专利名称：新角蒽环聚酮类抗生素的制造方法
技术领域：
本发明属于抗生素技术领域，具体的讲，本发明是关于用委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)ISP5230(ATCC NO.10712)制造一系列新角蒽环化合物的方法。新角蒽环化合物是委内瑞拉链霉菌代谢产物，将其培养产物用乙酸乙酯提取经硅胶层析获得。纯化后的产物经核磁共振分析证明结构与已报到捷达霉素B(简称JB)类似，但本发明公开的化合物在结构上具有新的特征，生物活性试验表明，这些化合物能抑制G+菌和肿瘤细胞的生长。
背景技术：
抗生素是在低浓度下能够选择性地抑制或杀死微生物或肿瘤细胞的化合物。目前，国内外均采用化学或生物合成的方法生产，是人类治疗微生物、病毒感染和肿瘤等疾病的主要药物。
1991年Ayer等人发现，委内瑞拉链霉菌在半乳糖—异亮氨酸培养基中，37℃培养产生一种新的有颜色的抗生素，定名为捷达霉素(Jadomycin，简称JA)结构式如图1a所示。1993年Doull等人发现在上述培养条件下，生物代谢的主要产物以角蒽环聚酮化合物的糖基化形式存在，称之为捷达霉素B(简称JB)，其结构式如图1b所示。
研究表明，JB是由芳香聚酮衍生而来的角蒽环类化合物，在第二个环上因为一个异亮氨酸分子插入形成一个含氮五元杂环。生物活性试验证明，JB能抑制革兰氏阳性菌生长。
目前，在克隆合成基因簇的基础上，已完成JB代谢途径的部分研究。JB合成基因簇(jad基因簇)中，聚酮合酶基因(jadABC)及jadJMN等，负责聚酮碳链的合成；酮还原酶基因(jadE)和两个推测的环化酶基因(jadDI)编码碳链修饰及环化相关蛋白；三个氧化酶基因(jadFGH)可能与开环和环化后修饰有关；JadOPQSTUVX编码糖基合成和转移相关蛋白；另外，还有六个基因可能参与JB合成的调控，jadR1是一个途径特异性的应答调控因子，促进JB的合成，jadR2，jadR*和jadW1是负调控基因。委内瑞拉链霉菌的生长细胞可视为一个多酶催化体系，相互协调，合成捷达霉素类化合物。
专利WO/94/20061报道了JB化合物及其抗微生物活性，目前，国内外仅报道了上述的角蒽环聚酮抗生素是JB一种，而且没有抑制肿瘤细胞生长的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的角蒽环聚酮抗生素的制造方法，并且还提供由该方法得到的一组新角蒽环聚酮类似物，它们分别命名为新角蒽环聚酮JF，新角蒽环聚酮JT，新角蒽环聚酮JS等。它们结构式分别如图2所示。应当指出的是，从结构式中可以看出第二个环分别插入不同的氨基酸分子，可以获得具有不同结构的抗生活性的类似物，所形成的五元杂环上可以相应地带有不同氨基酸的侧链基团。经查新，上述的一组新的角蒽环聚酮抗生素为新化合物。生物活性实验表明，这些化合物的抗菌活性与JB相似或较强，此外还具有抑制肿瘤生长的作用，在国内外至今均未见有关报道。
本发明提供了一种利用生物合成的系列新角蒽环聚酮化合物在制备临床抗G+菌药物和肿瘤细胞的生长的药物中的应用。
新角蒽环聚酮类抗生素的制备方法涉及的步骤1.以委内瑞拉链霉菌ISP5230(ATCC NO.10712)为生产菌，在半乳糖—氨基酸的无机盐培养基中培养，培养基组成以水为基质(100ml)半乳糖1.8g，氨基酸30mM，MgSO4·7H2O 0.02g，KH2PO40.102g，K2HPO40.044g，NaCl 0.088g，CaCl20.0065g，ZnSO4·7H2O 0.4mg，CuSO4·5H2O0.018mg，MnSO4·H2O 2.7mg，硼酸2.6mg，四水钼酸铵1.7mg，pH 7.0--7.5。在上述培养基中所述的氨基酸可以是Phe、Ser、Thr及其它芳香族和杂环族类氨基酸的一种，加入不同类型的氨基酸，形成不同的产物。如前所述的新角蒽环聚酮类似物是在捷达霉素(Jadomycin)英文第一个字母“J”之后加上底物氨基酸的单字母符号来命名，例如，苯丙氨酸发酵产物命名为JF，苏氨酸发酵产物命名为JT，丝氨酸发酵产物命名为JS。
2.收集上述微生物发酵液的上清液，通过有机化合物常规提取的方法，常规方法包括利用化合物抗生素与杂质在溶解度、离子亲和力、吸附力、分子量等方面的差异进行提取制备新角蒽环聚酮类似物。这些方法可以单独使用，也可以配合离心分离、膜分离，有机溶剂萃取、离子交换或吸附，等方法使用。本发明的另外一个特点在于除上述一般制备步骤外，产物的纯化步骤可以简化为收集发酵液培养物，离心后用乙酸乙酯提取，提取物在硅胶板上纯化、有机溶剂溶解、旋转蒸发浓缩获得产物。
3.纯化后的产物经质谱和核磁共振测定分析，确定为角蒽环聚酮化合物，是JB的类似物，但在五元环上有以前没有报道过的侧链。
4.获得的新化合物经过抗菌、抗肿瘤细胞生长活性实验。与报道的JB活性相似，有明显的抗革兰氏阳性菌活性，本专利首次报道这类化合物的抗肿瘤细胞活性。
本发明的特点1.利用微生物的次生代谢合成抗生素，其工艺简便，周期短，成本低。
2.本发明生物法合成抗生素对环境无污染。
3.发明涉及的化合物是已公开的JB的类似物，但分子结构不同于已报道JB，这些化合物的抗菌谱与JB相似，至今还未见有相同的报道。本发明首次公开这些化合物的抗G+菌和抗肿瘤活性。
4.本发明涉及的化合物的角蒽环骨架与JB类似，但其侧链的特征未见报道，因此，本发明的抗生素的结构不同于现有专利WO 94/20061中公开的化合物的结构。
5.建立了在含有半乳糖和不同氨基酸的培养基中，用委内瑞拉链霉菌ISP5230(ATCC NO.10712)合成一系列角蒽环化合物的方法，为筛选新抗生素药物提供了新资源。
图1.JB的分子结构式图2.新角蒽环聚酮化合物的分子结构式新角蒽环聚酮JF，新角蒽环聚酮JT，新角蒽环聚酮新角蒽环聚酮JS。
图3.新角蒽环聚酮化合物高压液相图谱(313nm)新角蒽环聚酮JF，新角蒽环聚酮JT，新角蒽环聚酮新角蒽环聚酮JS具体实施方式
以下实例将对本发明作进一步说明，本发明的保护范围不受这些实例的限制。
实施例1新角蒽环聚酮抗生素JF的制备将50μl委内瑞拉链霉菌孢子悬液接种于100ml含酵母膏、麦芽糖和麦芽汁的培养基(MYM)中，27℃，200~250rpm震荡培养24小时作为种子备用。在250mL的三角瓶中加入100mL培养基，其组成(100ml)半乳糖1.8g，苯丙氨酸30mM，MgSO4·7H2O 0.02g，KH2PO40.102g，K2HPO40.044g，NaCl 0.088g，CaCl20.0065g，ZnSO4·7H2O 0.4mg，CuSO4·5H2O0.018mg，MnSO4·H2O 2.7mg，硼酸2.6mg，四水钼酸铵1.7mg，pH 7.0--7.5，8磅/30min灭菌。将培养好的新鲜种子，在无菌条件下，接种到上述三角瓶中，接种量为10％。27℃震荡培养6-9小时，加入6％乙醇刺激提高产物的量，继续培养40-48小时，培养液由微黄色变成暗红色停止培养，收集培养物。
离心(4000rpm)，收集上清，用1M盐酸调节pH至3.0--4.0，在分液漏斗中加入1/3发酵液体积的乙酸乙酯，充分混匀，室温下放置20min，待溶液分层后，收集上部乙酸乙酯。发酵液如此被反复提取三次，合并收集的乙酸乙酯提取液，放入蒸馏瓶中，在37-40℃的水浴中旋转蒸发浓缩，得到深红色的产物。
产物溶解于乙醇中，浓度为50-100μg/mL。取10-20μL点样于硅胶版(GF254)上，用不加乙醇刺激的发酵提取物和JB作参照物，干燥后在氯仿∶甲醇∶乙酸(95∶10∶0.2)的混合溶液中上行展开，展开剂上行至离边缘1cm处时，从层析缸中取出硅胶板，干燥后观察，由于制备的化合物带有颜色，层析斑点或条带在硅胶板(GF254)上可以看到。将所要的产物从硅胶板上刮下，浸泡在无水乙醇中，室温下放置30min，离心(5000转/min)，收集上清，反复提取三次，合并收集的乙醇溶液，旋转蒸发浓缩并在氮气存在的条件下将乙醇溶液风干，获得纯化的深红色的角蒽环聚酮化合物JF。
实施例2产物分析对实施例1中得到的纯化的角蒽环聚酮化合物JF，进行如下分析1. 313nm波长下，高压液相色谱检测该化合物的滞留时间为12.7min，JB的滞留时间约15.4min(图3)。
2.电喷雾电离源(ESI)高分辨质谱确定分子式为C33H30NO9，分子量为583。正脉冲大气压化学电离源(APCI)谱示584[M+H]+，540[M+H-CO2]+，454[M+H-digitoxose]+，410[M+H-digitoxose-CO2]，306[M+H-digitoxose-C9H8O2]。
3.红外谱示，IR(KBr)v＝3468(br，m)，2928(br，w)，1804，1684(sh，s)，1777，1516(sh，w)，1454(sh，m)，1381(sh，w)，1273(sh，w)，1211(sh，s)，1136(sh，s)，970(sh，m)843(sh，m)，804(sh，m)，726(sh，m)cm-1。
4.紫外谱示，UV/Vis(Methanol)λmax(ε)＝497(1000)，393(1400)，310(9300)，289(sh)，239(9100)，211(13000)nm。
5.1H-NMR谱(400MHz，d6-丙酮，TMS)和13C-NMR谱(100MHz，d6-丙酮，TMS)分析表明，该化合物有两种可互变的构型，如图2所示，分别为结构I(1S，3aS；60％)，结构II(1S，3aR；40％)，结果见表1。
表1.新角蒽环聚酮化合物JF核磁共振结构I(1S，3aS；60％)
结构II(1S，3aR)40％
e可变，*高级效应实施例3_抗菌活性实验例2中已确定的新聚酮角蒽环化合物进行抗菌活性实验。待测菌株的孢子悬浮液1ml(105CFU)，加入19ml 0.6％的软琼脂，混匀，铺成平板，将含有100ug JB类似物的纸片平贴在平板上，培养后测抑菌圈直径。由下列表2可见，新角蒽环化合物对格兰氏阳性菌具有较强的抑制作用。
表2.部分新角蒽环聚酮化合物的抗菌活性
实施例4新角蒽环聚酮化合物对肿瘤细胞生长的影响用MTT法试验了新角蒽环化合物对肿瘤细胞生长的影响，结果见下列表3。由见表3可见，这些角蒽环化合物能抑制瘤细胞的生长，其中JF有较好的抗肿瘤活性，抑制50％肺癌细胞生长的抗生素摩尔浓度(IC50)为12.4μm，抗肿瘤活性高于JB，JB为21.8μm。
表3.部分新角蒽环聚酮化合物的抗肿瘤活性
注IC50[μm]抑制50％肿瘤细胞生长的抗生素摩尔浓度。
实施例5合成系列角蒽环聚酮化合物。
在同实施例1的培养基中加入一种新氨基酸进行微生物发酵，如加苏氨酸，丝氨酸或其它芳香族和杂环族氨基酸之一取代苯丙氨酸。分别按照实施例1中的方法进行微生物发酵培养和提取、纯化抗生素；按照实施例2中的方法进行产物分析，证明JT，JS具有如图2所示的结构；按照实施例3中的方法检测抗菌活性；按照实施例4中的方法检测对肿瘤细胞生长的影响。由于在培养基中加入不同类型的氨基酸，结果获得委内瑞拉链霉菌的代谢产物不同，得到不同分子结构的新角蒽环聚酮化合物新角蒽环聚酮JT，新角蒽环聚酮新角蒽环聚酮JS。它们的高压液相色谱检测的滞留时间不同(图3)。上述不同氨基酸合成的新角蒽环聚酮化合物其结构如图2所示。
权利要求
1.一种新抗菌素新角蒽环聚酮类似物的制造方法，该新角蒽环聚酮类抗生素具有如下式所示的结构式 其中R代表Phe、Ser、Thr及其它芳香族和杂环族类的氨基酸的侧链，该方法包括在半乳糖-氨基酸无机盐培养基中先培养委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)ISP5230 ATCC NO.10712，再从其培养物的上清液中通过有机化合物常规提取的方法，利用化合物抗生素与杂质在溶解度、离子亲和力、吸附力、分子量的差异、离心分离、膜分离，有机溶剂萃取、离子交换或吸附进行提取制得新角蒽环聚酮类似物。
2.根据权利要求1所述的方法，收集培养物上清液，离心后用乙酸乙酯提取，提取物在硅胶板上纯化、有机溶剂溶解、旋转蒸发浓缩制得新角蒽环聚酮类似物。
3.根据权利要求1所述的方法，半乳糖-氨基酸无机盐培养基其组成以水为基质100ml半乳糖1.8g，氨基酸30mM，MgSO4·7H2O0.02g，KH2PO40.102g，K2HPO40.044g，NaCl 0.088g，CaCl20.0065g，ZnSO4·7H2O0.4mg，CuSO4·5H2O 0.018mg，MnSO4·H2O 2.7mg，硼酸2.6mg，四水钼酸铵1.7mg，pH7.0-7.5，上述氨基酸为Phe、Thr、Ser及其它芳香族和杂环族氨基酸的一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所示的新角蒽环聚酮类抗生素结构式中的R为丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸取代或其它芳香族和杂环族氨基酸其中之一的侧链基团取代。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所示的新角蒽环聚酮类抗生素结构式中的R为丝氨酸取代的为新角蒽环聚酮JS；苏氨酸取代的为新角蒽环聚酮JT；苯丙氨酸取代的为新角蒽环聚酮JF.。
6.根据权利要求5所述的其新角蒽环聚酮JF、新角蒽环聚酮JT、新角蒽环聚酮JS分别具有如图2所示的结构。
7.根据权利要求1所述的的方法，其中所示的新角蒽环聚酮类抗生素结构式中的R为其它芳香族和杂环族氨基酸其中之一的侧链基团取代的新角蒽环聚酮化合物，除去它们依各自的氨基酸取代R外分别具有如权利要求1所示的相同结构。
8.根据权利要求1所述的方法在制备临床抗G+菌药物和肿瘤细胞的生长的新角蒽环聚酮药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及的一组新角蒽环聚酮抗生素由委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)ISP5230(ATCC no.10712)在半乳糖－氨基酸的培养基中，27－30℃培养，外界刺激的条件下产生。化合物用乙酸乙酯提取，经硅胶层析获得。纯化后的产物经核磁共振分析证明结构与已报导捷达霉素B(简称JB)类似，但本发明公开的化合物在结构上具有新的特征，生物活性试验表明，这些化合物能抑制G
文档编号A61P31/00GK1629173SQ200310122330
公开日2005年6月22日 申请日期2003年12月16日 优先权日2003年12月16日
发明者杨克迁, 郑舰艇, 陈义华, 寇秀芬 申请人:中国科学院微生物研究所