、卵巢癌、乳房癌、胃癌、肾脏肿瘤、甲状腺肿瘤、黑素瘤、宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、唾液腺肿瘤和/或淋巴腺肿瘤、白血病、炎症、器官排异反应、和/或自体免疫病。
18.如权利要求17的用途，其用于除去肿瘤以及引起肿瘤的健康组织。
19.一种生产如权利要求16至18之一的药物组合物的方法，其中使如权利要求1至13之一的包膜的微生物以生理有效剂量与一种或多种具有生理相容性的载体物质一起进行制备，以用于口服、肌内、静脉内或腹膜内用药。
全文摘要
本发明涉及一种有包膜微生物，在其基因组中插入并可以表达以下成分I)一种核苷酸序列，该序列用于对具直接或间接的、抗增生或细胞毒性活性的表达产物或者对多个这种表达产物进行编码；II)一种核苷酸序列，该序列在微生物体内可激活的活化序列控制下编码血浆蛋白，或是具有组成型活性的；III)任选的一种核苷酸序列，该序列在微生物体内可激活的活化序列的控制下编码细胞特异性配体，或是具有组成型活性的；IV)一种运送系统核苷酸序列，该系统诱导成分I)和II)以及任选的成分III)的表达产物在微生物外表面上的表达，或者诱导成分I)的表达产物的分泌，并诱导成分II)及任选的III)的表达，并优选具有组成型活性的；V)任选的一种蛋白质的核苷酸序列，该蛋白质能将微生物溶解在哺乳动物细胞的细胞溶胶中，并还能在细胞间释放质粒，其中至少一种或多种成分I)和VI)被包含于被溶解的微生物中；以及VI)一种在微生物体内可激活的和/或一种组织细胞特异性、肿瘤细胞特异性、功能特异性或者非细胞特异性的表达成分I)的活化序列，其中，成分I)至VI)中的每个成分都可以相同或不同地出现一次或多次。
文档编号A61K35/76GK1646693SQ03808244
公开日2005年7月27日 申请日期2003年2月13日 优先权日2002年2月14日
发明者W·格贝尔, 乌尔夫·R·拉普, H·－H·塞德拉策克, J·芬斯特勒, I·根特谢夫 申请人:乌尔夫·R·拉普