专利名称：载脂蛋白a－i在制备抗内毒素与抑制细胞因子释放药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属制药领域，涉及载脂蛋白A-I在制药中的用途，具体涉及载脂蛋白A-I的抗内毒素与抑制细胞因子释放的新用途。
背景技术：
载脂蛋白A-I(简称Apo A-I)作为血浆高密度脂蛋白(HDL)的主要成分，其抗动脉粥样硬化功能已为国内外研究所确认。有报道，在机体急性相反应(acutephase response，APR)时，如微生物和寄生虫感染性炎症；内毒素血症；急性胰腺炎、心脑梗塞、烧伤等非感染性炎症引起组织坏死，血清C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)和血清淀粉样蛋白(serum amyloid A，SAA)急剧升高(Morley JJ et alAnn.N.Y.Acad.Sci.1982389406)，SAA与血浆HDL相互作用(Gabanan VG et alJ.Lipid Res.19893039；Shephard EGet alBiochem.J.1987248919；Goetzee GA et alJ.Biol.Chem.19862619644)，SAA取代Apo A-I成为HDL中的主要载脂蛋白。
90年代中后期，国外对非特异性免疫细胞，如中性粒细胞、巨噬细胞等的功能有了新的认识，它们不仅仅被认为是炎症反应效应细胞，也可能作为体内细胞因子(cytokines，如肿瘤坏死因子TNF-α，白细胞介素系列IL等)的重要来源(Gabrilovich Etd“NeutrolphilsNew outlook for old cells”ImperialCollege Press England.1999)，细胞因子集中大量释放形成细胞因子风暴(cytokines stom)会造成机体极大伤害，直至组织坏死，休克死亡。内毒素(LPS)是G-菌细胞壁上的一种组分，本质是脂多糖，LPS在体内大量释放导致机体发热、低血压、休克、弥漫性血管内凝血、多器官衰竭甚至死亡。其直接诱因是LPS引发的细胞因子风暴(Breyer I et alMedicina(B Aires)199858(1)61-4)。SARS患者死亡的重要诱因是肺功能衰竭，其重要原因是免疫系统过度激活，细胞因子及弹性蛋白酶大量释放，至今临床上仍无直接对抗LPS及抑制细胞因子释放的有效药物。
发明内容
本发明的目的是提供Apo A-I在制药中的新用途，具体涉及Apo A-I的抗内毒素与抑制细胞因子释放的新用途。
本发明通过常规方法制备Apo A-I，并经动物实验和细胞实验证实Apo A-I具有抗内毒素与抑制细胞因子释放的新用途。
本发明Apo A-I能保护机体免受内毒素和细胞因子大量释放而导致对机体的严重损伤。为机体急性相反应时直接对抗内毒素和抑制细胞因子释放提供一条新的特效治疗途径。
具体实施例方式
实施例1制备及纯化Apo A-I(1)常规超速离心法分离人血浆(HDL)收集d 1.063-1.21g/cm3的HDL部分，收集d＞1.21的无脂蛋白血浆部分(LFF)。
(2)制备与纯化Apo A-I浓缩后的HDL经乙醇/乙醚脱脂，收集蛋白部分(Apo HDL)，经Bio CADWorkstation POROS HQ阴离子交换柱分离，获纯化Apo A-I。经SDS-PAGE电泳鉴定，仅有一条Apo A-I条带。
实施例2 Apo A-I的抗内毒素(LPS)功能实验(1)整体动物实验Apo A-I保护小鼠免受LPS损伤实验实验分四组，每组10只昆明种小鼠，尾静脉注射LPS，注射量为0.18ml/10g，LPS剂量为4mg/kg，Apo A-I剂量为49mg/kg，LFF剂量为49mg/kg，连续观察48小时。结果表明，Apo A-I具有对抗LPS对小鼠的致死作用，LFF存在增强Apo A-I的作用。预试验结果显示LFF无对抗LPS的毒性作用。
(2)Apo A-I抑制内毒素激活的小鼠腹腔巨噬细胞释放细胞因子对L929细胞的杀伤作用(MTT法)按常规方法取小鼠腹腔巨噬细胞，调节密度4×106/ml，细胞培养板预培养24小时。实验分三组，n＝5，培养液中LPS浓度0.2μg，Apo A-I 0.2mg/ml，LFF0.1mg/ml，L929细胞5×105/ml。共培养16小时，以常规MTT法测定L929存活率。结果表明，Apo A-I能对抗LPS刺激巨噬细胞释放细胞因子对L929细胞的杀伤作用，LFF存在能增强Apo A-I的作用。
(3)Apo A-I体外结合LPS实验采用荧光酶标法，Apo A-I+LPS组，将Apo A-I包板，洗涤后用BSA封闭，再洗涤，加入FITC-LPS，洗涤后用荧光分光光度仪测荧光结合量。Apo A-I+LFF+LPS组，BSA封闭后加入LFF，洗涤后加入FITC-LPS，再洗涤后用荧光分光光度仪测荧光结合量。结果表明，Apo A-I能直接结合LPS，LFF存在能增强Apo A-I的作用。
本发明实验所用L929细胞购自中科院上海细胞所，所述巨噬细胞按常规方法取自昆明种小鼠腹腔，所用LPS购自Sigma公司。
表1是Apo A-I对抗LPS对小鼠的杀伤作用。
表2是Apo A-I对抗LPS刺激巨噬细胞释放细胞因子对L929细胞的杀伤作用。
表3是Apo A-I体外结合LPS试验结果。
表1
*P＜0.05**P＜0.01表2
*P＜0.05**P＜0.01其中，数据负值表示细胞不但没有死亡，而且还有增长。
表3组别(n＝4)Apo A-I+LPSApo A-I+LFF+LPS荧光强度 24.35±3.7 64.47±8.06**P＜0.01实施例3 Apo A-I对中性粒细胞功能的调节作用实验(1)Apo A-I对激活中性粒细胞粘附功能抑制作用采用体外细胞培养法，常规由肝素抗凝兔血分离中性粒细胞，以fMLP激活，同时与不同浓度的Apo A-I共培养，调节细胞密度至2×106/ml，接种至纤维结合蛋白包被的细胞培养板，37℃培养30min，以PBS洗涤，结晶紫染色，酶标仪测定光吸收度。结果表明，Apo A-I具有抑制fMLP激活的中性粒细胞粘附于纤维结合蛋白的作用，其抑制作用随Apo A-I浓度增加而增强。
(2)Apo A-I抑制激活中性粒细胞释放细胞因子(TNF-α等)对L929细胞杀伤作用实验(MTT法)采用体外细胞培养法，常规由肝素抗凝兔血分离中性粒细胞，以fMLP激活，同时与不同浓度的Apo A-I共培养，调节细胞密度至2×106/ml，37℃培养30min，离心，弃上清液，调细胞密度至2×106/ml，加至L929细胞共培养12h，MTT法测定L929细胞存活率。结果表明，Apo A-I具有抑制激活的中性粒细胞释放细胞因子如TNF-α杀伤L929细胞的作用。
(3)Apo A-I抑制激活中性粒细胞释放超氧阴离子作用(NBT法)采用体外细胞培养法，常规由肝素抗凝兔血分离中性粒细胞，以fMLP激活，同时与不同浓度的Apo A-I共培养，调节细胞密度至2×106/ml，37℃培养30min，NBT染色，酶标仪测定光吸收度。结果表明，Apo A-I具有抑制激活的中性粒细胞产生超氧阴离子的功能，其抑制功能随着Apo A-I浓度增加而增强。
(4)Apo A-I对中性粒细胞脱粒功能抑制作用采用体外细胞培养法，常规由肝素抗凝兔血分离中性粒细胞，以fMLP激活，同时与不同浓度的Apo A-I共培养，调节细胞密度至2×106/ml，37℃培养30min，离心收集上清液，分别测定上清液中的弹性蛋白酶及髓过氧化物酶活性。结果表明，Apo A-I具有抑制激活的中性粒细胞脱颗粒的作用，其抑制作用随着Apo A-I浓度增加而增强。
本发明实验所用fMLP、纤维结合蛋白购自Sigma公司表4是Apo A-I抑制激活中性粒细胞粘附到纤维结合蛋白的结果。
表5是Apo A-I抑制激活的中性粒细胞释放细胞因子杀伤L929细胞的作用。
表6是Apo A-I抑制激活的中性粒细胞产生超氧阴离子作用的结果。
表7是Apo A-I抑制激活的中性粒细胞释放弹性蛋白酶的结果。
表8是Apo A-I抑制激活的中性粒细胞释放髓过氧化物酶的结果。
表4中性粒细胞粘附率ApoA-I(μg/ml) 0 2.55101、中性粒细胞 17.3±0.7％17.1±0.2％17.3±0.0％ 17.3±0.0％2、中性粒细胞+fMLP 24.1±1.6％**22.2±2.1％**，Δ15.7±0.3％ΔΔ10.6±1.0％**，ΔΔ与1组比较**P＜0.01，n＝3；与2/0组比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01表5 n＝3与1组比较**P＜0.01，与2/0组比较ΔP＜0.05，
表6A570nmApoA-I(μg/ml) 02.55 101、中性粒细胞 0.16±0.02、中性粒细胞+fMLP 0.20±0.0**0.15±0.0ΔΔ0.13±0.0**，ΔΔ0.12±0.0**，ΔΔn＝3与1组比较**P＜0.01，与2/0组比ΔΔP＜0.01，表7弹性蛋白酶产物(μM)ApoA-I(μg/ml) 0 2.51、中性粒细胞 29.6±1.42、中性粒细胞+fMLP 42.2±0.7**21.5±0.5％**，ΔΔn＝3，与1组比较**P＜0.01，与2/0组比ΔΔP＜0.01表8 Apo A-I抑制激活中性粒细胞释放髓过氧化酶(MPO)的作用释放MPO占细胞总MPO活性％ApoA-I(μg/ml) 0 2.5 5101、中性粒细胞 50.4±0.5％2、中性粒细胞+fMLP 93.0±1.0％**58.7±0.9％*’ΔΔ50.8±0.3％ΔΔ46.1±0.6％*’ΔΔn＝3与1组比较*P＜0.05，**P＜0.01与2/0组比ΔΔP＜0.0权利要求
1.载脂蛋白A-I在制备抗内毒素药物中应用。
2.载脂蛋白A-I在制备抑制中性粒细胞、巨噬细胞功能的药物中应用。
3.载脂蛋白A-I在制备抑制激活中性粒细胞粘附到纤维结合蛋白的药物中应用。
4.载脂蛋白A-I在制备抑制激活中性粒细胞释放细胞因子的药物中应用。
5.载脂蛋白A-I在制备抑制激活中性粒细胞释放超氧阴离子的药物中应用。
6.载脂蛋白A-I在制备抑制激活中性粒细胞释放髓过氧化酶的药物中应用。
7.载脂蛋白A-I在制备抑制激活中性粒细胞释放弹性蛋白酶的药物中应用。
8.载脂蛋白A-I在制备抑制激活巨噬细胞释放细胞因子的药物中应用。
全文摘要
本发明属于制药领域，涉及载脂蛋白A－I在制药中的新用途。本发明经动物实验和细胞实验证实，Apo A－I在机体急性相反应如微生物和寄生虫感染性炎症；内毒素休克；急性胰腺炎、心脑梗塞、烧伤等非感染性炎症引起组织坏死等时，具有直接抗内毒素、抑制非特异性免疫细胞功能作用。本发明Apo A－I能保护机体免受内毒素和细胞因子大量释放而导致对机体的严重损伤，为机体急性相反应时直接对抗内毒素和抑制细胞因子释放提供一条新的特效治疗途径。
文档编号A61P7/00GK1544086SQ200310108689
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月19日 优先权日2003年11月19日
发明者吴满平, 马娟, 廖雪玲 申请人:复旦大学