专利名称：甘草甜素及其衍生物用于mcp-1生成抑制剂的用途的制作方法
交叉引用的相关申请本申请要求美国临时申请60/422,338(提交于2002年10月29日)的优先权。
发明
背景技术：
领域本发明涉及将甘草甜素(Glycyrrhizin)及其衍生物在抑制MCP-1的生成及在制备MCP-1生成抑制剂中的应用，还涉及一种抑制MCP-1生成的方法及一种在MCP-1生成抑制过程中控制感染的方法，以及一种为此目的的药物组合物。
背景技术：
<MCP-1趋化因子>
细胞因子是淋巴细胞和其它细胞产生的蛋白质，作用于具有细胞因子受体的细胞以促进细胞的生长，分化及表达。细胞因子还包括一类称为趋化因子(chemokine)的蛋白，趋化因子具有诱导白细胞迁移的功能。这些趋化因子均具有一种由四个半胱氨酸残基构成的共同结构，并可以根据其N末端的两个半胱氨酸残基形成的基元(motif)将趋化因子分为CXC，CC等亚家族。
CXC亚家族趋化因子均含有由处在其N末端的头两个半胱氨酸残基围绕一个氨基酸所构成的序列，即含有CXC，该类趋化因子尤其可以体外诱导嗜中性粒细胞的趋化。而CC亚家族趋化因子与CXC亚家族趋化因子的区别在于CC亚家族的趋化因子中处在其N末端的头两个半胱氨酸残基直接排列在一起，其间没有其它氨基酸，并且已知CC亚家族趋化因子可以体外诱导单核细胞、巨噬细胞、T细胞、NK细胞，嗜酸粒细胞等细胞的趋化。
MCP-1(单核细胞化学引诱(趋化)蛋白-1)是一种CC亚家族趋化因子，是一种由76个氨基酸组成、分子量为8000-18000的蛋白质。当单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞或血管内皮细胞等细胞被细菌感染等所刺激时，认为上述细胞会产生并分泌MCP-1，从而通过巨噬细胞、T淋巴细胞等促进感染部位局部组织的浸润。另外，在某些类型的肿瘤细胞中已经观察到MCP-1的非依赖性、且持续性地生成。
已经知晓当2型T淋巴细胞反应占主要地位时，机体对多种感染性疾病的抵抗力会减低。而在敲除MCP-1的小鼠中，2型T淋巴细胞不出现。换句话说，MCP-1已被证明是产生2型T淋巴细胞反应所必须的。如果有可能停止MCP-1的生成，个体将不必经过2型T淋巴细胞反应占主要地位的阶段，从而可以避免个体死于传染性疾病。例如在出现MCP-1而2型T淋巴细胞反应占主要地位的病例中，个体对疱疹感染的易感性增加了100倍，对念珠菌感染的易感性增加了50倍，并因此最终恶化为疱疹性脑炎，隐球菌脑炎和肺炎。另外，在2型T淋巴细胞反应占主要地位的病例中，由于不能诱导产生个体对肿瘤的抗肿瘤免疫力，这就会在更大可能上加速肿瘤生长，并增加癌症患者机会性感染。
因此，如果能够抑制MCP-1的作用，则认为会在治疗上述疾病等疾病中获得令人满意的效果。
发明概述为达到上述目的而进行认真的研究，结果使得本发明人将焦点集中到甘草甜素(甘草酸glycyrrhizinic acid)及其衍生物。
甘草甜素(或甘草酸)是由甘草次酸(glycyrrhetic acid)和两分子葡糖醛酸构成的化合物，长期以来其抗炎作用已为公众所知。另外，其具有抑制胃液分泌、治疗消化器官溃疡、增强抗过敏活性、免疫抑制、肝功能强化、解毒和增加对病毒抵抗力等作用也是众所周知的。该化合物尤其作为肝病药剂和过敏症药剂而广泛应用于临床。
据近年报道，甘草甜素具有抑制细胞内HIV生长的作用，而且以每天150mg至225mg(6至9片)的剂量给予无症状病毒携带患者(AC)施用甘草甜素时，会实现存活10年或更长而且艾滋病不发病的效果。
本发明人发现甘草甜素及其衍生物具有抑制MCP-1生成的作用，由此完成本发明。
本发明提供了甘草甜素及其衍生物在抑制MCP-1生成中的应用。
应用于本发明的甘草甜素及其衍生物用以下通式(I)表示
[其中，R1代表氢原子或如下通式(II)或(III)所表示的基团 或其在药学上可接受的盐}；R2代表COOH或如下通式(IV)所表示的基团 或它们在药学上可接受的盐；X代表C＝O或CH；并且，点线合理地代表双键]。
以上化合物中，通式(II)、(III)和(IV)的药学可接受盐为钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铝盐、铵盐或者其它各种有机氨盐，但优选钠盐、钾盐、铵盐或其组合。
上述通式(I)中包括如下化合物齐墩果-11，13(18)-二烯-30-羧-3β-基-(2-O-β-吡喃葡糖醛酸基-β-D-吡喃葡糖醛酸二钠)(olear-11，13(18)-diene-30-carboxy-3β-yl-(disodium2-O-β-glucopyranuronosyl-β-D-glucopyranuronate))；齐墩果-3β-羟基-11-氧-12-烯-30-酸钠(sodium olean-3β-hydroxy-11-oxo-12-ene-30-ate)；齐墩果-9(11)，12-二烯-3β，30-二醇-3β，30-O-二半邻苯二甲酸二钠(disodium olean-9(11)，12-diene-3β，30-diol-3β，30-O-dihemiphthalate)；齐墩果-11，13(18)-二烯-3β，30-二醇-3β，30-O-二半邻苯二甲酸二钠(disodium olean-11，13(18)-diene-3β，30-diol-3β，30-O-dihemiphthalate)；齐墩果-3β-羟基-11，13(18)-二烯-30-盐-3β-O-半邻苯二甲酸二钠(disodium olean-3β-hydroxy-11，13(18)-diene-30-ate-3β-O-hemiphthalate)；齐墩果-3β-羟基-11-氧-12-烯-30-盐-3β-O-半邻苯二甲酸二钠(disodiumolear-3β-hydroxy-11-oxo-12-ene-30-ate-3β-O-hemiphthalate)；和20β-羧基-11-氧-30-正齐墩果-12-烯-3β-基-2-O-β-D-吡喃葡糖醛酸基-β-D-吡喃葡糖苷酸单铵(monoammonium 20β-carboxy-11-oxo-30-norolean-12-en-3β-yl-2-O-β-D-glucopyranuronosyl-β-D-glucopyranosidouronate)本发明还提供一种抑制MCP-1生成的方法，所述方法包括对单核细胞或T淋巴细胞迁移增多或IL-10生成增高的、且对上述增高需要进行抑制的哺乳动物，施用可以产生所述抑制作用的有效剂量的权利要求1或2的化合物。
另外，本发明还提供了一种控制感染的方法，该方法包括通过抑制MCP-1的生成来控制由MCP-1引发的个体感染易感性，从而使个体获得感染抵抗力。
另外，本发明还提供上述甘草甜素及其衍生物在制备MCP-1生成抑制剂中的用途。
另外，本发明还提供一种药物组合物，用于治疗或预防烧伤病人、AIDS病人、癌症病人、脑炎病人、重伤或大手术后个体，经受压力的个体以及其他诱生出MCP-1的个体对机会性感染的感染抵抗力降低，所述药物组合物包括权利要求1或2的化合物与任意药学上可接受的载体，所述化合物的量能够有效地治疗或预防所述个体对机会感染的感染抵抗力降低。
图1.说明甘草甜素对受IL-10刺激的外周血单核细胞的MCP-1生成抑制作用。
源自健康受试者的外周血单核细胞(1×106细胞/ml)用20ng/ml的IL-10刺激24小时，然后加入甘草甜素或其衍生物(100μg/ml)。用ELISA法测定培养上清中MCP-1的含量。
图2.说明甘草甜素对烧伤病人外周血单核细胞的MCP-1生成抑制作用。
源自烧伤病人的外周血单核细胞(1×106细胞/ml)用100μg/ml的甘草甜素刺激24小时，源自健康受试者的单核细胞做为对照。用ELISA法测定培养上清中MCP-1的含量。
图3.说明甘草甜素对AIDS病人外周血单核细胞的MCP-1生成抑制作用。
源自AIDS病人的外周血单核细胞(1×106细胞/ml)用0.01-100μg/ml的甘草甜素刺激24小时。用ELISA法测定培养上清中的MCP-1的含量。
图4A和4B。说明给予对HSV-1易感性增加的烧伤小鼠甘草甜素后的效果。
正常小鼠，烧伤小鼠和MCP-1敲除烧伤小鼠经腹腔感染101-106PFU/kg的HSV-1。
(A)对正常小鼠在感染前2小时和感染后24小时经皮下给予50ng/鼠的MCP-1。
(B)对烧伤小鼠在感染前2小时和感染后12及24小时经皮下给予10μg/鼠的抗MCP-1单克隆抗体。感染后立即及2小时后经腹腔给予20mg/kg的甘草甜素。图中显示感染2周后每组的存活率。
优选方案详述本发明中用于抑制MCP-1生成的甘草甜素及其衍生物可以从，如Minophagen制药公司(Minophagen Pharmaceutical Co.，Ltd)处获得。另外，甘草甜素衍生物记载于，如“日本未审查专利申请”(第一次发行No.Sho 63-2959)，“化学药物快报”(Chem.Pharm.Bull.)34，897(1986)和“日本药学杂志”(Jpn.J.Phamacol.)71，281(1996)等处。
齐墩果-3β-羟基-11-氧-12-烯-30-盐-3β-O-半邻苯二甲酸二钠可以依照下述方式合成。
齐墩果-3β-羟基-11-氧-12-烯-30-盐-3β-O-半邻苯二甲酸二钠的合成方法300ml甲醇和30ml 1N氢氧化钠水溶液加入到10g齐墩果-11，13(18)-二烯-3-羟基-30-盐-3-O-半邻苯二甲酸中，搅拌溶解。边搅拌边加入氢氧化钠水溶液使得反应溶液的pH值稳定在10.0-10.4的范围内。准备好反应溶液后，将该溶液通过薄膜过滤器过滤。过滤后，将该反应溶液浓缩约至其原始体积的一半，加入200ml丙酮，回收并干燥沉淀下来的白色晶体。获得9.3g上述化合物，它是本发明使用的化合物中的一种。熔点为283-287℃，质量分析值(m/z)为601(M-1)。
齐墩果-11，13(18)-二烯-3-羟基-30-盐-3-O-半邻苯二甲酸的合成方法将30g齐墩果-11，13(18)-二烯-3-羟基-30-酸，60g邻苯二甲酸酐和2g 4-二甲氨嘧啶的混合物加入到300ml氯仿中，80℃回流24小时。反应完成后，蒸馏去除溶剂，并向残留物中加入240ml乙醇。90℃加热溶解后，加入240ml水，接着加热搅拌15分钟。冷却后，回收沉淀下来的白色晶体，并向这些晶体加入200ml 50％乙醇，然后持续加热搅拌30分钟。冷却后，过滤回收不溶解的白色晶体，然后用50％乙醇溶液洗涤并干燥，获得37.6g齐墩果-11，13(18)-二烯-3-羟基-30-盐-3-O-半邻苯二甲酸。
齐墩果-11，13(18)-二烯-3-羟基-30-酸的合成方法将47.1g 18α-甘草次酸溶于500ml四氢呋喃(THF)，然后在80℃将其与500ml 1N氢氧化钠水溶液和500ml THF混合，然后向该混合物中滴入含有75.6g硼氢化钠(sodium borohydroxide)的溶液，并于相同的温度下反应24小时。反应完成后，反应液降至室温后加入600ml丙酮并搅拌，而后使用2N盐酸中和该溶液。蒸馏去除反应溶液中的THF，过滤回收沉淀下来的白色晶体(11α-羟基-甘草次酸和11β-羟基-甘草次酸的混合物)。将这些晶体溶于1000ml THF并干燥后，蒸馏去除溶剂，并向残留物中加入400ml氯仿，然后过滤回收不溶解的晶体，干燥，获得40g 11α-羟基-甘草次酸和11β-羟基-甘草次酸的混合物。将该混合物溶于4000ml THF，然后加入1600ml 10％盐酸并于室温搅拌3小时。沉淀下来的白色晶体通过过滤回收、用水洗涤和干燥，获得35.8g齐墩果-11，13(18)-二烯-3-羟基-30-酸。
另外，本发明中使用的甘草甜素及其衍生物也可从自然界中存在的资源获得，比如含甘草甜素作为成分之一的甘草或者甘草粉，得自甘草的甘草提取物或甘草粗提取物。
本发明提供一种抑制MCP-1生成的方法，所述方法包括对单核细胞或T淋巴细胞迁移增高或IL-10生成增高的、且对上述增高需要进行抑制的哺乳动物，施用可以产生所述抑制作用的有效剂量的甘草甜素及其衍生物；更具体地，该方法可用于单核细胞或T淋巴细胞迁移增高的病例和由于单核细胞或T淋巴细胞渗出所引发炎症的病例。
已经知晓当2型T淋巴细胞反应占主要地位时，机体对多种感染性疾病的抵抗力会减低。而在敲除MCP-1的小鼠中，2型T淋巴细胞不出现。换句话说，MCP-1已被证明是产生2型T淋巴细胞反应所必须的。如果有可能停止MCP-1的生成，个体将不必经过2型T淋巴细胞反应占主要地位的阶段，从而可以避免个体死于传染性疾病。例如在出现MCP-1而2型T淋巴细胞反应占主要地位的病例中，个体对疱疹感染的易感性增加了100倍，对念珠菌感染的易感性增加了50倍，因此最终恶化为疱疹性脑炎、隐球菌脑炎和肺炎。另外，在2型T淋巴细胞反应占主要地位的病例中，患有肿瘤的个体不能产生抗肿瘤的免疫力，这就会在更大可能上加速肿瘤生长，并增加癌症患者机会感染。因此，本发明所提供的控制方法可用于治疗或预防烧伤病人、AIDS病人、癌症病人、脑炎病人、重伤或大手术后个体、经受压力的个体以及其他诱生出MCP-1的个体对机会性感染的感染抵抗力降低。
本发明还提供了一种感染性疾病的控制方法，所述方法通过抑制MCP-1的生成来控制由MCP-1引发的个体感染易感性，从而使个体获得感染抵抗力。在由于MCP-1(其可导致感染易感性增加)的原因而使得2型T淋巴细胞反应占主要地位的病例中，上述方法很有效，因为该方法可以改善这种增加的易感性。也就是当1型T淋巴细胞反应在被细菌等侵入的个体中被激活时，虽然细菌在体内的扩散被抑制了，但在2型T细胞反应诱导后，2型T细胞生成的IL-4和IL-10抑制了1型T细胞的诱导或1型T细胞反应效应细胞(如巨噬细胞、NK细胞或细胞毒T细胞)的功能，机体仍难以摆脱那些导致感染恶化的细菌。由于MCP-1诱导2型T淋巴细胞，抑制MCP-1生成的方法就可应用于那些需要增强对细菌感染的抵抗力的病例。另外，由于2型T淋巴细胞降低了机体对病毒和霉菌感染的抵抗力，上述方法同样可应用于需要增加病毒和霉菌感染的抵抗力的病例。
虽然处在单核细胞或T淋巴细胞迁移增高的、或IL-10生成增高状态的哺乳动物的疾病都被包括在本发明所述抑制MCP-1生成方法的具体适用目标内，但这类疾病中的特例包括炎症和感染抵抗力的减低。
另外，本发明所提供的抑制MCP-1生成的方法也可以应用于那些已经诱导生成MCP-1的个体中，例如烧伤病人、AIDS病人、癌症病人、脑炎病人、重伤或大手术后个体以及经受压力的个体。
在本发明所提供的抑制MCP-1生成的方法中，甘草甜素及其衍生物的优选使用形式是本申请涉及的发明中的药物组合物形式，即含有甘草甜素及其衍生物和任意在药学上可以接受载体的形式，其中甘草甜素及其衍生物的含量可有效治疗和预防本申请所意图针对的疾病或状态(或者控制造成所述疾病或状态的作用机理，如促进单核细胞的迁移)。
本发明的药物组合物中可以单独含有甘草甜素及其衍生物，或与任意在药学上可以接受的载体混合。另外，本发明的药物组合物可以按照常规方法制成各种形式，比如片剂、针剂、胶囊、喷雾剂、锭剂以及粉剂。
此外，在本发明的药物组合物中任意包含的“在药学上可以接受的载体”指的是基本不抑制所述组合物中活性成分的功能的物质，更具体地，包括固体稀释剂或填充剂、无菌水性溶剂及各种无毒有机溶剂。
尽管根据本发明获得的用于控制单核细胞迁移增强的MCP-1生成抑制剂或药物组合物可以通过口腔、直肠、局部、皮肤、静脉内和肌肉等途径施用给哺乳动物，但适宜的给药途径应由临床医生根据所治疗的病人的体重和健康状况以及病情来决定。
根据本发明的MCP-1生成抑制剂的一般给药剂量为每天每公斤体重0.1-100mg。
实施例实施例1甘草甜素及其衍生物在MCP-1生成实验中的抑制效果试验方法采集健康个体的外周血并用Ficoll-Hypaque分离出含有外周血单核细胞(PBMC)的部分。
将单核细胞以1×106细胞/ml的浓度接种于96孔平底微量滴定板上。用含有10％FCS和抗生素(青霉素和链霉素)的RPMI1640培养基培养。将细胞置于37℃、5％CO2浓度的培养箱中培养。
每孔加入20ng/ml的IL-10(获自PeproTech)以刺激细胞，并在除对照孔以外的所有孔中加入浓度为100μg/ml的甘草甜素或其衍生物溶液，继续培养24小时。
在加入甘草甜素后，收集培养上清液，用ELISA法定量测定培养液上清中MCP-1的含量。ELISA法采用商购ELISA试剂盒(商品名人类MCP-1 BD OptEIAELISA试剂盒)。
结果结果显示于图1中。尽管加入IL-10的样本中MCP-1的生成增加了，但甘草甜素(甘草酸单铵，在图2-4中甘草酸单铵被描述为甘草甜素)及其衍生物被确切证明具有抑制由IL-10诱导的MCP-1生成的效果。
实施例2甘草甜素抑制烧伤病人的外周血单核细胞的MCP-1生成试验方法采集烧伤病人的外周血(覆盖45-78％体表面积的三度烧伤病人)，用Ficoll-Hypaque分离外周血单核细胞。1×106细胞/ml的外周血单核细胞用100mg/ml的甘草甜素刺激24小时。此外，源自健康受试者的单核细胞在相同条件下培养以作为对照。最后用人MCP-1 BD OptEIA ELISA试剂盒测定培养液上清中MCP-1的含量。
结果结果显示于图2中。图中明确显示健康受试者的单核细胞没有生成MCP-1，而与之相反的是，烧伤病人的单核细胞显著生成了MCP-1。甘草甜素可以有效的抑制烧伤病人单核细胞MCP-1的生成。
实施例3甘草甜素抑制AIDS病人的外周血单核细胞的MCP-1生成试验方法采集AIDS病人的外周血，用Ficoll-Hypaque分离出外周血单核细胞。单核细胞以1×106细胞/ml的密度接种于96孔平底微量滴定板上，培养液与实施例1中的相同。在37℃、5％CO2的培养箱中培养细胞。
除对照孔以外的其它每孔中加入终浓度为0.1-100ug/ml的甘草甜素溶液，继续培养24小时。
在加入甘草甜素后，收集培养上清，用ELISA法定量测定培养液上清中MCP-1的含量。ELISA法采用商购ELISA试剂盒(商品名人类MCP-1 BD OptEIA ELISA试剂盒)。
结果结果显示于图3中。图中显示源自AIDS病人的单核细胞中，测得的MCP-1生成有所增加。而在源自AIDS病人的单核细胞中加入终浓度为0.1-100ug/ml的甘草甜素溶液并培养时，MCP-1生成受到了抑制。
实施例4甘草甜素对单纯疱疹I型病毒感染的作用试验方法正常小鼠和MCP-1敲除的小鼠15％以上的体表面积三度烧伤一天后，腹膜内感染剂量为1×101-1×106pfu/kg体重的HSV-1病毒。作为对照的正常小鼠也在相同条件下感染病毒。另外，对正常小鼠在感染前2小时和感染后12及24小时经皮下给予50ng/鼠的MCP-1。对烧伤小鼠在感染前2小时和感染后12及24小时经皮下给予10μg/鼠的抗MCP-1单克隆抗体。
结果结果显示于图4中。图中显示烧伤小鼠和MCP-1给药小鼠对HSV-1的易感性比正常小鼠的易感性高100倍。另一方面，给予抗MCP-1单克隆抗体和甘草甜素的烧伤小鼠对HSV-1的易感性可以恢复到与正常小鼠相同的水平。此外，在MCP-1生成被阻滞的MCP-1敲除小鼠中，其对HSV-1的易感性与正常小鼠相比没有观察到差别。
本发明所合成之化合物显示如下
根据本发明，MCP-1的生成可以被抑制。
权利要求
1.以下通式(I)表示的化合物在抑制MCP-1生成中的用途 [其中，R1代表氢原子或如下通式(II)或(III)所表示的基团 {其中通式(II)和(III)所表示的基团也可以是它们在药学上可接受的盐}；R2代表COOH或如下通式(IV)所表示的基团 或它们在药学上可接受的盐；X代表C＝O或CH；并且，点线合理地代表键]。
2.如权利要求1所述的用途，所述通式(II)，(III)和(IV)的在药学上可接受的盐为钠盐、钾盐、铵盐或其组合。
3.如权利要求1所述的化合物的用途，所述化学通式(I)所表示的化合物为下列化合物中任何一个齐墩果-11，13(18)-二烯-30-羧-3β-基-(2-O-β-吡喃葡糖醛酸基-β-D-吡喃葡糖醛酸二钠)；齐墩果-3β-羟基-11-氧-12-烯-30-酸钠；齐墩果-9(11)，12-二烯-3β，30-二醇-3β，30-O-二半邻苯二甲酸二钠；齐墩果-11，13(18)-二烯-3β，30-二醇-3β，30-O-二半邻苯二甲酸二钠；齐墩果-3β-羟基-11，13(18)-二烯-30-盐-3β-O-半邻苯二甲酸二钠；齐墩果-3β-羟基-11-氧-12-烯-30-盐-3β-O-半邻苯二甲酸二钠；或20β-羧基-11-氧-30-正齐墩果-12-烯-3β-基-2-O-β-D-吡喃葡糖醛酸基-β-D-吡喃葡糖苷酸单铵。
4.一种抑制MCP-1生成的方法，所述方法包括对单核细胞或T淋巴细胞迁移增高的、或IL-10生成增高的、且对上述增高需要进行抑制的哺乳动物，施用可以产生所述抑制作用的有效剂量的如权利要求1中所述的化合物。
5.一种控制感染的方法，所述方法包括通过抑制MCP-1的生成来控制由MCP-1引发的个体感染易感性，从而使个体获得感染抵抗力。
6.权利要求1中所述化合物在制备MCP-1生成抑制剂中的用途。
7.一种药物组合物，用于治疗或预防烧伤病人、AIDS病人、癌症病人，脑炎病人、重伤或大手术后个体、经受压力的个体或者其他诱生出MCP-1的个体对机会性感染的感染抵抗力降低，所述药物组合物含有权利要求1的化合物和任意药学上可接受的载体，所述化合物的剂量能够有效地治疗或预防所述个体对机会性感染的感染抵抗力降低。
全文摘要
本发明的目的在于提供甘草甜素及其衍生物在抑制MCP－1生成中的用途。本发明公开了一种抑制MCP－1生成的方法，该方法包括对单核细胞或T淋巴细胞迁移增高的，或IL－10生成增高的而且对上述增高需要进行抑制的哺乳动物，给予可以产生所述抑制作用的有效剂量的甘草甜素及其衍生物；以及产生上述抑制作用的药物组合物。
文档编号A61K31/473GK1504196SQ20031011566
公开日2004年6月16日 申请日期2003年10月27日 优先权日2002年10月29日
发明者铃木富士夫, 小林真纪子, 纪子, 宇都宫德一郎, 德一郎, 松本广淳, 淳, 武田美登田, 登田, 岩田盛美, 美 申请人:日本米诺发源制药株式会社