专利名称：采用生物反应器制备双层活性人工皮肤组织的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备具有真皮和表皮双层结构的活性人工皮肤组织的方法，特别涉及一种采用生物反应器制备活性人工皮肤组织的方法。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，起着保护机体内环境并维持其稳定的作用，由于其处于人体的体表，易受各种损伤和产生疾病。以皮肤移植治疗各种急性和慢性皮肤病已有几千年历史，传统治疗方法是采用自体或异体移植，但由于自体移植皮肤来源有限，异体皮肤移植存在排斥反应、传播疾病、保藏困难等问题，难以满足患者移植需要。近年来，皮肤移植已开始从自体皮肤移植和同种异体移植发展到组织工程化皮肤替代物移植，寻求理想的永久性皮肤替代物成为人们梦寐以求的目标。
组织工程化皮肤分为表皮替代物、真皮替代物和双层活性皮肤。1975年Rheinwald和Green建立了角质细胞体外培养和扩增技术(RheinwaldJG，Green H.Serial cultivation of human epidermal keratinocytesthe formationof keratining colonies from single cell.Cell，1975，6331-336)，随后O’Connor和Gallico分别报道了体外培养的表皮替代物用于治疗烧伤患者并获得成功(O’Connor NE，Mulliken JB，Banks-Schlegel S，et al.Graftingof burns with cultured epithelium prepared form autologous epidermalcell.Lancet，1981，175.Gallico GG，O’connor NE，Comton CC，etal.Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured humanepithelium.N Engl J Med，1984，311448-451)。目前这类替代物在治疗大面积烧伤时仍有应用，但其存在以下缺点培养周期长，抗感染能力差，缺乏真皮成分，收缩大，不耐磨，易破溃，弹性欠佳，移植成功率低，因而在临床应用上受到一定限制。为了克服这些问题，研究者开发了真皮替代物，其可提高表皮替代物移植成功率和改善愈合质量，且已有多种商品化的真皮替代物已应用于临床。Integra是由美国Integra lifesciences公司生产的胶原-氨基多糖真皮替代物(Phillips TJ，Arch Dermatol，1998，110(6)344-349.)，其缺点是价格昂贵，不能广泛应用，植入后不易观察创面早期感染情况，尤其是需二次手术才能封闭创面。Hansbrough等将成纤维细胞接种至聚乳酸网构建真皮替代物，并命名为Dermagraft，临床上已成功用于治疗糖尿病性溃疡。单纯真皮替代物由于缺少表皮的防护，感染率高。
理想的皮肤替代物应是能够将所缺失的真皮和表皮层同时修复，美国Organogenesis公司生产的Apligraf是第一种双层活性的皮肤替代物，其真皮层是由成纤维细胞、牛I型胶原、培养基等组成的凝胶，表面接种角质细胞，体外培养20天左右构成双层皮肤组织，临床证明对各种顽固性和慢性皮肤溃疡有一定疗效，但因该产品及其制备工艺存在严重缺陷，导致临床应用受阻，如胶原凝胶严重收缩，抗胶原酶降解能力差，且由于人工皮肤构建是在培养皿中静止条件下进行，细胞培养环境无法控制，营养物及副产物的传递能力有限，不利于胶原凝胶内部细胞生长，加之手工操作，造成生产过程复杂，组织均一性和质量稳定性得不到保障。
美国专利RE35,399和中国发明专利(申请号91109937.9)阐述了一种双层皮肤替代物的制备方法，该皮肤替代物是由三部分组成培养的角质细胞构成表皮，中间是无孔胶原层，在多孔、交联化的胶原海绵基质上培养成纤维细胞构成真皮层。首先从皮肤样品中分离角质细胞和成纤维细胞，经体外培养后，将成纤维细胞接种到胶原海绵上，把海绵的另一面制成无孔胶原，将角质细胞“滴降”到无孔胶原上，培养后形成皮肤替代物。由于该皮肤替代物是在培养皿中生产的，一方面造成接种的成纤维细胞大部分截留在胶原海绵表面，并且在胶原海绵中分布不均匀，使构建的组织在解剖学结构上与天然组织有很大差别，另一方面如上所述静止培养过程不利于细胞生长和基质分泌，再者各培养皿之间、批与批之间的差异较大。
Halberstadt(Halberstadt CR，Hardin R，Bezverkov K，et al.The in vitrogrowth of a three-dimensional human dermal replacement using a single-passperfusion system，Biotechnol Bioeng，1994，43740-746.)等人将2×105cells/cm2的人成纤维细胞接种到PGA/PLA材料制成的多孔网状支架上，通过一种封闭的单向灌注培养系统，经过2-～3周的培养可以构建出具有生物学活性的真皮替代物，并可有效地重复生产真皮组织替代物。其优点在于与静止培养相比可以缩短真皮构建的时间；PGA/PLA支架材料的降解速度可控；构建的人工真皮可直接冷冻保存；但此系统只限于构建人工真皮。
Prenosil和Villeneuve(Prenosil JE，Villeneuve PE.Automated productionof cultured epidermal autograpts and sub-confluent epiderlmal autografts in acomputer controlled bioreactor.Biotechnol Bioeng，1998，59679-683.)将人的表皮细胞直接接种到FEP膜上，而FEP膜放置在聚碳酸酯生长室内，多个生长室可堆叠起来，通过连接在一个多管道的蠕动泵上，可以自动进行流量控制。其优点在于由于聚碳酸酯材料做的支撑板是透明的，可以监测表皮的形成情况。同样，此反应器系统只限于构建表皮替代物，无法实现双层活性皮肤的体外构建。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种采用生物反应器制备双层活性人工皮肤组织的方法，以克服现有技术存在的上述不足，满足有关领域的需要。
本发明的方法包括如下步骤(1)以复合胶原海绵为支架材料，置于灌注式生物反应器的多孔支架上，加入含5～15％新生牛血清的DMEM培养基，浸泡过夜，弃培养基，按1×105cells/cm2～5×106cells/cm2细胞密度将成纤维细胞悬液加入反应器中，通过蠕动泵进行灌注接种，至培养液中残留的细胞密度低于接种密度的5～20％后，进行灌注培养，同时检测反应器出口处培养液中葡萄糖浓度。调节培养基灌注速度为0.5～4d-1，控制出口处葡萄糖浓度不低于1.0～2.0g/L。在此反应器中经10～20d的灌注培养，完成真皮构建；(2)用角质细胞无血清培养基代替新生牛血清的DMEM培养基，在上述人工真皮上按密度1×105cells/cm2～5×106cells/cm2接种角质细胞，静止培养1～2d后，用角质细胞培养基灌注培养2～5d，灌注速率为0.5～2d-1。而后去除角质细胞无血清培养基，采用含2～10％新生牛血清的DMEM培养基进行气液界面培养，同时检测反应器出口处培养液中葡萄糖浓度，控制灌注速率为0.5～4d-1，使葡萄糖浓度不低于1.0～2.0g/L。培养8～14d后，完成表皮构建。
所说的复合胶原海绵由氨基多糖类物质和胶原溶液组成，氨基多糖类物质含量为胶原干重的5～25％(g/g)；所说的氨基多糖类物质包括壳聚糖、6-硫酸软骨素、透明质酸或肝素纳中的一种或一种以上。
其中所说的胶原溶液为牛筋去筋膜、脂质制成的肌腱粉末浸泡于醋酸溶液中而获得的胶原-HAc溶液，其浓度一般为5.0～10.0mg/mL，该胶原-HAc溶液是这样制备的牛筋去筋膜、脂质制成肌腱粉末，浸泡于醋酸溶液中，制得终浓度为8.0mg/mL的胶原-HAc溶液。或者直接购买商品化的胶原，配制成终浓度为5.0～10.0mg/mL的胶原-HAc溶液。
所说的复合胶原海绵是这样制备的将壳聚糖、6-硫酸软骨素、透明质酸和肝素纳一种或一种以上加入胶原-HAc溶液，-20℃冰箱冷冻过夜，真空冷冻干燥24hr，采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(Sigma)对胶原海绵进行化学交联，清洗，冻干，消毒，即获得所说的复合胶原海绵。此复合胶原海绵经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺交联后，能够克服单纯胶原凝胶或胶原海绵机械强度不够、收缩率高、降解速度过快、戊二醛交联具细胞毒性等缺点，并且可改善材料的生物相容性，促进在三维支架材料上细胞的贴附和增殖；所说的角质细胞为从表皮组织中分离的角质细胞，分离方法为一种常规的方法，在Johnson EW，Meunier SF，Roy CJ，Parenteau NL.Serialcultivation of normal human keratinocytesa defined system for studying theregulation of growth and differentiation.In Vitro Cell Dev Biol，1992，28A429-435.文献中已经有详细的报道；所说的成纤维细胞为从真皮组织中分离的成纤维细胞，分离方法为一种常规的方法，在Halberstadt CR，Hardin R，Bezverkov K，et al.The in vitrogrowth of a three-dimensional human dermal replacement using a single-passperfusion system，Biotechnol Bioeng，1994，43740-746.文献中已经有详细的报道；所说的灌注式生物反应器在中国专利申请号200410016651.6中有公开的描述。
所说的角质细胞无血清培养基在中国专利申请号200410016367.9中有详细的描述，其特征在于此无血清培养基为一种水溶液，包括基础培养基和以下的组分基础培养基12-18g/L组氨酸0.1-1.0mmol/L异亮氨酸 0.1-0.6mmol/L色氨酸0.05-0.3mmol/L苯丙氨酸 0.3-0.6mmol/L赖氨酸0.7-1.2mmol/L甲硫氨酸 0.05-0.3mmol/L酪氨酸0.3-0.6mmol/L
角质细胞生长因子 20-200ng/L和/或表皮生长因子5-20ng/L泛酸盐 0.02-0.04mmol/L氯化胆碱 0.1-0.5mmol/L叶酸 0.01-0.03mmol/L肌糖 0.1-0.4mmol/L烟酰胺 0.05-0.5mmol/L维生素B6 0.02-0.06mmol/L核黄素 0.001-0.01mmol/L硫胺 0.01-0.03mmol/L胰岛素 1-20μg/L转铁蛋白 1-20μg/L乙醇胺 0.01-0.05mmol/L磷酸乙醇胺 0.01-0.05mmol/L氯化锶 1-5mmol/L牛血清白蛋白 5-20μg/L氢化可的松 0.1-1μg/L三碘甲状腺胺 10-40pmol/L氯化钙 0.03-0.5mmol/L氯化镁 5-10mmol/L抗氧化剂 适量青霉素 50-200U/L链霉素 50-200U/L所说的基础培养基包括MCDB153、无钙DMEM或无钙DMEM与Ham′s F12以体积比为1∶0.3～3的混合物。
所说的抗氧化剂包括巯基乙醇0.01-0.05mmol/L和/或过氧化氢酶50-150U/L和/或超氧化物歧化酶50-150U/L和/或亚硒酸钠0.01-0.05mmol/L。
采用新型的生物反应器系统，可以在同一反应器中构建具有真皮层和表皮层的双层活性人工皮肤，避免了以往生物反应器系统只可构建人工真皮或人工表皮的局限性，同时通过反应器的叠加，使一次制备过程可以同时构建多块人工皮肤，与手工操作相比，制备过程更有效且可重复。
采用生物反应器系统制备具真皮和表皮双层结构的活性人工皮肤，使制成的人工皮肤具一定机械强度、延缓降解速度、细胞和胞外基质在材料中分布均匀，制备周期短，生产可重复，批与批之间差异小等特点。
与以往制备方法相比，采用灌注接种和培养方式，一方面物质的传递方式由被动扩散变成主动传递，使细胞在胶原海绵中的分布更均匀，有利于组织的形成、细胞生长和细胞胞外基质的分泌，在此动态培养环境中，一定程度上能够减轻营养物和副产物的扩散限制，降低了在三维材料内部营养物耗竭和副产物毒性对细胞正常生长和代谢的影响，从而进一步改善工程化组织的结构、成分和功能；另一方面采用灌注培养方式，根据反应器进出口葡萄糖浓度的变化，调节培养基的灌注策略，维持培养环境在一个相对稳定的水平，使之更接近体内细胞和组织稳定的内环境，促进细胞增殖和功能表达，缩短培养时间，使构建的组织在解剖学结构上更接近于天然组织。
图1为灌注式生物反应器系统结构图。
图2为反应器结果示意图。
具体实施例方式
参见图1和图2，本发明用于双层活性皮肤组织体外构建的灌注式生物反应器系统，包括加液装置、灌注式生物反应器、收液装置、液体回流装置和供气装置；所说的灌注式生物反应器包括设有上盖1的封闭容器2；设置在封闭容器2中将封闭容器2分隔为上室3和下室4的多孔支撑板5，设置在多孔支撑板5上方靠近封闭容器2内壁的紧固密封件6；用于皮肤构建的支架材料或细胞材料复合物7平放在多孔支撑板5上，并通过紧固密封件6固定，表皮层构建时多孔支撑板5可提供气液界面；上室3设有液体入口8和液体出口9，下室设有液体入口8和液体出口9，上盖1设有液体入口8、气体入口10和气体出口11，上盖1下方设有液体分布器101，用于分布从上盖1的液体入口8进入的培养基。
所说的加液装置与灌注式生物反应器的液体入口8相连接，所说的收液装置与灌注式生物反应器的液体出口9相连接，所说的液体回流装置通过管线分别与加液装置和收液装置相连通，所说的供气装置通过管线与灌注式生物反应器的气体入口10相连通；所说的加液装置包括加液蠕动泵12和与其相连接的加液储液瓶13，加液储液瓶13通过管线与灌注式生物反应器的液体入口8相连通，由于所说的生物反应器有三个液体入口8，接种时选用上盖1的液体入口8，灌注培养可能选择边侧的液体入口8，因此最好在加液蠕动泵12与灌注式生物反应器的各个液体入口8相连的管路之间设置控制阀门26，以控制液体从哪个入口8进入；所说的收液装置包括收液蠕动泵14、收液储液瓶15、收液控制阀16和收液瓶17，收液蠕动泵14的进口与灌注式生物反应器的液体出口9相连通，收液蠕动泵14的出口与收液储液瓶15的入口相连通，收液储液瓶15的出口通过储液蠕动泵25与收液瓶17相连通，收液控制阀16设置在收液储液瓶15与储液蠕动泵25之间的管线上，用于控制收液量，生物反应器各个出口与收液蠕动泵14之间设有控制阀门26。
所说的液体回流装置包括通过回流管线19设置在收液储液瓶15与加液储液瓶13之间的回流控制阀18；
所说的供气装置包括依次相互连接的空气泵20、空气流量计21和空气过滤器22，空气过滤器22与灌注式生物反应器相连接；所说的检测装置包括插在加液储液瓶13、收液储液瓶15中的溶氧电极23和收液储液瓶15中的pH电极24，溶氧电极23和pH电极24分别与溶氧测定仪和pH测定仪连接，以检测和控制加液储液瓶13、收液储液瓶15中培养基的溶氧浓度和pH。
由图1可见，可将多个所说的灌注式生物反应器并联连接，以满足扩大生产量的需要。
实施例1取幼儿包皮，剪成1cm2左右的皮肤块，用含有200U/mL庆大霉素的PBS清洗3遍，75％酒精清洗2遍，再用PBS清洗2遍。将皮肤组织加入到200U/mL的中性蛋白酶(Sigma)中，4℃下消化18hr，使真皮和表皮分离。从表皮组织中获得角质细胞，从真皮组织中获得成纤维细胞。
将表皮剪碎，用0.25％的胰酶(Sigma)/0.06％EDTA共6mL(胰酶/EDTA消化液的体积大约为被消化组织体积的3倍)作用8min，并用等量的小牛血清中和胰酶活性。
150目筛网过滤，除去表皮碎块，获角质细胞悬液。2000r/min离心5min，倒去上清，PBS清洗2遍，加入含200U/mL庆大霉素的角质细胞无血清培养基(Gibco)，细胞接种量为2×104cells/cm2，每个25cm2的培养瓶(Nunc)中加培养基5mL，在37℃、5％CO2的培养箱(Revco)中培养，每三天换液一次，获得原代培养的细胞。当细胞长满方瓶底面积的75％时，进行传代培养，倒去上清液，加入1.5mL的胰酶进行消化，当细胞变圆、脱落后加入等量小牛血清终止胰酶活性，细胞悬液用2000r/min的速度离心5min后倒去上清，PBS清洗两遍，加入培养基，接种至方瓶或生物反应器系统进行传代培养和扩增，获得构建表皮层所需的角质细胞。
真皮部分剪碎，加入0.05％的胶原酶(Gibco)溶液，在37℃条件下酶解40min；过滤除去残余碎片，细胞以PBS洗涤并离心收集，成纤维细胞悬浮液按照接种量5×104/cm2接种在方瓶中原代培养，用含10％小牛血清的DMEM(Gibco)为培养基，每3天换液一次。待成纤维细胞铺满方瓶底部约80％左右，用0.25％胰酶液消化，按2×104/cm2的接种量在方瓶或生物反应器中传代培养和扩增，获得构建皮肤组织真皮层所需的成纤维细胞。
实施例2牛筋去筋膜、脂质制成肌腱粉末分装，于-20℃贮存备用。将腱末浸泡于0.1mol/L的HAc溶液中，制得终浓度为8.0mg/mL的胶原-HAc溶液。将壳聚糖溶液、肝素纳溶液、硫酸软骨素溶液添加至胶原溶液中，使终浓度分别为胶原干重的10％(g/g)、7％(g/g)和3％(g/g)，-20℃冰箱冷冻过夜，真空冷冻干燥24hr后即得胶原海绵。采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(Sigma)对胶原海绵进行化学交联，用蒸馏水充分清洗并冻干，环氧乙烷消毒，制成可用于制备双层活性皮肤组织的复合胶原海面基质材料。
实施例3采用实施例2相同的方法，但是复合胶原海绵中，氨基多糖类物质为透明质酸，终浓度为胶原干重的20％(g/g)。
实施例4将胶原海绵置于双层活性皮肤体外构建的灌注式生物反应器的多孔不锈钢垫片支架上，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基，浸泡过夜。弃培养基，按5×105cells/cm2细胞密度将成纤维细胞悬液加入反应器中，通过蠕动泵进行灌注接种，至培养液中残留的细胞密度低于接种密度的10％后，进行灌注培养。
控制灌注速度为1d-1，同时检测反应器出口处培养液中葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2g/L时，提高灌注速率至2.5d-1。在此反应器中经16d的灌注培养，完成真皮构建。
用角质细胞无血清培养基代替10％新生牛血清的DMEM培养基，在上述人工真皮上按密度5×105cells/cm2接种角质细胞，静止培养1d后，用角质细胞培养基灌注培养2d，灌注速率为1d-1。而后去除角质细胞无血清培养基，采用含10％新生牛血清的DMEM培养基进行气液界面培养，液面位置由上出口控制，培养基由下端进出口进行灌注，控制灌注速率为1d-1，同时检测反应器出口处培养液中葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2g/L时，提高灌注速率至3d-1。培养14d后，完成表皮构建。
权利要求
1.一种用于体外构建双层活性人工皮肤组织的复合胶原海绵，其特征在于由氨基多糖类物质和胶原溶液组成，氨基多糖类物质含量为胶原干重的5～25％(g/g)；所说的氨基多糖类物质包括壳聚糖、6-硫酸软骨素、透明质酸或肝素纳中的一种或一种以上，所说的胶原溶液为牛筋去筋膜、脂质制成的肌腱粉末浸泡于醋酸溶液中而获得的胶原-HAc溶液，或者是由商业化的胶原产品配制的胶原-HAc溶液。
2.一种采用生物反应器制备双层活性人工皮肤组织的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)以复合胶原海绵为支架材料，置于灌注式生物反应器的多孔支架上，加入含5～15％新生牛血清的DMEM培养基浸泡，弃培养基，灌注接种成纤维细胞，至培养液中残留的细胞密度低于接种密度的5～20％后，进行灌注培养，在反应器中经10～20d的灌注培养，完成真皮构建；(2)在上述人工真皮上接种角质细胞，用角质细胞无血清培养基代替含新生牛血清的DMEM培养基，静止培养1～2d后，用角质细胞培养基灌注培养2～5d，灌注速率为0.5～2d-1，而后去除角质细胞无血清培养基，采用含2～10％新生牛血清的DMEM培养基进行气液界面培养，并根据需要调整灌注速率(0.5～4d-1)，8～14d后完成表皮构建。所说的角质细胞为从表皮组织中分离的角质细胞，所说的成纤维细胞为从真皮组织中分离的成纤维细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以1×105cells/cm2～5×106cells/cm2细胞密度将成纤维细胞悬液加入反应器中。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)的灌注速率为0.5～4d-1，使反应器出口处培养液中葡萄糖浓度不低于1.0～2.0g/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在人工真皮上按密度1×105cells/cm2～5×106cells/cm2接种角质细胞。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)用含血清的DMEM进行灌注培养，灌注速率的确定是使反应器出口处培养液中的葡萄糖浓度不低于1.0～2.0g/L。
全文摘要
本发明公开了一种采用生物反应器制备双层活性人工皮肤组织的方法。包括如下步骤以复合胶原海绵为支架材料，置于灌注式生物反应器的多孔支架上，将成纤维细胞悬液加入反应器中，灌注接种及培养；完成真皮构建后，接种角质细胞，灌注培养，完成表皮构建。采用生物反应器系统制备具真皮和表皮双层结构的活性人工皮肤，使制成的人工皮肤具一定机械强度、延缓降解速度、细胞和胞外基质在材料中分布均匀，制备周期短，生产可重复，批与批之间差异小等特点，且构建的组织在解剖学结构上更接近于天然组织。
文档编号A61L27/60GK1562392SQ20041001715
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月24日 优先权日2004年3月24日
发明者谭文松, 周燕 申请人:华东理工大学