专利名称：酶活性减少的非典型流感嗜血杆菌的p4蛋白突变体的制作方法
发明的领域本发明一般涉及免疫原性组合物的领域，更具体是抗中耳炎的免疫原性组合物。
发明的背景非典型流感嗜血杆菌(NTHi)引起人类疾病，包括成人中的肺炎、中耳炎、鼻窦炎和急性发热气管支气管炎。此细菌也是儿童和婴儿中耳炎的常见病原体。由于NTHi感染仅赋予菌株-特异的免疫性，人可被重复感染。事实上，此细菌引起的大部分慢性疾病是儿童的反复耳炎，使治疗包括反复接受抗生素或手术以将引流管插入耳中。
现有治疗典型流感嗜血杆菌菌株的免疫原性组合物(其特征是一种已知的胶囊)中没有一种对治疗NTHi有用。因此，进行大量研究以发现用于防止NTHi引起感染的成分。在研究防止人中耳炎发生的候选成分中，称为NTHi蛋白4(P4；以前称为“外膜蛋白e”)的细菌脂蛋白被鉴定为所需成分，因为它能在人中引发针对细菌的杀菌抗体。发现P4引发杀菌抗体，与抗其它NTHi外膜蛋白的抗体协同作用。因此，此蛋白可结合其它外膜蛋白使用以诱导更有效的杀菌反应。
编码P4的hel基因在流感嗜血杆菌菌株内和之间抗原性保守。参见例如美国专利号5,780,601；5,955,580和5,601,831及欧洲专利号EP 0 606 921和EP 0 462210，它们纳入本文供参考。hel基因序列(SEQ ID NO1)和编码的274个氨基酸的前蛋白序列(SEQ ID NO2)获得自NCBI数据库，登录号M68502并鉴定于Green，B.A.，等，1991 Infec.Immun.，59(9)3191-3198。NTHi的成熟P4是长度为254个氨基酸的脂化蛋白(SEQ ID NO3)，由SEQ ID NO1的核苷酸209-970编码。274个氨基酸的未加工前P4蛋白具有20个氨基酸的信号肽，特定作为脂肪酸酰化位点(SEQ ID NO2，氨基酸1-20)，此蛋白由SEQ ID NO1的核苷酸149-970编码，核苷酸149-208编码信号或前导肽。
原来认为嗜血杆菌中P4蛋白的功能是氯高铁血红素转运(Reidl，J.，和J.J.Mekalanos.1996 J.Exp.Med.，183621-629.5)。然而，后来发现P4蛋白是外膜酶，即细菌酸性磷酸酶(Reilly，T.J.等，1999 J.Bacteriol.，1816797-805)。最近此领域的工作显示实验室对于P4蛋白的真正功能持不同观点(Kemmer，G.等，2001 J.Bacteriol.，1833974-3981；Reidl，J.等，2000 Mol.Microbiol.，351573-81；Reilly，T.，和A.Smith，1999 Prot.Exp.Purif.，17401-409；Reilly，T.J.等，1999.J.Bacteriol.，1816797-805；Reilly，T.J.等，2001 FEBSLett.，49419-23)。
鉴定P4为酶蛋白产生对于其用作人免疫原性组合物成分的潜在关心。此蛋白是酶活性且未完全确定其体内底物。当野生型P4施用给人时没有已知的有害效果，一般认为在用于待施用给人的免疫原性组合物上，非酶活性蛋白或活性减少的蛋白优于酶活性蛋白。酶活性蛋白不优选用作免疫原性成分，因为除了诱导抗体，其酶活性可能在被免疫的人中引起意想不到的、不需要的反应。
上述文献和专利描述的P4蛋白片段或变体“突变体”P4序列的特征不在于免疫原性组合物的最重要的性质即免疫原性。没有提供关于突变对免疫原性效果的信息。更没有提供影响酶活性的变化对潜在免疫原性有任何效果的征兆。因此，先有技术未提供任何指导用于选择产生免疫原性组合物成分的P4蛋白的突变体。
本领域继续需要包含NTHi P4变异蛋白的治疗和预防性组合物，此变异蛋白酶活性减少且免疫性相当于野生型蛋白，安全用于人中的免疫原性组合物。
发明的概述一方面，与野生型P4蛋白相比发明提供P4变异(突变)蛋白的酶活性减少且诱导野生型P4蛋白的抗体和/或具有抗NTHi的杀菌活性。此变异蛋白用于在被免疫人中诱导抗NTHi的保护性免疫反应。
另一方面，发明提供免疫原性组合物，包含本文所述NTHi P4变异蛋白、药学上可接受载体和任选的佐剂。此组合物可含有另外的抗原性蛋白或肽并用于诱导抗NTHi的保护性免疫反应。
又一方面，发明提供分离或重组核苷酸分子，包括编码本发明P4变体的核酸序列。发明也涉及载体，如质粒、重组病毒等，所含这些分子在指导宿主细胞中变体表达的序列调节控制下。
另外一方面，发明提供包含载体的宿主细胞，载体含本文所述核苷酸分子。
另一方面，发明包括通过施用变异蛋白或含它的组合物在人中诱导抗NTHi的免疫反应的方法。
又一方面，发明包括宿主细胞重组表达P4变异蛋白的方法，宿主细胞用含这些分子的载体转化、转染或转导。
另外一方面，发明包括使用P4变异蛋白作为另一种抗原的载体，其中另一种抗原可以是蛋白、多肽、肽、多糖、寡糖、糖类、脂多糖、脂寡糖或脂糖。变异P4蛋白与野生型P4蛋白相比酶活性减少，但不一定诱导野生型P4蛋白的抗体或具有抗NTHi的杀菌活性，以P4变异载体蛋白在SEQ ID NO3的氨基酸位置122没有苯丙氨酸为条件。
发明的这些和其它方面对阅读下列发明详述的本领域技术人员是显而易见的。
发明的详述本发明通过提供非酶活性的P4变异蛋白满足本领域的需求，此蛋白诱导野生型P4蛋白的抗体和/或具有抗NTHi的杀菌活性。含这类P4变异蛋白、编码它们的核酸分子的组合物及使用这些蛋白和核酸分子的方法提供诱导人中对NTHi免疫性的新方法。
A.本发明的变异P4蛋白变异P4蛋白定义为突变P4蛋白，具有很低水平的P4酶活性或不能检测的P4酶活性。当用作免疫原性组合物的成分时，这些变异P4蛋白保持所需野生型P4蛋白的免疫原性性质。这些性质包括引发抗野生型P4的ELISA反应性抗体和/或抗NTHi的杀菌活性。当用作载体蛋白时，变异P4蛋白不需保持野生型P4蛋白的免疫原性性质。
由于不知道防御NTHi的临床相关性，如果突变体发ELISA效价和/或杀菌效价相当于野生型重组脂蛋白P4(rLP4)，突变P4取代免疫原性组合物中的野生型P4才能成功。这种变异P4蛋白是用于预防NTHi感染的免疫原性组合物的所需成分。如本文所用，术语“变异P4蛋白”或“突变P4蛋白”指在氨基酸残基上携带特定突变的蛋白或脂蛋白，它显著地减少野生型P4酶活性且仍保持蛋白在人中诱导对NTHi免疫反应的能力。
“免疫反应”或“免疫性”是在本文中交换使用的术语，指诱导体液(即B细胞)和/或细胞(即T细胞)反应。可适当评估体液免疫反应，这是根据本发明P4蛋白变体导入宿主，测量在免疫动物血清中存在的P4抗原-特异抗体。在下面的一个示范实施方案中，免疫反应通过酶联免疫吸收测定(ELISA)免疫动物的血清来评估。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定能用于测量来自淋巴细胞的T细胞反应，淋巴细胞分离自免疫动物的脾。
本发明的变异P4蛋白优选是脂蛋白，即它在氨基末端包含修饰的半胱氨酸，经硫醚连接脂肪酰化甘油且一个脂肪酸连接其末端氨基。在本发明P4变异蛋白的一个实施方案中，前导肽是流感嗜血杆菌的野生型P4前导肽，即SEQ ID NO2的氨基酸1到20。然而，其它用于细菌细胞中特定脂肪酰化位点的肽可融合P4变异蛋白，取代野生型序列以提供脂蛋白。其它前导肽的例子包括来自流感嗜血杆菌的P6蛋白、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的OspA蛋白的前导肽和来自革兰氏阳性菌脂信号肽的前导肽。
在本发明的另一个实施方案中，P4变异蛋白用作载体蛋白，它可优选为非脂质化，即它的表达没有前导肽。例如，它缺乏SEQ ID NO2的氨基酸1到20的前导肽或它与缺乏脂肪酰化位点的前导肽融合。
在此说明书中，确定特定突变时氨基酸残基的鉴定是与野生型P4的加工、成熟脂质化氨基酸序列即SEQ ID NO3对应的残基号。
本发明涉及NTHi的P4变异蛋白，与野生型P4蛋白相比酶活性减少且诱导野生型P4蛋白的抗体和/或具有抗NTHi的杀菌活性，其中P4变异蛋白具有的突变选自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸残基39的突变，它在野生型P4蛋白中是谷氨酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸残基48的突变，它在野生型P4蛋白中是苯丙氨酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64的突变，它在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸残基161的突变，它在野生型P4蛋白中是赖氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸残基218的突变，它在野生型P4蛋白中是天冬酰胺；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸残基35和37的突变，它们在野生型P4蛋白中是丙氨酸，其中突变不是谷氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64和66的突变，它们在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(h)一个或多个突变(a)-(g)的组合。
具体地，本发明特定P4变异蛋白的首个实施方案是在SEQID NO3的氨基酸残基39含突变的蛋白，在野生型P4蛋白中是谷氨酰胺。在一个实施方案中，P4变异蛋白包含在SEQ ID NO3的氨基酸位置39的谷氨酸。另外，P4变异蛋白包含在SEQ ID NO3的氨基酸位置39的天冬氨酸或天冬酰胺。
本发明P4变异蛋白的第二个实施方案包含在氨基酸残基号48的突变，它在野生型P4蛋白中是苯丙氨酸。P4变异蛋白中的氨基酸残基最好是半胱氨酸。Cys残基在位置48取代Phe残基是非保守性变化，可能预期会破坏蛋白结构。然而，此P4变异蛋白具有所需抗原和免疫原性性质。此P4变异蛋白也缺乏在大肠杆菌中补充hemA突变的能力。参见Reilly，T.J.等，2001 FEBS Lett.，49419-23，它全部纳入本文供参考。另外，P4变异蛋白在SEQ ID NO3的氨基酸位置48包含丝氨酸或其它具有不带电极性基团的氨基酸，如甘氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。
本发明P4变异蛋白的第三个实施方案包含在SEQ ID NO3的氨基酸残基位置64的突变，它在野生型P4蛋白中是天冬氨酸。在一个实施方案中，P4变异蛋白包含在残基64的天冬酰胺或谷氨酸。另外，P4变异蛋白包含在SEQ ID NO3的氨基酸位置64的丙氨酸。
本发明P4变异蛋白的第四个实施方案包含在SEQ ID NO3的氨基酸残基位置161的突变，它在野生型P4蛋白中是赖氨酸。在一个实施方案中，P4变异蛋白包含在残基161的精氨酸。
本发明P4变异蛋白的第五个实施方案包含在SEQ ID NO3的氨基酸残基位置218的突变，它在野生型P4蛋白中是天冬酰胺。在一个实施方案中，P4变异蛋白包含在残基218的谷氨酰胺。另外，P4变异蛋白包含在SEQ ID NO3的氨基酸位置218的天冬氨酸或谷氨酸。
本发明P4变异蛋白的第六个实施方案包含在SEQ ID NO3的氨基酸残基位置35和37的突变，它们在野生型P4蛋白中是丙氨酸。在一个实施方案中，P4变异蛋白包含在残基35和37的天冬酰胺。P4变异蛋白在SEQ ID NO3的氨基酸残基位置35和37不包含谷氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸。
本发明P4变异蛋白的第七个实施方案包含在SEQ ID NO3的氨基酸残基位置64和66的突变，它们在野生型P4蛋白中是天冬氨酸。在一个实施方案中，P4变异蛋白包含在残基64和66的丙氨酸。另外，P4变异蛋白包含在SEQ ID NO3的氨基酸位置64和66的天冬酰胺或谷氨酸。
发明者确定P4变异蛋白中酶活性去除或减少对于是否保存抗野生型P4的免疫原没有遵循明显模式。一些P4序列中的突变去除或减少酶活性，但也产生不能引发高ELISA效价或高杀菌效价的突变蛋白。发明者在下面例子中研究和鉴定的多种P4变异蛋白中观察到酶活性和免疫原性间、高ELISA效价和高杀菌效价间及保守性变化对抗原结构的作用的可预测性间缺乏相关性。
例如，初次尝试在已知DD基序(两个相邻或附近的天冬氨酸残基)进行去除P4蛋白中的酶活性，DD基序为细菌酸性磷酸酶所共有(Thaller，M.C.等，1998.Prot.Sci.，71647-52)，即SEQ ID NO3的氨基酸残基64和66及SEQ ID NO3的氨基酸位置184和185。当评估酶活性的P4变异蛋白包含两个丙氨酸取代位置64和66两个天冬氨酸的双重突变体或两个丙氨酸取代位置184和185两个天冬氨酸的双重突变体时，两者都是酶失活的。
然而，当这些蛋白用于免疫小鼠时，产生的抗血清显示抗野生型P4的低ELISA效价。这是由于抗体识别抗原表位的变化，因为抗血清有抗同源蛋白的高效价。相反，当评估这些抗血清的杀菌活性时，两种突变蛋白的抗血清都显示对D64A、D66A突变体的高杀菌活性水平和对D184A、D185A突变体的低杀菌活性水平。因此，D64A、D66A突变体是包含于免疫原性组合物的有用成分，而D184A、D185A突变体不是。另一种建议突变体在位置64由高度保守的Glu残基取代Asp残基，产生的P4变体(D64E)引发抗野生型P4的高ELISA效价，尽管它抗NTHi的杀菌效价低。下面例子中显示其它的建议突变P4蛋白，它们不满足P4变异蛋白用作本发明免疫原性组合物成分的标准。
用于本发明的其它有用的P4变异蛋白包括全长、成熟的254个氨基酸脂蛋白，有上面提供的一个或多个特定突变，或者含上述诱变残基的多肽或其片段且蛋白、多肽或片段，保持减少的酶活性、ELISA和/或其衍生的全长P4变体的杀菌(BC)活性。
这些P4变异蛋白的免疫活性、酶失活片段一般包含至少约25个P4变异蛋白的相邻氨基酸，含上述诱变位点。P4变异蛋白片段更典型地包含至少约100个相邻氨基酸。另一种P4变异蛋白的片段包含至少约150个相邻氨基酸。另外一个P4变异蛋白的实施方案包含至少长约200个相邻氨基酸。
如果P4变异蛋白片段在受试者中诱导对NTHi的保护性免疫反应，它用于下述方法。片段包括截短P4蛋白的羧基末端区域。例如，在约残基200截短的P4变异蛋白(即它包含SEQ ID NO3的氨基酸1-200)是所需片段。类似地，在约残基210、221或232截短的P4变异蛋白是所需片段。可选择本发明非酶活性、免疫活性P4变体的其它片段。前述片段也包能含一个或多个上述特定突变。
其它合适的P4变异蛋白可包括其中一个或多个氨基酸残基含取代基团的蛋白。另一种合适的P4变异蛋白中多肽与另外的化合物融合，如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)。另外一种合适的P4变异蛋白中其它氨基酸与多肽融合，如前导肽或分泌序列或用于提高P4变异蛋白的免疫原性的序列。P4变异蛋白的其它修饰包括上述在P4的N末端缺失信号或前导序列，即由SEQ ID NO1的核苷酸148-208编码，和/或缺失不影响免疫原性的其它区域。类似地，本文所述P4变异蛋白的修饰包括用另外的信号或前导序列取代信号或前导序列。参见例如美国专利号5,780,601，纳入本文供参考。
另一个合适的P4变异蛋白的例子中任选氨基酸(如-Gly-Ser-)或其它氨基酸或化学化合物间隔可包括在肽末端，用于将蛋白连接一起或连接到载体。例如，有用的P4变异蛋白可包括与载体蛋白偶联的一种或多种上述P4变异蛋白。另外，有用的P4变异蛋白可存在于含多种P4变异蛋白的融合蛋白，P4变异蛋白任选与载体蛋白偶联。对于这些实施方案，载体蛋白最好是能提高所选P4变异蛋白免疫原性的蛋白或其它分子。这种载体可以是同样具有辅佐效果的较大分子。示范的常规蛋白载体不限于包括大肠杆菌DnaK蛋白、半乳糖激酶(galK，它催化细菌中半乳糖代谢的第一步)、泛素、α-交配因子、β-半乳糖苷酶和流感NS-1蛋白。类毒素(即编码天然产生毒素的序列，有足够的修饰去除其毒性)如白喉类毒素和破伤风类毒素、它们各自的毒素和这些蛋白的任何突变形式如CRM197(白喉毒素的非毒性形式，参见美国专利号5,614,382)也能用作载体。其它载体包括假单胞菌的外毒素A、大肠杆菌的热不稳定毒素和轮状病毒颗粒(包括轮状病毒和VP6颗粒)。另外，可使用载体蛋白或其它免疫原性蛋白的片段或抗原表位。例如，半抗原可偶联细菌毒素的T细胞抗原表位。参见美国专利号5,785,973。类似地，可使用多种细菌热激蛋白如分枝杆菌hsp-70。谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是另一种有用载体。本领域技术人员能容易地选择适当载体用于此部分。融合蛋白可通过偶联蛋白质物质的标准技术来形成。融合可表达自融合的基因构建物，基因构建物由下述重组DNA技术制备。
本文所述其它合适的P4变异蛋白能通过修饰不同于特定示范的P4变异蛋白或肽，修饰不恢复酶活性、不减少免疫原性或组合这些特性。例如，可进行保守性氨基酸变化，尽管它们改变P4变异蛋白的一级结构，但通常不改变其功能。
在进行这些变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。本领域一般理解亲水氨基酸指数在赋予活性生物功能中对多肽的重要性(Kyte&Doolittle，1982)。已知某些氨基酸能取代具类似亲水指数或分数的其它氨基酸且仍产生有相似生物活性的多肽。各氨基酸在其疏水性和电荷特征基础上赋予亲水指数。这些指数是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
认为氨基酸残基的相对亲水特征决定所得多肽的二级和三级结构，进而确定多肽与其它分子的相互作用，如酶、底物、受体、抗体、抗原等。本领域已知氨基酸能被具类似亲水指数的另一种氨基酸取代且仍获得功能相等的多肽。在这种变化中，氨基酸取代的亲水指数优选在+/-2内，特别优选+/-1内，甚至更特别优选+/-0.5内。
取代类似氨基酸也能在疏水性基础上进行，特别是其中产生的生物功能相等多肽或肽用于免疫实施方案。纳入本文作为参考的美国专利号4,554,101陈述了多肽的最大局部平均疏水性，这由其相邻氨基酸的疏水性控制，与其免疫原性和抗原性相关，即多肽的生物性质。
如美国专利号4,554,101所详述，下列疏水性值赋予氨基酸残基精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。据说氨基酸能被具类似疏水性值的另一种氨基酸取代且仍获得功能相等的多肽，特别是免疫相当的多肽。在这种变化中，氨基酸取代的疏水性值优选在+/-2内，特别优选+/-1内，甚至更特别优选+/-0.5内。
如上所概括，氨基酸取代一般以氨基酸侧链取代基的相对类似性为基础，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到上述不同特征的示范取代对本领域技术人员熟知且包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
此外，通常不改变P4变异蛋白一级序列的修饰包括体内或体外化学衍生多肽，如乙酰化、甲基化或羧化。同样包括作为本发明P4变异蛋白的是由糖基化修饰的蛋白，如在合成和加工中或在进一步加工步骤中通过修饰多肽的糖基化模式产生的蛋白；或通过将多肽暴露于影响糖基化的酶，如哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶。同样包括作为P4变异蛋白的是上面鉴定的诱变序列，具有磷酸化氨基酸残基如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
同样包括作为P4变异蛋白的是以上已修饰的序列，用普通分子生物技术修饰以改进它们对蛋白降解的抗性或最优化溶解性质。这些P4变异蛋白包括的蛋白含除了天然产生L-氨基酸的残基，如D-氨基酸或非天然产生的合成氨基酸。可存在于本发明P4变异蛋白的已知修饰不限于是酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价附着黄素、共价附着血红素部分、共价附着核苷酸或核苷酸衍生物、共价附着脂质或脂质衍生物、共价附着磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、GPI-锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、异戊烯化、外消旋、硒化(selenoylation)、硫酸化、转移-RNA介导的氨基酸加入蛋白如精氨酰化和泛素化。
B.编码P4变异蛋白的核酸分子本发明的另一方面包括分离、合成或重组核酸分子和编码上述P4变异蛋白的序列，具有针对突变的特定位点或P4蛋白的片段(片段可进一步包含一个或多个这些突变)。
分离的核苷酸分子包括编码P4变异蛋白的核酸序列，可优选在指导宿主细胞中P4变体表达的调节序列的控制下。如本文所述，这种核酸分子能用于体外表达P4变异蛋白或在人中体内表达P4变异蛋白。
如本文所用，术语“分离的核苷酸分子或序列”指没有污染其它生物成分的核酸区段或片段，其它生物成分可与其自然环境中的分子或序列相关。例如，本发明分离核苷酸分子或序列的一个实施方案是从天然产生状态中其侧翼序列分离的序列，例如从通常与片段相邻的序列取出的DNA片段，如与天然产生基因组中片段相邻的序列。此外，改编本发明的核苷酸序列和分子以编码本发明的P4变异蛋白。因此，术语“分离的核苷酸分子或序列”也应用于大体纯化自其它成分的核酸序列或分子，其它成分在细胞中天然伴随着未诱变的核酸，例如RNA或DNA或蛋白。本发明的分离核苷酸分子或序列也包括由其它常规方法制备的序列和分子，如重组方法、合成方法例如诱变、或这些方法的组合。构建本发明的核苷酸序列或分子不应仅限于本文所示的特定核苷酸序列，而应包括与本文所示的核苷酸序列共享同源性(即有序列同一性)的任何和所有核苷酸序列。
当指核酸或其片段时，术语“大体同源”或“大体相似”表示当适当核苷酸插入或缺失与另外核酸(或其互补链)最佳排列时，核苷酸序列同一性为至少约70％的核苷酸碱基，由任何熟知的序列同一性算法测量，如GCG版本6.1中的程序Fasta。如本文所用，术语“同源”指两个聚合分子间的序列相似性，如两个核酸分子，如两个DNA分子或两个RNA分子，或两个多肽分子间。当两个分子的核苷酸或氨基酸位置都被相同单体核苷酸或氨基酸占据时，例如如果两个DNA分子各自的位置被腺嘌呤占据，则它们在此位置同源。两种序列间的同源性是匹配或同源位置数量的直接功能，例如如果两种化合物序列的一半(如10亚基长度聚合物中的5个位置)位置同源，则两种序列是50％同源。如果90％位置如10个中的9个匹配或同源，两种序列共享90％的同源性。通过例子，DNA序列3’ATTGCC5’和3’TATGCG5’共享50％的同源性。如本文所用，术语“大体同源”指DNA或RNA与所需核酸约70％同源，更优选约80％同源且最优选约90％同源。
发明也涉及分离的核苷酸分子，所含核酸序列与编码NTHi的P4变异蛋白的核酸序列至少70％、80％或90％同源，P4变异蛋白与野生型P4蛋白相比酶活性减少且诱导野生型P4蛋白的抗体和/或具有抗NTHi的杀菌活性，其中P4变异蛋白具有的突变选自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸残基39的突变，它在野生型P4蛋白中是谷氨酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸残基48的突变，它在野生型P4蛋白中是苯丙氨酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64的突变，它在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸残基161的突变，它在野生型P4蛋白中是赖氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸残基218的突变，它在野生型P4蛋白中是天冬酰胺；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸残基35和37的突变，它们在野生型P4蛋白中是丙氨酸，其中突变不是谷氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64和66的突变，它们在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(h)一个或多个突变(a)-(g)的组合，其中核酸序列编码至少一种(a)-(g)突变。
此外，由于遗传密码的简并性，本文所述编码P4突变氨基酸残基的任何三核苷酸密码子在发明的范围内。
其中如本文所述，P4变异蛋白和/或编码它们的DNA序列或者用于本文所述核酸分子或组合物的其它序列通过它们与鉴定序列的百分比同源性或同一性来确定，用于计算百分比同源性或百分比同一性的算法包括下列Smith-Waterman算法(J.F.Collins等，1988，Comput.Appl.Biosci.，467-72；J.F.Collins等，《分子序列比较和排列》(Molecular Sequence Comparison andAlignment)(M.J.Bishop等主编)，《实践方法系列核酸和蛋白序列分析XVIII》(Practical Approach SeriesNucleic Acid and Protein Sequence AnalysisXVIII)，IRL PressOxford，England，UK(1987)417页)、BLAST和FASTA程序(E.G.Shpaer等，1996，Genomics，38179-191)。这些参考文献纳入本文供参考。
如本文所述，两种DNA描述为“可操作连接”是指单链或双链DNA包括这两个DNA中的每一个且两个在DNA内的排列方式使至少一种DNA序列能发挥生理作用，由此它对另一种具有特征。
为用于生成本发明P4变异蛋白或施用它在细胞中体内生成，编码序列的各P4变异蛋白和必需的调节序列优选存在于单独的病毒或非病毒重组载体(包括传递核酸分子到细胞中的非病毒方法)。另外，两种或多种这些编码P4变异蛋白的双份拷贝或编码本发明多种不同P4变异蛋白的核酸序列可包含于多顺反子转录物，即设计用于表达多种基因产物的单分子。
如本文所述，术语“载体”指来源于病毒或非病毒的DNA分子，如设计用于编码外源或异源核酸序列的细菌属。因此，此术语包括常规细菌质粒。这种质粒或载体可包括来自病毒或噬菌体的质粒序列。这种载体包括染色体载体、附加型载体和来源于病毒的载体，如来源于细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件和病毒的载体。载体也能来源于它们的组合，如来源于质粒和噬菌体遗传元件、粘粒和噬菌粒。术语也包括将基因从一个细胞转移到另一个细胞的非复制型病毒。术语也应包括促进核酸转移到细胞的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物等。
发明的核酸分子包括非病毒载体和根据本发明将编码P4变异蛋白的序列传递到宿主细胞的方法。多种非病毒载体在本领域已知且可包括但不限于质粒、细菌载体、噬菌体载体、“裸露”DNA和与阳离子脂质或聚合物缩合的DNA。
细菌载体的例子包括但不限于来源于卡介菌(BCG)、沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌和李斯特菌的序列。合适的质粒载体包括例如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pK37、pKC101、pAC105、pVA51、pKH47、pUB110、pMB9、pBR325、Col E1、pSC101、pBR313、pML21、RSF2124、pCR1、RP4、pBAD18和pBR328。
合适诱导型大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amann等.，1988Gene，69301-315)、阿拉伯糖表达载体(如pBAD18，Guzman等，1995J.Bacteriol.，1774121-4130)和pETIId(Studier等.，1990 Methods inEnzymology，18560-890)。来自pTrc载体的靶基因表达取决于来自杂合trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。来自pETIId载体的靶基因表达取决于来自T7gn10-lac融合启动子的转录，转录由共表达的病毒RNA聚合酶T7 gn 1介导。此病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS I 74(DE3)提供，来自lacUV 5启动子的转录控制下携带T7 gn 1基因的居留原噬菌体。pBAD系统取决于受araC基因调节的诱导型阿拉伯糖启动子。该启动子在阿拉伯糖存在时被诱导。
示范载体是单链或双链噬菌体载体。例如，合适的克隆载体包括但不限于载体如噬菌体λ载体系统、λgt11、μ gt μ WES.tB、Charon 4、λgt-WES-λB、Charon28、Charon 4A、λgt-1-λBC、λgt-1-λB、M13mp7、M13mp8或M13mp9。
在另一个实施方案中，表达载体是酵母表达载体。在酵母如酿酒酵母中表达的载体例子包括pYepSec 1(Baldari等.，1987)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982)、pJRY88(Schultz等.，1987)和pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。
另外，使用杆状病毒表达载体。可用于在培养昆虫细胞(如Sf9或Sf21细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAC系列(Smith等.，1983)和pVL系列(Lucklow和Summers，1989)。
在另外一个实施方案中，哺乳动物表达载体用于在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，1987)和pMT2PC(Kaufman等.，1987)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能通常由病毒调节元件提供。
一类重组载体是重组单链或双链RNA或DNA病毒载体。本领域已知多种病毒载体系统。这种载体的例子包括但不限于重组腺病毒载体、以单纯疱疹病毒(HSV)为基础的载体、腺伴随病毒(AAV)载体、杂合腺病毒/AAV载体、重组逆转录病毒或慢病毒、重组痘病毒载体、重组痘苗病毒载体、SV-40载体、昆虫病毒如杆状病毒等，构建它们用于携带或表达所选感兴趣的核酸组合物。
能使用的逆转录病毒载体包括EP 0 415 731；国际专利出版号WO 90/07936；WO94/03622；WO 93/25698和WO 93/25234；美国专利号5,219,740；国际专利出版号WO 93/11230和WO 93/10218；Vile和Hart，1993 Cancer Res.533860-3864；Vile和Hart，1993 Cancer Res.53962-967；Ram等.，1993 Cancer Res.5383-88；Takamiya等.，1992 J.Neurosci.Res.33493-503；Baba等.，1993 J.Neurosurg.79729-735；美国专利号4,777,127；GB专利号2,200,651和EP 0 345 242所述。合适的重组逆转录病毒的例子包括国际专利出版号WO 91/02805所述。
以甲病毒为基础的载体也可用作编码P4变异蛋白的核酸分子。这种载体能构建自多种甲病毒，包括例如辛德比斯病毒载体、塞姆利基森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532)。这种载体系统的代表例子包括美国专利号5,091,309；5,217,879和5,185,440；国际专利出版号WO 92/10578；WO 94/21792；WO 95/27069；WO 95/27044和WO 95/07994所述。
腺病毒载体的例子包括Berkner，1988 Biotechniques 6616-627；Rosenfeld等.，1991 Science 252431-434；国际专利出版号WO 93/19191；Kolls等.，1994PNAS 91215-219；Kass-Eisler等.，1993 PNAS 9011498-11502；Guzman等.，1993Circulation 882838-2848；Guzman等.，1993 Cir.Res.731202-1207；Zabner等.，1993 Cell 75207-216；Li等.，1993 Hum.Gene Ther.4403-409；Cailaud等.，1993 Eur.J.Neurosci.51287-1291；Vincent等.，1993 Nat.Genet.5130-134；Jaffe等.，1992 Nat.Genet.1372-378和Levrero等.，1991 Gene 101195-202所述。示范腺病毒载体包括国际专利出版号WO 94/12649；WO 93/03769；WO94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655所述。其它腺病毒载体包括来源于黑猩猩腺病毒的载体，如美国专利号6,083,716所述。
另一个病毒载体以细小病毒为基础，如腺伴随病毒(AAV)。代表例子包括国际专利出版号WO 93/09239；Samulski等.，1989 J.Virol.633822-3828；Mendelson等.，1988 Virol.166154-165和Flotte等.，1993 PNAS 9010613-10617所述AAV载体。其它特别理想的AAV载体包括以AAV1为基础的；参见2000年5月18日发表的国际专利出版号WO 00/28061。其它理想AAV载体包括假型载体，即含有由AAV 5’ITRS、转基因和AAV 3’ITRs组成的小基因，它们包装于对AAV ITRs异源的AAV血清型的衣壳中。生成这种假型AAV载体的方法详细描述于国际专利出版号WO 01/83692。
在一个实施方案中，发明的核酸分子是“裸露”DNA，它可结合的聚合物包括传统聚合物和非传统聚合物如含环式糊精的聚合物和保护性、活性非缩合聚合物。“裸露”DNA和与阳离子脂质或聚合物缩合的DNA一般用化学方法传递给细胞。一些化学方法在本领域已知用于细胞传递且包括使用脂质、聚合物或与DNA复合的蛋白质，任选相同缩合入颗粒并传递给细胞。另一种非病毒化学方法包括使用阳离子缩合DNA，随后置于脂质体并根据本发明使用。参见C.Henry，2001 Chemicaland Engineering News，79(48)35-41。
核酸分子作为“裸露”DNA直接导入细胞(美国专利号5,580,859)或制成有试剂的组合物，试剂促进免疫，如布比卡因和其它局部麻醉剂(美国专利号6,127,170)。
以上所有病毒和非病毒载体的成分可容易地选自本领域已知材料和且获得自制药工业。不认为选择载体成分和调节序列是对本发明的限制。根据本发明编码P4变异蛋白的各核酸序列优选在调节序列的控制下，调节序列指导哺乳动物细胞中各核酸序列产物的复制和产生。术语“启动子/调节序列”指表达核酸所需的DNA序列可操作连接于启动子/调节序列。在一些情况中，启动子/调节序列可以组织特异方式发挥功能。例如，启动子/调节序列仅能驱动在特定组织类型的细胞中表达。在一些情况中，此序列可以是核心启动子序列，在其它情况中，此序列也可包括增强子序列和以组织特异方式表达所需的其它调节元件。
编码本发明P4变异蛋白的核酸分子和/或重组载体进一步优选包括调节序列。例如，这种调节序列包括驱动P4变异蛋白表达的启动子。启动子/调节序列优选位于编码序列的5’末端，从而它驱动细胞中P4变异蛋白的表达。
合适的启动子可容易地选自组成型启动子、诱导型启动子、组织-特异启动子和其它。非特异活性且在编码本发明P4变异蛋白的核酸分子中使用的组成型启动子的例子包括但不限于逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、逆转录病毒LTR启动子(任选有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选有CMV增强子)(参见例如Boshart等.，Cell，41521-530(1985))、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子(Invitrogen)。
由外源提供化合物调节的诱导型启动子包括但不限于阿拉伯糖启动子、锌-诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)-诱导型小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)、蜕皮激素昆虫启动子(No等，1996Proc.Natl.Acad.Sci.USA，933346-3351)、四环素-阻抑系统(Gossen等，1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895547-5551)、四环素-诱导系统(Gossen等，1995Science，2681766-1769，也参见Harvey等，1998 Curr.Opin.Chem.Biol.，2512-518)、RU486-诱导系统(Wang等，1997 Nat.Biotech.，15239-243和Wang等，1997 Gene Ther.，4432-441)和雷帕霉素-诱导系统(Magari等，1997J.Clin.Invest.，1002865-2872)。
其它可用于本文的诱导型启动子类型由特定生理状态调节，如温度或急性期或仅在复制细胞中。有用的组织特异启动子包括来自编码骨骼β-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、肌营养不良蛋白、肌肉肌酸激酶的基因的启动子，以及活性高于天然产生启动子的合成肌肉启动子(参见Li等.，1999 Nat.Biotech.，17241-245)。组织特异启动子的例子已知用于肝(白蛋白，Miyatake等.1997J.Virol.，715124-32；乙肝病毒核心启动子，Sandig等.，1996 GeneTher.，31002-9；α-胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等.，1996 Hum.GeneTher.，71503-14)、骨(骨钙蛋白，Stein等.，1997 Mol.Biol.Rep.，24185-96；骨涎蛋白，Chen等.，1996 J.Bone Miner.Res.，11654-64)、淋巴细胞(CD2，Hansal等.，1988 J.Immunol.，1611063-8；免疫球蛋白重链；T细胞受体α链)、神经元(神经元-特异性烯醇酶(NSE)启动子，Andersen等.1993 Cell.Mol.Neurobiol.，13503-15；神经丝轻链基因，Piccioli等.，1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，885611-5；神经元-特异性vgf基因，Piccioli等.，1995 Neuron，15373-84)。参见例如国际专利出版号WO 00/55335的另外已知启动子列表，这些启动子用于本文。
用于包含于本发明核酸序列、分子或载体的另外调节序列包括但不限于增强子序列、聚腺苷酸化信号、剪接供体序列和剪接受体序列、分别位于待翻译多肽开始和末端的转录起始和终止位点、用于转录区翻译的核糖体结合位点、抗原决表位标签、核定位序列、IRES元件、戈德堡-霍格内“TATA”元件、限制性酶切割位点、可选择标记等。增强子序列包括例如72bp的SV40 DNA串联重复或逆转录病毒长末端重复或LTRs等并用于增加转录效率。常规选择启动子和其它共同载体元件且有许多这类序列可用于设计本发明中有用的核苷酸分子和载体。参见例如Sambrook等.，《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning.A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989)和其引用的参考文献，例如3.18-3.26和16.17-16.27页以及Ausubel等.，《最新分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley&Sons，New York(1989)。本领域技术人员可容易地从这些已知调节序列中选择以制备本发明的分子。选择这类调节序列不是本发明的限制。
C.产生本发明P4变异蛋白和核苷酸分子的方法制备或合成本文所示核苷酸序列和P4变异蛋白以及含本发明核苷酸分子或P4变异蛋白的组合物在使用现有材料的本领域普通技术人员的能力范围内。合成方法不是本发明的限制。下面的例子详述了本发明编码P4变异蛋白的序列合成的较佳实施方案。
本发明的P4变异蛋白和核苷酸分子和序列可通过化学合成方法、重组遗传工程方法、定点诱变和这些方法的组合产生。
例如，本发明的核苷酸序列/P4变异蛋白可采用已知化学合成技术来常规制备，例如固相化学合成，如Merrifield，1963 J.Amer.Chem.Soc.，852149-2154；J.Stuart和J.Young，固相肽合成》(Solid Phase PeptideSynthesis)，Pierce Chemical Company，Rockford，IL(1984)；Matteucci等.，1981J.Am.Chem.Soc.，1033185；Alvarado-Urbina等.，1980 Science，214270和Sinha，N.D.等.，1984 Nucl.Acids Res.，134539所述。也参见例如《蛋白质-结构和分子性质》(PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES)，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993；Wold，F.，“翻译后蛋白修饰观点和前景”(Posttranslational Protein ModificationsPerspectives and Prospects)，1-12页，《翻译后共价修饰蛋白》(POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS)，B.C.Johnson主编，Academic Press，New York，1983；Seifter等.，1990 Meth.Enzymol.，182626-646和Rattan等.，1992 Ann.N.Y.Acad.Sci.，66348-62。
另外，重组构建本发明组合物可用常规分子生物技术、定点诱变、遗传工程或聚合酶链式反应，如用本文提供的信息在宿主微生物中用任选的其它免疫原和任选的载体蛋白克隆和表达编码P4变异蛋白的核苷酸分子，(参见例如Sambrook等.，《分子克隆实验室手册》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory.NewYork(1989)；Ausubel等.，《最新分子生物学实验指南》，John Wiley&Sons，NewYork(1997))。P4变异蛋白和任选的免疫原的编码序列能合成制备(W.P.C.Stemmer等，Gene，16449(1995))。另外，编码P4野生型蛋白的DNA可如纳入本文供参考的美国专利号5,780,601所述分离自流感嗜血杆菌并诱变。
一般，重组DNA技术包括通过合成获得或如上所述分离编码P4变异蛋白的DNA序列，并将其导入表达它的适当载体/宿主细胞表达系统。所述将DNA插入表达载体的任何方法可用于将启动子和其它调节控制元件连接入所选重组载体的特定位点。本发明的重组P4变异蛋白可作为脂质化或非脂质化蛋白产生，分别使用P4前导肽编码序列或无前导肽序列(或前导肽序列没有上面讨论的特定脂肪酸乙酰化)。
多种宿主细胞载体系统能用于表达本发明的P4变异蛋白。用合成核酸分子克隆和表达本发明P4变异蛋白和其它组合物的系统包括使用重组技术中熟知的不同微生物和细胞。宿主细胞可选自任何生物体，包括原核(如细菌)细胞和真核细胞，包含哺乳动物、昆虫细胞、酵母细胞。用于本发明不同方法和组合物的细胞优选是细菌细胞。
合适的细菌细胞包括例如大肠杆菌、杆菌和链霉菌的不同菌株。酵母细胞如酵母属和毕赤酵母属、昆虫细胞如Sf9和Sf21也是用于生产目的的有用宿主细胞。哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、NIH3T3、PER C6、NSO、VERO或COS细胞也是合适的宿主细胞。
载体可选自上述一种病毒载体或非病毒载体，但必须与所用宿主细胞相容。重组DNA载体可通过转化、转导或转染(取决于载体/宿主细胞系统)导入适当宿主细胞(细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞等)。宿主-载体系统包括但不限于用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌；微生物如含酵母载体的酵母；用病毒(如牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统和用病毒(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统。
选择其它合适的宿主细胞和用于转化、培养、扩增、筛选、产物生成和纯化的方法能由本领域技术人员参考已知技术来完成。参见例如Gething和Sambrook，1981 Nature，293620-625。
通常，宿主细胞在培养条件下维持一段足表达的时间。培养条件在本领域熟知且包括离子组成和浓度、温度、pH等。一般，转染细胞在培养基中维持于培养条件下。不同细胞类型的合适培养基在本领域熟知。在一个较佳实施方案中，温度从约20℃到约50℃，更优选从约30℃到约40℃，甚至更优选约37℃。
pH优选从约6.0的值到约8.0的值，更优选从约6.8的值到约7.8的值，最优选约7.4。渗量浓度优选从约200毫摩尔渗透压每升(mosm/L)到约400mosm/L，更优选从约290mosm/L到约310mosm/L。转染和表达编码蛋白所需的其它生物条件在本领域熟知。
重组P4变异蛋白从宿主细胞或其膜或培养这些细胞的培养基中回收或收集。回收包括分离和纯化重组P4变异蛋白。多肽的分离和纯化技术在本领域熟知且包括过程如沉淀、过滤、层析、电泳等。
当通过常规重组方法产生时，本发明的P4变异蛋白可通过常规方法从细胞或其培养基分离和纯化，包括层析(如离子交换、亲和和大小柱层析)、离心、溶解度差异或通过任何其它纯化蛋白的标准技术。存在一些技术用于从原核细胞纯化异源蛋白。参见美国专利号4,518,526；4,599,197和4,734,362。然而，产生的纯化制品应大体上没有可能对人有害的宿主毒素。特别是当表达于革兰氏阴性菌宿主细胞如大肠杆菌时，纯化肽或蛋白应大体上没有内毒素污染。参见例如Sambrook等.，《分子克隆 实验室手册》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork(1989)。
用于发明方法和组合物的P4变异蛋白不限于本文所列任何特定示范过程的产物。事实上，制备蛋白可通过上面所引用的方法或本说明书其它地方所引用的方法。分离和产生用于这类用途的重组或合成蛋白组合物在本领域技术范围内。所得组合物能制成有任意数量的任选免疫原的免疫原性组合物并通过体内测定筛选功效，如下面例子所述的BC测定。另外，如上所述制备的蛋白和/或核苷酸分子可用于诊断测定。
D.本发明的免疫原性组合物本发明的P4变异蛋白和编码它们的核酸分子可用于多种免疫原性组合物以诱导抗非典型流感嗜血杆菌的保护性免疫反应。这种免疫原性组合物能用于防止或减少对急性中耳炎和NTHi引起的其它疾病的敏感性。免疫原性组合物通常用于免疫儿童或成人抗中耳炎或它们可用于有感染中耳炎危险的儿童(例如有耳感染史的儿童)。
这些NTHi的变异P4蛋白也适合包含于抗多种典型流感嗜血杆菌菌株的免疫原性组合物，如流感嗜血杆菌b型，因为编码P4蛋白的hel基因在流感嗜血杆菌菌株内和之间抗原性保守。
这种免疫原性组合物可制成单价和多价疫苗。除了编码P4变异蛋白的核酸分子或蛋白本身之外，这类组合物包含另一抗原或表达其它抗原的核苷酸分子。这些用于本发明免疫原性组合物的另外抗原包括其它抗原的B或T细胞抗原表位。这些与本发明P4变异蛋白共施用的“其它抗原”包括但不限于流感嗜血杆菌的其它抗原，如流感嗜血杆菌的其它外膜蛋白(或有其抗原表位的肽或蛋白)。这类流感嗜血杆菌的外膜蛋白包括15,000-道尔顿肽聚糖相关外膜脂蛋白(PAL)和15,000-道尔顿的嗜血杆菌脂蛋白PCP(Deich，R.A.等.1988 J.Bacteriol.170(2)489-498)。“其它”抗原也可包括流感嗜血杆菌的寡-或多糖荚膜成分，如多核糖基磷酸核醣醇(PRP)或者流感嗜血杆菌或其它微生物的脂多糖、脂寡糖或脂糖成分。可包含于本发明免疫原性组合物的另外“其它”抗原包括其它微生物(如有被囊或无被囊的细菌、病毒、真菌和寄生虫)。例如，中耳炎中包括的其它微生物的抗原如肺炎链球菌(包括但不限于一种或多种已知肺炎链球菌多肽、脂多糖-蛋白缀合物和多糖-蛋白缀合物，包括但不限于现有的23价肺炎球菌荚膜多糖疫苗和7价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物疫苗)、化脓链球菌A组、金黄色葡萄球菌、呼吸合胞病毒和卡他募拉菌(Moraxella catarrhalis)(包括但不限于UspA1、UspA2、B1、C/D、E和74kDa蛋白)可包含于本发明的免疫原性组合物。
1.在免疫原性组合物中使用P4变异蛋白P4变异蛋白最好制成免疫原性组合物以诱导保护性免疫反应。因此，在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在药学上可接受载体中包含一种或多种上述P4变异蛋白。这种制剂包括P4变异蛋白，结合药学上可接受载体如无菌水或无菌等渗盐水。如本文所用，术语“药学上可接受载体”指包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等，与施用给人相容。适当载体对于本领域技术人员是显然的且大部分取决于施用途径。
制剂包括但不限于悬浮液、溶液、油或水载体中的乳剂、糊和可移植的缓释或可生物降解制剂。这种制剂可进一步包括一种或多种另外组分，包括但不限于悬浮、稳定或分散剂。在肠胃外施用制剂的一个实施方案中，活性组分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供以与合适的载体(如无菌无热原的水)重建，然后肠胃外施用重建组合物。其它有用的肠胃外施用制剂包括的活性组分以微晶形式、脂质体制剂、或作为可生物降解聚合物系统的成分。用于缓释或移植的组合物可包括药学上可接受聚合或疏水物质如乳剂、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
可存在于本发明蛋白免疫原性组合物的另外成分是佐剂、防腐剂、化学稳定剂或其它抗原性蛋白。通常，优化稳定剂、佐剂和防腐剂以确定在目标人或动物中功效最佳的制剂。合适的示范防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚和对氯苯酚。可使用的合适稳定组分包括例如酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、酚红、N-Z胺、二磷酸一钾、乳糖、乳白蛋白水解物和奶粉。
常规佐剂用于增强免疫反应。这类佐剂包括MPLTM(3-O-脱酰化单磷酰脂A；Corixa，Hamilton，MT)，描述于纳入本文供参考的美国专利号4,912,094。
同样适合用作佐剂的是氨烷基磷酸葡糖胺化合物(AGP)或其衍生物或类似物，它们获得自Corixa(Hamilton，MT)且描述于纳入本文供参考的美国专利号6,113,918。这种AGP是2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰-3-O-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基-2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰氨基-b-D-吡喃葡糖苷，也称为529(以前称为RC529)。此529佐剂制成含水形式或稳定乳剂。
其它佐剂包括矿物油和水乳剂、铝盐(明矾)如氢氧化铝，磷酸铝等、Amphigen、Avridine、L121/鲨烯、D-丙交酯-聚交酯/糖苷、Pluronic多元醇、胞壁酰二肽、灭活包特菌、皂苷如Quil A或StimulonTMQS-21(Antigenics，Framingham，MA)，描述于纳入本文供参考的美国专利号5,057,540、以及由此产生的颗粒如ISCOMS(免疫刺激复合体)、结核分枝杆菌、细菌脂多糖、合成多核苷酸如含CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646，纳入本文供参考)、霍乱毒素(以野生型或突变形式，例如其中氨基酸位置29的谷氨酸被另一种氨基酸取代，优选组氨酸，根据纳入本文供参考的国际专利出版号WO 00/18434)、百日咳毒素(PT)或大肠杆菌热不稳定毒素(LT)，特定是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129；参见例如纳入本文供参考的国际专利出版号WO 93/13302和WO 92/19265。多种细胞因子和淋巴因子适合用作佐剂。这种佐剂是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，它具有纳入本文供参考的美国专利号5,078,996所述核苷酸序列。含GM-CSF的质粒转化到大肠杆菌并保存于美国模式培养物保藏所(ATCC)，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，登录号39900。细胞因子白介素-12(IL-12)是另一种佐剂，描述于纳入本文供参考的美国专利号5,723,127。其它细胞因子或淋巴因子显示具有免疫调节活性，包括但不限于白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18、干扰素-α、β和γ、粒细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子α和β，它们适合用作佐剂。
其它合适的佐剂包括但不限于表面活性物质(如十六烷基胺、十八烷基胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基-二十八烷基溴化铵)、甲氧基十六烷基甘油和甘油；Pluronic多元醇聚胺，如吡喃、硫酸葡聚糖脂、聚IC、carbopol；肽，如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、吞噬作用激素；油乳剂；矿物凝胶，如磷酸铝等以及免疫刺激复合体。免疫原也可掺入脂质体或缀合于多糖、脂多糖和/或其它用于疫苗制剂的聚合物。
如上所述，另外的免疫原性成分可包括一种或多种上述另外抗原。为与其它外膜蛋白抗原表位结合施用，P4变异蛋白能在与其它抗原的混合物中单独存在或它可作为缀合物或融合蛋白存在，融合蛋白包括其它流感嗜血杆菌或非典型流感嗜血杆菌抗原的多种外膜蛋白决定簇或多种抗原决定簇。例如，流感嗜血杆菌PAL和PCP或来源于它们的任何蛋白、肽或抗原表位能施用作为与本发明P4变异蛋白的混合物或作为缀合物或融合物。
在用本发明单独或所述不同组合的P4变异蛋白制成免疫原性组合物中，免疫原调节到合适浓度并用任何合适的佐剂制成。在一些较佳实施方案中，制备发明的蛋白免疫原性组合物以施用给人受试者，例如以液体、粉剂、气雾剂、片剂、胶囊、肠溶片剂或胶囊或者栓剂形式。
2.含核酸分子的免疫原性组合物本发明的另一个免疫原性组合物的实施方案包括编码本发明P4变异蛋白的核酸分子和药学上可接受载体。编码P4变异蛋白的核酸序列用于抗NTHi的免疫原性组合物，可存在于合适的药学或生理上可接受载体，如等渗盐溶液。适当的载体对本领域技术人员是显然的且大部分取决于施用途径。
另外，免疫原性组合物由多核苷酸分子组成，最好包含任选的多核苷酸促进剂或“协同剂”(coagent)，如局部麻醉剂、肽、含阳离子脂质的脂质、脂质体或脂颗粒、聚阳离子如聚赖氨酸、分支的三维聚阳离子如树状聚体、碳水化合物、阳离子两亲物、去垢剂、苄铵表面活性剂、或另一种促进多核苷酸转移到细胞的化合物。用于本发明的这种促进剂或协同剂的非唯一例子描述于美国专利号5,593,972；5,703,055；5,739,118；5,837,533；1996年4月4日发表的国际专利出版号WO 96/10038和1994年8月8日发表的国际专利出版号WO94/16737，它们各自纳入本文供参考。
更优选局部麻醉剂的存在量与核酸分子形成一个或多个复合体。当局部麻醉剂混合本发明核酸分子或质粒时，它形成多种小复合体或包装DNA的颗粒且是均匀的。因此，在本发明免疫原性组合物的一个实施方案中，通过混合局部麻醉剂和至少一个本发明质粒来形成复合体。
另外，在本发明组合物的另一个实施方案中，如果所有质粒要以单推注施用，局部麻醉剂可与各质粒单独预混合，然后单独的混合物结合于单个组合物以确保所需质粒的比例在单个免疫原性组合物中存在。另外，局部麻醉剂和各质粒可单独混合并单独施用以获得所需比例。以后，术语“复合体”或“一个或多个复合体”或“几个复合体”用于定义此免疫原性组合物的实施方案，当然该术语包括一个或多个复合体，各复合体含P4变异蛋白编码质粒的混合物或分开形成的复合体混合物，其中各复合体仅包含一类质粒或者一个复合体或一种复合体混合物，其中各复合体含一种多顺反子DNA。
复合体直径优选在约50到约150nm间。当促进剂用作局部麻醉剂时，优选布比卡因，其量优选从约0.1重量百分比到约1.0重量百分比，以多核苷酸组合物的总重量为基础。也参见国际专利出版号WO99/21591，它纳入本文供参考且教授了掺入苄铵表面活性剂作为协同剂，优选施用量在约0.001-0.03重量％间。根据本发明，局部麻醉剂的存在量与所述核酸分子的比例为0.01-2.5％w/v局部麻醉剂相对1-10μg/ml核酸。另一个这种范围是0.05-1.25％w/v局部麻醉剂相对100μg/ml到1ml/ml核酸。
在此多核苷酸免疫过程中，发明的变异P4蛋白在体内瞬时基础上表达；无遗传物质插入或整合入宿主的染色体。此过程与基因治疗有区别，其目标是将感兴趣的遗传物质插入或整合入染色体。测定用于确认通过免疫施用的多核苷酸不在宿主中引起表型转变(美国专利号6,168,918)。
免疫原性组合物也可包含其它添加物，适用于所选组合物的施用模式。发明组合物也可包括冻干的多核苷酸，它能与其它药学上可接受赋形剂一起使用，用于开发粉剂、液体或悬浮剂型。参见例如《Remington药学的科学和实践》(TheScience and Practice of Pharmacy)，第2卷，第19版(1995)，如第95章气雾剂；国际专利出版号WO 99/45966，其教授的内容纳入本文供参考。如果需要，可结合或调整这些组合物的施用途径。
如上所述，这些含核酸分子的免疫原性组合物可包括编码一种或多种上述“另外”抗原的核酸序列。例如，编码单独抗原的单独核苷酸分子可混合含编码P4变异蛋白序列的核苷酸分子。另外，编码P4变异蛋白的序列能融合DNA序列，序列编码一种或多种其它流感嗜血杆菌的抗原或其它细菌、病毒、寄生虫或真菌的抗原，以产生遗传融合(享有共同的肽骨架)的多价抗原。
这些含核酸分子的免疫原性组合物能包含添加物，添加物适合经任何常规施用途径来施用。在一些较佳实施方案中，制备发明的免疫原性组合物以施用给人受试者，例如以液体、粉剂、气雾剂、片剂、胶囊、肠溶片剂或胶囊或者栓剂形式。
3.含重组病毒的免疫原性组合物在本发明的另一方面，免疫原性组合物可包含能表达P4变异蛋白(和/或任何另外的免疫原)的重组病毒。合适的非致病病毒可改造以携带本发明核酸分子进入宿主细胞，它们包括痘病毒如牛痘病毒、腺病毒、腺伴随病毒、金丝雀痘病毒、逆转录病毒等。对于施用，病毒优选是非复制病毒，如缺失E1的腺病毒，典型用于基因治疗。作为例子，参见美国专利号5,698,202所述重组复制缺陷型腺病毒。一些这种非致病病毒常用于人基因治疗并作为其它疫苗剂的载体，为本领域技术人员已知且可选择。
携带本发明编码P4变异蛋白的核酸序列的非复制病毒优选悬浮于生物相容溶液或药学上可接受传递载体。合适的载体是无菌盐水。其它含水和非水等渗无菌注射溶液及含水和非水无菌悬浮液已知是药学上可接受载体且对本领域技术人员熟知，它们可用于此目的。
此类发明的免疫原性组合物可任选制成包含其它成分，包括例如上述的佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂。这种成分对疫苗领域的技术人员熟知。
另一个根据本发明适用于免疫原性组合物的实施方案是使用灭活的免疫原性组合物，如培养生长大量表达所需P4变异蛋白的重组病毒以提供必需量的相关抗原并通过常规方法灭活。表达不同抗原表位的灭活病毒的混合物可用于制成“多价”免疫原性组合物，如纳入本文供参考的美国专利号5,780,601所述。此免疫原性组合物也应包含上述合适的佐剂，用于增强对抗原的免疫反应。
4.含共生细菌的免疫原性组合物在本发明的另外一方面，编码P4变异蛋白的本发明的合成核酸分子(包括任何融合蛋白和/或另外抗原)能掺入非致病微生物中。当所得微生物施用给人宿主时，体内表达和增殖本发明的表达组合物以诱导特定抗体形成。例如，非致病共生细菌能用于携带本发明的P4变异蛋白编码分子且用于施用给病人，它可通过使用常规方法制备并选自已知的非致病微生物。可用于体内外源传递本发明核酸分子给病人的共生细菌包括但不限于多种链球菌菌株如戈氏链球菌(S.gordonii)，或大肠杆菌、杆菌、链霉菌和酵母菌株。
如上所述，本发明的免疫原性组合物不受选择常规、生理上可接受载体、佐剂或其它成分的限制，它们用于上述药物制品类型。从上述成分制备这些药学上可接受组合物在本领域技术范围内，这些组合物具有适当pH等渗性、稳定性和其它常规特征。
E.使用方法上述免疫原性组合物可用于在人中诱导抗非典型流感嗜血杆菌的免疫反应的方法。在此方法的一个实施方案中，有效量的上述P4变异蛋白免疫原性组合物施用给病人。组合物中P4蛋白、表达P4变体的核酸分子或表达P4变体的重组病毒的量有效引发抗NTHi的免疫反应。免疫反应优选对NTHi感染起保护作用。
本发明免疫原性组合物的施用途径包括但不限于肠胃外施用、腹膜内施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、皮内施用、口服施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、直肠施用、阴道施用等。所有这种途径适合这些组合物的施用。选择合适途径取决于所用免疫原性组合物性质和病人年龄、重量、性别及总的健康状况和免疫原性组合物中存在的抗原和参与医师的类似因素。
一般，选择用于本发明免疫原性组合物的适当“有效量”或剂量也以所用特定免疫原性组合物以及受试者的生理状况为基础，尤其包括被免疫受试者的总的健康状况和重量。这种选择和上调或下调有效剂量在本领域技术范围内。诱导免疫反应优选是保护性反应或在病人中产生外源效果而没有显著副作用所需的活性成分量的变化取决于所用药物组合物和佐剂的任选存在(用于含蛋白的组合物)。
在一个实施方案中，对于含蛋白成分的组合物如上述P4变异蛋白或融合蛋白，各剂量在约1μg到约20mg蛋白免疫原每mL无菌溶液间。其它剂量范围也可由本领域技术人员考虑。起始剂量后可任选在需要的地方反复加强。
在另一个实施方案中，DNA和载体组合物中核苷酸分子的量可由本领域技术人员选择和调节。在一个实施方案中，各剂量在约50μg到约1mg免疫原编码核酸如DNA质粒每mL无菌溶液间。
对于含本发明编码P4变异蛋白的核酸分子的重组病毒，优选复制缺陷型病毒，“有效量”是施用途径中有效的重组病毒的量，用于转染所需受试者的细胞并提供足够的所选基因的表达水平以提供有益即保护性免疫。能监控免疫水平以确定对于加强的需要。然而，当然本领域技术人员可改变这种剂量，这取决于重组病毒的同一性和免疫原的组成(即存在重组病毒传递给宿主的另外P4变异蛋白或“其它”抗原)。
携带核酸序列的共生细菌的量一般范围在约103到约1012个细胞/kg间，核酸序列表达待传递给病人的P4变异蛋白。这些剂量可由本领域技术人员改变，这取决于所用细菌和活细菌传递给宿主的另外P4变异蛋白或“其它”抗原。
F.使用P4变异蛋白作为载体蛋白除了用作主要免疫原之外，P4变异蛋白可用作载体蛋白来赋予或增强其它抗原的免疫原性，其中其它抗原可以是蛋白、多肽、肽、多糖、寡糖、糖、脂多糖、脂寡糖或脂糖。变异P4蛋白与野生型P4蛋白相比酶活性减少，但不一定需要诱导野生型P4蛋白的抗体或具有抗NTHi的杀菌活性，但须是P4变异载体蛋白在SEQID NO3的氨基酸位置122没有苯丙氨酸。例如，P4变异蛋白通过常规方法化学缀合多糖或脂多糖或表达为与另一种蛋白的融合蛋白。
G.诊断测定本发明的P4变异蛋白和核酸分子任选结合可检测标记或能检测免疫复合体的形成或DNA杂交，也可用作测定中的抗原，用于在不同组织和体液中检测非典型流感嗜血杆菌，如血液、脊髓液、痰等。这些测定和测定模式是常规的且与使用野生型P4试剂所述模式相同，如美国专利号5,780,601所述。
例如，本发明的P4变异蛋白可用作放射性免疫测定、ELISA测定、“三明治”测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、凝集测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定和免疫电泳测定中的试剂。本发明的P4变异蛋白任选结合可检测标记。
本发明编码P4变异蛋白的核酸分子和与其杂交的任何核苷酸序列也能用作核酸杂交测定中的探针，以检测病人的不同组织和体液中的非典型流感嗜血杆菌。合适的杂交测定包括但不限于DNA印迹、RNA印迹和菌落印迹。杂交严谨性可取决于测定要求而变化。
合适的可检测标记包括但不限于蛋白或小化学分子，它能单独作用或结合其它分子或蛋白来提供直接或间接可检测的信号。例如，可检测标记可以是荧光标记、发光标记、放射性标记或化学发光标记。标记也可以是与底物相互作用的酶以产生可检测信号。参见例如《荧光探针和研究化学只手册》(Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals)，第6版，R.P.Haugland，MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR(1996)；美国专利号4,542,104和美国专利号5,272,257。其它标记包括绿色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白。用于核酸分子的合适标记可以是DNA序列，编码lux基因、β-内酰胺酶、半乳糖苷酶如β-半乳糖苷酶(lacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶或葡糖酸酶(gluconase)。
常规使用的任何数量的其它标记系统适合于结合本发明的P4变异蛋白和/或编码P4变异蛋白的核酸序列。技术人员理解选择和/或执行标记系统仅包括途径实验。
实施例提供以下例子以阐明本发明代表性P4变异蛋白的产生和活性。这里所示例子显示编码P4变异蛋白的分离核苷酸分子的构建、宿主细胞中的重组表达和由此纯化。在灵敏的比色测定中分析纯化蛋白的酶活性。蛋白也用于和野生型rLP4一起免疫Swiss-Webster小鼠且分析所得抗血清用于抗野生型rLP4的总IgG抗体及抗NTHi的杀菌活性。这些例子证明确定缺乏酶活性而保持野生型免疫原性且引起功能抗体的P4突变体不是繁琐的事。如下所述构建的突变P4蛋白中有3种具有所需免疫性质，即引起抗野生型P4的高ELISA效价和抗NTHi的高杀菌抗体水平。本领域技术人员理解尽管以下例子概括了特定试剂和条件，这些试剂和条件不是对本发明的限制。
实施例1定点诱变P4基因细菌酸性磷酸酶被很好地研究了几年，在其底物特异性、细胞定位等的基础上分成多个种类(Thaller，M.C.等，1998.Prot.Sci.，71647-52.9)。具多种细菌酸性磷酸酶间高保守氨基酸的区域被鉴定为定点诱变的可能区域以去除或减少酶活性，且通过进行保守性变化来维持三级结构。
合成引物用于引入BsmB1位点和下述所需突变后，在野生型P4上进行定点诱变。用BsmB1消化和再连接产生所需突变P4序列，伴随着失去BsmB1位点。这些脂质化的突变蛋白在大肠杆菌BLR宿主细胞中表达，通过对用于纯化脂质化的野生型rLP4的标准过程稍微修改来纯化。
特别是在野生型P4蛋白中的2个天冬氨酸残基对酸性磷酸酶活性关键的信息基础上构建双天冬氨酸定点突变。构建名为P4-351的突变体，其中在SEQ ID NO3的位置Asp64和Asp66的氨基酸残基变为Ala64和Ala66A。构建名为P4-D184A、D185A的另外突变体，其中SEQ ID NO3的野生型Asp184和Asp185突变为Ala184和Ala185。在其它突变体中，定点诱变SEQ ID NO3的氨基酸残基35和37产生四种蛋白，丙氨酸残基变为谷氨酸(A35G，A37G)、苏氨酸(A35T，A37T)、天冬酰胺(A35D，A37D)或谷氨酰胺(A35Q，A37Q)。构建这些突变体以确定另外区域中除了Asp到Ala的变化是否会使蛋白分子构象破坏更少并因此抗野生型P4的免疫原性更好。
另外，进行下列P4蛋白中的单突变以产生P4变异蛋白N218Q、K161R、D64E、Y122F、D64N、D64E和Q39E。此外，位置48的Phe残基变为Cys残基。选择此残基用于诱变，选择是以它在推定氯高铁血红素结合结构域中的位置为基础。
产生多种表达的突变蛋白，如表1所鉴定。
表1.突变体P4变异蛋白和突变
除了F48C和D64A，D66A的所有定点突变体来源于质粒pLP339、pBAD18Cam表达载体，在阿拉伯糖启动子控制下含野生型非典型流感嗜血杆菌(NTHi)P4基因(Green，B.A.，等1991 Infect.Immun.，593191-3198)。突变蛋白D64A，D66A和F48c来源于质粒pHel3(Reilly等，1999，上面引用)。
大部分定点突变蛋白用QuickChange诱变试剂盒(Stratagene)根据厂商说明的构建。用于构建P4突变的引物列于下表2。本文所用寡核苷酸引物(除了上面引用的Reilly等，1999中所用的)在PerSeptive生物系统寡核苷酸合成仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)上用β-氰乙基亚磷酰胺化学来合成。
表2.定点诱变hel基因所用的引物
BsmBI无缝克隆用于产生一些P4突变体。P4基因部分通过聚合酶链反应(PCR)(PE2400热循环仪，Applied Biosystems，Foster City，CA)从质粒pLP339扩增。首先，含BsmBI位点和所需突变的引物与适当载体引物配对并用于扩增P4基因部分。另外，第二个含BsmBI位点的引物与适当载体引物配对并用于扩增剩余P4基因部分。连接各P4基因部分且克隆入pCR2.1-TOPO中(Invitrogen)。
由于插入物的存在通过PCR筛选转化体并通过序列分析确认。正确克隆用BsmBI和SacI或SphI(New England Biolabs提供的限制性酶)限制性消化，插入物在低熔点琼脂糖凝胶上纯化。凝胶纯化片段在BsmBI位点无缝连接一起。
除了F48C基因，克隆入pCR2.1-TOPO中的诱变P4基因亚克隆入pBAD18Cam(Invitrogen)中以用SacI-SphI位点表达突变P4蛋白。F48C序列用NheI-SacI位点亚克隆入pBAD18Cam中。
实施例2脂质化重组突变P4蛋白的表达含这些突变P4蛋白的质粒转化入大肠杆菌菌株BLR中且所有突变P4蛋白在其中重组表达。克隆通过测序P4基因来确认。含适当质粒的BLR过夜培养物生长于Hy-Soy培养基，用含0.05％葡萄糖和30μg/ml氯霉素的NaPO4缓冲，37℃通气。含相同培养基但减去葡萄糖的烧瓶用1∶20稀释的过夜培养物接种并在37℃通气培养，直到OD600达到约2.0。然后细菌用0.5％阿拉伯糖诱导且连续培养3小时。细菌细胞通过10,000xg 4℃离心30分钟来收集，细胞沉淀用PBS洗1X。再沉淀细胞并在-20℃冷冻保存。用12％胶通过SDS-PAGE分析总细胞裂解物检查P4蛋白的表达。
实施例3脂质化重组P4和突变体的纯化然后P4突变蛋白如下纯化大肠杆菌细胞悬浮于低渗缓冲液(10mMHEPES-NaOH，pH7.4、1mM Na2EDTA)并在高压下(约18,000psi)细胞悬浮液通过微流化器来裂解。在Beckman 45Ti转子中以300,000xg 10℃超离心1小时后获得膜。内膜和外膜蛋白分别用10mM HEPES-NaOH，pH7.4、1mM MgCl2中的1％(w/v)TritonX-100和50mM Tris-HCl，pH8、5mM Na2EDTA中的1％(w/v)两性洗涤剂3-12连续提取来差异溶解。两性洗涤剂3-12提取物溶解rLP4或突变蛋白。
感兴趣的蛋白通过在串联离子交换柱(DEAE&SP-琼脂糖)上分级分离来纯化。rLP4蛋白在0-0.2M盐梯度中从SP-琼脂糖洗脱，2个峰命名为形式1和形式2。通过在10mM磷酸钠，pH7.1、150mM NaCl、1％两性洗涤剂3-12的缓冲液中缓慢冷冻，接着透析入Tris-EDTA-两性洗涤剂3-12-缓冲液，pH8中，形式2转变成形式1。转化的形式1进一步在SP-琼脂糖柱上纯化。rLP4突变体用与野生型蛋白相同的方法纯化，除了突变减少蛋白的pl。在这些情况中，提取后，缓冲液变为10mMHEPES-NaOH，pH7.4、1mM Na2EDTA、1％(w/v)两性洗涤剂3-12，然后进行串联柱步骤。此缓冲液也用于从SP-琼脂糖柱洗脱。大部分rLP4突变体洗脱于单个蛋白峰。根据厂商说明书(Pierce)用二金鸡宁酸测定法来测定蛋白。
实施例4磷酸酶活性的测定然后在灵敏的流动相测定中检测纯化P4突变蛋白的酶活性。通过上面引用的Reilly等，1999所述基本比色测定测量rLP4的磷酸单酯酶活性，与野生型rLP4相比较。加入1％(w/v)Triton X100到测定缓冲液提高rLP4的活性。通过比较410nm处吸光度和p-硝基酚标准曲线。一单位的酶活性定义为在37℃将1μmol底物转变成产物每分钟所需的活性的量确定产生的p-硝基酚的nmol量。比活性定义为每1mg蛋白的酶单位数。结果也表示为％野生型活性。结果示于表3。
表3.rLP4突变体的比活性(pNPP测定)
a/与野生型rLP4相比的活性百分比b/检测极限下c/无数据在选择用于细菌酸性磷酸酶间保守性的P4特定残基中进行的每个变化几乎完全去除P4酶活性，除了Y122F突变。在剩余的测试突变体中，只有Q39E突变体保持＞1％的野生型活性(3.3％)，而双重突变体没有可检测活性。
这些结果表明，细菌酸性磷酸酶间保守的P4区域内的电荷和三级结构对于酶功能是关键的。当变化在保守的Asp残基上进行时，即使保守性变化如将Asp残基变为Glu残基，几乎完全去除酶活性。
除了Y122F和Q39E突变体，发明者没有检测到仅部分减少酶活性的突变体。实际上所有突变几乎完全去除酶活性。将F48变为半胱氨酸或丝氨酸残基的突变也减少酶活性。
实施例5抗脂质化RLP4突变蛋白的抗血清的产生然后测定突变P4蛋白与单克隆抗体(Mabs)的反应性和引起高效价、抗野生型P4的生物活性抗血清的能力。
A.免疫过程雌性Swiss Webster小鼠(6-8周龄)用15μg野生型或突变P4蛋白皮下免疫，蛋白混合盐水或PBS中的100μgMPLTM佐剂。组合物也包含0.01％硫汞撒作为防腐剂。2次免疫隔4周进行，在第6周进行最后一次放血。第0周和第6周，通过ELSA测定单独分析血清或血清库并分析库的杀菌活性。
B.酶联免疫吸附测定(ELSA)抗P4(野生型和突变)抗体如下测量。平板用PBS中稀释的1μg/ml野生型P4或12μg/ml突变P4涂布。90分钟/37℃孵育后，平板贮存于4℃直到次日。突变P4涂布的平板用脱脂牛奶封闭。洗涤后，100μl等分血清在PBS/0.05％吐温20中连续稀释到1∶50至1∶5,467,500的终浓度，加入各孔且室温孵育2小时。洗平板并加入100μl二抗(缀合山羊抗小鼠IgG的碱性磷酸酶，在PBS/0.05％吐温20中以1∶5,000稀释)，室温孵育2小时。
洗涤后，结合抗体通过底物pNPP(p-磷酸硝基酚)检测，pNPP以1mg/ml稀释于二乙醇胺。1小时后，在405nm处读到黄色，参考为650nm。各反应进行两次，平均结果。血清的抗P4效价计算为4-参数曲线上产生0.1吸光度的血清稀释。
C.总细胞ELISANTHi菌株P860295在巧克力琼脂平板上生长6小时并收集到PBS中。细胞悬浮液稀释到620nm处确定为0.2的OD且75μl分散到NUNCpolysorb平板。平板在37℃干燥过夜并保持于室温直到使用。它们用PBS/5％脱脂牛奶封闭并洗涤，然后加入100μl稀释血清(在PBS/0.1％吐温20/5％脱脂牛奶中连续稀释到1∶36,450或1,093,500的终浓度)。1小时/37℃孵育后，洗平板，用100μl二抗(缀合山羊抗小鼠IgG的碱性磷酸酶，在PBS/0.1％吐温20/5％脱脂牛奶中以1∶5,000稀释)37℃再孵育1小时。
再次洗平板且通过底物pNPP(p-磷酸硝基酚)检测结合抗体，pNPP以1mg/ml稀释于二乙醇胺。1小时后，在405nm处读到黄色，参考为650nm。各反应进行两次，平均结果。血清的抗总细胞效价计算为4-参数曲线上产生0.1吸光度的血清稀释。
表4阐明非酶活性P4突变体的ELISA结果，突变体是P4-D184A，D185A和P4-D64A，D66A，它们包含非保守性突变。ELISA数据证明这些位点参与酶活性并对免疫反应重要。抗这些突变蛋白产生的抗体显示突变P4蛋白引起抗野生型rLP4的抗体效价显著低于天然P4或野生型rLP4。
表4.定向抗初始P4突变体的血清的GMT ELISA效价
表5报导了P4突变蛋白(A35G，A37G)、(A35T，A37T)、(A35D，A37D)或(A35Q，A37Q)的ELISA测定结果。如上所述，编码这些蛋白的突变基因插入用于rLP4的阿拉伯糖表达载体(pBAD18cam)，在大肠杆菌BLR中表达，纯化并用于免疫小鼠。小鼠用5μg适当P4蛋白+MPL在第0和4周免疫。动物在第6周放血。表5的数据来自第6周放血的5只小鼠库。确定各抗血清抗各同源突变P4蛋白和野生型P4的ELISA抗体效价。在表中，ND表示无数据。
各突变蛋白引起良好水平的定向抗本身(同源蛋白)抗体。没有蛋白引起相当水平的抗野生型rLP4抗体。这些结果减低了突变P4蛋白不是良好免疫原的可能性。它们抗同源蛋白的效价在此模式中脂质化P4所预期的正常范围内。
表5.rLP4突变小鼠相对rLP4突变蛋白的ELISA反应
D.杀菌测定杀菌抗体测定是功能测量抗NTHi的抗体且如上面引用的Green等.1991所述进行。简要地，NTHi菌株P860295在37℃过夜生长于BHI-XV液体培养基。过夜培养物在BHI-XV液体培养基中稀释到30克莱特的光密度，光密度在Klett-Sumerson光度计中660nm处测量。培养物在37℃过培养直到对数中期并以1∶15,000稀释到PCM(约1-2×105cfu/mL)。抗P4小鼠血清在55℃加热30分钟以去除补体活性。然后这些血清在磷酸缓冲盐水中连续稀释，盐水含0.15mM CaCl2和0.5mM MgCl2(PCM)。
吸收抗NTHi P860295的人补体，人补体由罗切斯特大学提供(Green，B.A.等，1990 Infect.Immun.，583272-3278)。在96孔微量滴定板中，结合30μl PCM、5μl稀释的小鼠抗血清、10μl稀释的NTHi和5μl吸收的人补体并在37℃孵育30分钟。通过加入200μl PCM终止反应。来自各孔的50μl一式两份铺在BHI-XV琼脂上且37℃孵育过夜。计数菌落以确定杀菌效价(能杀死至少50％细菌的抗血清最高稀释的倒数与不含抗体的测定对照相比)。
表6证明抗血清产生抗P4-D184A，D185A和P4-D64A，D66A的BC效价。确定这些效价且显示它们与rLP4引起的相等，在测定误差内(下表6)。这些突变体的BC效价和ELISA效价间没有相关性。
表6.抗血清相对突变体和野生型P4的杀菌活性血清a/放血BC效价相对NTHiP860295抗天然P4 后-2° 160抗野生型rLP4 后-2° ＞320抗rLP4-D184A，D185A 后-2° 80抗rLP4-D64A，D66A 后-2° ＞320免疫前库 免疫前 ＜20抗P860295总细胞 后-3° ＞320免疫前库 免疫前 ＜20a/来自10只小鼠的血清库表7报导了免疫小鼠的血清的BC测定结果，免疫用双重突变蛋白(A35G，A37G)、(A35T，A37T)、(A35D，A37D)或(A35Q，A37Q)。杀菌抗体效价不与抗野生型P4的ELISA效价相关。例如，rLP4 A35N，A37N突变体不引起抗野生型rLP4的高ELISA效价，但引起抗NTHi的良好杀菌抗体效价。因此，这些突变体中没有一种被认为是良好的免疫原性或疫苗成分。有趣的是，抗rLP4血清对大部分突变体的反应不很强烈，似乎表明酶活性位点也是免疫显性的。
表7.抗rLP4和抗P4突变体的血清的ELISA和BC效价
表8报导了脂化质蛋白的BC测定结果，蛋白具有单突变N218Q、K161R、D64E、Y122F、D64N、D64E、F48C和Q39E，它们纯化自大肠杆菌BLR细胞，检测蛋白的酶活性。当蛋白用于免疫小鼠时，3种突变体似乎结合了高ELISA效价和高BC效价以及不能检测的酶活性。这些是F48C、N218Q和Q39E突变(表7和8)。这些突变P4蛋白有抗野生型P4的高ELISA效价，相当于野生型P4，但也有抗NTHi的高杀菌效价。
表8.突变P4蛋白的ELISA和BC效价突变体 IgG效价BC效价相对P860295rLP4-D64N1,921,553* 20rLP4-N218Q 1,475,833** 200rLP4Y122F1,106,822* 40rLP4D64E 988,016*20rLP4-Q39E770,483*320rLP4-F48C687,742** 240rLP4 197,160** 160rLP4-K161R 186,394** 60rLP4-D64A，D66A 60,358**30rLP4-D184A，D185A33,185**30rLP4-A35Q，A37Q 14,331**50rLP4-A35N，A37N 7,121** 200rLP4-A35E，A37E 4,322** 30*来自10只小鼠的集合血清**来自10只小鼠的单独血清的GMT实施例6P4截短突变体构建了在野生型序列的C末端不同点截短的4种P4变异蛋白。截短突变体通过pLP339中hel基因的PCR产生。简要地，合成与hel基因的5’引发末端和核糖体结合位点同源的引物，其5’末端有SphI位点。合成3’引物，将指定截短点后的残基变为终止密码子，但引物3’末端处的hel基因同源。第二个引物的5’末端也包含SacI位点。PCR产物克隆入pCR2.1-TOPO中(Invitrogen)且用SphI-SacI消化。纯化hel基因片段并连接入用相同酶消化的pBAD18Cam。鉴定阳性克隆并测试表达。所有构建表达在大肠杆菌BLR中脂质化的截短P4蛋白。
特别产生了P4变异蛋白，它们在残基200(即它包含SEQ ID NO3的氨基酸1-200)、210、221和232截短。用实施例4所列方案测定各片段的磷酸酶活性。所有4个片段都没有可检测的酶活性。
其次，Swiss Webster小鼠遵循实施例5A的方案免疫，除了施用与25μg MPLTM混合的5μg截短P4蛋白。表9阐明了4个截短P4片段的ELISA结果，与野生型rLP4相比，其中遵循实施例5的方案。代号“rLP4-232”表示重组P4在SEQ ID NO3的氨基酸232截短。ELISA数据证明所有4种截短突变体引起有用的效价水平。
表9.Swiss Webster小鼠中P4截短突变体的抗rP4 ELISA效价
接着，遵循实施例5D的方案进行2次杀菌测定。在第一次测定中，在氨基酸210截短的P4蛋白与野生型rLP4和上述多种P4变体相比，其中各制剂包括与100μg MPLTM混合的15μg P4蛋白，除了最后一组，其中仅包括来自前研究的5μg rLP4蛋白作为正对照。表10中杀菌测定数据表明在氨基酸210截短的P4蛋白引起的杀菌抗体效价在统计上明显区别于背景。在此实验中，认为80或更高的BC50效价显著不同于背景(＜20)。所用补体是吸收的人UR8-96。
表10.抗血清相对突变体、截短&野生型P4的杀菌活性
在第二次测定中，在氨基酸200、210、221和232截短的P4蛋白与野生型rLP4和上述多种P4变体相比，其中各制剂包括与25μgMPLTM混合的5μg P4蛋白(次最佳量)，除了最后一组，其中仅包括来自前研究的5μg rLP4蛋白加100μg MPLTM作为正对照。表11中杀菌测定数据表明在氨基酸221和232截短的P4蛋白引起的杀菌抗体效价在统计上明显区别于背景，即使有低剂量的MPLTM。在此实验中，认为80或更高的BC50效价显著不同于第0周。所用补体是吸收的人UR8-97。
表11.抗血清相对突变体、截短和野生型P4的杀菌活性
总之，建议P4突变的结果表明，来自杀菌活性的ELISA效价分开意味着杀菌活性所需位点不同于酶活性必需的区域。
本发明书引用的全部出版物纳入本文供参考。尽管发明参考特定的较佳实施方案来描述，应理解可进行修改而不背离发明的精神。这种修改属于所附权利要求范围内。
序列表<110>惠氏控股有限公司(Wyeth Holdings Corporation)密苏里州立大学校董(The Curators of the University of Missouri)B.A.格林(Green，Bruce A.)G.W.洛特尼克(Ziotnick，Gary W.)L.D.弗莱彻(Fletcher，Leah D.)A.L.史密斯(Smith，Arnold L.)T.J.雷利(Reilly，Thomas J.)<120>酶活性减少的非典型流感嗜血杆菌的P4蛋白突变体<130>AM100935PCT<150>US 60/364,688<151>2002-03-15<160>29<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1143<212>DNA<213>流感嗜血杆菌(H.influenzae)的hel基因<400>1gaattcttaa aaggaataaa ataatttcta ttataaccgt aggtagttta tttacggtta60ttaatgccat ctatgatgaa aaacactttt caattgaaaa gtgtttttca gaaagactta120ctataccctg aatgaatagg aacataatat gaaaacaacg ttaaaaatga ccgcacttgc180ggctctttct gcttttgttt tagctggctg tggttcacac caaatgaaat cagaagaaca240tgcaaatatg caattacaac aacaagcggt gcttggatta aactggatgc aagattctgg300cgaatataaa gcattagctt atcaagcgta caatgcggca aaagttgcat ttgatcacgc360aaaagtggca aaaggtaaga aaaaagcggt tgtggctgat ttagatgaaa ctatgttaga420caacagccct tatgctggct ggcaagttca aaataacaaa ccattcgatg gtaaagattg480gactcgttgg gtagacgcac gtcaatctcg tgccgttccg ggtgcggtag aatttaataa540
ttatgtaaac agccacaacg gtaaagtgtt ctacgtaaca aaccgcaaag acagcactga600aaaatcaggc actatcgatg atatgaaacg cttaggtttc aatggcgtgg aagaatctgc660attttatttg aaaaaagaca aatcagctaa agcggctcgt tttgcagaaa ttgaaaaaca720aggctatgaa atcgtacttt atgtaggtga taacttagat gacttcggta ataccgtata780tggcaaatta aacgctgacc gccgtgcatt cgttgatcaa aaccaaggca aatttggtaa840aactttcatc atgttaccta acgcaaacta cggtggctgg gaaggcggtt tagctgaagg900gtatttcaaa aaagatacac aaggccaaat caaagctcgt ttagatgcag tacaagcttg960ggatggtaaa taattttcca ttaaaaagat cgatttaaat atcgattttg aaaatttaat1020tgaggggcta agctcagttt ttactggctt agctttttca ttttcagtca ctcaagtatc1080atcattacta catctgagtt tgctatgatg ttgcagcttc aaatgatcaa gtagagaatg1140acc 1143<210>2<211>274<212>PRT<213>流感嗜血杆菌(H.influenzae)的hel基因<400>2Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe1 5 10 15Val Leu Ala Gly Cys Gly Ser His Gln Met Lys Ser Glu Glu His Ala20 25 30Asn Met Gln Leu Gln Gln Gln Ala Val Leu Gly Leu Asn Trp Met Gln35 40 45Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Ala Leu Ala Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Ala
50 55 60Lys Val Ala Phe Asp His Ala Lys Val Ala Lys Gly Lys Lys Lys Ala65 70 75 80Val Val Ala Asp Leu Asp Glu Thr Met Leu Asp Asn Ser Pro Tyr Ala85 90 95Gly Trp Gln Val Gln Asn Asn Lys Pro Phe Asp Gly Lys Asp Trp Thr100 105 110Arg Trp Val Asp Ala Arg Gln Ser Arg Ala Val Pro Gly Ala Val Glu115 120 125Phe Asn Asn Tyr Val Asn Ser His Asn Gly Lys Val Phe Tyr Val Thr130 135 140Asn Arg Lys Asp Ser Thr Glu Lys Ser Gly Thr Ile Asp Asp Met Lys145 150 155 160Arg Leu Gly Phe Asn Gly Val Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Leu Lys Lys165 170 175Asp Lys Ser Ala Lys Ala Ala Arg Phe Ala Glu Ile Glu Lys Gln Gly180 185 190Tyr Glu Ile Val Leu Tyr Val Gly Asp Asn Leu Asp Asp Phe Gly Asn195 200 205Thr Val Tyr Gly Lys Leu Asn Ala Asp Arg Arg Ala Phe Val Asp Gln210 215 220Asn Gln Gly Lys Phe Gly Lys Thr Phe Ile Met Leu Pro Asn Ala Asn
225 230 235 240Tyr Gly Gly Trp Glu Gly Gly Leu Ala Glu Gly Tyr Phe Lys Lys Asp245 250 255Thr Gln Gly Gln Ile Lys Ala Arg Leu Asp Ala Val Gln Ala Trp Asp260 265 270Gly Lys<210>3<211>254<212>PRT<213>流感嗜血杆菌(H.influenzae)的hel基因<400>3Cys Gly Ser His Gln Met Lys Ser Glu Glu His Ala Asn Met Gln Leu1 5 10 15Gln Gln Gln Ala Val Leu Gly Leu Asn Trp Met Gln Asp Ser Gly Glu20 25 30Tyr Lys Ala Leu Ala Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Ala Lys Val Ala Phe35 40 45Asp His Ala Lys Val Ala Lys Gly Lys Lys Lys Ala Val Val Ala Asp50 55 60Leu Asp Glu Thr Met Leu Asp Asn Ser Pro Tyr Ala Gly Trp Gln Val65 70 75 80Gln Asn Asn Lys Pro Phe Asp Gly Lys Asp Trp Thr Arg Trp Val Asp85 90 95
Ala Arg Gln Ser Arg Ala Val Pro Gly Ala Val Glu Phe Asn Asn Tyr100 105 110Val Asn Ser His Asn Gly Lys Val Phe Tyr Val Thr Asn Arg Lys Asp115 120 125Ser Thr Glu Lys Ser Gly Thr Ile Asp Asp Met Lys Arg Leu Gly Phe130 135 140Asn Gly Val Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Leu Lys Lys Asp Lys Ser Ala145 150 155 160Lys Ala Ala Arg Phe Ala Glu Ile Glu Lys Gln Gly Tyr Glu Ile Val165 170 175Leu Tyr Val Gly Asp Asn Leu Asp Asp Phe Gly Asn Thr Val Tyr Gly180 185 190Lys Leu Asn Ala Asp Arg Arg Ala Phe Val Asp Gln Asn Gln Gly Lys195 200 205Phe Gly Lys Thr Phe Ile Met Leu Pro Asn Ala Asn Tyr Gly Gly Trp210 215 220Glu Gly Gly Leu Ala Glu Gly Tyr Phe Lys Lys Asp Thr Gln Gly Gln225 230 235 240Ile Lys Ala Arg Leu Asp Ala Val Gln Ala Trp Asp Gly Lys245 250<210>4<211>28
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<223>合成的寡核苷酸引物<400>29gcggtttgtt acaaagaaca ctttaccg 28
权利要求
1.一种非典型流感嗜血杆菌(NTHi)的P4变异蛋白，与野生型P4蛋白相比酶活性减少且诱导野生型P4蛋白的抗体和/或具有抗NTHi的杀菌活性，其特征在于，P4变异蛋白具有的突变选自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸残基39的突变，它在野生型P4蛋白中是谷氨酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸残基48的突变，它在野生型P4蛋白中是苯丙氨酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64的突变，它在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸残基161的突变，它在野生型P4蛋白中是赖氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸残基218的突变，它在野生型P4蛋白中是天冬酰胺；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸残基35和37的突变，它们在野生型P4蛋白中是丙氨酸，其中突变不是谷氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64和66的突变，它们在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(h)一个或多个突变(a)-(g)的组合。
2.如权利要求1所述的P4变异蛋白，其特征在于，P4变异蛋白具有的突变选自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸残基39的谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸残基48的半胱氨酸、丝氨酸或其它具有不带电极性基团的氨基酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64的天冬酰胺、谷氨酸或丙氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸残基161的精氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸残基218的谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸残基35和37的天冬酰胺；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64和66的丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；(h)一个或多个突变(a)-(g)的组合。
3.如权利要求2所述的P4变异蛋白，其特征在于，所述变异蛋白是脂质化的。
4.如权利要求3所述的P4变异蛋白，其特征在于，所述变异蛋白进一步包括融合所述P4变异蛋白的N-末端的信号肽。
5.如权利要求4所述的P4变异蛋白，其特征在于，所述信号肽是SEQ ID NO2的氨基酸1-20。
6.如权利要求2所述的P4变异蛋白，其特征在于，所述变异蛋白是非脂质化的。
7.如权利要求2所述的P4变异蛋白，其特征在于，所述变异蛋白与载体蛋白框内融合。
8.如权利要求7所述的P4变异蛋白，其特征在于，所述载体蛋白选自大肠杆菌DnaK蛋白、GST蛋白、分枝杆菌热激蛋白70、白喉类毒素、破伤风类毒素、半乳糖激酶、泛素、α-交配因子、β-半乳糖苷酶和流感NS-1蛋白。
9.一种免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的P4变异蛋白和药学上可接受载体。
10.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括佐剂。
11.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括另外抗原，抗原来自流感嗜血杆菌或除了流感嗜血杆菌的微生物。
12.一种免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求2所述的P4变异蛋白和药学上可接受载体。
13.如权利要求12所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括佐剂。
14.如权利要求12所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括另外抗原，抗原来自流感嗜血杆菌或除了流感嗜血杆菌的微生物。
15.一种非典型流感嗜血杆菌(NTHi)的P4变异蛋白，与野生型P4蛋白相比酶活性减少且诱导野生型P4蛋白的抗体和/或具有抗NTHi的杀菌活性，其特征在于，P4变异蛋白是在野生型P4蛋白的羧基末端区域中有截短的片段。
16.如权利要求15所述的P4变异蛋白，其特征在于，截短P4变异蛋白以包含SEQ ID NO3的氨基酸1-200、1-210、1-221或1-232。
17.如权利要求16所述的P4变异蛋白，其特征在于，所述变异蛋白进一步包括一个或多个突变，突变选自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸残基39的突变，它在野生型P4蛋白中是谷氨酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸残基48的突变，它在野生型P4蛋白中是苯丙氨酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64的突变，它在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸残基161的突变，它在野生型P4蛋白中是赖氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸残基218的突变，它在野生型P4蛋白中是天冬酰胺；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸残基35和37的突变，它们在野生型P4蛋白中是丙氨酸，其中突变不是谷氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64和66的突变，它们在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(h)一个或多个突变(a)-(g)的组合。
18.如权利要求16所述的P4变异蛋白，其特征在于，所述变异蛋白进一步包括一个或多个突变，突变选自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸残基39的谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸残基48的半胱氨酸、丝氨酸或其它具有不带电极性基团的氨基酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64的天冬酰胺、谷氨酸或丙氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸残基161的精氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸残基218的谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸残基35和37的天冬酰胺；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64和66的丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；(h)一个或多个突变(a)-(g)的组合。
19.一种免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求15所述的P4变异蛋白和药学上可接受载体。
20.如权利要求19所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括佐剂。
21.如权利要求19所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括另外抗原，抗原来自流感嗜血杆菌或除了流感嗜血杆菌的微生物。
22.一种免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求16所述的P4变异蛋白和药学上可接受载体。
23.如权利要求22所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括佐剂。
24.如权利要求22所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括另外抗原，抗原来自流感嗜血杆菌或除了流感嗜血杆菌的微生物。
25.一种分离的核苷酸分子，所含核酸序列与编码NTHi的P4变异蛋白的核酸序列至少70％同源，P4变异蛋白与野生型P4蛋白相比酶活性减少且诱导野生型P4蛋白的抗体和/或具有抗NTHi的杀菌活性，其特征在于，P4变异蛋白具有的突变选自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸残基39的突变，它在野生型P4蛋白中是谷氨酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸残基48的突变，它在野生型P4蛋白中是苯丙氨酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64的突变，它在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸残基161的突变，它在野生型P4蛋白中是赖氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸残基218的突变，它在野生型P4蛋白中是天冬酰胺；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸残基35和37的突变，它们在野生型P4蛋白中是丙氨酸，其中突变不是谷氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64和66的突变，它们在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(h)一个或多个突变(a)-(g)的组合。
26.如权利要求25所述的分离核苷酸分子，其特征在于，核酸序列与编码NTHi的P4变异蛋白的核酸序列至少80％同源。
27.如权利要求26所述的分离核苷酸分子，其特征在于，核酸序列与编码NTHi的P4变异蛋白的核酸序列至少90％同源。
28.如权利要求25所述的分离核苷酸分子，其特征在于，所述核酸序列在指导宿主细胞中P4变异蛋白表达的调节序列的控制下。
29.一种分离的核苷酸分子，所含核酸序列与编码NTHi的P4变异蛋白的核酸序列至少70％同源，P4变异蛋白与野生型P4蛋白相比酶活性减少且诱导野生型P4蛋白的抗体和/或具有抗NTHi的杀菌活性，其特征在于，P4变异蛋白具有的突变选自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸残基39的谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸残基48的半胱氨酸、丝氨酸或其它具有不带电极性基团的氨基酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64的天冬酰胺、谷氨酸或丙氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸残基161的精氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸残基218的谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸残基35和37的天冬酰胺；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64和66的丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；(h)一个或多个突变(a)-(g)的组合，其中核酸序列编码至少突变(a)-(g)中的一个。
30.如权利要求29所述的分离核苷酸分子，其特征在于，核酸序列与编码NTHi的P4变异蛋白的核酸序列至少80％同源。
31.如权利要求30所述的分离核苷酸分子，其特征在于，核酸序列与编码NTHi的P4变异蛋白的核酸序列至少90％同源。
32.如权利要求29所述的分离核苷酸分子，其特征在于，所述核酸序列在指导宿主细胞中P4变异蛋白表达的调节序列的控制下。
33.一种分离的核苷酸分子，所含核酸序列与编码NTHi的P4变异蛋白的核酸序列至少70％同源，P4变异蛋白与野生型P4蛋白相比酶活性减少且诱导野生型P4蛋白的抗体和/或具有抗NTHi的杀菌活性，其特征在于，P4变异蛋白是在野生型P4蛋白的羧基末端区域有截短的片段。
34.如权利要求33所述的分离核苷酸分子，其特征在于，核酸序列与编码NTHi的截短P4蛋白的核酸序列至少70％同源。
35.如权利要求34所述的分离核苷酸分子，其特征在于，核酸序列与编码NTHi的截短P4蛋白的核酸序列至少80％同源。
36.如权利要求35所述的分离核苷酸分子，其特征在于，核酸序列与编码NTHi的截短P4蛋白的核酸序列至少90％同源。
37.如权利要求36所述的分离核苷酸分子，其特征在于，核酸分子进一步编码截短的P4蛋白片段，片段具有的突变选自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸残基39的突变，它在野生型P4蛋白中是谷氨酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸残基48的突变，它在野生型P4蛋白中是苯丙氨酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64的突变，它在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸残基161的突变，它在野生型P4蛋白中是赖氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸残基218的突变，它在野生型P4蛋白中是天冬酰胺；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸残基35和37的突变，它们在野生型P4蛋白中是丙氨酸，其中突变不是谷氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64和66的突变，它们在野生型P4蛋白中是天冬氨酸；(h)一个或多个突变(a)-(g)的组合，其中核酸序列编码至少突变(a)-(g)中的一个。
38.如权利要求37所述的分离核苷酸分子，其特征在于，核酸分子进一步编码截短的P4蛋白片段，片段具有的突变选自(a)在SEQ ID NO3的氨基酸残基39的谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；(b)在SEQ ID NO3的氨基酸残基48的半胱氨酸、丝氨酸或其它具有不带电极性基团的氨基酸；(c)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64的天冬酰胺、谷氨酸或丙氨酸；(d)在SEQ ID NO3的氨基酸残基161的精氨酸；(e)在SEQ ID NO3的氨基酸残基218的谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；(f)在SEQ ID NO3的氨基酸残基35和37的天冬酰胺；(g)在SEQ ID NO3的氨基酸残基64和66的丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；(h)一个或多个突变(a)-(g)的组合，其中核酸序列编码至少突变(a)-(g)中的一个。
39.如权利要求25所述的分离核苷酸分子，其特征在于，所述分子是质粒载体。
40.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞用权利要求39所述的质粒载体转化、转染或转导。
41.如权利要求29所述的分离核苷酸分子，其特征在于，所述分子是质粒载体。
42.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞用权利要求41所述的质粒载体转化、转染或转导。
43.如权利要求33所述的分离核苷酸分子，其特征在于，所述分子是质粒载体。
44.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞用权利要求43所述的质粒载体转化、转染或转导。
45.一种免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求25所述的核苷酸分子和药学上可接受载体。
46.一种免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求29所述的核苷酸分子和药学上可接受载体。
47.一种免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求33所述的核苷酸分子和药学上可接受载体。
48.一种在人中诱导抗非典型流感嗜血杆菌的免疫反应的方法，其特征在于，所述方法包括步骤施用有效量的权利要求9所述免疫原性组合物给所述人。
49.一种在人中诱导抗非典型流感嗜血杆菌的免疫反应的方法，其特征在于，所述方法包括步骤施用有效量的权利要求19所述免疫原性组合物给所述人。
50.一种在人中诱导抗非典型流感嗜血杆菌的免疫反应的方法，其特征在于，所述方法包括步骤施用有效量的权利要求45所述免疫原性组合物给所述人。
51.一种在人中诱导抗非典型流感嗜血杆菌的免疫反应的方法，其特征在于，所述方法包括步骤施用有效量的权利要求46所述免疫原性组合物给所述人。
52.一种在人中诱导抗非典型流感嗜血杆菌的免疫反应的方法，其特征在于，所述方法包括步骤施用有效量的权利要求47所述免疫原性组合物给所述人。
53.一种产生P4变异蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括在适合产生P4变异蛋白的条件下培养权利要求40所述宿主细胞并从培养物中回收P4变异蛋白。
54.一种产生P4变异蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括在适合产生P4变异蛋白的条件下培养权利要求42所述宿主细胞并从培养物中回收P4变异蛋白。
55.一种产生P4变异蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括在适合产生P4变异蛋白的条件下培养权利要求44所述宿主细胞并从培养物中回收P4变异蛋白。
56.如权利要求1所述的P4变异蛋白，其特征在于，所述变异蛋白用作另一种抗原的载体蛋白。
57.如权利要求56所述的P4变异蛋白，其特征在于，所述变异蛋白化学缀合多糖、寡糖、糖类、脂多糖、脂寡糖或脂糖。
58.如权利要求56所述的P4变异蛋白，其特征在于，所述变异蛋白与蛋白、多肽或肽融合。
59.如权利要求15所述的P4变异蛋白，其特征在于，所述变异蛋白用作另一种抗原的载体蛋白。
60.如权利要求59所述的P4变异蛋白，其特征在于，所述变异蛋白化学缀合多糖、寡糖、糖类、脂多糖、脂寡糖或脂糖。
61.如权利要求59所述的P4变异蛋白，其特征在于，所述变异蛋白与蛋白、多肽或肽融合。
全文摘要
P4变异蛋白的酶活性减少且诱导野生型P4蛋白的抗体和/或具有抗非典型流感嗜血杆菌(NTHi)的良好杀菌活性，它用作人的免疫原性组合物中的活性成分。也提供了使用这些蛋白和组合物的方法，组合物含与另外的抗原组合的蛋白。
文档编号A61P31/04GK1653084SQ03809166
公开日2005年8月10日 申请日期2003年3月13日 优先权日2002年3月15日
发明者B·A·格林, G·W·洛特尼克, L·D·弗莱彻, A·L·史密斯, T·J·雷利 申请人:惠氏控股有限公司, 密苏里州立大学校董