DLP参与Pre－mRNA剪接与细胞周期调控的用途的制作方法

专利名称：DLP参与Pre－mRNA剪接与细胞周期调控的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及DLP蛋白，编码DLP的基因，DLP在制备与Pre-mRNA剪接与细胞周期调控有关的试剂和药物中的应用，本发明还涉及针对DLP设计的RNAi(RNA干扰)在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
背景技术：
真核细胞的基因表达是一个多步骤的复杂过程，包括转录的起始，延伸和终止。在转录过程中，初级Pre-mRNA经过5’端加帽、内含子切除、外显子连接、3’端被切割和加多聚腺苷酸形成成熟的mRNA，并运送到胞浆翻译成蛋白质。生物体内蛋白质组的大小不仅来自基因数量的大小，而且还取决于蛋白质的多样性。而蛋白质多样性产生机制的研究对在分子水平上了解生物进化有很重要的意义。据预测，人类基因组可能有约35,000个基因，果蝇约14,000个，而简单的模式生物线虫约19,000个基因。生物的复杂性与其基因组基因数量似乎存在明显差异。原因在蛋白质组。基因重排、基因转录不同起始位点的使用、Pre-mRNA编辑、多聚腺苷酸化、选择性剪接和转录后蛋白质修饰等机制可以从一个基因产生多种蛋白，从而使蛋白质组中蛋白质的数量超过基因组中基因的数量。其中，从影响的基因数量和生物种类范围来看，选择性剪接是扩大蛋白质多样性的最重要的机制。最近人类基因组草图的完成表明Pre-mRNA的选择性剪接在生物的多样性方面扮演一个重要角色，因为有59％以上的人类基因看上去是通过选择性剪接产生的(Hastings ML and Krainer AR 2001)。另外，据估计引起人类遗传性疾病的所有突变的15％都是由于相应基因的Pre-mRNA不能正确剪接从而使基因不能正确表达造成的(Philips AV and Cooper TA 2000)。因此Pre-mRNA内含子的移走在基因调节中扮演一个重要角色。选择性Pre-mRNA剪接和不同外显子的连接可以形成不同功能的蛋白质，这是蛋白质多样性的一个重要来源(Maniatis and Tasic 2000)。
Pre-mRNA的剪接反应是通过剪接体-含有5个小核RNA(U1，U2，U4，U5和U6)(Adams et al.1996；Kramer 1996；Reed 1996；Reed2000)和多种蛋白亚基组成的核糖体蛋白复合体来完成的(Ajuh et al.2001)。这些蛋白质包括与snRNA相关的一套普通的蛋白和特异的蛋白(Kramer et al.，1996，1999；Will and Luhrmann 1997)，也包括很多非snRNA相关的蛋白，这些蛋白对复合物的组装和剪接的催化是关键的(Will andluhrmann 1997；Staley and Guthrie 1998)。它们可能参与snRNP的生物合成、剪接体的组装和解离及内含子切除和外显子连接的催化反应(Raker VA andkastner B et al.，1999；Reed R 2000；Arenas JE and Abelson JN 1997)。剪接反应包括两步连续的转酯反应，在第一步转酯反应中，5’剪接位点被切割产生剪接中间产物(外显子1和套索状的外显子2)，在第二步转酯反应中，3’剪接位点被切割产生剪接产物(套索状的内含子和剪接的mRNA)。然后完全的剪接体解离，其中的成分重新参与到其它剪接体的形成，这叫做“剪接循环”(Jurica M.S.and Moore M.J 2003)。剪接体的组装包括snRNP颗粒和其它蛋白质在催化前顺序组装到Pre-mRNA的底物(Reed and Ralandjian1997)。剪接体复合物组装过程中，按顺序形成复合物E、A、B和C。复合物A是一个早期组装的中间产物，它含有结合到没有剪接的Pre-mRNA上U1和U2 snRNPs并且被组装到Pre-mRNA底物上。复合物B为第一步催化反应做准备，除了没有剪接的Pre-mRNA，它含有U2，U5和U6 snRNAs。和复合物B一样，复合物C也含有U2，U5和U6 snRNAs，但代表着第一步催化反应之后的一个阶段(含有剪接中间产物)，它被聚集到没有完成外显子连接的Pre-mRNA上并与内含子相连(Jurica et al.，2002)。U1snRNP是第一个和mRNA前体底物结合的颗粒，接着是U2 snRNP与U1 snRNP一起形成前剪接体复合物，随后U4/U6和U5 snRNPs形成triple snRNP和前剪接体复合物连接形成剪接体(Guthrie C 1991；Ruby S.W.and Abelson J 1991；Moore M and Query C 1993；Lamond A 1993；Newman A 1994)。在这个动力学过程中，有大量的蛋白质参与。到1999年为止，大约有100个剪接因子被鉴定(Burge et al.，1999)。随着质谱的发展和剪接体纯化技术的改进，剪接因子的数目已经成倍的增长。令人满意的是，大多数以前鉴定的剪接因子已经在最近的质谱研究中被发现。但许多新的以前与剪接没有关系的蛋白质的出现是令人吃惊的。2002年美国哈佛大学分子和细胞生物实验室分离到145种不同的剪接体蛋白，其中88种是已知的剪接因子、snRNP蛋白和剪接体蛋白，43个存在于U1、U2、U4、U5、U6 sn RNPs中，58种是未知的新蛋白。90种蛋白在酵母中有同源体。至少30种蛋白质已经知道在剪接以外的基因表达的步骤中发挥作用。这些蛋白不仅在多细胞生物Pre-mRNA剪接的多个步骤中起作用，还可以介导剪接和基因表达的其它步骤广泛的联系(Zhou et al.2002)。剪接与细胞内的其它的生物学过程如细胞周期、转录和mRNA的输出都有关联，Pre-mRNA剪接和细胞周期调控已经成为近年来细胞生物学和分子生物学研究的热门领域，也是研究基因表达和调控、细胞增殖和分化、细胞癌变和凋亡、以及基因工程和细胞工程等生物技术的基础。

发明内容
在对一个细胞因子类似因子-CKLF的研究过程中，发现了一种参与参与Pre-mRNA剪接与细胞周期调控的蛋白，并将该蛋白质命名为Dim1-likeprotein(DLP)。基于该发现，按以下方面构思了本发明1、参与Pre-mRNA剪接与细胞周期调控的DLP蛋白，其特征在于它具有如序列2所示的氨基酸序列。
2、编码DLP蛋白的核苷酸序列，其特征在于它含有如序列1所示的核苷酸序列。
3、含有第2项的核苷酸序列的表达载体。
4、DLP在制备与Pre-mRNA剪接或细胞周期调控有关的试剂或药物中的用途。
5、DLP的抗体。
6、针对DLP设计的RNAi。
7、根据第6项的RNAi，其特征在于它具有序列3或4所示的基因序列。
8、含有第6或7项的RNAi的原核或真核表达载体。
9、第6、7或8项的RNAi用于制备治疗肿瘤的药物中的应用。
附图简述

图1DLPcDNA的核苷酸序列和推断的氨基酸序列。核苷酸序列的方向是从5’-3’。预测的氨基酸序列显示在核苷酸序列的下面。终止密码子用*表示，蛋白激酶C磷酸化位点用‘△’表示，酪蛋白激酶II磷酸化位点用‘○’表示，N-myristoylation位点用‘▲’表示。
图2GST Pull-down检测DLP和剪接相关因子APC4，hnRNPF，PQBP和Prp6在体外相互作用。
图3上图为DLP的缺失体的图示。Del1(1-128aa)，Del2(21-126aa)，Del3(33-149aa)。
下图为DLP的不同缺失体与Prp6的GST Pull-down的结果，DLPDel3与Prp6在体外有相互作用。
图4DLP参与Adml-M3 Pre-mRNA的剪接的图。
图5RT-PCR检测DLP在MCF-7，HepG2和ISH的RNAi的结果。
GAPDH为内参。
图6DLP对细胞周期的影响。右侧为相应的蛋白质水平用WesternBlotting检测的结果。
DLP具有一个DIM1结构域。氨基酸序列进行同源性分析发现DLP与酵母的一个15KD的剪接体蛋白U5有弱的同源性，和一种有丝分裂蛋白DIM1及人硫氧还蛋白分别有39％、24％的同源性，同时发现它在人、鼠、Arabidopsis thaliana、Oryza、melanogaster、果蝇、酵母菌等各种属之间有相当的保守性。进化分析也表明DLP是一个保守的蛋白而且进化上与DIM1蛋白相关。进一步研究发现，它的功能与剪接和细胞周期有关。
DLP核苷酸全长2540bp，编码149氨基酸，分子量约为17KD，等电点为5.63，定位于16q22.3。Nothern Blot杂交显示DLP在骨骼肌，肝脏，心脏和胰腺中高表达，在肾脏，脑和胎盘中中等程度的表达，在肺中表达较低。RT-PCR证实DLP在人的乳腺癌细胞MCF-7，肝癌细胞HepG2和子宫内膜癌细胞Ishikawa中也有高表达。说明DLP在体内分布广泛，是一个广谱基因。
发明人对DLP作了定位分析，用绿色荧光蛋白做定位表明DLP定位于核内，这与DLP可能在核内参与剪接的过程是一致的。
还做了流式检测。DLP过表达和RNAi的质粒分别瞬时转染进MCF-7细胞，用流式细胞仪检测细胞周期的改变，发现DLP在MCF-7细胞中过表达可以使G2/M期的细胞数百分比增加，当DLP的作用被RNAi抑制后，S期的细胞百分比增加，G2/M期的细胞数百分比降低。用雌激素抑制剂ICI182780将细胞阻滞在G0/G1期，再用DLP过表达和RNAi的质粒分别瞬时转染进MCF-7细胞，发现对细胞周期没有明显的影响，表明DLP对细胞周期的进入没有影响，而是可能在细胞周期的S-G2/M期的转换中发挥作用。结果显示DLP对S期-G2/M的转换是必须的和充分的。这个结果与Dim1在裂殖酵母和啤酒酵母调节G2期的进程一致(Stevens SW and AbelsonJ1999)。因此，针对DLP设计的RNAi在治疗肿瘤中重要意义。另外用MTT分析发现DLP能促进某些细胞如Hela，C2C12细胞的增殖和C2C12细胞的分化。这可能是DLP影响细胞周期的间接作用。DLP瞬时转染到293T细胞，Hela细胞，MCF-7细胞和C2C12细胞，用MTT分析细胞的增殖，发现DLP能明显促进C2C12和Hela细胞的增殖(p＜0.05)。DLP还能促进C2C12细胞的分化，诱导肌管的形成。
用GST Pull-down检测证明DLP与剪接因子存在着相互作用。首先，在原核细胞中表达了DLP，并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用制备的多克隆抗体进行Western Blot检测，能检测到内源性DLP蛋白在MCF-7细胞中的表达。GST Pull-down实验发现DLP与剪接相关因子U5-102KD(Prp6)在体外存在直接的相互作用。为了验证DLP与U5-102KD(Prp6)相互作用的区域，发明人设计了DLP的不同缺失体，缺失体的GSTPull-down研究证实了DLPN端的33个氨基酸是与U5-102KD(Prp6)相互作用的区域。说明DLP的N端是其发挥作用的部位。U5-102KD(Prp6)是一个U4/U6特异的蛋白(Evgen 1999)，Prp6已经被证明和hDim1p在酵母中的同源体Dib1相互作用(Uetz 2000)，Prp6至少含有10个TPR(tetratrico peptiderepeats)结构域(Abovich 1990；Galisson 1993)，U5-102KD含有19个TPR(Evgen 2000)。TPR结构域是多个蛋白质-蛋白质相互作用的结合位点(Sikorslci 1990；Vockhart 1994；Chung 1999)。这个结果更加证实了DLP可能参与Pre-mRNA剪接。接下来用免疫共沉淀和酵母双杂交以及共聚焦的方法进一步验证了DLP和U5-102KD(Prp6)蛋白存在着直接的相互作用，这三种方法都证实了GST Pull-down的结论。而且通过酵母双杂交的方法还筛选出了其它与DLP相互作用的蛋白，其中Homo sapiens nuclear receptorcoactivator 7(ERAP140)在2002年被哈佛大学Myles.Brown实验室克隆鉴定，ERAP140是一个分子量为140KD的核受体的辅助激活子，能增强与它作用的核受体的转录活性。像其它的辅助激活子一样，雌激素可以周期性募集ERAP140到启动子上，但它和以前鉴定的核受体辅助激活子没有任何结构和序列上的相似性(wenlin shao 2002)。这个结果和DLP Pre-mRNA剪接中的作用并不矛盾，而且提示DLP也许与转录的过程相连。DLP与转录激活子的作用与DLP定位于核中是一致的。
发明人设计了体外剪接实验。发现GST-DLP的融合蛋白的加入能刺激Adml-M3剪接底物的剪接，当加入抗GST-DLP的抗体后则抑制了剪接，重新加入GST-DLP融合蛋白则恢复DLP的剪接活性，这些充分证明了DLP确实能参与剪接的过程。
mRNA的转录包括mRNA前体的剪接，mRNA前体的剪接产生成熟mRNA，有利于遗传信息正常传递，剪接异常可导致遗传、肿瘤等疾病。本发明的DLP参与剪接过程，因此可用于制备与剪接异常有关的这类疾病的药物和诊断试剂。
含有DLP核苷酸的表达载体和宿主细胞可用于大量生产DLP。宿主细胞可以是原核细胞如细菌细胞如大肠杆菌；也可以是真核细胞，如酵母细胞，高等真核细胞，如哺乳动物细胞。转化宿主细胞可以按本领域的常规方法进行。针对DLP的抗体可用于拮抗DLP的作用。包括单克隆和多克隆抗体。针对DLP的多克隆抗体可以通过直接免疫动物获得，单克隆抗体可以通过杂交瘤技术来获得。
实施例在以下列举了在实施例中所用的试剂和仪器。
1.1.质粒载体和重组克隆原核表达载体pGEX-4T-3购自Amersham Biosciences。真核表达载体pcDNA3.1(-)/myc/hisB，pEGFP，pDsRed-C1由北大医学部疾病基因中心提供。RNA干扰载体pSURER购自Brummelkamp。
DNA结合结构域载体pGBKT7，pGBKT7-53，pGBKT7-Lam，DNA激活结构域载体pGADT7，pGADT7-T购自Clontech公司。
重组质粒pADML-M3由哈佛大学Reed R.教授赠送。
1.2.菌株1.2.1.细菌菌株DH5α，基因型FΦdlacZΔM15 recA endA1 gyrA96 thi-1hsdR17(rK-mK+)supE44 relAl deoRΔ(lacZYA-argF)U169，Invitrogen。
BL21，基因型E.coil B F-，ompT，hsdS(rB-，mB-)，gal，dcm购自AmershamBiosciences。
1.2.2.酵母菌株

1.3.细胞株C2C12细胞为小鼠骨骼肌细胞，Hela细胞为人子宫颈癌细胞，293T为人胚胎肾细胞。MCF-7细胞为人的乳腺癌细胞，HepG2细胞为人的肝癌细胞，Ishikawa细胞为人的子宫内膜癌细胞由本室保存。
1.4.工具酶及试剂
(1)限制性内切酶，DNA修饰酶，T4DNA连接酶，T7RNA聚合酶购自美国NEW England Biolabs；牛小肠碱性磷酸酶(CIP)购自Promega公司；Taq聚合酶，pfu酶购自Takara公司；RNaseA购自Sigma公司；RnaseA抑制剂购自invitrogen公司。
(2)核苷酸，dNTP和ATP购promega和invitrogen公司。
(3)寡聚核苷酸，以下是用于RNAi的寡聚核苷酸oligo1，5’-GATCCCCCTGCAGTTTATACACAGTATTCAAGAGATACTGTGTATAAACTGCAGTTTTTGGAAA-3’oligo2，5’-AGCTTTTCCAAAAACTGCAGTTTATACACAGTATCTCTTGAATACTGTGTATAAATGCAGGGG-3’1.5.分子量标准DNA分子量标准DL2000购自Takara公司，蛋白质分子量标准购自Novangen公司。
1.6.试剂盒QIAGEN质粒大提试剂盒，胶回收试剂盒，PCR纯化试剂盒购自GENE公司；Adventage cDNA PCR试剂盒购自Clontech公司。Trizon RNA提取试剂盒购自invitrogen公司。ProtoScriptTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自NEB公司。HelaScribe Nuclear Extract in vitro Transcription System，TNTCoupled Reticulocyte Lysate Systems购自Promega公司。Human adultmultiple tissue Northern(MTN)blots，Human cDNA normal tissue first strand，The spotlightTMRandom Primer Labeling Kit购自Clontech公司。
1.7.放射性同位素L-[35S]蛋氨酸，α-[32P]dCTP(10mci/ml)，γ-[32P]dGTP(10mci/ml)购自Amersham Biosciences。
1.8.培养基和文库来源Trypton，Yeast Extract，Agar购自Oxoid公司。酵母YPD培养基(液)、SD培养基(液)的配制按照Clontech公司的要求。人乳腺文库购自Clontech公司。
1.9.化学试剂三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自美国GIBCO-BRL公司。PEG3350，鲑精DNA购自sigma公司。LIPOFECTAMINE2000 Reagent购自invitrogen公司。其它试剂为进口分装或国产分析纯试剂。醋酸锂，各种氨基酸，鲑精DNA购自Clontech公司，X-gal购自Sigma公司。
1.10.主要仪器(1)DNA扩增仪(Perkin-Elmer，USA)，PCR扩增。
(2)紫外凝胶成像系统(UVP GSD5000，UK)。
(3)电击穿孔仪(Gene Pulser，Bio-Rad USA)。
(4)PE公司ABI3700自动测序仪。
(5)Image Master Desk Top Scanner(Pharmacia)扫描仪。
(6)Gyrotory Water BathShaker G76(New Brunswick Scientific Co.，Inc)摇床，用于细菌和酵母的扩增。
(7)杂交炉A10284(Gene company)(8)EL 311 SX酶联免疫检测仪。
(9)Vibra Cell超生破碎仪(Sonic&Material Inc.)。
(10)BECTON DICKINSON FACScan流式细胞仪德国。
1.11.引物名称和序列pcDNA3.1-DLPForward5’ATGAGCTTCCTACTGCCCAAG 3’Reverse5’GCTCTAGATGTGCCTTCTTCTTCATC 3’pcDNA3.1-Prp6Forward 5’ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATACTTTGCTACGGAGTGCAT 3’Reverse5’CCGGAATTCCGGCTGACACGAGACATAAAAACT 3’pcDNA3.1-PQBPForward 5’ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATGGGAGAGGAACAGGGCCCT 3’Reverse5’CCGGAATTCCGGGGTGGGCAGGATCACCAGAA 3’pcDNA3.1-hnRNPFForward 5’ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTCTGGCCATTTCTCTTGAAAC 3’Reverse 5’CCGGAATTCCGGTCAAGTTGAAAAACAAACAAATCT 3’pcDNA3.1-APC4Forward 5’ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATATGTTGCGTTTTCCGACCTG 3’Reverse5’CCGGAATTCCGGTTAGGAGTCTAGCTCAGGGTC 3’pcDNA3.1-Flag-Prp6Forward 5’ATAAGAATGCGGCCGCGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGAC
AAGGAATTCACTTTGCTACGGAGTGCAT 3’Reverse5’CCGGAATTCCGGCTGACACGAGACATAAAAACT 3’pEGFPN1-DLPForward5’GGAATTCATGAGCTTCCTACTGCCCAAG 3’Reverse5’CGGGATCCAATGTCTTGATAGCGAAGGTCATATTTG 3’pGEX-4T-3-DLPForward5’GGAATTCCATGAGCTTCCTACTGCCCAAG 3’Reverse5’AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAACTAAATGTCTTGATAGAGAAGGTCA 3’pGEX-4T-3-DLPDEL 1Forward5’GGAATTCCATGAGCTTCCTACTGCCCAAG 3’Reverse5’AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAATTAAAGCTTCCCCCTCATTGC 3’pGEX-4T-3-DLPDEL2Forward5’GGAATTCCATGAGCTTCCTACTGCCCAAG 3’Reverse5’AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAGGAAAAAAAGCTTCCCCCTCATTGC 3’pGEX-4T-3-DLPDEL3Forward5’GGAATTCCATGGAAGATCCTGTCTGTCTGC 3’Reverse5’AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAACTAAATGTCTTGATAGAGAAGGTCA 3’pDsRedC1-Prp6Forward5’GGAATTCCACTTTGCTACGGAGTGCAT 3’Reverse5’GGGGTACCCTGACACGAGACATAAAAACT 3’pGBKT7-DLPForward5’GGAATTCATGAGCTTCCTACTGCCCAAG 3’Reverse5’ACGCGTCGACGCTAAATGTCTTGATAGAGAAGG 3’pGADT7-Prp6Forward5’GGAATTCACTTTGCTACGGAGTGCAT 3’Reverse5’CATCGATCTGACACGAGACATAAAAACT 3’1.12.核酸序列分析使用序列分析软件DNASTAR对序列进行分析。同源性比较用BLAST进行。
实施例1
总mRNA的提取细胞总mRNA的提取利用Invitrogen公司的TrizolTM试剂。各取1×107的MCF-7细胞，HepG2和Ishikawa细胞，离心收集后，加入1ml TrizolTM试剂，反复吹打以破碎细胞，室温静止5分钟后加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒后，4℃12000rpm 15分钟，收集上清用异丙醇沉淀，70％的乙醇洗一遍，室温干燥后，总RNA重悬于DEPC处理的H2O中，分光光度计定量后用于cDNA第一条链的合成。
cDNA双链的合成利用NEB的ProtoScriptTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，利用2.3所提的mRNA为模板，进行cDNA第一链和第二链的合成。简述如下1ng-2ugmRNA，2ul Primer dT23VN，4ul dNTP，加H2O至16ul反应体系，70℃5分钟，快速冰浴冷却，短暂离心后，加入2ul 10xRT Buffer，1ul RNaseinhibitor，1ul M-MulV Reverse Transcriptase，轻轻混匀后，42℃反应一个小时，95℃5分钟灭活，加1ul(2u)RNase H37℃20分钟，消化RNA。95℃5分钟灭活DNase。稀释反应到50ul，取2-5ul进行PCR反应。
RT-PCR反应反应体系如下2.5ul 10x buffer，4ul dNTP mix，5ul(10uM)DLP上下游引物或GAPDH阳性对照引物，5ul cDNA双链或人成人组织cDNA第一链(Clontech)，0.25ul pfu，3.25ul水。PCR反应条件为94℃ 1分钟；94℃30秒，50℃ 30秒，72℃1分钟，28轮，72℃延伸10分钟。对于阳性对照反应条件为94℃ 2分钟，94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，25轮，72℃延伸10分钟。PCR产物经TAE配制的琼脂糖电泳分离后，切下PCR条带，加三倍体积的结合缓冲液，55℃溶胶，短暂离心后，用PE洗涤缓冲液洗三次，加洗脱缓冲液洗脱。
质粒的构建根据计算机分析的DLP的mRNA序列设计开放性读码框架两端的引物，用此引物将DLP的ORF扩增出来，扩增的产物连接在pGEM-T-Easy载体上进行测序。将DLP的开放性读码框架从pGEM-T-easy载体上用EcoRI切下，再用EcoRV和BamHI酶切，纯化后将之连接在经EcoRv和BamHI酶切后的真核表达载体pcDNA3.1(-)/myc/HisB，得到pCDNA3.1-DLP。设计DLP编码区引物，两端设计EcoRI和BamHI的酶切位点，DLP的编码区用PCR从pCDNA3.1-DLP上扩增，酶切后连到经EcoRI-BamHI酶切后pEGFP-N1的表达载体中，得到pEGFP-DLP重组质粒，此载体可以在真核细胞中表达加强的绿色荧光蛋白(EGFP)和DLP的融合蛋白，DLP的读码框架和EGFP一致，将此载体转染真核细胞后，可以在荧光显微镜下观察DLP所在的部位。设计DLP编码区引物，两端设计EcoRI和NotI的酶切位点，DLP的编码区用PCR从pCDNA3.1-DLP上扩增，酶切后连到经EcoRI-NotI酶切后pGEX-4T-3的表达载体中，得到pGEX-DLP的重组质粒。此载体可以在E.coil BL21中表达GST和DLP融合蛋白。利用Clontech公司的AdvantangeTM-cDNA PCR试剂盒，从人的cDNA panel扩增出hnRNPF，PQBP，APC4和Prp6的cDNA序列，引物两端设计NotI和EcoRI的酶切位点，酶切后连到pcDNA3.1(-)/myc/HisB载体上，得到pcDNA3.1-hnRNPF，PQBP，APC，Prp6的重组质粒，可以在体外转录翻译，用GST Pull-down研究与DLP的相互作用。对于DLP缺失体的构建，缺失体1(1-128)，缺失体2(21-126)，缺失体3(33-149)引物两端设计EcoRI和NotI的酶切位点，从pcDNA3.1-DLP上扩增，酶切后连到处理过的pcDNA3.1(-)/myc/HisB，得到不同缺失体的重组质粒。为了研究DLP和Prp6在真核细胞中是否共定位，构建Prp6与红色荧光蛋白的重组质粒，设计Prp6的引物，两端引物引入EcoRI和KpnI的酶切位点，将Prp6全长从pcDNA3.1-Prp6上扩增，酶切后连到EcoRI和KpnI酶切过的pDsred-C1(Clontech)载体上，得到pDsred-Prp6的重组质粒。此载体可以在真核细胞中表达红色荧光蛋白(Red)和Prp6的融合蛋白，将此载体转染真核细胞后，可以在荧光显微镜下观察Prp6所在的部位。为了研究DLP和Prp6的体内相互作用，构建了带Flag标签的重组质粒。设计引物，上游引入NotI位点和Flag标签序列，下游引入EcoRI的酶切位点，从pcDNA3.1-prp6上扩增出，酶切后连pcDNA3.1载体上。
对于酵母双杂研究，诱饵蛋白pGBKT7-DLP的构建如下DLP的读码框架用PCR从pSUPER-DLP上扩增，PCR产物用EcoRI和SalI消化，连接到pGBKT7(Clontech)载体上。Prp6的编码区用PCR从pcDNA3.1-Prp6上扩增，PCR产物用EcoRI和CalI消化，连接到pGADT7(Clontech)载体上。
质粒的提取和纯化用于测序和基因克隆操作的质粒纯化采用《分子克隆(第二版)》的碱裂解法和天为时代的小提质粒试剂盒。用于转染真核细胞的质粒用Qiagentip-20 Minipreparation Kit(质粒纯化)挑单菌落于3ml LB培养基中，培养12-16小时，离心，重悬于0.3ml Buffer P2，颠倒4-6次，室温放置5分钟。加4℃预冷的Buffer P3中，颠倒4-6次，冰浴5分钟。高速离心，上清加经1ml Buffer QBT平衡好的Qiagen-tip 20柱中，用1ml Buffer QC洗柱，重复三次，加0.8ml Buffer QF洗脱质粒，加0.7倍体积的异丙醇，室温高速离心30分钟。弃上清，用70％的乙醇洗两遍。空气干燥5分钟，溶于H2O中。
测序使用ABI公司的3700DNA测序仪测序。测序结果如图1所示。
Northern Blot探针的标记和杂交操作参照Clontech公司的SpotlightTMRandom PrimerLabeling Kit试剂盒说明书。过程简述如下(1)探针标记25ng-1ug DNA溶于20ul体积中，90-100℃ 2-3分钟，迅速冰浴5分钟，加5ul[α-32P]dCTP标记的Random Primers and ReactionBuffer Mix，补水至50ul，37℃孵育5-10分钟。
(2)杂交68℃预热杂交液，将吸附有核酸的尼龙膜放入含又杂交液的杂交瓶中，加入含有100ug/ml的鲑精DNA的杂交液0.1ml/cm2，68℃预杂交30分钟。20ng/ml探针混入杂交液，95℃2-5分钟，冰浴5分钟。加入杂交瓶，68℃杂交1小时。
(3)洗膜用Wash Buffer 1室温洗膜30-40分钟，用Wash Buffer 2 50℃洗膜40分钟。
(4)显色用镊子取出膜，洗干Wash Buffer 2，用保鲜膜覆盖，-70℃曝光1-3天后显影，定影。
DLP在原核细胞中的表达和纯化GST-DLP可以在大肠杆菌BL21菌株中30℃中诱导表达GST-DLP的融合蛋白，首先制备BL21的感受态细胞挑取单克隆到适量培养基中，37℃250rpm培养至A600 0.4-0.5，2500g离心15分钟，备用。将1-50ngGST-DLP转化到感受态细胞中，用Glutathione Sepharose 4B进行纯化，纯化的步骤如下(1)挑取单克隆到2-3ml LBA培养基中培养4-5小时。转到100ml的锥形瓶中生长过夜。
(2)转到500ml的锥形瓶中培养3-5小时。
(3)加0.5ml 1M IPTG 30℃培养3个小时。
(4)3000rpm 10分钟离心收集细胞。
(5)用25ml PBS重悬细胞。超声10分钟。
(6)加1.25ml 20％ Triton X-100，混匀1小时。
(7)1000rpm 10分钟离心，加入0.5ml 50％slurry of Glutathione Sepharose 4B，室温30分钟。
(8)1000rpm 5分钟离心，PBS洗三遍。
(9)用0.5ml洗脱buffer洗脱，短暂离心后收集上清。
结果，DLP在大肠杆菌中获得成功的表达，纯度可达90％以上。
实施例2
抗GST-DLP多克隆抗体的制备和Western blot印迹杂交纯化的GST-DLP融合蛋白用来免疫新西兰大白兔以制备抗DLP的多克隆抗体。对于Western blot，提取的蛋白质利用Bio-Rad公司的DC蛋白定量试剂进行定量后，进行15％的SDS-PAGE电泳，电泳后将蛋白质电转移到硝酸纤维膜上。膜用5％的脱脂奶粉封闭2小时后，加入1∶30稀释的兔抗DLP多抗或1∶5000稀释的anti-c-myc的单克隆抗体(Invitrogen)4℃过夜，用TBST洗三遍后)(10分钟/次)，加入1∶4000稀释的辣根酶标记的抗兔IgG(Amersham Pharmacia Biotech)或羊抗鼠IgG(Santa Cruz)，孵育1小时，膜用TBS再洗三遍后加入底物液进行显色。
实施例3GST Pull-down利用Promega公司的TNT Rabbit Reticulocyte lysate and TNT T7polymerase labels试剂盒，在体外转录翻译pcDNA-Prp6，hnRNPF，PQBP andAPC4。步骤如下(1)在1.5ml管中按如下顺序加入试剂25ulTNT溶解产物2ul TNT反应缓冲剂1ul TNT RNA聚合酶1ul 氨基酸混合物，minus Met(1mM)2ul [35S]甲硫氨酸(＞1000ci/mmol)1ul Rnasin Ribonuclease inhibitor2ul pcDNA-Prp6，hnRNPF，PQBP and APC416ul不含核酸酶的水50ul总体积30℃作用90分钟。
(2)在1.5ml管中加入50ul glutathione agarose beads，500ng-10ug GST或GST-DLP，4-5ul体外转录翻译产物。
(3)4℃孵育2小时，13000rpm 2分钟，弃上清。用1ml预冷的裂解缓冲液洗glutathione agarose beads。
(4)13000rpm离心1分钟，弃上清，重复洗两次。
(5)用50ul 20mM还原谷胱甘肽洗脱，室温10分钟。
(6)13000rpm离心2分钟。
(7)加入2xSDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸5分钟。上样12％SDS-PAGE聚丙烯酰氨胶。
(8)取下凝胶，室温固定30分钟。
(9)在干胶仪上干燥30-90分钟。
(10)-70℃曝光，4-16小时后显影。
结果发现DLP与U5-102KD(酵母中的同源体为Prp6)存在相互作用，与PQBP、hnRNPF及APC4没有相互作用(图2)。为了研究DLP与Prp6相互作用的部位，构建了DLP的不同缺失体。GST Pull-down实验证明DLP的N端1-33aa与Prp6相互作用(图3)。
实施例4免疫共沉淀(1)MCF-7细胞培养至106，用LIPOFECTAMINE 2000试剂转染pcDNA-Flag-Prp6重组质粒。
(2)48小时后，收集细胞，先用预冷的PBS洗两遍，用细胞刮刀将细胞刮下，PBS重悬。
(3)2000g离心5分钟，弃上清，加入裂解缓冲液[50mM Tris-HCL PH7.5，100mM Nacl，10％(v/v)glycerol，0.1％(v/v)NP-40，1mM dithiothreitol，1mMEDTA，protease inhibitor cocktail]孵育10分钟。
(4)超声两次，每次10秒钟裂解细胞，裂解液和Protein-A-Sepharose在4℃孵育2小时。
(5)14000g离心10分钟，上清分别加入免疫前血清或抗Flag抗体(invitrogen)(1ug)，4℃孵育16小时。免疫复合物用Protein-A-Sepharose捕获。
(6)6000g离心10分钟，Protein-A-Sepharose用NETN Buffer[20mM Tris(PH8.0)，1mM EDTA，900mM Nacl，0.5％(v/v)NP-40，Protease inhibitor cocktail]洗4-5遍。
(7)95-100℃5分钟，加入2xSDS上样缓冲液。免疫复合物在12％SDS变性聚丙烯酰氨凝胶上分离。
(8)取下凝胶，电转移到硝酸纤维素膜上，加入5％的脱脂奶粉室温封闭1-2小时。
(9)加入抗GST-DLP的多克隆抗体(1∶30)，室温1-2小时。
(10)TBST洗膜3次，每次10分钟。
(11)加入辣根酶偶连的猴抗兔IgG(Amersham Pharmacia Biotech)的二抗，室温孵育1-2小时。
(12)TBST洗膜三次，每次10分钟。
(13)用Pharmacia公司的ECL试剂曝光。
为了检测DLP和Prp6在细胞内相互作用，MCF-7细胞用pcDNA3.1-Flag-Prp6转染，提取总蛋白，用抗Flag的单克隆免疫沉淀，然后Western blotting抗GST-DLP的多克隆抗体检测DLP。结果发现，DLP的确能和带Flag标签的Prp6相互作用，这和GST Pull-down的结果是一致的。
DLP在细胞内的定位及与Prp6的共定位利用CLONTECH公司的pEGFP-N1 N末端蛋白融合载体构建了pEGFPN1-DLP载体，它可以在真核细胞内表达GFP-DLP的融合蛋白，将这些载体用LipofectinTM的方法转染进MCF-7细胞中，转染的细胞进行爬片，24小时后，片子用PBS洗三遍，用PBS/4％多聚甲醛进行固定，室温15分钟，然后用PBS洗三遍。用0.1％的Triton/PBS透化15分钟，然后用PBS洗三遍，加入200ul 2.5mg/ml的DAPI，室温作用30分钟，然后用PBS洗三遍后，在荧光显微镜下分别用常规荧光波长和DAPI波长进行观察，并进行拍照。
为了研究DLP和Prp6是否在真核细胞中相互作用，利用CLONTECH公司的pDsred-C1 C末端蛋白融合载体构建了pDsredC1-Prp6载体，它可以在真核细胞内表达pDsred-Prp6的融合蛋白。将pEGFP-DLP和pDsred-Prp6载体用LipofectinTM的方法转染进MCF-7细胞中，转染的细胞进行爬片，24小时后，片子用PBS洗三遍，用PBS/4％多聚甲醛进行固定，室温15分钟，然后用PBS洗三遍。在荧光显微镜下分别用常规荧光波长进行观察，并进行拍照。
为了进一步证实DLP和Prp6的相互作用，做了DLP和Prp6的亚细胞共定位。pEGFP-DLP和pDsRed-Prp6的融合表达载体被共转染进MCF-7细胞。转染后24小时，用共聚焦显微镜观察两者的共定位。结果发现，所标记的绿色和红色荧光主要在细胞核内观察到并且重叠，表明DLP和Prp6存在相互作用，并且和Pre-mRNA剪接有关。
实施例5体外剪接实验先利用Promega公司的HelaScribe Nuclear Extract in vitro TranscriptionSystem在体外转录Pre-mRNA剪接底物。步骤如下(1)用XbaI将剪接底物pAdML-M3 mRNA线性化。利用Gene公司的胶回收试剂盒回收纯化。
(2)在1.5ml无菌的硅化管中依次加入以下成分6ul Hela Nuclear Extract 1X Transcription Buffer
2ul Mgcl250mM1ul 25X rNTP Mix5ul lined pAdML-M3 mRNA subtracts1ul[α-32P]rGTP(3000Ci/mmol，10mCi/ml)5ul Nuclease-Free ddH2O5ul HelaScribe Nuclear Extract25ul 总体积(3)30℃孵育60分钟。
(4)25℃预热Hela Extract stop buffer 1小时，加175ul到反应体系终止反应。
(5)加200ul TE饱和的酚，混匀60秒，14000g离心5分钟。
(6)转移150ul上清到一干净的1.5ml管。
(7)重新加入200ul终止Buffer，用酚重新抽提一次。如上混匀离心。两次上清加入300ul氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，混匀并短暂离心。
(8)转移上清到一新的无菌的硅化管。
(9)加700ul 100％的乙醇，混匀。-70℃至少15分钟。
(10)转移乙醇混合物到一个无菌1.5ml的微离心管。14000g 4℃离心10分钟。
(11)小心移走上清，室温干燥。用10-20ul无核酸酶的水溶解RNA。
(12)加入2X SDS loading buffer，100℃ 5分钟。
(13)在含有7M尿素的6％变性聚丙烯酰氨胶上分离RNA.
(14)从胶上切下全长RNA，加入洗脱缓冲液(0.75M醋酸胺，10mM醋酸镁，0.1％SDS，0.1mM EDTA)过夜。
(15)洗脱的RNA用0.45um的滤器分离，乙醇沉淀，用无核酸酶的水溶解RNA。
剪接过程简述如下(1)1.5ml无菌的微离心管中依次加入下述溶液6-8ul Hela Nuclear Extract5ul[α-32P]-radiolabled transcription products1.25ul 50mM Mgcl23.75ul 100mM ATP1.28ul 20mM creatine phosphate1.25ul 10mM DTT1ulRnasin inhibitor(40u/ul)
5-6ul Nuclease-Free ddH2O(or pre-immune，GST，GST-DLP，Anti GST-DLP antibody) —25ul 总体积(2)30℃孵育1小时。
(3)加入终浓度为4ug/ml和0.1％的蛋白酶K和SDS终止反应。37℃孵育20分钟。用125mM Tris(PH8.0)，1mM EDTA，0.3M醋酸钠稀释体积到100ul。
(4)用200ul TE饱和的酚/氯仿∶异戊醇抽提一遍。14000g离心5分钟。
(5)转移上清到一新的微离心管，用200ul氯仿抽提一遍。14000g离心5分钟。
(6)转移上清到一新的微离心管，用300ul无水乙醇沉淀RNA，-80℃过夜。
(7)14000g离心10分钟，弃上清，室温干燥。
(8)20ul DEPC处理的水溶解RNA。加入等体积的2x SDS loadingbuffer。
(9)90-100℃ 5分钟，在含有7M尿素的12％变性聚丙烯酰氨胶上分离RNA。
(10)室温固定30分钟，干胶90分钟。
(11)-80℃曝光1-2天后，显影。
体外剪接实验用来证实DLP在剪接中的作用，32p标记的Adml-M3Pre-mRNA被合成，在标准剪接条件下和Hela细胞的核提取物孵育。在剪接实验中，抗GST-DLP的多克隆抗体用来抵消Hela细胞中内源性DLP的作用。如图4所示，加入非特异的血清对剪接没有明显的影响。加入抗GST-DLP的多克隆抗体后明显抑制剪接，过量的原核细胞纯化的GST-DLP融合蛋白则可以恢复Adml-M3 Pre-mRNA的剪接。这些结果表明DLP参与Adml-M3 Pre-mRNA的剪接。
实施例6RNAi重组质粒的构建和Western blotting利用pSUPER载体构建DLPRNAi的重组质粒，简述如下(1)选择DLP开放性读码的197-215bp，设计寡核苷酸序列。
Oligo15’GATCCCCCTGCAGTTTATACACAGTATTCAAGAGATACTGTGTATAAACTGCAGTTTTTGGAAA 3’Oligo2
5’AGCTTTTCCAAAAACTGCAGTTTATACACAGTATCTCTTGAATACTGTGTATAAATGCAGGGG 3’(2)寡核苷酸被重悬在退火buffer(100mM potassium acetate，30mMHEPES-KOH，PH7.4，2mM acetate)，95℃4分钟，70℃ 10分钟，然后冷却到室温以产生双链DNA。
(3)双链DNA用磷酸化酶磷酸化并插入到用BglII/HindIII处理过的pSUPER载体中。
(4)DLP RNAi的重组质粒用LIPOFECTAMINE 2000试剂转染MCF-7细胞。48小时后，收集细胞，用GST-DLP的多克隆抗体检测DLP被抑制的程度。步骤如前所述。
为了进一步验证DLP RNAi是否能抑制内源性DLP mRNA，用DLPRNAi转染MCF-7，HepG2和Ishikawa细胞，提取mRNA，反转录做RCR，发现DLP RNAi的确能抑制这三种细胞中DLP的内源性表达(图5)。
实施例7流式细胞仪检测细胞周期(1)细胞的准备MCF-7细胞用pcDNA-DLP和pSUPER-DLP的重组质粒转染，转染后12小时，加入雌激素抑制剂ICI182780至终浓度10nM，48小时后，贴壁细胞经0.25％胰酶消化约10分钟，吹落细胞离心收集，2000rpm，10分钟。用PBS洗两遍，加70％的乙醇固定过夜。
(2)染色程序细胞经离心，PBS洗一遍，加入PI染液使终浓度为50ug/ml，RnaseA使终浓度为100U/ml，室温染30分钟。上流式细胞仪检测细胞周期的变化。
MTT法测定细胞的增殖为了检测DLP对细胞生长的影响，pcDNA3.1-DLP和pSUPER-DLP重组质粒被瞬时转染至C2C12、293T、Hela和MCF-7细胞中。细胞培养终止前4小时，在培养孔中加入10ul 10mg/ml的MTT(溶在PBS中)，细胞继续培养4小时后加入裂解液(50％DMSO，20％SDS，PH4.4)后过夜，第二天用酶标仪测定570mM波长的光吸收值。
MCF-7细胞被pSUPER-DLP或pcDNA3.1-DLP转染，24小时后，加入雌激素抑制剂ICI182780作用16小时，细胞被阻滞在G0/G1期。细胞被收集，用流式细胞仪检测细胞周期的变化。相应的蛋白质水平用WesternBlotting检测。如图6所示，内源性的DLP被沉默后，G2/M期的细胞所占的百分比明显减少，S期的百分比升高。另一方面，DLP的过表达导致G2/M期细胞数明显升高。然而当用雌激素抑制剂ICI182780将细胞周期阻滞在G0/G1期，DLP的过表达对细胞周期没有明显影响。这些结果表明DLP在细胞周期的S-G2/M期扮演一个重要角色。
细胞分化实验C2C12细胞被pcDNA-DLP的细胞转染，24小时后，更换含有2％马血清的培养基继续培养4-5天，每天更换同样的培养基。48小时后，细胞用PBS洗两遍，用Wright-Gimsa室温染色1小时，荧光显微镜观察。
DLP在C2C12、293T、Hela和MCF-7细胞中过表达，然后用MTT分析对细胞增殖的影响。DLP的过表达能刺激C2C12和Hela细胞的增殖，在293T和MCF-7中作用不明显。另外还发现DLP能促进小鼠骨骼肌细胞C2C12的分化，能促进骨骼肌肌管的形成。这些结果与DLP影响细胞周期的过程是一致的。
序列表SEQUENCE LISTING<110>尚永丰<120>DLP参与Pre-mRNA剪接与细胞周期调控的用途<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>451<212>DNA<213>大肠杆菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(447)<223>
<400>1atg agc ttc cta ctg ccc aag ctg act agc aaa aag gaa gta gac cag 48Met Ser Phe Leu Leu Pro Lys Leu Thr Ser Lys Lys Glu Val Asp Gln1 5 10 15gcg ata aaa agt act gct gag aag gtg ttg gtt ctc agg ttt ggg aga 96Ala Ile Lys Ser Thr Ala Glu Lys Val Leu Val Leu Arg Phe Gly Arg20 25 30gat gaa gat cct gtc tgt ctg cag cta gat gat att ctt tct aag acc 144Asp Glu Asp Pro Val Cys Leu Gln Leu Asp Asp Ile Leu Ser Lys Thr35 40 45tct tct gac tta agt aaa atg gct gct ata tac ctg gta gat gtg gac 192Ser Ser Asp Leu Set Lys Met Ala Ala Ile Tyr Leu Val Asp Val Asp50 55 60caa act gca gtt tat aca cag tat ttt gac atc agt tat att cca tct 240Gln Thr Ala Val Tyr Thr Gln Tyr Phe Asp Ile Ser Tyr Ile Pro Ser65 70 75 80act gtc ttt ttc ttc aat ggg cag cat atg aaa gtg gat tat gga tct 288Thr Val Phe Phe Phe Asn Gly Gln His Met Lys Val Asp Tyr Gly Ser85 90 95cca gat cac act aag ttt gtg gga agc ttc aaa acc aaa caa gac ttc 336Pro Asp His Thr Lys Phe Val Gly Ser Phe Lys Thr Lys Gln Asp Phe100 105 110ata gat ttg att gaa gta atc tat cga gga gca atg agg ggg aag ctt 384Ile Asp Leu Ile Glu Val Ile Tyr Arg Gly Ala Met Arg Gly Lys Leu115 120 125att gtc caa agt cct att gat ccc aag aat att ccc aaa tat gac ctt 432
序列表Ile Val Gln Ser Pro Ile Asp Pro Lys Asn Ile Pro Lys Tyr Asp Leu130 135 140ctc tat caa gac att tagt451Leu Tyr Gln Asp Ile145<210>2<211>149<212>PRT<213>大肠杆菌<400>2Met Ser Phe Leu Leu Pro Lys Leu Thr Ser Lys Lys Glu Val Asp Gln1 5 10 15Ala Ile Lys Ser Thr Ala Glu Lys Val Leu Val Leu Arg Phe Gly Arg20 25 30Asp Glu Asp Pro Val Cys Leu Gln Leu Asp Asp Ile Leu Ser Lys Thr35 40 45Ser Ser Asp Leu Ser Lys Met Ala Ala Ile Tyr Leu Val Asp Val Asp50 55 60Gln Thr Ala Val Tyr Thr Gln Tyr Phe Asp Ile Ser Tyr Ile Pro Ser65 70 75 80Thr Val Phe Phe Phe Asn Gly Gln His Met Lys Val Asp Tyr Gly Ser85 90 95Pro Asp His Thr Lys Phe Val Gly Ser Phe Lys Thr Lys Gln Asp Phe100 105 110Ile Asp Leu Ile Glu Val Ile Tyr Arg Gly Ala Met Arg Gly Lys Leu115 120 125Ile Val Gln Ser Pro Ile Asp Pro Lys Asn Ile Pro Lys Tyr Asp Leu130 135 140Leu Tyr Gln Asp Ile145<210>3
序列表<211>64<212>DNA<213>人工合成<400>3gatccccctg cagtttatac acagtattca agagatactg tgtataaact gcagtttttg60gaaa 64<210>4<211>63<212>DNA<213>人工合成<400>4agcttttcca aaaactgcag tttatacaca gtatctcttg aatactgtgt ataaatgcag60ggg 6权利要求
1.参与Pre-mRNA剪接与细胞周期调控的DLP蛋白，其特征在于它具有如序列2所示的氨基酸序列。
2.编码DLP蛋白的核苷酸序列，其特征在于它含有如序列1所示的核苷酸序列。
3.含有权利要求2的核苷酸序列的表达载体。
4.权利要求1的DLP在制备与Pre-mRNA剪接或细胞周期调控有关的试剂或药物中的用途。
5.权利要求1的DLP的抗体。
6.针对DLP设计的RNAi。
7.根据权利要求6的RNAi，其特征在于它具有序列3或4所示的基因序列。
8.含有权利要求6或7的RNAi的原核或真核表达载体。
9.权利要求6、7或8的RNAi用于制备治疗肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及DLP蛋白，编码DLP的基因，DLP在制备与Pre－mRNA剪接与细胞周期调控有关的试剂和药物中的应用，本发明还涉及针对DLP设计的RNAi(RNA干扰)在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
文档编号A61P35/00GK1631899SQ200410009850
公开日2005年6月29日 申请日期2004年11月24日 优先权日2004年11月24日
发明者尚永丰, 沈岩, 孙晓静 申请人:北京大学