一种双歧杆菌及其应用的制作方法

专利名称：一种双歧杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物及其应用，特别是涉及一种双歧杆菌及其应用。属于生物制品领域。
背景技术：
现在双歧杆菌产品的产品已经达70多种，本发明人经过长期的筛选和培育，得到了本发明的双歧杆菌，经过本发明中产品双歧杆菌制备的一系列产品都具有对人体十分有益的效果。

发明内容本发明的目的是得到一种双歧杆菌(Bifidobacterium longum)；本发明的另一目的是本发明产品双歧杆菌(Bifidobaterium longum)的应用。
本发明双歧杆菌的保藏号CGMCC No.1085。保藏日期2004年1月6日。保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地点中国.北京.中关村。
本发明产品的确具有相比于现有技术更好的和更多的功能。在耐酸耐胆盐、抑制细菌等很多方面具有特别的优势。
本发明的技术方案如下胶囊剂的制备方法胶囊剂是双歧杆菌制品的一种重要剂型。胶囊剂有其特点生产工艺较简单，运输和携带方便，可掩盖制剂的不良气味，可有不同颜色便于区别，药物的生物利用率高，因为制造时不用加粘合剂，也不施压，因而易于分散，可以用不透明胶囊壳减少双歧杆菌受光、热和空气的影响。其缺点是水剂和吸湿性强的制剂不宜直接制成胶囊。此外，胶囊不适于儿童服用。
胶囊有胶囊壳填装制剂组成，胶囊壳有许多种，选择适合的囊壳对双歧杆菌制剂非常重要。
(一)空胶囊的选择胶囊剂分硬胶囊、软胶囊和肠溶胶囊。硬胶囊剂是将益生军剂制成粉末或小颗粒填充与空胶囊中，囊壳称空心胶囊或空胶囊。空胶囊有明胶、增塑机、防腐剂、着色剂和遮透剂组成，经溶胶、蘸胶、干燥、脱模、截割及套合等工序组成。由于着色剂不同，可制成不同颜色的囊壳，还可用印字机在囊壳上印字。软胶囊系指一定量的液态制剂密封于球形或椭圆形的软质囊材中，囊材由明胶、甘油或其他适宜的药用材料制成。肠溶胶囊系指囊客不溶于胃液，但能在肠液中崩解释放出胶囊中的内容物，有硬胶囊或软胶囊剂。肠溶胶囊过去用甲醛与明胶制造，甲醛与明胶起氨缩醛反应，使明胶分子互相交联，形成甲醛明胶，分子中已无氨基，失去与酸结合能力，故仍含羧基，故能在碱性肠液中溶解，使内容物释放出来。由于这种囊材具有不稳定性。
本发明产品用PVP作底衣，再CAP、蜂蜡等进行外层包衣，可进一步改善质量。
空胶囊的规格由大到小可分为000、00、0、1、2、3、4以及5号等八种规格，一般常用的是0～5号，使用时应根据双歧杆菌剂的密度、颗粒大小和所占容积来选用相应的最小型号胶囊。
(二)胶囊的填装一般小量制备时可以用手工填装，大规模工业化生产时则用自动填充机填装。目前自动填装机可分为四种类型，适合于不同物理性状的制剂填装。制剂的流动性是直接影响填充物的物理性状，I、II型填充机因为有机械措施适合于填装流动性较好的制剂；III型适合于自由流动的粉剂，为改善流动性，可添加低于2％的润滑剂如乙二醇酯、聚硅铜、二氧化硅、硬脂酸盐、硬脂酸、滑石粉、甲基纤维素以及淀粉等，选用原则是不影响双歧杆菌的存活率及其检测；IV型机适于聚集性强的针状结晶和具吸湿性的制剂，可加矿物油、食用油或微晶纤维素等，制成小颗粒再填装。双歧杆菌胶囊填装的全过程要求在无菌条件下进行，以减少二次污染，层流室的相对湿度要求低于40％。
(三)胶囊剂的包装与储藏双歧杆菌胶囊包装有其特殊要求，特别是像双歧杆菌等厌氧菌，首要条件是要尽可能避免与空气接触减少氧的作用。因此，包装材料应选用不透气材料，并是用真空或充氮气包装。在储藏中也和其他胶囊剂一样，易受环境温度和湿度的影响，应在阴凉干燥条件下储藏。当温度超过室温，相对湿度大于45％时，双歧杆菌易死亡，胶囊剂变软发粘，膨胀，真菌容易滋生，若长期在高湿度下储藏，则崩解时间也会延长。
双歧杆菌片剂制备方法目前片剂也是双歧杆菌制品的一大类，它是用双歧杆菌剂加适当辅料，通过制剂技术制成的片状制剂。片剂具有剂量准确，质量稳定(与光、空气、水分等接触面减小之故)，服用和携带方便，便于识别以及成本低廉等优点。其缺点是儿童不易吞服，储藏条件不当时易变质。
(一)口服片剂的制备片剂制备即是将菌粉与合适的辅料混合均匀，使其具有良好的流动性和可压性，然后通过压片机机械压成片。原料的流动性是为了使混合物顺利而以准确的剂量流入模孔，使片剂大小一致。对双歧杆菌片剂而言，良好的可压性至关重要，可压性越好，压片时所需压力就越小，即可在适度的压力下压成硬度符合要求的片剂，因为制片时的压力直接影响片剂中菌的存活率。
压片分干法压片和湿法制粒压片。干法压片又分干法直接压片和干法制粒压片。干法压片适合于大多数双歧杆菌片剂制备。对流动性和可压性好的混合物可以直接压片，而有的则需先行制粒，即加入黏合剂先制成大片再粉碎成颗粒后制片。湿法制粒压片是将混合物进行湿法制粒再压片。湿法制粒有几种方法一是将混合料制成软材，过筛或以其他方式制粒，干燥后压片；二是流化喷雾制粒，即进一步制粒压片和转动制粒压片等。制粒的目的除改善流动性外，还可增大物料的紧密度，逸出空气，减少片剂的松裂现象，避免因粉末分层而影响片剂中的剂量的准确性，避免细粉飞扬及黏附于冲头表面而造成黏冲和拉模现象。湿法制粒过程中烘干阶段对一些不耐热和氧气的菌剂影响较大，宜慎用。多数双歧杆菌可采用先将辅料制成恐怖颗粒，再与菌粉混合均匀后压片的方法制片，以减少制粒过程中菌的死亡。
(二)外用片剂——泡腾片的制备用于治疗阴道疾病或改善阴道微生态平衡的双歧杆菌制剂，可制成泡腾片。这种片剂放入阴道后，与阴道液体发生反应即产生大量气泡，泡腾片崩解，使双歧杆菌均匀的分布到阴道黏膜表面而发挥作用。
泡腾片是由双歧杆菌菌粉和泡腾崩解剂组成。泡腾片中的酸碱系统与水相互反应，生成二氧化碳气体而加速片剂崩解溶解和形成泡沫。崩解剂所用的酸和碱应分别制粒，在压片前与菌粉混合立即压片。最常用的酸和碱系统是枸橼酸和酒石酸的混合物，以及碳酸盐或碳酸氢钾、甘氨酸碳酸酸、钠以及倍半碳酸钠等。
泡腾片要求产生的气泡细小而持久，以达到双歧杆菌充分分散。泡腾片应采用不透气不透水，而且避光的包装材料进行包装，以防止吸潮变质。
双歧杆菌冲剂制备方法冲剂也是双歧杆菌制品的一大类。冲剂生产工艺简单，不需要复杂的设备，携带和服用方便。冲剂以菌粉、填充剂、稳定剂和调味剂等组成。冲剂可分为可溶性冲剂和混悬性冲剂，双歧杆菌冲剂多为后者。双歧杆菌冲剂主料为干燥菌粉，辅料为奶粉以及淀粉等，根据产品要求还可加入一些甜味剂、香精等调味剂，有的还加入一些营养强化剂如维生素等。在双歧杆菌冲剂中还可以加入低聚糖等双歧因子。经充分混合制成颗粒或粉剂，用复合铝膜真空包装，按所含菌数有不同规格，每克含菌数从几亿到百亿。
双歧杆菌冲剂在日本和欧洲早已形成商品，国内也已有类似产品上市。在保存期内如何保持产品中的活菌数是及其重要的问题，因为活菌数是这累产品的唯一指标。这类产品服用时不能用开水，只能用低于50℃温水冲服。
双歧杆菌口服液类产品制备方法口服液也是双歧杆菌制品的一大类。20世纪90年代中出现过许多产品，并有较大的市场份额，但由于种种原因，近年一些产品销量锐减。尽管如此，我国双歧杆菌口服液的兴起，对我过消费者认识和了解双歧杆菌及其保健功能起到了积极作用，促进了双歧杆菌制品的研究和开发。随着基础研究和产品开发的深入，实事求是的宣传其功效，消除认识和某些理论上的偏差，双歧杆菌制品包括双歧杆菌口服液仍将有光明的前景。
双歧杆菌口服液有多种配方，有含双歧因子的，有加入食药兼用的中草药的，也有含强化营养素的，等等。如系保健食品类口服液，其配方原料必须是食物和卫生部已批准公布的食药兼用的中草药，不得随意添加其他药物。营养素也要按规定的量添加。
双歧杆菌口服液的生产工艺取决于口服液的类型。上述第一类口服液工艺与一般的液态发酵工艺相比，只不过是在发酵结束后增加灌装工艺，灌装要求在无菌条件下进行，因此，发酵罐通过管道与灌装设备密封连接，灌装车间要求有一定的洁净度，一避免污染。第二类产品则分两部分一是双歧杆菌的培养和菌剂制备；二是按配方配制口服液基料，然后将二者按要求混合，再行灌装。
双歧杆菌发酵果蔬汁双歧杆菌发酵果蔬汁是一类新型制剂，它是利用营养价值高的某些精制果蔬汁，经合适的双歧杆菌发酵而制成的液态产品，其优点是兼有双歧杆菌和代谢物以及果蔬汁高营养的有益作用，可以不添加任何人工成分，达到全天然的要求。
原料选择胡萝卜应选择红色、肉质细嫩、纤维少、无硬心的优质品种。
胡萝卜和番茄等果蔬均可用本发明的双歧杆菌发酵，制成双歧杆菌发酵果蔬汁。
双歧杆菌果蔬汁发酵是在发酵罐内进行。发酵过程中需定时取样检测发酵液的PH值和菌数，以及时了解发酵情况。发酵终点的判别标准，一是PH值，一般PH值达到4.2～4.5；二是活菌数达到108CFU/ml以上。根据双歧杆菌产品的特定要求，发酵结束后应立即冷却到室温以下，然后在无菌条件下迅速灌装冷藏。
双歧杆菌微胶囊制剂双歧杆菌制品质量最重要的标志之一是活菌数，特别是对那些单纯以活菌数为唯一指标的产品来说更为重要。双歧杆菌中应用最多的是双歧杆菌和乳酸菌等，它们在产品保存中极易失活，如何延长保存期成了这类产品的一大难题。国内外都在试图通过基因改造或耐酸耐氧菌株的筛选等来提高菌种对酸和氧的抵抗能力；在工艺技术上，通过微胶囊使菌与氧和酸等不利因素隔离，以提高菌的存活率。
1.囊心和囊材的制备工艺 双歧杆菌菌种用液体或固体培养基培养，收集和洗涤菌体，然后加入淀粉、奶粉或其他保护剂混合成悬液或冷冻干燥成菌粉；将合适的囊材配成溶液，经灭菌后与囊心混合均匀。固化剂通常采用0.1～0.3mol/L的氯化钙溶液灭菌后冷却待用。
2.微胶囊的制备工艺 将心材和囊材的混合物挤压成细滴或喷入固化剂溶液中，缓缓搅拌固化，然后收集微胶囊，用缓冲液洗涤三次即得湿的双歧杆菌微胶囊。
湿的微胶囊可直接用于生产各种制剂及添加到食品饮料中。干燥后的微胶囊除可加入食品饮料外还可制成胶囊、片剂等剂型，其保存期更长。
湿微胶囊的干燥有两种方式，一是在湿胶囊中加入一些填充剂如淀粉、碳酸钙、滑石粉等拌匀，然后在不高于40℃下烘干；二是用喷雾干燥法进行干燥。喷雾干燥的优点是可以以比较快的速度使样品干燥，其缺点是双歧杆菌的死亡率较高。当进风温度为140～160℃，随排风温度升高，死亡率也升高，70～73℃是菌体对温度最敏感的阶段，而从72℃到82℃则死亡率变化不大。从存活率的角度考虑最好的温度是68～70℃，但此时得到的样品水分过高，一般选择80℃左右较为适宜。在这样的排风温度下，如果囊材配方选择较好，则可得到较高的存活率。在优化条件下，微胶囊喷雾干燥后，乳酸菌的存活率为20％左右。影响微胶囊在喷雾干燥中菌的存活率的主要因素是喷雾是进出风温度和囊材的配方。双歧杆菌由于对氧敏感，不宜用喷雾干燥法进行干燥。干燥微胶囊中菌的存活率与保护剂、水分含量等有密切关系。
Selmer-Olsen等(1999)在瑞士乳杆菌微胶囊的研究中，将培养液在低于5℃下离心收集菌体，将菌体分别悬浮在核糖醇、三甲氨乙内酯、甘油及脱脂奶粉复原乳中，与热处理过的海藻酸钠溶液混合，滴入缓慢搅拌下的乳酸钙溶液中，搅拌30min，即得到湿的乳酸菌微胶囊，用灭菌Ringer液漂洗，去除多余的钙离子和游离细胞，在2～3℃下保存。湿的微胶囊通过流化床进行干燥，流化床进风温度为5℃，相对湿度55％±2.5％，微胶囊的直径约3mm。在4保护剂中，核糖醇和脱脂乳保持菌体存活率相对较高，与起始菌数比，分别为71％和57％。其储藏过程中的存活率也最高。存活率随微胶囊内的含水量增高而下降。
双歧杆菌微胶囊的质量评价双歧杆菌微胶囊的质量评价包含三个方面，即包埋效率、包埋产率及储藏期间菌的存活率即稳定性。包埋效率是指微胶囊内外菌存在的数量，微胶囊内部活菌数越高说明包埋效率越高；包埋产率是指产品中的活菌数与微胶囊制备时加入的菌数之比；而稳定性是以在一定储藏条件下一定时间后菌体的存活率来表示，菌的存活率越高说明稳定性越好。
双歧杆菌的微胶囊化是解决产品保存性的重要技术之一，应进一步把菌种选育、新囊材和保护剂的选择以及胶囊加工技术结合起来，以提高双歧杆菌在储藏期间的存活率，得到更理想的双歧杆菌制剂。
双歧杆菌乳粉利用各种乳酸菌经过培养发酵剂制成的各种酸乳制品，具有很高的营养价值和特殊的医疗作用。制品中所含的蛋白质更容易被人体消化。使用酸乳制品对人体具有很高的医疗作用，除能促进人的消化作用和加强新陈代谢作用外，对于肠胃病、赤痢、腹泻、便秘等消化系统病症，有特殊的疗效。由于乳酸菌的代谢作用能产生乳酸和抗生物质，可以抑制大肠内腐败微生物的繁殖和生长，改善肠道中微生物群。
婴儿如果长期喂哺以普通乳粉，则由于缺乏必要的乳酸菌，会对婴儿的消化及发育引起不良影响；如果哺育以经过纯培养发酵剂制成的酸乳制品，则可以治疗和改善婴儿的消化机能，促进消化作用，加强新陈代谢。
酸乳制品由于所使用的乳酸菌不同而有很多种类，双歧杆菌乳是医疗价值最高的一种，所使用的乳酸菌为双歧杆菌。这种菌在肠内较保加利亚乳杆菌具有更高的活力。
使用双歧杆菌纯培养发酵剂制造双歧杆菌乳，目前各国已很普遍。这种双歧杆菌乳是一种均匀柔腻的乳状体，唯不便长期保存和运输。因此，最近在我国开始制造含有这种双歧杆菌的乳粉，这样，不仅便于贮存和运输，而且原菌的活力可在长时期内不致减弱。
用本发明产品双歧杆菌，制备得到的双歧杆菌乳粉不但能保持双歧杆菌对人体的作用，而且便于贮存和运输。
还可以用本发明双歧杆菌制备一种含有这种双歧杆菌的纯培养发酵剂片，可以保存更长的日期原菌的活力不会减退，携带方便、使用简单。
无论双歧杆菌乳粉或双歧杆菌发酵剂片，其制造方法，有下列三种1.将纯培养的双歧杆菌粉末(可以采用真空冷冻升华干燥法制备)与良质乳粉在无菌室内成分混合、包装、进行无菌操作。这种方法制造的双歧杆菌乳粉质量很好。
2.采用真空冷冻升华干燥法。即将纯培养的双歧杆菌的脱脂乳培养液与经过杀菌浓缩的牛乳成分混匀，再进行真空冷冻升华干燥。这种方法制造的双歧杆菌乳粉质量极高。
3.喷雾法。即将纯培养的双歧杆菌的脱脂乳培养液与经过杀菌浓缩的牛乳成分混匀后喷雾干燥。这种方法制造的双歧杆菌乳粉中原菌的含量，较前两种方式为低。但如果控制得当，仍能得到很好的制品，而且可使用生产普通乳粉的全套设备，不须另外增加新设备，投资较少。
双歧杆菌乳粉的产品指标，一般应达到下列要求。
水分(不超过) 4％溶解度(不低于) 98％杂质度(不超过) 2ppm双歧杆菌含量(不低于) 600万/克乳粉复原后在40～42℃保温凝固时间(不超过) 10小时凝块均匀稠密、无乳清分离、无气泡产生、味纯而酸、无其他异味显微镜检查不发现其他杂菌双歧杆菌酸奶工艺流程如下混合料、均质、杀菌、冷却，然后加入香料，小卖容器灌装、培养、冷却，得到凝固型酸牛奶；
混合料、均质、杀菌、冷却，然后加入发酵剂，加入发酵罐培养、搅拌、冷却，再加入果料、香料、小卖容器灌装，得到搅拌型酸牛奶；双歧杆菌乳饮料a、液体酸牛乳型双歧杆菌饮料发酵混合料是用浓缩脱脂乳或脱脂乳粉强化的脱脂乳，必要时添加葡萄糖等促进乳酸菌发育的物质进行配置。混合料在90～95℃温度下加热杀菌50～60分钟，冷却到37℃；然后在其中添加2～3％的双歧杆菌发酵剂，在35～37℃下培养，使酸度达到1.5～2.0％。一般培养时间以24小时以内为好，这时菌数达到108CFU/ml。培养后若提高菌数，以稍降培养温度为宜。培养后的混合料应立即冷却，直到使用时为止保持温度在10℃以下。
另外，将作为辅料的砂糖、稳定剂、色素等溶解配成糖浆，经80～90℃加热杀菌10～30分钟后冷却到10℃以下。稳定剂用少量的水溶解，同时用机械强力搅拌，充分分散后加热溶解。
将发酵乳与糖浆混合，必要时添加柠檬酸调节酸度；添加香料后，用9.8～14.72兆帕的压力均质，制成发酵原液；加一定量的冷却水稀释，最后把3～5℃的制品灌装于容器中冷藏。
b、果汁型双歧杆菌饮料按配方量将果汁、蔗糖、果肉酱色素等混合溶解，必要时添加稳定剂，柠檬酸后，经80～85℃、10～15分钟或90～95℃、15秒钟杀菌后冷却到3～5℃。添加另外培养的乳酸菌发酵剂充分混合，灌装于容器中后冷藏。
发酵剂的添加量，按菌种、菌数、活力等各异，通常5％以内已足够。如果发酵剂的添加量过多，则产生酪蛋白沉淀，降低商品价值。
双歧杆菌冰激凌用常规的方法得到冰激凌，在分装之前加入本发明活性双歧杆菌菌粉或本发明双歧杆菌活性发酵液，搅拌后即得到双歧杆菌冰激凌。
原料的成分与成分值见下表
monomer)，交联剂(Cross-linker)、聚合引发剂(Photo-initiator)作为夹持在上述基板1、2之间的物质的结构。
更具体地说，在本具体例子中，作为支持在上述基板1、2之间的物质(即构成上述介电性物质层3的物质)，在上述化合物1-1(30重量％)，化合物1-2(40重量％)和化合物1-3(30重量％)构成的负型液晶性混合物(1)中，添加手性试剂“S811”，调整手性试剂添加浓度为10重量％的添加手性液晶材料(以下称为添加手性液晶材料(5))中，作为液晶单体，使用由下述结构式(23)
表示的化合物(50重量％)和与用下述结构式(24)
表示的化合物(50重量％)的等量(等重量)混合物“UCL001”(商品名DIC(大日本化学)，作为交联剂用下述结构式(25)
表示的“RM257”(商品名，Merck公司制的ジワクリ-ト单体)，作为聚合引发剂，用下述结构式(26)
表示的“DMPAP”(2，2-二甲氮基-乙-戊基乙酰苯，Aldrich公司制)；按下述表2所示比例(组成)混合的混合物。
(表2)
<p>表2与一个网页进行交互式通信的笔的概述
这个系统维持每一个笔的一个当前选择。这个选择简单地包括在背景字段中最近被捕获的笔画。在一个非激活时间后，这个选择被清除，以确保可预测的行为。
在每一个字段中被捕获的原始数字墨水被保留在这个网页服务器上，并且当这个表格被提交给应用时被与表格数据一起可选地进行传送。这允许这个应用能够询问原始数字墨水，当它对这个初始的转换有怀疑时，例如手写文本的转换。例如，这可以包括在应用层上对没有通过特定的、与应用相关的一致性检查的表格进行人为干预。作为这个的一个扩展是，一个表格的整个背景区域可以被指定为一个绘画字段。然后，这个应用可以根据在表格的明确字段外出现的数字墨水来决定将这个表格路由到一个人工操作员，假设这个用户可能已经在这些字段外指出了对已经填充的字段的修改。
图38显示了处理相对一个网页的笔输入的过程的一个流图。这个过程包括从这个笔接收(在884)一个笔画；标识(在885)笔画中的这个页面ID 50所涉及的页面实例830；检索(在886)这个页面描述5；标识(在887)这个笔画与其区域58有交叉的一个格式化部件839；判断(在888)这个格式化部件是否与一个字段部件相应，并且如果是就将所<p>氮气流速20ml/min进样体积2μl(一)培养基上清液中胆固醇含量的测定方1.将1.0ml的菌悬液接种到装有10ml MRS液体培养基的试管中，同时用1ml灭菌生理盐水做对照；2.加入1.0ml胆固醇溶液(1.6)；3.37℃培养10小时后，4000*g离心10分钟，收集上清；4.皂化向一具塞试管中加入0.1ml上清，0.3ml 33％KOH，3ml 95％乙醇，混匀后60℃水浴15分钟，然后迅速降至室温；5.萃取加入5ml正己烷，3ml蒸馏水，混合震荡1分钟。转移1ml正己烷层到容量瓶中待测。
(二)降低发酵乳制品中胆固醇含量实验1.将菌悬液1ml接种到100ml均质原料乳中；2.在37℃培养箱中培养4-6小时；3.待乳凝固后取出，放入冰箱中冷藏备用；4.样品处理方法及检测方法准确称取5g样品(乳50ml)于皂化瓶中，然后加入25ml 50％KOH溶液和25ml 95％乙醇，连接冷凝管，水浴回流皂化30分钟。
迅速冷却皂化液至室温，然后将皂化液全部移至250ml分液漏斗中，加入50ml石油醚，振摇2分钟后萃取，静止分层；放出水相于另一分液漏斗中，再分别用50ml石油醚，按上述方法萃取水相两次；合并有机相，用蒸馏水洗至中性后，再用无水硫酸钠干燥。
在旋转蒸发器上将石油醚蒸干，最后用1ml正己烷定容。
将萃取后所得的正己烷部分吸取1ml备用，然后用气相色谱进行检测。具体方法b.实验结果培养基中
发酵乳中
实施例3吸附实验a.实验方案1.将待测菌株从斜面上活化1次，37℃培养18hr取出备用；2.用灭菌生理盐水将菌体从斜面上洗下；3.用PBS清洗2次，每次用3000rpm离心10min。最后配成1*108CFU/ml的菌悬液；4.向带盖玻片的12孔培养板中(已培养好单层HT-29细胞)加入0.5ml菌悬液，并加入细胞培养液。37℃培养60min(培养条件为10％CO2、90％空气或5％CO2、95％空气)；5.倒去培养液，并用PBS清洗3-4次，自然干燥；6.用甲醇、丙酮或其它试剂固定；7.革兰氏染色；8.在光学显微镜(1000倍，油镜)下观察吸附情况；9.计数并照像。
b.实验结果
实施例4抑菌实验a.实验方案(一)平板法1.将致病菌用营养肉汁琼脂培养基活化2次，分别取0.2ml进行平板涂布。37℃放置30min，使其表面干燥。
2.向每一个平板中放置4个牛津杯，分别加入0.1ml的PH3.5乳酸、双歧杆菌培养上清、双歧杆菌菌悬液和空白MRS液体培养基。
3.培养或，测量抑菌环直径。
(二)液体培养法
1.向MRS液体培养基(8ml)中加入致病菌菌悬液1ml，测原始菌数；2.加入双歧杆菌菌悬液1ml，设置对照(用MRS液体培养基)；3.混合培养24-48hr；4.测致病菌菌数CFU/ml(平板法)；5.菌落计数。
b.实验结果平板法
液体培养基法
实施例5抑制幽门螺杆菌实验a.实验方案(平板法)1.制备幽门螺杆菌菌悬液(109CFU/ml)、浓度109CFU/ml双歧杆菌菌悬液；MRS液体培养基；培养液上清；乳酸溶液(自备)；2.制备幽门螺杆菌平板；3.培养基平板上加入0.2ml螺杆菌菌悬液，用三角形玻璃棒涂布均匀。放入培养箱预培养30min；4.放入4个牛津杯，依次加入菌悬液、菌培养液上清、PH3.5乳酸溶液(灭菌)、MRS液体培养基；5.培养箱培养24-48hr；6.测抑菌环直径(使用游标卡尺)；7.记录数据。
b.实验结果
实施例6将双歧杆菌菌种用液体或固体培养基培养，收集和洗涤菌体，干燥制备成活性菌粉；用明胶制成囊材，用PVP作底衣，再用蜂蜡进行外层包衣，用0号胶囊包装。得到双歧杆菌胶囊。
实施例7取胡萝卜50公斤，经过分选、清洗、去皮、切分、漂烫、榨汁打浆、配料、均质、灭菌步骤得到无菌果蔬汁。
然后经过如下步骤将双歧杆菌菌种活化、菌种扩大培养、接种到灭菌蔬菜汁、发酵、取样检测合格、冷却降温、无菌灌装、产品包装、成品，得到双歧杆菌发酵果蔬汁，其中，所述的取样检测合格的条件一是PH值达到4.2～4.5；二是活菌数达到108CFU/ml以上。
实施例8将双歧杆菌菌种用液体或固体培养基培养，收集和洗涤菌体，然后加入淀粉、奶粉混合成悬液或冷冻干燥成菌粉；将现有技术中的常规囊材配成溶液，经灭菌后与菌粉混合均匀；然后将菌粉和囊材的混合物挤压成细滴或喷入灭菌的0.3mol/L氯化钙溶液中，缓缓搅拌固化，然后收集微胶囊，用缓冲液洗涤三次即得湿的双歧杆菌微胶囊。
实施例9用浓缩脱脂乳或脱脂乳粉强化的脱脂乳，将混合料在95℃温度下加热杀菌60分钟，冷却到37℃；然后在其中添加3％的双歧杆菌发酵剂，在35℃下培养，使酸度达到1.5％，培养时间24小时，这时菌数最低达到108CFU/ml。得到双歧杆菌乳饮料。
上述实施例说明本发明产品的确具有相比于现有技术更好的和更多的功能。在耐酸耐胆盐、抑制细菌等很多方面具有特别的优势。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基本上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种双歧杆菌菌株，其特征是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No.1085。
2.一种双歧杆菌胶囊的制备方法，其特征在于将权利要求1所述的双歧杆菌菌种用液体或固体培养基培养，收集和洗涤菌体，干燥后装入选用0～5号胶囊。
3.如权利要求2所述的双歧杆菌胶囊的制备方法，其特征在于胶囊用PVP作底衣，再CAP或蜂蜡进行外层包衣，并且选用不透气材料作为包装材料，并用真空或充氮气包装。
4.一种双歧杆菌片剂的制备方法，其特征在于将双歧杆菌菌粉与辅料或泡腾崩解剂混和制备成双歧杆菌片剂。
5.一种双歧杆菌发酵果蔬汁的制备方法，其特征在于将蔬菜用常规方法处理成蔬菜汁，然后经过如下步骤将双歧杆菌菌种活化、菌种扩大培养、接种到灭菌蔬菜汁、发酵、取样检测合格、冷却降温、无菌灌装、产品包装、成品，得到双歧杆菌发酵果蔬汁，其中，所述的取样检测合格的条件一是PH值达到4.2～4.5；二是活菌数达到108CFU/ml以上。
6.一种双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于将双歧杆菌菌种用液体或固体培养基培养，收集和洗涤菌体，然后加入淀粉、奶粉或其他保护剂混合成悬液或冷冻干燥成菌粉；将现有技术中的常规囊材配成溶液，经灭菌后与菌粉混合均匀；然后将菌粉和囊材的混合物挤压成细滴或喷入固化剂溶液中，缓缓搅拌固化，然后收集微胶囊，用缓冲液洗涤三次即得湿的双歧杆菌微胶囊；其中，固化剂采用灭菌后的0.1～0.3mol/L氯化钙溶液。
7.一种双歧杆菌乳粉的制备方法，其特征在于将纯培养的本发明双歧杆菌粉末与良质乳粉在无菌室内成分混合、包装、进行无菌操作。
8.如权利要求7所述的双歧杆菌乳粉的制备方法，其特征在于将纯培养的双歧杆菌的脱脂乳培养液与经过杀菌浓缩的牛乳混和，然后进行真空冷冻升华干燥，得到双歧杆菌乳粉。
9.一种双歧杆菌酸乳的制备方法，其特征在于用常规方法制备得到酸乳发酵剂和用本发明菌种制备的发酵剂按一定比例混合后，用常规工艺生产凝固性和搅拌型酸奶。
10.一种双歧杆菌乳饮料的制备方法，其特征在于用浓缩脱脂乳或脱脂乳粉强化的脱脂乳，将混合料在90～95℃温度下加热杀菌5～10分钟，冷却到37℃；然后在其中添加2～3％的双歧杆菌发酵剂，在35～37℃下培养，使乳酸度达到1.5～2.0％，培养时间低于24小时，其中，这时菌数最低达到108CFU/ml。
全文摘要
本发明涉及一种微生物及其应用，特别是涉及一种双歧杆菌及其应用。属于生物制品领域。本发明人经过长期的筛选和培育，得到了本发明的长双歧杆菌，经过本发明中产品双歧杆菌制备的一系列产品都具有对人体十分有益的效果。本发明长双歧杆菌的保藏号CGMCC No.1085。保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地点中国.北京.中关村。用本发明产品双歧杆菌可以制备的产品包括双歧杆菌胶囊、双歧杆菌片剂、双歧杆菌发酵果蔬汁、双歧杆菌微胶囊、双歧杆菌乳粉、双歧杆菌酸乳、双歧杆菌乳饮料。本发明产品的确具有相比于现有技术更好的和更多的功能。在耐酸耐胆盐、抑制细菌等很多方面具有特别的优势。
文档编号A61K35/66GK1641015SQ200410000768
公开日2005年7月20日 申请日期2004年1月18日 优先权日2004年1月18日
发明者于景华, 陈历俊, 王建, 张国钰, 张和平 申请人:北京三元食品股份有限公司