用于预防结核病和免疫治疗的嵌合型dna疫苗的制作方法

专利名称：用于预防结核病和免疫治疗的嵌合型dna疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型结核疫苗，具体地说涉及一种能诱导和增强人或动物体内保护性免疫应答(体液免疫和细胞免疫)的嵌合DNA分子。这种DNA分子作为疫苗，用于结核病的预防和治疗；同时作为免疫增强剂，能提高人或动物体内的免疫功能，达到防治病毒疾病和肿瘤的作用。
背景技术：
继第一次和第二次世界大战全球出现两次结核病回升高峰之后，80年代中期，由于世界范围内结核病疫情又急剧恶化而形成第三次回升高峰，据《世界卫生组织简报》报道，1996年全球所有年龄死亡人数，结核病排列于缺血性心脏病、脑血管疾病和急性下呼吸道感染死亡例数之后，位居第四位，占全球单病种引起死亡例数之首，创百年历史之最高记录。全球每年死于结核病的人数达300万，每天有8000人死于结核病，每10秒种就有1人死于结核病。贫穷、流动人口、耐多药结核病增多以及爱滋病的流行使结核病更加成为全球性的严重公共卫生问题(Cole ST.Why sequence the genome of Mycobacterium tuberculosis？Tubercle Lung.Dis.1996；77486-490.)，因而引起国际社会的极大关注。应用现代分子生物学方法揭示分枝杆菌的秘密是目前研究策略的中心问题。通过分析结核杆菌基因组DNA序列将获得大量有关结核杆菌的生物信息，应用这些信息可以了解结核病的发生、发展过程，并可以加强对结核病的诊断、治疗和预防新措施的研究。
卡介苗(BCG)是至今为至唯一被批准使用的预防肺结核的疫苗，每年市场使用超过1亿剂。但是卡介苗却不是理想的疫苗。虽然卡介苗对儿童有一定的保护作用，它对成人却没有效用。
目前使用的卡介苗已经过度软化。卡介苗是活菌疫苗。自从卡介苗由法国人在1908-1921年研制成功以后，菌株被各国实验室在培养液中连续传代，一直到1961年低温(零下80度)冰箱的出现才被低温保存。最近的基因库(Genome)研究表明，目前在全世界使用的十几种卡介苗已经不再是同一菌株，许多基因片段已经失落。这是造成卡介苗保护效应减弱的原因之一，也解释了为什么早期的临床实验，卡介苗表现出很好的保护性(1930年，英国，80％保护率)，而后期卡介苗结果远不尽人意(1970年，印度，0％保护率)(刘军，加拿大国家卫生院。肺结核(TB)的诊断与预防新技术 中国防痨杂志。2003，25，增刊20-22)；1995年WHO也发表声明指出，BCG复种没有科学依据，所以不提倡复种。BCG免疫失败也与下列因素有关(Baldwin SL，D’Souza C，Roberts A D，et al.Evaluation of new vaccines in themouse and guinea pig model of tuberculosis.Infect.Immun.1998，66(6)2951-2959.)(1)BCG不能提高由于其他因素已具有免疫力人群的保护水平，(2)个体随着年龄增长，有可能继续接触到周围环境的分支杆菌抗原，从而将该免疫反应从Th1型推向Th2型(这就是BCG预防儿童结核效果良好，而对成人效果差的主要原因)。鉴于这种情况，一种合格的新疫苗应该可以恢复到Th1型的保护性和记性免疫状态；因此，研制安全、有效、价廉的新一代疫苗成为一项紧迫而重要的工作。
热休克蛋白(heat shock protein，hsp)是一类具有重要生物和免疫功能的高度保守的蛋白质，存在于原核和真核细胞中。分支杆菌hsp70包含多个T细胞和B细胞表位，免疫原性非常强，具有免疫优势抗原(immunodominant antigen)的特点，能诱导出特异性Th1型细胞反应，并产生r-干扰素(r-IFN)和白细胞介素12，对结核杆菌的攻击可产生较强的保护性免疫效应(Mckenzie.KR，Adams E，BrittonWJ，et al.Sequence and immunogenicity of the 70-kDa heat shock protein ofMycobacterium leprae.J.Immune.1991；147312-319.)。
B7-1(B7-1)是重要的具有免疫活化功能的共刺激分子(costimulatory molecule)之一。近年来对免疫调控的研究表明，T细胞活化时，必需两个信号，即T细胞受体(TCR)与抗原递呈细胞(APCs)表面的MHC-Ag结合产生的第一信号，和由共刺激分子提供的第二信号(协同刺激信号)，如果缺乏协同刺激信号，T细胞则不能被完全活化而呈现无反应状态(Anergy)，或者出现细胞凋亡(Apoptosis)。B7-1(与其共刺激受体CD28和/或CTLA-4间相互作用可提供T细胞活化所必需的协同刺激信号，诱导T细胞产生r-IFN，对体液免疫和细胞免疫具有全面的活化作用，通过实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型，证明B7-1可以促进Th1型细胞反应(Orme I M.Progress in the development of new vaccines against tuberculosis.Int.J.Tuberc.Lung.Dis.1997；1(2)95-100和Lenschow DJ，Walunas TL andBluestone J A.CD28/B7 system of Tcell costimulation.Annu.Rev.Immunol 1996；14233.)。
r-IFN主要由T细胞产生；主要活性是参与免疫调节，是体内重要的免疫调节因子，通过增强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其抗病毒、抗肿瘤作用。r-IFN的免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞的活性的影响，如对巨噬细胞可使其表面MHCII类分子的表达，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复活物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。同时，对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，能增强Th1细胞的活性，增强细胞免疫功能(Hathcock KS，Laszlo G，Pucillo C，et al. Comparitive analysis of B7-1 and B7-2costimulatory ligandsExpression and function.J.Exp.Med.1994；180631-640.)。

发明内容
由于BCG不能将免疫状态从TH2型转向TH1型，导致了BCG作为疫苗预防结核病所存在的缺陷性，本发明的目的是通过选择分支杆菌hsp70基因与人B7-1基因在分子水平进行嵌合，构建成新型结核病DNA疫苗；其中hsp70提供免疫特异性信号，诱导出特异性Th1型细胞反应，产生r-IFN和白介素-12；B7-1提供第二信号即协同刺激信号，间接诱导T细胞产生r-IFN，全面活化细胞和体液免疫。通过两者的共同作用，将人和动物的免疫状态由Th2型推向Th1型，达到预防和治疗结核病和其他感染性疾病的效果。
根据本发明的一方面，本发明的新型DNA疫苗包含如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的全长开放读码框架，及其保守性变异体，SEQ ID NO.1中包含了分支杆菌hsp70基因与人B7-1基因，该两个基因之间通过设计一接头序列(SEQ ID NO.3)将二者连接。
在本发明中，术语“全长开放读码框架”是指不受终止密码干扰的阅读框架，其来源一般是从DNA顺序中推论得出的。
术语“保守性变异体”是指相同或不同生物体中编码相同产物的同工基因，如结核杆菌hsp60、hsp65，麻风杆菌hsp70等。
本发明设计的用于合成SEQ ID NO.1序列的共有P3～P8六条引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6～11所示。其中用于扩增分枝杆菌部分hsp70基因和接头的引物组合，上游引物P3(SEQ ID NO.6)为一条长30个核苷酸的单链DNA，下游引物P4(SEQ ID NO.7)为一条长76个核苷酸(含接头)的单链DNA。上游引物P3的碱基序列与SEQ ID NO1开放读码框架1593-1623位核苷酸相同，并在其5’端设计酶切位点；下游引物P4的碱基序列与SEQ ID NO1开放读码框架1844～1920位核苷酸相同，含SEQ ID NO3的负链序列，以质粒pcDNA3.1(+)-hsp70为模板进行扩增分枝杆菌部分hsp70基因及接头。
用于扩增人B7-1基因和部分接头的引物组合，上游引物P5(SEQ ID NO.8)为一长53个核苷酸的单链DNA，下游引物P6(SEQ ID NO.9)为一长39个核苷酸的单链DNA。上游引物P5的碱基序列与SEQ ID NO1开放读码框架1896-1948位核苷酸相同，在其5’端为SEQ ID NO3之3’端24个核苷酸(部分接头序列)；下游引物P6的碱基序列与SEQ ID NO1开放读码框架2745～2784位核苷酸相同，在终止密码TAA后设计有酶切位点，以质粒pcDNA3.1(+)-B7-1为模板扩增人B7-1基因和部分接头。将以上两段目的基因作为模板用P3和P6进行第三次扩增，将所得目的基因定向插入进经酶切真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中，构建成pcDNA3.1(+)和含部分hsp70-B7-1质粒。
pcDNA3.1(+)-hsp70用KpaI酶切后所获得的目的基因连入pcDNA3.1(+)和含部分hsp70-B7-1质粒中，构建成pcDNA3.1(+)Hsp70/B7-1嵌合质粒嵌合基因。
在下面的扩增中，上游引物P7(SEQ ID NO.10)的碱基序列与SEQ ID NO1开放读码框架1-21位核苷酸相同，并在其5’端设计酶切位点；下游引物P8(SEQID NO.11)的碱基序列与SEQ ID NO1开放读码框架2764～2784位核苷酸相同，在终止密码TAA后设计有酶切位点。用以上所构建pcDNA3.1(+)Hsp70/B7-1嵌合质粒的作为摸板，扩增出hsp70/B7-1嵌合目的基因。
将hsp70/B7-1DNA转染真核细胞，提取mRNA进行逆转录PCR，扩增产物显示有hsp70/B7-1基因表达。
hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗接种小鼠，用结核杆菌强毒株攻击，观察该疫苗对结核杆菌感染的预防作用；并进行先用结核杆菌强毒株攻击，形成小鼠结核模型后，用hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗进行治疗，观察小鼠的血清IFN-γ产生水平和肝、脾组织涂片细菌计数及组织培养菌落计数。以hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗免疫和治疗猕猴结核模型，通过CT肺扫描，观察其免疫保护和治疗作用。
本发明的SEQ ID No1中所包含的分支杆菌hsp70基因，可通过多种方法获得。如本领域内熟知的①克隆化基因(含hsp70基因的质粒)酶切、聚合酶链(PCR)扩增，或②提取分支杆菌基因组后PCR扩增。在本发明的一个实施方案中，hsp70基因来源于结核杆菌强毒株H37RV基因组DNA，经PCR扩增，将获得的扩增产物酶切后连入pcDNA3.1(+)，获得真核表达质粒pcDNA3.1(+)-hsp70。
本发明的SEQ ID No1所包含的人B7-1基因，也可通过多种方法获得。如①克隆化基因(含人B7-1基因)酶切、聚合酶链(PCR)扩增，或②提取外周血单个核细胞总RNA，逆转录cDNA，然后进行PCR扩增，或③用特异性探针，从相应cDNA文库中获取，或商购。在本发明的一个实施方案中，采用人工合成的PCR引物，以上述pcDNA3.1(+)-hsp70为模板，合成hsp70/B7-1嵌合基因。
本发明的嵌合基因序列中，通过PCR扩增，在hsp70与B7-1之间插入了SEQID No3序列，该段DNA序列所编码的氨基酸残基序列为(GGGGS)3，因为其独特的理化特性，可以在整个SEQ ID No1编码的分支杆菌hsp70和人B7-1蛋白质之间，形成一段钢性间隔，将hsp70和人B7-1分开，使它们在空间结构上互不干扰，能形成各自的天然构像，发挥各自生物学功能。
根据本发明的另一方面，提供含有本发明SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的表达载体。在本发明的一个实施方案中，采用质粒pcDNA3.1(+)为载体，通过限制性内切酶酶切，将获得的嵌合基因装载入质粒中，构建成表达载体。除质粒pcDNA3.1(+)外，其它多种表达载体系统可用于SEQ ID No1的表达，这些载体包括它真核表达质粒、腺病毒和腺相关病毒、逆转录病毒等，这些载体一旦克隆了SEQ ID No1全长开放读码框架，可在机体内起到相同或类似的作用。采用本领域内技术人员熟知的方法可用于构建含SEQ ID No1全长开放读码框架表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/基因重组。见如由Maniatis等，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，N.Y.，第12章(1982)所述。
本发明还提供包含本发明表达载体的宿主细胞，多种宿主表达载体系统可用于体外表达DNA，这些系统包括但不限于以含有SEQ ID No1序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物如细菌；以含有SEQ ID No1序列的表达载体的重组酵母菌；以含有SEQ ID No1序列的表达载体的重组表达病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；以含有SEQ ID No1序列的表达载体的重组表达病毒表达载体(如腺病毒、腺相关病毒或逆转录病毒)感染的动物细胞系统。其实验方法如酶切、连接、转化、PCR等也为本分子生物学领域熟知的方法。
本发明的疫苗可以以裸DNA的形式直接免疫动物，经宿主肌细胞摄取，利用宿主细胞表达系统在体内表达除了能直接在体内表达相应蛋白质，还可在体外真核细胞中表达相应蛋白质，采用适当方法分离纯化的蛋白质，注射机体后，也能产生相同或类似的作用，因此本发明还包含了SEQ ID NO.1所编码的氨基酸序列，该序列如SEQ ID NO.2所示。
根据本发明的又一方面，提供一种药物组合物，其含有本发明的DNA嵌合疫苗和药学上可接受的载体和赋形剂。
本发明还提供含有SEQ ID NO.1序列的嵌合DNA疫苗的应用，本发明的疫苗可用于结核病的预防和治疗，还可作为免疫增强剂，用于提高免疫功能。
本发明提供制备一种新型结核疫苗的设计思想、技术路线，特别涉及用于人和动物体内诱导和增强保护性免疫应答(体液免疫和细胞免疫)的DNA。选择分枝杆菌hsp70和人的B7-1基因在分子水平进行嵌合，构建新型结核疫苗，其中hsp70提供免疫特异性信号，诱导出特异性Th1型细胞反应产生，r-IFN和白介素12；B7-1提供第二信号即协同刺激信号，间接诱导T细胞产生r-IFN，全面活化细胞和体液免疫。通过两者的共同作用，将人和动物的免疫状态由Th2型推向Th1型。
本发明的疫苗可用于结核杆菌所致的结核病；或者在体外真核细胞中表达相应的蛋白质，用作预防和治疗结核病，特别是对耐多药结核病(MDR-TB)的治疗；本发明的疫苗也可作为一种免疫增进剂，用于相应的病毒性疾病以及肿瘤的免疫治疗。
附图的简要说明

图1为hsp/B7-1嵌合型质粒构建路线图；图2为pcDNA3.1(+)载体图谱；图3为分支杆菌hsp70-接头-人B7-1全基因序列开放读码框架(SEQ ID NO1)，起始密码子和终止密码子均表示为黑体下划线；图4为pcDNA3.1(+)-hsp70/B7-1嵌合质粒构建的PCR鉴定图；
图5为pcDNA3.1(+)-hsp70/B7-1嵌合质粒的酶切鉴定图；图6为pcDNA3.1(+)hsp70/B7-1嵌合DNA在COS.7细胞中的表达产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例方式
下面，结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。
实施例1pcDNA3.1(+)-hsp70/B7-1嵌合质粒的构建。
参见图1和图2主要实验材料一、质粒和菌株；pcDNA3.1(+)-B7-1(含人B7-1编码基因及两侧调控基因)和质粒pcDNA3.1(+)购置于Invitrogen，工程菌Dh5α购置上海生工生物工程公司。
二、寡核苷酸引物设计根据发表的人结核杆菌H37Rv株hsp70的基因序列(Mckenzie.KR，Adams E，Britton WJ，et al.Sequence and immunogenicity of the 70-kDa heatshock protein of Mycobacterium leprae.J.Immune.1991；147312-319.)和人B7-1序列(GenBank accession number NM005191)设计。
1.重组pcDNA3.1(+)-hsp70质粒引物P1(SEQ ID NO.4)5′ggagccATGGCTCGTGCGGTCGGGATC 3′(含BamHI位点和起始密码ATG)P2(SEQ ID NO.5)5′gaattcATGGCTCGTGCGGTCGGGATC3′(含EcoRI位点)。
2.hsp70-linker-B7-1引物P3GGTGGTTCGAAggtaccTGAAGACACGCTG，位于hsp70序列的1604bp处(含KapI位点)；P4ACTCCCTCCGCCACCGCTCCCTCCGCCACCACTCCCTCCGCCACCCTTGGCCTCCCGGCCGTCGTCGACCACCTCC画线部分为linkerP5GGAGGGAGCGGTGGCGGAGGGAGTGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACC画线部分为linker互补序列P6GACACtctagaTTATACAGGGCGTACACTTTCCCTTCTC(含XbaI位点和终止密码TTA)3.重组pcDNA3.1(+)hsp70/B7-1质粒鉴定引物P75′aagcttATGGCTCGTGCGGTCGGGATC 3′(含HindIII位点和起始密码ATG)P85′tctagaTTATACAGGGCGTACACTTTC 3′(含XbaI位点和终止密码TTA)以上引物均由上海生工生物工程公司合成。
三、相关酶限制性内切酶、Taq+Pfu酶购自上海生工生物工程公司；T4 DNA连接试剂盒购自宝生物大连公司。
四、质粒提取试剂盒购自上海华舜公司，用于质粒提取。
五、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海华舜公司，用于DNA电泳产物的回收。
六、PCR产物纯化试剂盒为上海华舜公司产品，用于PCR产物的纯化。
七.真核细胞mRNA提取试剂和盒以及RT-PCR试剂盒为上海生工产品。
八.COS-7细胞购置于中国科学院上海细胞库。
九、结核杆菌强毒株H37Rv，由四川省结核病防治研究所惠赠。
十.阳离子脂质体转染试剂盒购置与深圳晶美公司。
十一.一步法RT-PCR试剂为上海生工生物工程公司产品十二.实验动物C57BL小鼠，清洁级；购置于重庆医科大动物研究所。猕猴，2级；购置于中国科学院苏州西山实验动物中心。
实验方法1.Hsp70目的基因的准备提取结核杆菌强毒株H37RV基因组DNA，进行PCR扩增，其反应体系为H37RV基因组DNA2μl5′引物溶液(P1) 3μl3′引物溶液(P2) 3μldNTP 2.5μlTaq+Pfu酶 1μl10×PCR缓冲液 5μl灭菌双蒸水33.5μl2.
为50μl体系，PCR条件参数为94℃预变性5分钟，热启动后转为94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，进行25个循环后，72℃延伸10分钟。反应所得片段大小约1875bp，取5μl电泳。并送上海生工生物公司分别测序证实。PCR产物的纯化按上海华舜公司小量PCR产物纯化试剂盒提供的说明书进行。
2.pcDNA3.1(+)质粒的提取按上海华舜公司的小量质粒提取试剂盒操作，BamHI和EcoRI双酶切载体质粒pcDNA3.1(+)，BamHI和EcoRI双酶切hsp70目的基因，连入pcDNA3.1(+)，采用大连宝生物公司的连接试剂盒，获得真核表达质粒pcDNA3.1(+)-hsp70。
3.hsp70/B7-1目的基因的准备三次PCR反应。
第一次PCR反应(获取部分Hsp70-linker)，反应体系为pcDNA3.1(+)-hsp70质粒DNA6.01μM 2μl5′引物溶液(P1) 17.5μM 3μl3′引物溶液(P2) 10mM 3μldNTP 2.5μlTaq+Pfu酶 1μl10×PCR缓冲液 5μl灭菌双蒸水 33.5μl第二次PCR反应(获取linker-B7-1)，反应体系为6.01μM质粒pcDNA3.1(+)-B7-1 2μl溶液3μl16.6μM5′引物溶液(P3) 3μl16.0μM3′引物溶液(P4) 2.5μl10mM dNTP 1μlTaq+Pfu酶 5μl10×PCR缓冲液 33.5μl灭菌双蒸水均为50μl体系，PCR条件参数为94℃预变性5分钟，热启动后转为94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，进行25个循环后，72℃延伸10分钟。第一次PCR反应所得片段大小约327bp，第二次PCR反应所得片段大小约915bp，取5μl电泳。同时以灭菌双蒸水作空白对照。并送上海生工生物公司分别测序证实。PCR产物的纯化按上海华舜公司小量PCR产物纯化试剂盒提供的说明书进行。
第三次PCR反应(获取部分hsp70-linker-B7-1目的基因)，反应体系如下第一次PCR产物(纯化) 2μl第二次PCR产物(纯化) 2μl16.0μM5′引物溶液(P1) 3μl16.0μM3′引物溶液(P4) 3μl10mM dNTP 2.5μlTaq+Pfu酶 1μl10×PCR缓冲液 5μl灭菌双蒸水 31.5μl50μl反应体系，PCR条件参数为94℃5分钟，45℃2分钟，70℃10分钟，进行1个循环后，转为94℃2分钟，50℃2分钟，70℃2分钟，进行25个循环后，72℃延伸10分钟。取全部PCR产物电泳，发现所得片段中包括大小约1197bp的片段。同时以灭菌双蒸水作空白对照。PCR产物的胶回收按前述方法将约1197bp的片段进行胶回收，取5μl电泳可见相应电泳带，嵌合基因经KpaI和XbaI双酶切后，65℃灭活获得了部分hsp70接头B7-1，目的基因cDNA准备完成。
4.KpaI和XbaI双酶切载体质粒pcDNA3.1(+)，与第三次PCR产物连接，采用大连宝生物公司的连接试剂盒，按说明书操作；构建成pcDNA3.1(+)部分hsp70(327bp)-Linker-B7-1质粒。
5.KpaI单酶切pcDNA3.1(+)-hsp70，获得1.6KbHsp70基因；KpaI单酶切pcDNA3.1(+)部分hsp70(327bp)-Linker-B7-1质粒，将1.6KbHsp70基因连入其中。采用大连宝生物公司的连接试剂盒，按说明书操作；构建成pcDNA3.1(+)hsp70-Lenker-B7-1质粒。用上述连接产物转化大肠杆菌DH5α，按《分子克隆》的方法进行。并送上海生工生物公司测序(序列如图3)证实嵌合真核表达质粒pcDNA3.1(+)hsp70/B7-1构建成功。
构建过程中进行鉴定的琼脂糖电泳图如图4和图5所示。
实施例2pcDNA3.1(+)hsp70/B7-1嵌合DNA在真核细胞中的表达将pcDNA3.1(+)hsp70/B7-1嵌合DNA用脂质体包裹转染真核细胞(COS.7)，24.48.72小时提取细胞mRNA进行RT-PCR，取产物进行琼脂糖电泳，见目的带(图6)。
实施例3pcDNA3.1(+)hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗对小鼠的免疫预防效果研究动物预防实验DNA疫苗的接种实验动物6-8周龄、清洁级的健康小鼠C57BL/6N(购自重庆医科大学动物实验中心)。每组8只，雌雄各半，分为实验组和对照组，实验组分别注射pcDNA.3.1(+)、pcDNA.3.1(+)-hsp70、pcDNA.3.1(+)-hsp70/B7-1 100μg(0.5ml)，BCG按体重注射；对照组注射生理盐水0.5ml。注射部位均为两侧胫前肌，每侧剂量各半。接种3周和6周各自按原方案加强接种一次。第三次免疫后三周每只小鼠用H37RV尾静脉注射104-105CFU。
实施例4动物治疗实验小鼠分组、疫苗接种及H37RV攻击方法、均与“先免疫后感染的动物实验”相同。唯在本次实验中，攻击转染结核杆菌在前，相应的DNA疫苗的接种在后(对照组则仅注射生理盐水)，疫苗接种时间为H37RV攻击后的第7天和第14天各一次。
IL-4、γ-INF的体外检测预防组在H37RV尾静脉注射两周，治疗组第二次疫苗接种后14天后处死动物，取血清进行检测，检测方法按晶美公司小鼠ELISA检测试剂盒说明书。
病理改变观察观察小鼠肝、脾组织涂片、切片病理改变及以及培养结核杆菌记数。
统计学处理方法采用SPSS for windows10.0统计软件包进行数据处理。
研究结果1.γ-IFN、IL-4的体外检测用ELISA法检测接受接种pcDNA3、pcDNA3-hsp70、pcDNA3-hsp70/B7-1、BCG、生理盐水各组小鼠血清中γ-IFN、IL-4。
表1γ-IFN、IL-4的体外检测(X±SD)γ-IFN(pg/ml) IL-4(pg/ml)组别预防 治疗 预防 治疗生理盐水146.58±62.41 132.66±74.68 141.86±81.23 20.61±7.65(n＝8)BCG134.74±55.32 121.54±56.39 175.70±72.35 45.32±9.45(n＝8)pcDNA3516.94±58.76△192.00±64.38 171.25±63.24 106.67±34.12△(n＝8)hsp70542.82±92.34△542.33±99.77△1224.38±98.64△215.44±61.25△(n＝8)hsp70/B7-13230.80±114.35▲1336.98±129.61423.70±86.19 843.57±97.34▲△(n＝8)△4注▲与生理盐水、BCG、pcDNA3和HSP70比较，p＜0.001；△与生理盐水、BCG比较，p＜0.01。
1.病理观察预防组在H37RV尾静脉注射两周，治疗组第二次疫苗接种后14天后处死动物取肝、脾组织研磨后培养，并取少量组织进行涂片。
表2肝、脾组织涂片(Z-N染色)肝组织涂片 脾组织涂片组别预防 治疗预防 治疗生理盐水++++ ++++++++ ++++(n＝8)BCG++++++++++(n＝8)pcDNA3++++△+++++(n＝8)hsp70+△++△+△+△(n＝8)hsp70/B7-1-▲+▲-▲-▲(n＝8)注，+为50个菌落以下，++为500个菌落以下，+++为1000个菌落以下，++++为5000个菌落以上。▲与其他组比较，p＜0.01；△与其他组(无标记)比较，p＜0.05表3.肝、脾结核菌培养菌落记数肝组织 脾组织组别预防治疗 预防治疗生理盐水+++ ++++ ++++++++(n＝8)BCG+++ ++++ ++ ++(n＝8)pcDNA3+++ ++ +++ +++(n＝8)hsp70++ ++ + +(n＝8)hsp70/B7-1+ + + +(n＝8)注，+为50个菌落以下，++为500个菌落以下，+++为1000个菌落以下，++++为5000个菌落以上。
实施例5hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗的免疫猕猴预防效果研究动物预防实验组DNA疫苗的接种实验动物猕猴、2级，(购自中国科学院苏州西山实验动物中心)。每组2只，雌雄各半；分为hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗预防组、BCG预防组、感染组和正常对照组；实验组注射pcDNA.3.1(+)-hsp70/B7-1500μg(1ml)，BCG按体重注射；对照组注射生理盐水1ml。注射部位均为右臂三角肌。实验组接种3周和6周各自按原方案加强接种一次。第三次免疫后三周每只猕猴用结核杆菌强毒株H37RV肘静脉注射50CFU。攻击后一月用螺旋CT扫描，见BCG预防组双肺散在结节影大小为1-5mm左右，感染组已出现数1-10mm个空洞，hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗预防组只见下肺野少许结节；第二、三个月用螺旋CT扫描双肺结节逐渐减少；然后每两个月一次螺旋CT扫描双肺，6个月后见结节明显减少并吸收；生理盐水组为正常胸部改变。
实施例6hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗的免疫猕猴治疗效果研究动物治疗实验组4只猕猴，雌雄各半，用结核杆菌强毒株H37RV肘静脉注射50CFU。攻击后一月用螺旋CT扫描，见双肺弥漫分布大小不等之结节。2只猕猴，雌雄各半用hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗500ug/ml进行治疗，每三周注射一次；2只猕猴，雌雄各半每天用异烟肼50mg、利副平75mg、吡秦酰氨125mg、链霉素100mg治疗，一月后用螺旋CT扫描结果无明显改变，第二、三个月用螺旋CT扫描双肺结节逐渐减少；然后每两个月一次螺旋CT扫描双肺结节明显减少并逐渐吸收；6各月后见双肺hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗组结核结节有一定的吸收；与抗痨药物组相比较有一定治疗作用。
序列ST25 txtSEQUENCE LISTING<110> 钟，森丁，慧忠史，小玲钟，林<120>用于预防结核病和免疫治疗的嵌合型DNA疫苗<130>A2095<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2784<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
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80 85 90 95atg aag ctg aag cgc gac gcc gag gcc tac ctc ggt gag gac att acc 336Met Lys Leu Lys Arg Asp Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Asp Ile Thr100 105 110gac gcg gtt atc acg acg ccc gcc tac ttc aat gac gcc cag cgt cag 384Asp Ala Val Ile Thr Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln115 120 125gcc acc aag gac gcc ggc cag atc gcc ggc ctc aac gtg ctg cgg atc 432Ala Thr Lys Asp Ala Gly Gln Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile130 135 140gtc aac gag ccg acc gcg gcc gcg ctg gcc tac ggc ctc gac aag ggc 480Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly145 150 155gag aag gag cag cga atc ctg gtc ttc gac ttg ggt ggt ggc act ttc 528Glu Lys Glu Gln Arg Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe160 165 170 175gac gtt tcc ctg ctg gag atc ggc gag ggt gtg gtt gag gtc cgt gcc 576Asp Val Ser Leu Leu Glu Ile Gly Glu Gly Val Val Glu Val Arg Ala180 185 190act tcg ggt gac aac cac ctc ggc ggc gac gac tgg gac cag cgg gtc 624Thr Ser Gly Asp Asn His Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Gln Arg Val195 200 205gtc gat tgg ctg gtg gac aag ttc aag ggc acc agc ggc atc gat ctg 672Val Asp Trp Leu Val Asp Lys Phe Lys Gly Thr Ser Gly Ile Asp Leu210 215 220acc aag gac aag atg gcg atg cag cgg ctg cgg gaa gcc gcc gag aag 720Thr Lys Asp Lys Met Ala Met Gln Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys225 230 235gca aag atc gag ctg agt tcg agt cag tcc acc tcg atc aac ctg ccc 768Ala Lys Ile Glu Leu Ser Ser Ser Gln Ser Thr Ser Ile Asn Leu Pro240 245 250 255tac atc acc gtc gac gcc gac aag aac ccg ttg ttc tta gac gag cag 816Tyr Ile Thr Val Asp Ala Asp Lys Asn Pro Leu Phe Leu Asp Glu Gln260 265 270ctg acc cgc gcg gag ttc caa cgg atc act cag gac ctg ctg gac cgc 864Leu Thr Arg Ala Glu Phe Gln Arg Ile Thr Gln Asp Leu Leu Asp Arg275 280 285
act cgc aag ccg ttc cag tcg gtg atc gct gac acc ggc att tcg gtg 912Thr Arg Lys Pro Phe Gln Ser Val Ile Ala Asp Thr Gly Ile Ser Val290 295 300tcg gag atc gat cac gtt gtg ctc gtg ggt ggt tcg acc cgg atg ccc 960Ser Glu Ile Asp His Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro305 310 315gcg gtg acc gat ctg gtc aag gaa ctc acc ggc ggc aag gaa ccc aac1008Ala Val Thr Asp Leu Val Lys Glu Leu Thr Gly Gly Lys Glu Pro Asn320 325 330 335aag ggc gtc aac ccc gat gag gtt gtc gcg gtg gga gcc gct ctg cag1056Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln340 345 350gcc ggc gtc ctc aag ggc gag gtg aaa gac gtt ctg ctg ctt gat gtt1104Ala Gly Val Leu Lys Gly Glu Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val355 360 365acc ccg ctg agc ctg ggt atc gag acc aag ggc ggg gtg atg acc agg1152Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Lys Gly Gly Val Met Thr Arg370 375 380ctc atc gag cgc aac acc acg atc ccc acc aag cgg tcg gag act ttc1200Leu Ile Glu Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Arg Ser Glu Thr Phe385 390 395acc acc gcc gac gac aac caa ccg tcg gtg cag atc cag gtc tat cag1248Thr Thr Ala Asp Asp Asn Gln Pro Ser Val Gln Ile Gln Val Tyr Gln400 405 410 415ggg gag cgt gag atc gcc gcg cac aac aag ttg ctc ggg tcc ttc gag1296Gly Glu Arg Glu Ile Ala Ala His Asn Lys Leu Leu Gly Ser Phe Glu420 425 430ctg acc ggc atc ccg ccg gcg ccg cgg ggg att ccg cag atc gag gtc1344Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val435 440 445act ttc gac atc gac gcc aac ggc att gtg cac gtc acc gcc aag gac1392Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His Val Thr Ala Lys Asp450 455 460aag ggc acc ggc aag gag aac acg atc cga atc cag gaa ggc tcg ggc1440Lys Gly Thr Gly Lys Glu Asn Thr Ile Arg Ile Gln Glu Gly Ser Gly465 470 475
ctg tcc aag gaa gac att gac cgc atg atc aag gac gcc gaa gcg cac1488Leu Ser Lys Glu Asp Ile Asp Arg Met Ile Lys Asp Ala Glu Ala His480 485 490 495gcc gag gag gat cgc aag cgt cgc gag gag gcc gat gtt cgt aat caa1536Ala Glu Glu Asp Arg Lys Arg Arg Glu Glu Ala Asp Val Arg Asn Gln500 505 510gcc gag aca ttg gtc tac cag acg gag aag ttc gtc aaa gaa cag cgt1584Ala Glu Thr Leu Val Tyr Gln Thr Glu Lys Phe Val Lys Glu Gln Arg515 520 525gag gcc gag ggt ggt tcg aag gta cct gaa gac acg ctg aac aag gtt1632Glu Ala Glu Gly Gly Ser Lys Val Pro Glu Asp Thr Leu Asn Lys Val530 535 540gat gcc gcg gtg gcg gaa gcg aag gcg gca ctt ggc gga tcg gat att1680Asp Ala Ala Val Ala Glu Ala Lys Ala Ala Leu Gly Gly Ser Asp Ile545 550 555tcg gcc atc aag tcg gcg atg gag aag ctg ggc cag gag tcg cag gct1728Ser Ala Ile Lys Ser Ala Met Glu Lys Leu Gly Gln Glu Ser Gln Ala560 565 570 575ctg ggg caa gcg atc tac gaa gca gct cag gct gcg tca cag gcc act1776Leu Gly Gln Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Gln Ala Ala Ser Gln Ala Thr580 585 590ggc gct gcc cac ccc ggc ggc gag ccg ggc ggt gcc cac ccc ggc tcg1824Gly Ala Ala His Pro Gly Gly Glu Pro Gly Gly Ala His Pro Gly Ser595 600 605gct gat gac gtt gtg gac gcg gag gtg gtc gac gac ggc cgg gag gcc1872Ala Asp Asp Val Val Asp Ala Glu Val Val Asp Asp Gly Arg Glu Ala610 615 620aag ggt ggc gga ggg agt ggt ggc gga ggg agc ggt ggc gga ggg agt1920Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser625 630 635ggc cac aca cgg agg cag gga aca tca cca tcc aag tgt cca tac ctc1968Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr Leu640 645 650 655aat ttc ttt cag ctc ttg gtg ctg gct ggt ctt tct cac ttc tgt tca2016Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys Ser660 665 670ggt gtt atc cac gtg acc aag gaa gtg aaa gaa gtg gca acg ctg tcc2064
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<221>misc_feature<222>(1)..(27)<223>重组pcDNA3.1(+)hsp70/B7-1质粒鉴定引物
<400>11tctagattat acagggcgta cactttc 27<210>12<211>1875<212>DNA<213>结核杆菌(H37Rv)株<400>12atggctcgtg cggtcgggat cgacctcggg accaccaact ccgtcgtctc ggttctggaa 60ggtggcgacc cggtcgtcgt cgccaactcc gagggctcca ggaccacccc gtcaattgtc120gcgttcgccc gcaacggtga ggtgctggtc ggccagcccg ccaagaacca ggcagtgacc180aacgtcgatc gcaccgtgcg ctcggtcaag cgacacatgg gcagcgactg gtccatagag240attgacggca agaaatacac cgcgccggag atcagcgccc gcattctgat gaagctgaag300cgcgacgccg aggcctacct cggtgaggac attaccgacg cggttatcac gacgcccgcc360tacttcaatg acgcccagcg tcaggccacc aaggacgccg gccagatcgc cggcctcaac420gtgctgcgga tcgtcaacga gccgaccgcg gccgcgctgg cctacggcct cgacaagggc480gagaaggagc agcgaatcct ggtcttcgac ttgggtggtg gcactttcga cgtttccctg540ctggagatcg gcgagggtgt ggttgaggtc cgtgccactt cgggtgacaa ccacctcggc600ggcgacgact gggaccagcg ggtcgtcgat tggctggtgg acaagttcaa gggcaccagc660ggcatcgatc tgaccaagga caagatggcg atgcagcggc tgcgggaagc cgccgagaag720gcaaagatcg agctgagttc gagtcagtcc acctcgatca acctgcccta catcaccgtc780gacgccgaca agaacccgtt gttcttagac gagcagctga cccgcgcgga gttccaacgg840atcactcagg acctgctgga ccgcactcgc aagccgttcc agtcggtgat cgctgacacc900ggcatttcgg tgtcggagat cgatcacgtt gtgctcgtgg gtggttcgac ccggatgccc960gcggtgaccg atctggtcaa ggaactcacc ggcggcaagg aacccaacaa gggcgtcaac 1020cccgatgagg ttgtcgcggt gggagccgct ctgcaggccg gcgtcctcaa gggcgaggtg 1080aaagacgttc tgctgcttga tgttaccccg ctgagcctgg gtatcgagac caagggcggg 1140
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1.含有SEQ ID NO.1序列的核苷酸。
2.由SEQ ID NO.1核苷酸序列所编码的氨基酸序列，其具有SEQ ID NO.2的序列。
3.含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述载体为质粒载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述质粒载体为pcDNA3.1(+)。
6.含有权利要求3所述的表达载体的宿主细胞。
7.含有SEQ ID NO.3的接头序列。
8.一种嵌合型DNA疫苗，包含如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的全长开放读码框架，或其保守性变异体。
9.根据权利要求8所述的嵌合型DNA疫苗，其特征在于它进一步包含一表达载体。
10.根据权利要求9所述的嵌合型DNA疫苗，其特征在于所述表达载体为质粒载体。
11.根据权利要求10所述的嵌合型DNA疫苗，其特征在于所述质粒载体为pcDNA3.1(+)。
12.一种药物组合物，含有权利要求9所述的嵌合型DNA疫苗以及药学上可接受的载体和赋形剂。
13.一种药物组合物，含有包含SEQ ID NO.2的蛋白质以及药学上可接受的载体和赋形剂。
14.权利要求9所述嵌合型DNA疫苗在制备预防和治疗结核病药物中的应用。
15.权利要求9所述嵌合型DNA疫苗在制备免疫治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及用于预防结核病和免疫治疗的嵌合型DNA疫苗，包含如SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的全长开放读码框架，或其保守性变异体，SEQ ID NO.1中包含了分支杆菌hsp70基因与人B7－1基因，该两个基因之间通过设计一接头序列将二者连接。本发明的疫苗可用于结核杆菌所致的结核病；或者在体外真核细胞中表达相应的蛋白质，用作预防和治疗结核病。也可作为一种免疫增进剂，用于相应的病毒性疾病以及肿瘤的免疫治疗。
文档编号A61K48/00GK1562362SQ20041000178
公开日2005年1月12日 申请日期2004年2月5日 优先权日2003年3月6日
发明者钟森, 丁惠忠, 史小玲, 钟林 申请人:钟森, 丁惠忠, 史小玲, 钟林