专利名称：能够诱导引起轴突生长的肽以及它们用于治疗神经退化性疾病的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够诱导引起轴突生长的新肽，特别在存在semaphorin时，以及它们用于治疗神经退化性疾病的用途。
背景技术：
本发明涉及包含序列ASNKL(SEQ ID NO1)的肽，其在存在semaphorin(Sema3A)、L1和NP-1蛋白质时诱导轴突的生长，以及这些肽在制备用于神经元/轴突再生或用于治疗神经退化性疾病中的用途。本发明还包括用于确定能够结合NP-1的化合物的方法，用于确定能够从合适的细胞中逆转Sema3A对轴突生长的排斥作用的化合物的方法，或者用于筛选能够阻断Sema3A-诱导的细胞内吞作用的分子的方法。
轴突正确寻路(Axon pathfinding)受到大量化学营养的和作为发育中的神经元突出的吸引因子或排斥因子的细胞接触诱向刺激(guidance cue)的调控。在该通路的选择点上，可能发生复杂的系列事件来确保生长锥(growth cone)作出的恰当决定(Cook等，CurrOpin Neurobiol.，864-72，1998)。特别地，这在连合突出中已经被证实，其中发生上调和下调轴突对诱导暗号的反应的高度动力学机制，从而引导轴突朝向、跨过或者远离中线。这些事件被证明涉及免疫球蛋白(Ig)超家族的细胞粘附分子以及netrin，slit和semaphorin家族的分泌因子(Stoeckli和Landmesser，Opin Neurobiol，873-79，1998)。在啮齿类动物中，缺乏Ig超家族的细胞粘着分子(IgCAM)L1的功能已经表明这种蛋白在锥体交叉中起轴突诱向作用(Cohe等，Curr Biol，826-33，1998)。在皮质脊髓正确寻路的特定阶段已经通过两种主要事件表征轴突生长跨过中线，接着在脊髓从腹部转向背部。LI可能对这些步骤的每一步都是重要的，它是跨过中线所需的细胞接触暗号(Cohen等，1998)。此外，L1也已经在体外被证明是轴突对腹部分泌的semaphorin，Sema3A反应所必需的，Sema3A触发了该通路的背向化(Castellani等，Curr Biol.，826-33，2000)。
最近研究表明，semaphorin通过多分子受体复合物发出信号，该复合物含有neuropilin-1(NP-1)和/或neuropilin-2(NP-2)作为特异配体结合亚基(Raper，Curr Opin Neurobiol.，1088-94，2000)和plexins作为信号传导物(Tamagnone和Comoglio，Trends CellBiol.，10377-383，2000)。L1也已经被证明与NP-1相关，并且是作为轴突诱向反应的Sema3A受体复合物一部分(Castellani等，2000)。L1和NP-1/Sema3A信号之间的功能连接得到一个发现的支持，该发现表明可溶性L1 Fc嵌合体将Sema3A诱导的化学排斥转变成吸引(Castellani等，2000)。早先已经证明，生长锥能够通过调节内部环核苷酸水平来在吸引和排斥之间转换(Song等，Science，2811515-1518，1998)。可溶性L1结合到细胞表面能够诱导这种转换的原因是极其不清楚的。L1具有非常复杂的同种细胞和异种细胞作用模式。除了L1和NP-1之外，作为Sema3A受体复合物的组成，轴突表达大量在Sema3A逆转中潜在作为L1 Fc的受体的其他结合配体。这些配体包括其他Ig CAMs如F3/接触蛋白，和TAG-1/axonin-1、α3-β5整合素以及一些ECM蛋白，如层粘连蛋白和一些硫酸软骨素蛋白多糖(Brümmendorf和Rathjen，Curr Opin Neurobiol，6584-593，1996)。而且，生长锥中的L1表达是高度动态调控的。在配体活化后，Li被内化和转运到膜囊中，在细胞表面再循环(Kamiguchi和Lemmon，J.Neurosci.，203676-3686，2000)。
轴突发育显然需要L1，这体现在人类功能紊乱的各种与L1突变相关的神经异常中，称作为X-连锁脑积水、MASA综合症或1型SPG(脑积水、脑室扩大、胼胝体发育不全、皮层脊髓束积水，Rosenthal等，NatGenet.2107-112，1992；Vits等，Nat Genet.，7408-413，1994；Jouet等，Nat Genet.，7402-407，1994)。导致这些紊乱的L1的突变包括许多可能截去成熟蛋白和消除细胞表面表达的突变。L1中更加细微的错义突变已经被证明对L1功能产生多重影响，阻断细胞内蛋白质运输和配体结合或两者都阻断(De Angelis等，EMBO J.，184744-4753，1999)。这些突变影响轴突对Sema3A的反应的可能性至今还未被检验。
令人惊奇地，本发明人在采用具有病理错义突变的L1 Fcs，剖析表明通过可溶性L1转变轴突对Sema3A的反应的分子机制后，证明了L1 Fc(在本说明书中也称作L1-Fc)结合到NP-1上，而不会结合到L1或者其他两种在生长锥上表达的Ig CAM，这对于L1Fc激活转化过程是关键的。还证明结合和共免疫沉淀反应研究表明该区域以顺式和反式L1/NP-1的复合物形式在L1的Ig结构域1中含有突变L120V。而且，已经证明了由(F)ASNKL)120氨基酸序列组成的肽足以逆转Sema3A-介导的排斥。
因此，第一个方面，本发明涉及一种包含序列ASNKL(SEQ IDNO1)的肽，优选地，诱导吸引轴突生长，特别是存在semaphorin(Sema3A)、L1和NP-1蛋白时。
在第一个方面的优选实施方案中，本发明包括包含序列SEQ IDNO1的肽，其具有不超过10个氨基酸残基。
由SEQ ID NO1组成的肽和包含或由序列FASNKL(SEQ ID NO2)或FASNKLGTAM(SEQ ID NO3)组成的肽是特别优选的。
一种包含本发明的肽之一的轴突生长诱导剂构成本发明的第一个方面的一部分。
第二个方面，本发明涉及用于鉴定能够结合NP-1蛋白的化合物的方法，包括步骤a)在将包含NP-1蛋白的样本与L1-Fc蛋白或与按照本发明的肽，特别是与包含或由SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3组成的肽接触的之前、之后或同时，将所述化合物与所述样本接触，b)检测NP-1和L1 Fc或按照本发明的所述肽之间的结合，所述化合物与NP-1蛋白的结合可以从在不存在所述化合物时观察到NP-1结合到L1-Fc或按照本发明的所述肽上的改变推导得出。
在第二个方面的优选实施方案中，本发明涉及用于鉴定能够结合按照本发明的NP-1蛋白的化合物的方法，其中所述样本包含L1蛋白。
在第二个方面的进一步的优选方案中，本发明涉及用于鉴定能够结合按照本发明的NP-1蛋白的化合物的方法，其中所述NP-1是重组蛋白。
在第二个方面的进一步的优选方案中，本发明涉及用于鉴定能够结合按照本发明的NP-1蛋白的化合物的方法，其中所述样本包含在其表面表达NP-1蛋白的细胞。
在第二个方面的进一步的优选方案中，本发明涉及用于鉴定能够结合按照本发明的NP-1蛋白的化合物的方法，其中所述样本包含在其表面表达NP-1和L1蛋白的细胞。
在第二个方面的进一步的优选方案中，本发明涉及用于鉴定能够结合按照本发明的NP-1蛋白的化合物的方法，其中所述L1-Fc蛋白或按照本发明的所述肽被标记，并且NP-1蛋白与所述L1-Fc蛋白或按照本发明的所述肽的所述结合是通过与所述NP-1蛋白相关的信号的水平来测定。
本发明人已经证明，L1/NP-1的顺式作用对于与排斥反应相关的Sema3A受体复合物的内吞作用来说是必需的，而反式作用防止这种内吞。反式作用激活一氧化氮(NO)合成酶和cGMP鸟苷酸环化酶。如下面的实施例所指出，已经确定了涉及触发Sema3A排斥为吸引的分子机制，并指出内吞作用在决定轴突对诱向暗号的反应的性质中是关键的。还给人X-连锁的L1基因的病理突变的影响提供了新的解释。
因此，在第二个方面的特别优选实施方案中，本发明涉及用于鉴定能够结合按照本发明的NP-1蛋白的化合物的方法，其中NP-1与L1-Fc或按照本发明的所述肽的结合的所述改变通过测定在存在所述结合时出现的第二信号来测定。
在第二个方面的该特别优选实施方案中，优选所述第二信号在存在Sema3A时被诱导。
在第二个方面的该特别优选实施方案中，更加优选的是所述第二信号是逆转Sema3A对轴突生长的排斥作用。
在第二个方面的该特别优选实施方案中，优选的是所述第二信号是激活NO合成。
在第二个方面的该特别优选实施方案中，优选的是所述第二信号cGMP的产量增加。
第三个方面，本发明在于通过给予适合于促进轴突生长的细胞Sema流来吸引/调节轴突的生长方向的方法，包含将所述细胞与本发明的肽或诱导剂接触的步骤。
第四个方面，本发明在于用于鉴定能够从适当的细胞中逆转Sema3A对轴突生长的排斥作用的化合物的方法，包含在存在Sema3A时将所述在其表面表达L1和NP-1的细胞与所述化合物接触，并检测所述细胞中NO合成增加的步骤。
第五个方面，本发明在于用于筛选防止由Sema3A处理引起的葡聚糖的内化的分子的方法或者筛选能够阻断Sema3A诱导的由细胞在其表面表达L1和NP-1蛋白引起的内吞作用的分子的方法，其特征在于所述方法包含如下步骤a)在存在Sema3A时培养表达L1和NP-1的细胞、标记的葡聚糖和被检测的分子；和b)肉眼观察或确定是否所述被标记的葡聚糖被内化到细胞中；c)如果没有检测到被标记的葡聚糖被细胞的摄取，则选用被分析的分子。
在优选实施方案中，步骤a)中的所述细胞是用能够在其表面表达L1和NP-1蛋白的表达载体转染的重组细胞系，或者自然地共表达L1和NP-1蛋白的神经元细胞。
这种载体可以按照本领域技术人员通常使用的方法来制备，从中获得的克隆可以通过标准方法被导入合适的宿主中，如脂质体感染、电穿孔或热休克。
在进一步的优选实施方案中，所述步骤a)中的被标记的葡聚糖选自若丹明-葡聚糖、FITC-葡聚糖或偶联到荧光分子上的葡聚糖。
第六个方面，本发明涉及筛选能够阻断Sema3A-诱导的共内化L1和NP-1蛋白的分子的方法，和筛选能够维持细胞表面表达L1和NP-1蛋白的分子的方法，或筛选能够阻断Sema3A-诱导的内吞作用的分子的方法，其特征在于所述方法包含如下步骤a)在存在Sema3A时，培养表达L1和NP-1的细胞与被分析的分子；和b)在存在标记的抗L1和NP-1蛋白的单克隆或多克隆抗体(如果需要)时，采用免疫细胞化学方法肉眼观察或确定是否所述L1和NP-1蛋白已经被共同内化到细胞中；c)如果在细胞表面检测到L1和NP-1蛋白，选用被测定的分子。
在优选实施方案中，按照本发明的第六个方面的方法的步骤a)中的所述细胞是用能够在其表达L1和NP-1蛋白的表达载体转染的重组细胞系，或者自然地共表达L1和NP-1蛋白的神经元细胞。
所述免疫细胞化学方法是指任何技术人员知晓的任何免疫细胞化学方法，其可以采用介导特异性地抗这些L1和NP-1蛋白的抗体特异性地检测存在于细胞表面的L1和NP-1。
特定的多克隆抗体可从被接种免疫抗这些L1和NP-1蛋白的动物的血清中获得。这些特定的单克隆抗体可以按照Kohler和Milstein，1975描述的常规杂交瘤培养方法来获得。
所述抗L1和/或NP-1的抗体，或其Fab或F(ab’)2片段可以是免疫结合物或标记抗体的形式，以获得可检测和/或可量化的信号，因而构成了用于免疫细胞化学分析在细胞表面表达L1和NP-1蛋白的方法，例如通过免疫荧光、金标记、酶促免疫结合物。
第七个方面，本发明涉及按照本发明的肽或诱导剂，或者通过按照本发明的方法选择的能够阻断Sema3A诱导的内吞作用的分子，在制备用于神经元/轴突再生或用于治疗神经退化性疾病的药物中的用途。
最后，本发明在于按照本发明的肽或诱导剂作为靶向试剂在制备用于细胞治疗的组合物中的用途作为治疗剂的活性成分的按照本发明的肽或诱导剂优选是可溶形式，并与药学上可接受的载体组合。
这种肽、诱导剂或按照本发明的能够阻断Sema3A诱导的内吞作用的所选择分子，可以被用作提供需要或者与神经/轴突再生相关的新方法，如用于预防和/或治疗神经退化性疾病的治疗剂。
优选地，这些肽、诱导剂或按照本发明的能够阻断Sema3A诱导的内吞作用的所选择分子，可以通过全身通路给予，特别是通过静脉内、肌肉内或皮内或口服途径。
服用模式、优选剂量和盖伦形式可以按照在确定适合于患者的治疗时考虑的标准来决定，例如患者的年龄和体重、疾病的严重性、对治疗的耐受和出现的副作用等。
本发明的其他特征和优点体现在说明书的包括实施例和附图的剩余部分，下面提供附图的简单说明。
附图1A到1F在存在突变的L1Fc嵌合体时，共培养皮层切片和腹侧脊髓外植体附图1A明显地影响被选择用于分析的Ig结构域的具有单个错义突变的L1Fc嵌合体。
附图1B皮层切片和腹侧脊髓外植体的共培养系统的图解。
附图1C该微缩照片表明在存在一些突变L1嵌合体时，轴突优先朝Sema3A源生长。相反，具有L120V突变的嵌合体不能将Sema3A的排斥活性转变为吸引。在这种情况下，如对照组中，生长被引向远离Sema3A源。标志线(Scale bar)50μm。
附图1D如正诱导指数所表明，在共培养测定中，H210Q，E309K，D598N，A426D和G121S突变的L1Fc嵌合体能够逆转将Sema3A的排斥作用逆转为吸引。
附图1E和1F该柱状图表示轴突朝向(空白柱)或远离(填充柱)脊髓外植体生长的数量(附图IF)及其长度(附图1E)。*以P＜0.0001表示朝向外植体的一边(朝向)和与之相反的一边(远离)的轴突生长之间的统计学差异。
附图2A和2B突变的L1同种细胞结合到野生型的L1附图2A突变的L1Fc蛋白结合到COS细胞中表达的野生型L1上，通过免疫荧光分析检测。细胞表面L1用德克萨斯红偶联的第二抗体检测，突变L1Fc嵌合体用FITC-偶联的第二抗体检测。A426D，H210Q和L120V突变的嵌合体结合到野生型L1上，而G121S没有。标志线5μm。
附图2B在双色聚合物检测中通过FACS分析比较野生型/突变和突变/突变组合中的同种细胞结合。该柱状图表示在30min的时间点上形成的混合聚合物的百分比，数值用结合野生型的比例表示，误差线表示3个独立试验的SEM。野生型Li-Fc为100％。对于突变A426D和H210Q，与突变与突变结合相比，突变与野生型结合增加，而G121S在两种结合中都仍然非常低。wt野生型，m突变。
附图3在表达Plexin-A1和NP-1的细胞中进行L1Fcs的结合测定L1，Plexin-A1和NP-1的细胞表面表达采用德克萨斯红偶联的第二抗体检测。突变L1Fc嵌合体用FITC-偶联的第二抗体肉眼观察。野生型L1Fc结合到L1，但是不会结合到表达Plexin-A1的细胞上。A426D和G121S L1Fc嵌合体结合到表达NP-1的细胞上，而L120V嵌合体不会。标志线5μm。
附图4A和4B由L1的模拟肽转变Sema3A排斥附图4AL1 Ig1结构域的氨基酸序列的一部分。合成了含有天然亮氨酸或突变的缬氨酸120残基的六个氨基酸的肽。
附图4B在5种不同浓度的肽的共培养分析中的诱向诱导。表明在10-5和10-6M时，具有C末端亮氨酸的肽将Sema3A排斥转变为吸引，而具有C末端缬氨酸的肽没有。
附图5A和5B病理L1突变对L1-NP-1受体复合物形成的影响附图5A含有错义突变的编码全长L1的表达质粒被转染到COS7细胞中，细胞表面的表达通过免疫荧光分析来检测。如所阐述，突变L1构建体在细胞表面被表达。标志线5μm。
附图5B共免疫沉淀反应试验。用缺乏胞质结构域(ΔNP-1)的NP-1和全长L1转染的细胞被溶解，用抗myc的抗体沉淀蛋白质(参见方法部分)。免疫印迹用抗L1和抗NP-1的抗体检测。在沉淀物中检测到L1和NP-1，表明顺式作用涉及各种蛋白的细胞外结构域。用抗HA抗体免疫沉淀的细胞溶解产物的Western印迹分析表明具有表达突变L1构建体(L120V，G121S或A426D)和全长NP-1的双重转化子。具有G121S或A426D突变的L1蛋白与NP-1共免疫沉淀，而L120V-L1没有。
附图6A和6B可溶性L1的肽模拟物阻断Sema3A-诱导的内吞作用附图6A新生皮层细胞与Sema3A(“Cortex POSema3A15’”)一起培养。该处理诱导若丹明-葡聚糖内化，沿轴突或围绕体细胞积聚。当Sema3A与L1模拟肽结合使用时(″Cortex POSema3A+肽15″’)，内化被阻断。在对照组条件下和单独用肽处理的培养物中没有检测到若丹明-葡聚糖的摄取(未显示)。标志线10μm。
附图6B当用Sema3A(″L1/NP-1Sema3A15″’)处理时，共表达L1和NP-1的COS7细胞也内化若丹明-葡聚糖。该过程被Sema3A/肽处理(″L1/NP-1Sema3A+肽15″’)阻断。如在皮层细胞培养中所示，在对照条件下或在单独用肽处理的细胞中没有检测到内吞作用。
附图7A-7HL1确保Sema3A受体复合物的内吞作用附图7A在用Sema3A处理后，没有检测到L1和NP-1的细胞表面免疫标记。
附图7B和7C相反地，在对照条件下(附图7B)和在单独用肽处理(附图7C)后观察到L1/NP-1的细胞表面表达。
附图7D和7E如该两组所表明，当细胞用Sema3A与肽组合处理细胞时，在细胞膜上检测到L1和NP-1。
附图7F-7H在细胞透明后，观察到L1和NP-1免疫标记的共定位，表明附图7A中缺乏细胞表面表达是由于这两种蛋白的内化。
附图8在逆转Sema3A排斥中激活NO/cGMP路径在共培养皮层切片和腹脊髓外植体中，从药理学上阻断可溶性鸟苷酸环化酶(用ODQ)和nNOS(用7NI)。在仅存在ODQ和7NI时，轴突被Sema3A源排斥，而在仅存在L1Fc时，轴突从排斥作用(负诱向指数)转向吸引Sema3A源(正诱向指数)。在结合L1Fc加入ODQ和7NI时，轴突不再从排斥反应转向吸引反应。量化各个条件下远离和朝向脊髓外植体生长的皮层轴突的数量和长度。在ODQ，7NI，ODQ+L1Fc，7NI+L1Fc和对照条件下，相对于反面，朝向脊髓外植体一面的轴突的数量和长度显著地下降。在仅存在L1Fc时，轴突被吸引，这表现在朝向脊髓外植体生长的轴突的数量较多和长度较长。因此，ODQ和7NI阻止L1Fc诱导Sema3A从排斥转向吸引。采用ANOVA检验进行统计分析。*p＜0.0001。柱状图中的条柱指示远离(黑色柱)和朝向(空白柱)脊髓外植体的生长。
附图9A和9BL1-NP-1作用和调节Sema3A信号的模型附图9A该图表表示L1-L1和L1/NP-1的反式作用，以及错义突变对调节Sema3A信号的影响。(a)L1的顺式作用，NP-1激发排斥的Sema3A信号。(b)可溶性L1(L1Fc)结合生长锥上的L1和NP-1，将Sema3A的排斥转变为吸引。(c)含有L120V突变的可溶性结合L1，但是不结合NP-1，并且不能够逆转逆转Sema3A的排斥作用。(d)突变体G121S破坏同种细胞结合，但是不影响L1结合到NP-1，也不改变嵌合体诱导转变的能力。这表明可溶性L1与NP-1作用但是不与L1作用对于逆转逆转过程是关键的。
附图9B在Sema3A受体复合物中L1与NP-1相相互作用用的模型。(a)L1与Sema3A受体复合物结合激活化学排斥信号，该激活是通过L1/NP-1共内化相互作用起始的。(b)缺乏L1(L1-缺乏小鼠)时，受体复合物不再具有功能性，排斥信号被阻断。(c)L1与NP-1的同时顺式和反式作用阻断内吞作用，并改变信号路径。nNOS/cGMP路径的激活与排斥反应转变为吸引反应有关。(d)由于在缺乏神经元L1(L1缺乏小鼠)时，既便通过其结合到NP-1上，野生型L1Fc不能将Sema3A排斥作用转变为吸引作用，细胞膜上形成L1/NP-1复合物对于启动Sema3A吸引反应也是必要的。
具体实施例方式
实施例1材料与方法共培养试验在P0(出生后的第0天)到P2小鼠中解剖皮层块，并用Mcllwain组织切片机切割成250μm厚的切片。颈胸脊髓的腹侧部分被解剖并切割成250μm厚的切片。如先前的描述，在三维血浆凝块中共培养皮层切片和腹侧脊髓外植体(Castellani等，2000)。皮层切片在血浆凝块中如附图1B显示被引导，给轴突偏离或朝向脊髓外植体生长提供相同机会。被纯化的野生型或突变的L1Fc嵌合体被加入培养液中(3μg/ml)。鸟苷酸环化酶抑制剂(ODQ，10-5M，Sigma)和NOS的抑制剂(7NI，10-4M，Sigma)被单独或与野生型L1Fc(3μg/ml)一起被加入到培养液中。在体外培养(DIV)1-2天后，培养液与4％多聚甲醛(PFA)混合，并用反相显微镜(Axiovert 35-M，Zeiss)分析。定性诱向指数被用共培养来评价排斥作用(负值)或吸引作用(正值)的大小(Castellani等，2000)。指数范围从-2(当大部分纤维生长偏离脊髓外植体)到+2(当大部分纤维生长朝向外植体)，以及中间状态(指数-1和+1为中度诱向作用)。指数0被赋予无偏向生长的培养物。从皮层切片生长的轴突的轴突长度和数量的定量分析如已有描述来进行(Castellani等，2000)。在各个培养中确定覆盖600μm-片皮层组织的近侧和远端区域。从这两个区域延伸出来的所有纤维被计数，并且测定三条最长的纤维的长度，采用计算机分析软件测定(Visiolab 2000，Biocom)。采用小鼠抗磷酸化神经丝抗体SMI31(Stemberger and Meyer Inc.)，和德克萨斯红偶联的第二抗小鼠抗体进行轴突的免疫荧光标记(参见从下表1和2的轴突数量和轴突长度中获得的结果)。
表1轴突数量
表2轴突长度
B.结合测定突变的L1Fc嵌合体如先前的描述被制备和纯化(De Angelis等，1999)。简而言之，COS-7细胞以每150mm培养皿10μg DNA进行瞬时转染，可溶性Fc嵌合蛋白在培养液中积累6天，并通过蛋白质A-琼脂糖亲合层析进行回收和纯化。在结合试验中，37℃下，L1Fcs被偶联到抗人Fc抗体上(50μg/ml，Jackson Immunoresearch)1h。检测与NP-1结合要求L1Fcs的浓度比L1高10倍。然后抗体偶联的L1-Fc蛋白与用编码全长的人L1或myc-标记的NP-1的表达载体瞬时转染的COS7细胞一起培养，其中胞质结构域被删除(J.Raper，2000和Renzi等，1999友情赠送)。在培养后，细胞用4％PFA固定，进行双免疫荧光检测。用小鼠抗-c myc抗体(clone 9E10，Sigma)检测NP-1，用大鼠单克隆抗-L1抗体检测L1。第二抗体抗-c-myc(德克萨斯红偶联的抗小鼠抗体)被用于检测NP-1，抗-L1(德克萨斯红偶联的抗大鼠抗体)用于检测L1，而抗-Fc(FITC偶联的抗兔抗体)用于检测被结合的L1Fc嵌合体。在用第二抗体培养后，细胞用PBS洗涤并在Mowiol中计数(Calbiochem)。
C.双色凝集分析一种双色凝集分析从De Angelis等(1999)描述的同细胞结合分析中发展和改进得到。对于双色分析，红色和绿色的荧光微珠(0.6um，Duke Scientific Corps.)用抗人IgG抗体(Fc特异的；Sigma，1-2136)包被。2.5μg野生型(红色珠)或突变(绿色珠)L1Fc-蛋白质通过在37℃培养2h被偶联到10μl抗体包被的珠上。过量未被结合的蛋白质通过用PBS/5％FCS洗涤来去除。对于每一突变体，制备野生型L1和突变L1的1∶1混合物包被的珠，解聚制备单珠悬浮液，并可以在37℃下在30min的时程中与双份取出(removed in duplicate)的样本形成混合的聚集体，样本以1∶5000用冷PBS稀释，并用荧光激活细胞分类仪(Becton Dickenson FACSort)评价两种颜色的聚集体的比例。每种样本计数1万个颗粒，并以仅为红色(WT-L1∶WT-L1)、仅为绿色(突变L1∶突变L1)或混合的聚集体分类。每种突变蛋白至少在三个不同的时间点上被分析，并用同时进行的野生型对照标准化。
D.共免疫沉淀试验COS细胞采用脂质体感染转染方法(lipofectamine)用各种表达载体转染，这些载体编码全长HA标记的NP-1、myc-标记的cyt-删除的NP-1、野生型L1和L1突变构建体(G121S，A426D，L120V)。在2天DIV后，细胞用免疫沉淀缓冲液(IP缓冲液肝素25mM，EDTA 5mM，MgCl21mM，PMSF 2mM，甘油10％和triton X100 1％，pH 7)溶解。溶解产物在4℃下培养30min，离心5min，用蛋白A-琼脂糖在4℃下预清洗2h。样本用小鼠抗HA(3μl，clone 12CA5，Roche)、兔抗-L1抗体(3μl)、小鼠抗-myc抗体(3μl，9E10，Sigma)在4℃下免疫沉淀16h，这些抗体被偶联到蛋白A构成的联合体上的兔抗小鼠抗体。洗涤珠，并用抗-HA(1∶1000)和抗-L1(1∶1000)的抗体来免疫印迹分析沉淀物。
E.若丹明-葡聚糖摄取用L1和NP-1的表达载体转染的神经皮层细胞或COS7细胞，用被混合到Sema3A-AP上清液、Sema3A和肽(10-5M)、单独肽(10-5M)或对照上清液的溶液中的若丹明-葡聚糖(2mg/ml)培养15min。细胞与PFA 4％混合，并如上面章节所描述进行免疫细胞化学试验。为了检测细胞内蛋白质，细胞作用甲醇透化2min。
实施例2L1Fc的Ig结构域1中的突变L120V不能将Sema3A排斥转变为吸引一种采用腹侧脊髓外植体与皮层轴突共培养来确定与轴突的排斥和吸引相关的因子的分析系统已经被开发(Castellani等，2000)。采用这种系统，本发明人已经证明从腹侧脊髓分泌的Sema3A排斥皮层轴突。但是在存在可溶性野生型L1Fc嵌合蛋白时，排斥作用转变为吸引(Castellani等，2000)。在本试验中，本发明人的目的在于确定L1的隐含转变过程的作用。由于已经表明Ig结构域能够将Ig CAMs结合到它们的许多配体上(Brmmendorf和Rathjen，1996)，本发明人假设Ig结构域对于L1Fc介导的转变也是必需的。还评价了含有影响特定Ig结构域的病理错义突变的六L1Fc嵌合体(De Angelis等，1999和附图1A，1B)将Sema3A排斥作用逆转为吸引的能力。
对于每一突变体，在哺乳动物细胞中制备可溶性Fc-嵌合蛋白，并通过蛋白A-琼脂糖亲合层析纯化。被纯化的L1Fc嵌合体进行SDSPAGE，并用抗-Fc抗体进行免疫印迹来证实它们的完整性。在共培养分析中，六种在Ig结构域1，2，3，5或6中含有单一点突变L1-Fc蛋白中的五种(分别为G121S，H210Q，E309K，A426D和D598N)被证实能够有效地诱导Sema3A排斥转变为吸引(附图1C)。如由定性诱向指数和定量分析所证明，绝大部分的轴突在存在L1Fc嵌合体时优先朝向Sema3A源生长，而不是远离其生长，如对照组所示(附图1D-1F，在3个独立试验中总共进行147个共培养)。相反，一种错义突变，Ig结构域1中的L120V，不能将Sema3A排斥逆转为吸引。当L120V嵌合的Fc蛋白被加入到培养液中时，轴突仍然远离脊髓外植体。这给共培养产生-1.3的负诱向指数，产生统计学显著的背向而不是朝向脊髓外植体的神经纤维优先生长(Figures1C-1F)。因此，至少Ig结构域1部分对于L1Fc转变轴突反应是必需的。
目的在于确定皮层轴突上的受体，该受体结合L1Fc并起动逆转Sema3A排斥为吸引。L1和/或NP-1能够实现这种作用，它们都是Sema3A受体复合物的成分，并且都与反式L1作用(Castellani等，2000)。Plexin-A1可能也能够逆转Sema3A，其在Sema3A受体中与NP-1结合。其他已知的L1配体，包括Ig CAMs F3/接触蛋白和TAG-1/axonin也是L1Fc的候选受体。已有的工作表明上面描述的突变体能够选择性地作用同种细胞结合或异种细胞结合到F3或axonin-1(De Angelis等，1999)。这些突变体中的两种G121S和A426D减少同种细胞结合和异种细胞结合到F3，axonin-1和axonin-1的人的同系物，TAX-1。H210Q和E309K分别影响同种细胞或异种细胞结合。D598N对同种细胞结合具有适当的中度作用，但是显著地降低异种细胞结合到F3和axonin-1，虽然不与TAX-1结合。L120V不影响同种细胞或异种细胞的结合。因此，可以将突变的嵌合体逆转Sema3A排斥的能力与其结合能力比较。
实施例3在逆转Sema3A排斥中，包括L1的IgCAMs不是L1Fc的轴突受体四种突变体(E309K，D598N，A426D和G121S)被发现能够改变L1Fc结合到Ig CAMs F3，而axonin-1转变Sema3A的排斥为吸引，达到与野生型L1Fc相同的程度。因此，Ig CAMs F3和TAG-1(axonin-1的啮齿类同系物)不可能是L1Fc在逆转过程中的轴突受体。当各个突变L1Fc蛋白与自身结合时，突变体A426D，H210Q和G121S原先被证明能够降低同种细胞结合(De Angelis等，1999)。但是在本试验中，突变的L1Fc蛋白对于与生长锥上表达的野生型L1作用是必需的。为了从形式上排除L1的同种结合在引发逆转过程中的作用，因此有必要检查突变的L1Fc嵌合体与野生型L1的同种结合是否被打破。突变的L1Fc与感染了全长野生型L1 cDNA的COS7细胞孵育，通过免疫荧光测定结合。同时，突变体/突变体和突变体/野生型L1Fc的同种结合用双色FACS凝集实验比较，作出定量评价(见方法部分)。有意思的是，免疫荧光研究表明A426D和H210Q L1Fc嵌合体与野生型L1结合(图2A)。类似的，在双色FACS测定中，野生型对A426D和H210Q的同种结合水平分别恢复至74.4％和90.5％(图2B)。与之相反，在两种测定中，突变体G121S于野生型L1几乎没有同种结合(图2A，2B)。然而，在共培养测定中，该突变仍然促进了L1Fc诱导的Sema3A排斥转变为吸引。因此，L1Fc转变Sema3A排斥的能力不依赖于同种细胞结合。因此，在受体复合物中L1Fc与L1的顺式作用不是生长锥对Sema3A响应的变化所必需的。为了支持该结论，本发明人还观察到L120V突变的L1Fc保留100％同种细胞结合能力，但是不能逆转Sema3A的作用(附图2A，2B)。
实施例4NP-1而非Plexin-A1，是L1Fc在转变Sema3A排斥中的轴突受体为了确定可溶性L1Fc是否结合plexin-A1，COS7细胞用编码融合到VSV-标记的Plexin-A1的载体(Rohm等，MechDev.，9395-104，2000)瞬时转染，并与野生型l1Fc蛋白一起培养。作为阳性对照，嵌合蛋白还与用全长的野生型L1瞬时转染COS7细胞一起培养。用抗-Fc抗体免疫检测L1Fc清楚地表明，嵌合体与表达L1的细胞结合，而不与表达Plexin-A1的细胞结合(附图3)。因此，Plexin-A1不可能是L1Fc在转变Sema3A排斥为吸引中的轴突结合配体。
其次，本发明人检验突变的L1Fc嵌合体结合NP-1的能力。COS7细胞用编码融合到myc标记的NP-1的细胞外和跨膜结构域的载体(ΔNP-1，Renzi等，J.Neurosci.，157870-7880，1999)瞬时转染，并与突变的L1Fc嵌合体一起培养。通过免疫荧光来检测结合。该分析表明含有G121S，H210Q，E309K，D598N和A426D的突变嵌合体结合表达NP-1的细胞。相反，L120V-L1Fc不结合NP-1。L120V，G121S和A426D L1Fc结合到NP-1被示于附图3中。由于L120V-L1Fc在结合分析中不与NP-1作用，在共培养试验中也不转变Sema3A排斥为吸引，这有力地表明NP-1是L1Fc调节的转变的轴突受体(参见附图9A的模型)。
实施例5六个氨基酸的肽模拟L1Fc的逆转生物活性已经假设，仅L1的Ig1结构域中的限制性序列参与与NP-1的作用。G121S是一种可能破坏Ig结构域1构象的突变体(Bateman等，EMBO J.，156050-6059，1996)，既不改进NP-1的结合也不改变转变过程，而作用于表面残基的邻近的突变体L120V两者都不能。按照这种假设，被分离的肽应当模拟L1Fc将Sema3A排斥逆转为吸引。由于G121S突变体没有废除L1Fc的转变，这些氨基酸对于肽的生物学活性不是必要的。基于这些标准，六个氨基酸的肽FASNKL120(SEQ ID NO2)，具有游离的NH2和COOH末端(Schafer-N，CopenhagenDK)被设计，并在共培养分析中被检测(附图4A，4B)。其在10-6M浓度下成功地将Sema3A-诱导的化学排斥转换为吸引(附图4B)。
本发明人还证明，在与检测六个氨基酸肽FASNKL120的相同条件下，五个氨基酸的肽ASNKL120和十个氨基酸的肽FASNKLGTAM(SEQ IDNO3)成功地将Sema3A-诱导的化学排斥转换为吸引，同时模拟了L1Fc的逆转生物活性(数据未显示)。
而且，通过在肽中用缬氨酸置换C末端亮氨酸120来模拟人的突变体，导致其转换能力降低100倍。残余作用仅在10-4M下观察(附图4B)。因此，六个氨基酸的肽FASNKL120和五个氨基酸的肽ASNKL120含有结合NP-1的L1序列，而亮氨酸120是相相互作用用的关键残基。
实施例6病理学突变L120V破坏Sema3A的L1/NP-1受体复合物已经在细胞膜上证明，L1和NP-1以常规的分子复合物结合，作为Sema3A的受体(Castellani等，2000)。本发明人研究L1突变体对该复合物形成的影响。第一，本发明人确定L1和NP-1细胞外区域对于反式作用是否必需。COS7细胞用编码缺乏其胞质区域的NP-1的载体(ΔNP-1，Renzi等，1999)和编码全长野生型L1的载体共转染。细胞被溶解，蛋白质通过偶联到兔抗小鼠和小鼠抗-myc抗体的蛋白A-琼脂糖来免疫沉淀。采用抗-L1和抗-NP-1抗体，通过western印迹分析鉴定被免疫沉淀的蛋白质。共免疫沉淀ΔNP-1和L1表明细胞外结构的顺式结合域对于L1/NP-1复合物的形成是必需的(附图5B，泳道3)。第二，本发明人在COS7细胞中表达突变的L1蛋白，并通过免疫荧光证实了它们在细胞表面表达(附图5A)。第三，COS7细胞用编码全长的HA-标记的NP-1载体和表达野生型或突变L1的载体共转染。溶解细胞，用包被了抗-HA抗体的蛋白A-琼脂糖进行免疫沉淀。回收的蛋白质进行SDS-PAGE，转移，和用抗-L1和抗-HA的抗体进行免疫印迹。这些结果表明，含有错义突变A426D和G121S的L1成功地免疫沉淀NP-1，而含有L120V的L1没能(附图5的泳道4-6)。因此，L1与NP-1的顺式和反式作用取决于上述Igl结构域的六个氨基酸序列中的相同结合位点。
可溶性L1及其模拟肽能够对Sema3A信号施加其调节作用的可能分子机制是，它们在L1/NP-1复合物中与跨膜L1竞争。为了说明该问题，本发明人在免疫沉淀试验中检测模拟排斥(仅Sema3A)或吸引(Sema3A与肽结合)环境的条件下的L1/NP-1复合物。本发明人观察到，存在肽并不废除L1和NP-1之间的顺式作用(附图5C)，而在存在单独的Sema3A或与肽结合，以及在对照条件下时，L1与NP-1共沉淀。由于不能举证L1与NP-1之间的顺式和反式作用之间的竞争，本发明人试图确定其他能够说明转变轴突排斥为吸引的机制。
实施例7控制Sema3A-诱导的内吞作用的顺式和反式L1/NP-1相相互作用用已经证明，轴突末端中的内吞作用和Sema3A受体复合物的重新组合伴随着Sema3A-诱导的生长锥的萎缩(collapse)(Fournier等，2000)。已经表明，可溶性L1防止对Sema3A响应时的生长锥的萎缩(Castellani等，2000)。因此，已经验证L1模拟肽是否能够阻断内吞作用。为了肉眼观察内吞作用，本发明人在各种条件下检验活皮层培养物对若丹明-葡聚糖的摄取。细胞用若丹明-葡聚糖以及单独的Sema3A、Sema3A结合L1模拟肽、单独肽处理15min，或不被处理作为对照条件。明显地，在仅用Sema3A处理的细胞中特别地观察到若丹明-葡聚糖的摄取。在这种条件下，在轴突轴体上和细胞周围观察到内化的荧光斑点。相反，在所有其他处理中没有检测到若丹明-葡聚糖的摄取(附图6A)。因此，这表明模拟可溶性L1的肽阻断Sema3A-诱导的内吞作用。为了将该过程与L1/NP-1的顺式和反式作用相关联，在被转染来共表达L1和NP-1的COS7细胞中进行若丹明-葡聚糖摄取的试验(附图6B)。在皮层细胞中，单独Sema3A而不是结合模拟肽的Sema3A在共转染细胞中诱导若丹明-葡聚糖的内化。在仅用肽处理后或在对照条件下，没有检测到荧光标记(附图6B)。
同时，经过相同处理的细胞用于免疫细胞化学检测L1和NP-1。有意思的是，本发明人观察到细胞表面表达L1和NP-1被Sema3A处理取消(附图7A)。相反地，在所有其他条件下检测到这两种蛋白，包括用Sema3A结合肽的处理(附图7B-7E)。而且，在用Sema3A-处理的培养物中，L1和NP-1的免疫反应活性在透化后被检测，共定位在胞质路径上(附图7F-7H)。这些结果首先表明Sema3A诱导L1和NP-1的共内化，而其次表明该过程通过转换肽被阻断。
该发现有力的说明，L1功能可以是确保与Sema3A诱导的轴突排斥相关的适当的NP1内吞。为了支持这一点，本发明人证实了在缺乏L1时，Sema3A不能诱导NP-1的内吞和内化。COS7细胞被转染来只表达NP-1，并且在用Sema3A处理后检测若丹明-葡聚糖的摄取。如所预期的，在缺乏L1时，不发生NP-1内吞，免疫化学标记证实NP-1仍然保留在用Sema3A处理的细胞表面，在缺乏L1时不发生Sema3A-诱导的内吞作用(数据未显示)。
实施例8L1/NP-1反式作用激活NO合成，并随即提高cGMP水平先前的试验已经证明通过提高cGMP内部水平可以将Sema3A的化学排斥作用被转变为吸引(Song等，1998)。为了研究L1/NP-1的反式作用激活cGMP路径来特化Sema3A的吸引作用的可能性，本发明人采用一种药理学方法。1H-(1，2，4)噁二唑(4，3-a)喹喔啉-1-酮(ODQ)通过特异性阻断可溶性鸟苷酸来阻止cGMP合成。ODQ单独或与L1Fc一起加到脊髓和皮层外植体的共培养物中(附图8)。与对照相比，单独加入ODQ(10-5M)不改变化学排斥(诱导指数分别为-1.6和-1.7)。在朝向或远离脊髓外植体的轴突的数量和长度差别显著(附图8)。如预期，单独的L1Fc将排斥转变为吸引(诱导指数为+1.5)。但是，当ODQ结合L1Fc(3μg/ml)时，阻止逆转(诱向指数为-1.5)。这表明，cGMP合成是L1Fc逆转Sema3A排斥所必需的。一氧化氮(NO)是熟知的鸟苷酸环化酶激活剂(Hanafy等，Med.Sci.Monit.，7801-819，2000)。本发明人检测是否激活神经元NO合成酶(nNOS)也是逆转过程所必需的。NOS的特定抑制剂7硝基吲哚(7NI)被加入皮层切片和腹侧脊髓共培养物中。在单独使用ODQ、7NI(10-4M)时，没有改变对照组中的化学排斥作用(诱向指数分别为-1.6和-1.7，图8)，但是其阻断L1Fc介导的化学吸引。绝大部分轴突优先远离脊髓外植体生长，如对照(附图8)。这表明，L1-NP-1反式作用引起NO合成，随后激活cGMP鸟苷酸环化酶来诱导Sema3A排斥逆转为吸引。
实施例9模拟可溶性L1的肽阻断Sema3A诱导的内吞作用轴突末梢中的内吞作用和Sema3A受体复合物的再组装被证明是伴随Sema3A诱导的生长锥的萎缩(Fournier等，2000)。
已经发现，可溶性L1防止生长锥在对Sema3A响应时萎缩(Castellani等，2000)。
试验因此，已经检测L1模拟肽是否能够阻断内吞作用。为了肉眼观察内吞作用，在各种条件下检测应用于活皮层培养物的若丹明-葡聚糖的摄取。细胞用若丹明-葡聚糖以及只有Sema3A、Sema3A结合L1模拟肽、单独的肽处理15min，或者不进行处理作为对照。明显地，在仅用Sema3A处理的细胞中特别地观察到若丹明-葡聚糖的摄取。在这种条件下，在轴突轴体上和细胞周围观察到内化的荧光斑点。相反，在所有其他处理中没有检测到若丹明-葡聚糖的摄取。
结论这表明模拟可溶性L1的肽阻断Sema3A-诱导的内吞作用。
为了将该过程与L1/NP-1相互作用相关联，在被转染来共表达L1和NP-1的COS7细胞中进行若丹明-葡聚糖摄取的试验。在皮层细胞中，单独Sema3A而不是结合模拟肽的Sema3A在共转染细胞中诱导若丹明-葡聚糖的内化。在仅用肽处理后或在对照条件下，没有检测到荧光标记。
同时，接受相同处理的细胞进行L1和NP-1的免疫细胞化学检测。本发明人观察到L1和NP-1的细胞表面表达被Sema3A处理取消(附图7A)。相反，在所有其他条件下检测到这两种蛋白，包括用Sema3A结合肽的处理。而且，在用Sema3A处理的培养物中，L1和NP-1的免疫反应活性在透化后被检测，共定位在胞质路径上。
因此，Sema3A诱导L1和NP-1的共内化。两种蛋白的内化作用被该肽阻断。
基于这些结果，可以进行两个筛选活性肽或分子的细胞试验。
—试验N°1在于存在Sema3A和若丹明-葡聚糖(或FITC-葡聚糖或偶联到荧光分子的葡聚糖)时，培养表达L1和NP-1的细胞(用转染表达载体或神经细胞的细胞系)。该试验用于筛选阻止由Sema3A处理引起的葡聚糖的内化的分子。
—试验N°2表达L1和NP-1的细胞(细胞系或神经元细胞)用Sema3A处理并用候选分子筛选。进行L1和/或NP-1的免疫细胞化学，来检测蛋白质的细胞表面表达。在用Sema3A处理(对照条件)后，没有检测到标记。该试验用于筛选维持细胞表面表达的分子。
这些结果提供证据表明Sema3A排斥作用与L1介导的NP-1内吞相关。Sema3A排斥转变为吸引通过阻断内吞作用的L1对NP-1的特定反作用起动。接着是下游激活细胞内的NO/cGMP路径。位于L1Ig结构域1上的单个错义突变L120V完全阻止由排斥转变为吸引，并且破坏反式和顺式的L1/NP-1相互作用。相反，先前已经被证明能够改变同种细胞和异种细胞结合到IgCAMs的其他突变L1蛋白仍然有效地逆转Sema3A排斥，以及结合NP-1(附图9A)。来自Ig1结构域的五个和六个氨基酸的肽足以转变Sema3A诱导的排斥，这表明L1/NP-1结合位点被限定在FASNKL的氨基酸序列中。基于这些发现，本发明人提出一种模型，其中顺式和反式L1/NP-1相互作用控制生长锥对Sema3A的响应。
L1/NP-1结合位点位于L1的Ig1结构域中Sema3A受体复合物已经被证明含有结合亚基(NP-1)和信号传感器(Plexin)(Tamagnone等，2000)。最近，本发明人提出L1也是该受体复合物的一个成分(Castellani等，2000)。
先前的研究已经表明，几个L1的Ig结构域是同种细胞和异种细胞的Ig CAM结合所必需的(Appel等，Neurosci.，134764-4775，1993；Su等，Nat Genet.，7408-413，1998；Haspel等，J Neurobiol.，15287-302，2000)。这被Ig结构域中影响这些相互作用的病理学突变的数量所强调(De Angelis等，1999)。相反，本发明人发现，这些突变中的一些不会改变L1/NP-1相相互作用用，表明L1的限制性区域可能决定了结合NP-1的位点。这种观点被本发明的结果所证实，该结果表明六氨基酸肽在逆转Sema3A排斥为吸引中能够模拟完整的L1Fc。如试验所证明，采用具有突变L120V的L1Fc和将残基亮氨酸120改变为缬氨酸的肽完全破坏了L1-NP-1相相互作用用和逆转过程。总之，这些发现表明NP-1的结合位点被包含在FASNKL序列中，亮氨酸是关键的残基。
本发明人先前的发现表明L1Fc可以独立地作用于Sema3A信号路径，通过同种细胞结合激活细胞内的级联，导致cGMP水平升高和随后由排斥转变为吸引(Castellani等，2000；He，Neuron，27191-193，2000)))))))。虽然本发明人发现L1Fc确实激活鸟苷酸环化酶，如使用G121S-L1Fc的试验所示，这不依赖于同种细胞的作用。因此，本发明人认为，转变是通过在受体复合物中与NP-1的选择性相互作用发生。有意思的是，顺式和反式的L1-NP-1相互作用都使用相同结合位点。但是，可溶性的和跨膜的L1不竞争与NP-1结合。这与本发明人先前的发现是一致的，该发现表明L1Fc不能使缺乏L1的轴突对Sema3A诱导的化学排斥敏感。此外，L1Fc也不能够诱导L1缺乏的轴突的吸引(Castellani等，2000)。因此，L1-NP-1顺式作用对于Sema3A受体复合物转换排斥和吸引信号的前提。因而，膜上L1和NP-1的二聚体形式使得顺式作用和反式作用可以同时发生。
L1/NP-1顺式和反式作用对内吞作用和控制Sema3A-诱导的排斥和吸引行为的双功能本研究表明，跨膜L1调节与Sema3A诱导的排斥反应相关的NP-1内吞作用(Fournier等，2000)。相反，可溶性L1模拟肽的反式作用阻断L1/NP-1受体复合物的内吞作用，将Sema3A由排斥转变为吸引。可以将内吞作用与在排斥接触中发生的伪足和lamellipodial结构的回缩相关联。内吞作用如何产生反作用目前仍然是不清楚的。一种可能是持续的配体/受体相互作用最终稳定生长锥的结构。无论该机制如何，必需最终导致细胞内信号的改变。本发明结果与最近的发现是一致的，说明局部蛋白质合成和降解对于控制生长锥反应的诱导信号是必需的(Campbell和Holt，Neuron，321013-1026，2001)。如几个最近的研究所证实，受体内吞控制蛋白酶的降解水平，细胞表面表达和细胞内下游发出信号(Lloyd等，Cell.，25261-269，2002；Soubeyran等，Nature，14183-187，2002)。因此，在生长锥中的合成和蛋白酶水解之间的平衡以及决定由诱向信号产生的反应的性质中，控制内吞作用可能是有益的。
转变Sema3A化学排斥为吸引需要激活NO/cGMP路径在共培养分析中采用药学抑制剂阻断可溶性鸟苷酸环化酶阻止L1Fc将Sema3A排斥逆转为吸引。对cGMP的要求与先前的工作一致(Song等，1998)，产生高水平的cGMP对Sema3A信号是关键的。在发育中的皮层中，Sema3A被证明产生双重作用，抵制轴突同时吸引树突细胞(Polleux等，Nature，6567-573，2000)。基于其在细胞中的不对称的亚细胞分布，一般认为鸟苷酸环化酶响应树枝状生长锥对Sema3A的特定吸引表现(Polleux等，2000)。但是，本发明人的发现表明，皮层轴突还表现适当的分子机制来展示对Sema3A的吸引作用。这可能是由于在每个试验中所研究的皮层轴突的不同发育阶段(出生后的轴突被用于本研究来与Polleux研究中的胚胎细胞比较)。可选择地，在成熟过程中鸟苷酸环化酶的定位的变化或上调或下调事件可能是轴突和树突之间的差异的原因。
此外，本发明的发现还表明，NO作为逆转Sema3A的化学排斥为吸引中的重要信使。因此，Sema3A诱导的反应的转变密切依赖于nNOS表达的成熟。在小鼠大脑皮层中，nNOS免疫反应活性出现于晚期胚胎阶段，在出生后第一周内达到高峰，然后降低到成年水平(Oermann等，Anat.Embryol.(Berl)20027-41，1999)。一般认为NO调控未成熟的突触联系(Wu等，Science，2651593-1596，1994)和某些成年突触可塑性形式的精确化(Kiss和Vizi的综述，TrendsNeurosci.，24211-215，2001)。本发明的观察结果表明NO在通过调节轴突对诱向信号来制定神经发射模式中的新功能，特别是在成熟后发育的皮质束中。
调节Sema3A信号和轴突寻路由可溶性L1调节Sema3A介导的反应也可能在体内发生。Sema3A受体复合物中的动力学改变可能作为生长锥与膜结合L1或细胞表面释放的L1作用的结果。作为佐证，一些研究报道由纤维蛋白溶酶(纤维蛋白溶酶原)和去整合素金属蛋白酶家族成员ADAM10的蛋白水解酶裂解L1(Nayeem等，J.Cell.Sci.，1124739-4749，1999；Gutwein等，J.Biol.Chem.，1915490-15497，2000；Mechtersheimer等，J.Cell.Biol.，12661-674，2001)。此外，在出生后的大脑中检测到L1的膜近侧裂解，这可能是L1依赖的迁移过程所必需的(Mechtersheimer等，2001)。关于轴突诱向，从本发明的数据可以提出，可溶性L1可能以两种非专有的方式起作用。一方面，可溶性L1能够在邻近生长锥中将Sema3A诱导的反应从排斥逆转为吸引。另一方面，L1胞外结构域的脱落可能破坏Sema3A受体复合物，从而使生长锥对Sema3A不敏感。这与最近的发现一致，该发现表明金属蛋白酶作为在轴突对其他类型诱向信号的反应的决定因子的活性(Galko等，Science，251365-1367，2000；Hattori等，Science，251360-1365，2000)。最近已经证明，被转变的对Slit家族的诱向信号的反应在指引肌肉先导(muscle pioneer)的迁移中是可操作的(Kramer等，Science，292737-740，2001)。因此，可以推测，转变Sema3A反应性在神经发射形成中很重要。
Sema3A信号和与L1突变相关的人类疾病令人感兴趣的是，本发明数据可能说明能够导致人疾病病理的分子事件。个别理论已经被提出来解释与L120V突变相关的病理缺陷。第一种提议是，这种突变产生一种具有潜在的供体剪接位点的核苷酸序列(De Angelis等，1999)。其次，一般认为，L120V突变影响细胞外基质相互作用，在体外试验中其能够阻断L1结合到硫酸软骨素蛋白多糖神经聚糖上(Oleszewski等，J.Biol.Chem.，33478-3485，2000)。本发明的数据可能证实第三种可能性，其中人病理的某些方面可能是影响Sema3A信号传导的缺陷型L1/NP-1相互作用的结果，从而导致在皮质纤维束发育过程中的轴突诱向缺陷。由于本发明人发现，L1调节Sema3A受体复合物的内吞作用，任何影响L1细胞表面表达和转运的突变类型可能潜在地改变Sema3A的信号传导。这从而提高了可能在神经元发射发育的过程中扰乱轴突对Sema3A的反应的突变体的光谱。
序列表国家科学研究中心<110>
国立马赛第二大学<120>能够诱导引起轴突生长的肽以及它们用于治疗神经退化性疾病的用途<130>D19980<150>EP 02076552<151>2002-04-19<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述来自L1 Ig1结构域的人氨基酸序列<400>1Ala Ser Asn Lys Leu1 5<210>2<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述来自L1 Ig1结构域的人氨基酸序列<400>2Phe Ala Ser Asn Lys Leu1 5<210>3<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述来自L1 Ig1结构域的人氨基酸序列<400>3Phe Ala Ser Asn Lys Leu Gly Thr Ala Met1 5 10
权利要求
1.一种包含SEQ ID NO1优选诱导轴突生长的吸引的肽，特别在存在semaphorin(Sema3A，L1和NP-1)蛋白情况下。
2.根据权利要求1所述的肽，其包含不超过10个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的肽，其由SEQ ID NO1组成。
4.根据权利要求1所述的肽，其包含或由SEQ ID NO2组成。
5.根据权利要求1所述的肽，其包含或由SEQ ID NO3组成。
6.一种轴突生长诱导剂，其包含根据权利要求1-5任何一项的肽。
7.一种用于确定能够结合NP-1蛋白的化合物的方法，包含步骤a)在将包含NP-1蛋白的样本与L1-Fc或根据权利要求1-5任何一项的肽接触之前、之后或同时，将所述化合物与样本接触，b)检测NP-1和L1-Fc或所述肽之间的结合，在缺乏所述化合物时观察到NP-1与L1-Fc或所述肽的结合的变化推导所述化合物与NP-1蛋白的结合。
8.根据权利要求7的方法，其中所述样本还包含L1蛋白。
9.根据权利要求7或8的方法，其中所述NP-1蛋白是重组蛋白。
10.根据权利要求7-9任何一项的方法，其中所述样本包含表面表达NP-1蛋白的细胞。
11.根据权利要求7-10任何一项的方法，其中所述样本包含表面表达NP-1和L1蛋白的细胞。
12.根据权利要求7-11任何一项的方法，其中所述L1-Fc蛋白或所述肽被标记，并且所述NP-1蛋白和所述L1-Fc蛋白或所述肽的结合通过与所述NP-1蛋白相关的信号水平来检测。
13.根据权利要求7-12任何一项的方法，其中所述NP-1蛋白和所述L1-Fc蛋白或所述肽的结合变化通过测定存在所述结合时出现的第二信号来检测。
14.根据权利要求13的方法，其中所述第二信号在存在Sema3A时被诱导产生。
15.根据权利要求14的方法，其中所述第二信号是逆转Sema3A对轴突生长的排斥作用。
16.根据权利要求14的方法，其中所述第二信号是激活NO的合成。
17.根据权利要求14的方法，其中所述第二信号是增加cGMP的产生。
18.通过适合于促进轴突生长的细胞来吸引/调节轴突生长方向的方法，该细胞被加入到Sema3A流中，包括将所述细胞与权利要求1-5的任何一项的肽或权利要求6的诱导剂接触的步骤。
19.用于从适当细胞中确定能够逆转Sema3A对轴突生长的排斥作用的化合物的方法，包括在存在Sema3A时将在其表面表达L1和NP-1的细胞与所述化合物接触，并研究所述细胞中NO合成的增加的步骤。
20.一种用于筛选阻止由Sema3A处理诱导的葡聚糖内化的分子和用于筛选能够阻断Sema3A诱导的细胞内吞的分子的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤a)在存在Sema3A，标记的葡聚糖和被检测的分子时，培养表达L1和NP-1的细胞；以及b)肉眼观察或确定所述标记的葡聚糖是否被内化到细胞中；c)如果没有检测到标记的葡聚糖被该细胞摄取，选择被检测的分子。
21.一种用于筛选能够阻断Sema3A诱导的L1和NP-1蛋白共内化的分子，筛选能够维持细胞表面表达L1和NP-1蛋白的分子或筛选能够阻断Sema3A诱导的内吞作用的分子的方法，其特征在于所述方法包含如下步骤a)在存在Sema3A和被检测的分子时，培养表达L1和NP-1的细胞；和b)存在指导抗L1和NP-1蛋白的抗体时，采用免疫细胞化学方法肉眼观察或确定所述L1和NP-1蛋白是否被内化到细胞中；c)如果可以在该细胞的表面检测L1和NP-1蛋白，选择被检测的分子。
22.权利要求1-5的任何一项所述的肽，或者权利要求6的诱导剂在用于制备神经元/轴突再生的药物中的用途。
23.权利要求1-5的任何一项所述的肽，或者权利要求6的诱导剂在用于制备治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
24.权利要求1-5的任何一项所述的肽，或者权利要求6的诱导剂作为靶向试剂在用于制备细胞治疗的组合物中的用途。
全文摘要
本发明涉及包含序列ASNKL(SEQ ID NO1)的肽，其在存在semaphorin(Sema3A)、L1和NP－1蛋白质时诱导轴突的生长，以及这些肽在制备用于神经元/轴突再生或用于治疗神经退化性疾病中的用途。本发明还包括用于确定能够结合NP－1的化合物的方法，用于确定能够从合适的细胞中逆转Sema3A对轴突生长的排斥作用的化合物的方法，或者用于筛选能够阻断Sema3A－诱导的细胞内吞作用的分子的方法。
文档编号A61K38/00GK1656119SQ03812283
公开日2005年8月17日 申请日期2003年4月18日 优先权日2002年4月19日
发明者G·罗贡, V·卡斯泰拉尼 申请人:国家科学研究中心, 地中海岸大学(国立马赛第二大学)