专利名称：乙型脑炎病毒疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种经人二倍体细胞培养制备的乙型脑炎病毒疫苗。具体而言，本发明涉及一种将乙型脑炎病毒接种于人二倍体细胞进行培养，经过驯化、适应和扩增工艺处理，乙型脑炎病毒在人二倍体细胞内大量繁殖，再经浓缩、纯化配制成一种乙型脑炎病毒疫苗。这种病毒疫苗可以预防婴幼儿、儿童、青少年及成人因乙型脑炎病毒感染引起的乙型脑炎疾病。本发明还涉及这种病毒疫苗的制备方法。
背景技术：
乙型脑炎是中枢神经系统急性病毒感染的传染性疾病，在流行地区年发病率高达10～100/10万，近30亿人口生活在乙型脑炎流行区，该地区每年新生儿就超过7,000万。在亚洲的病毒性脑炎中，乙型脑炎是最严重的疾病。每年至少引起50,000临床病例和10,000例病死，绝大多数发生于儿童中。在最近几十年中，乙型脑炎的数起暴发流行越来越向曾经是非流行的地区扩大，同时伴随很高的病死率和严重的持久性神经系统后遗症，因而在亚洲很多国家和地区，乙型脑炎成为严重地公共健康问题。
流行性乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)简称乙脑病毒，病毒颗粒呈二十面体对称结构，直径45-50nm，病毒颗粒由核心、包膜和刺突组成，属黄病毒的一种。基因为正链单股RNA，RNA包被于多肽的衣壳C中，组成病毒颗粒的核心。其包膜中有糖基化蛋白E和非糖基化蛋白prM/M。
在乙型脑炎传染途径中蚊子是乙脑病毒的主要传播媒介，猪是主要中间宿主，人因被带毒的蚊虫叮咬而感染。目前还没有治疗乙型脑炎疾病的特效药物，从环境方面控制其传播的效果不理想。乙型脑炎疫苗的免疫接种是控制乙型脑炎疾病最为经济有效的措施。
乙型脑炎疫苗有3类在大规模应用，经鼠脑组织培养制备的灭活疫苗、地鼠肾原代细胞或Vero细胞培养制备的灭活疫苗和地鼠肾原代细胞培养制备的减毒活疫苗。
由于乙型脑炎疫苗基础免疫始于6月龄的健康婴幼儿，这就要求疫苗首先必须要保证有足够的安全为前提条件。上述乙型脑炎疫苗无论采用何种培养体系，均是经动物源性的组织或动物细胞培养制成。这些疫苗的缺点在于首先，无法彻底去除动物源性外源因子的污染。其次，无法进一步增加抗原含量从而在人体中产生更高的免疫应答反应、提供更高、更久的免疫保护。其原因为如进一步增加病毒抗原含量时，伴随的动物源性物质如杂蛋白、核酸及脂质等也随之增加，引起严重的超敏反应，因此疫苗副反应就加大。例如，经鼠脑组织培养的灭活疫苗以疼痛、发红、肿胀的局部副反应约为20％，包括头疼、发热、肌痛、不适和胃肠道症状的全身性反应为10～30％。1989年和1990年在丹麦及澳大利亚还分别发现31例和7例荨麻疹和血管性水肿的严重变态反应。经地鼠肾原代细胞培养的灭活疫苗超过38℃的发热高达12％，在减少了牛血清残留量后，超过38℃的发热减至6％(Tsai，Theodore F，Japanese encephalitis vaccines，http://www.cdc.gov.publication date01/01/1990)。而减毒活疫苗是用非清洁级地鼠肾原代细胞作为疫苗培养基质，这难以避免鼠源的外源因子的污染，这种可能造成的污染又是难以用现行生物学方法检出。因此，不能为世界卫生组织疫苗制造检定规程所接纳(迮文远，计划免疫学，上海科学技术文献出版社，2001年，484页)。虽然用Vero细胞培养制备的灭活疫苗的安全性有了显著性提高，但Vero细胞超过232代次后在裸鼠体内有致瘤现象(Levenbook IS，etal，Tumorigenicity of vero cells.J Biol Stand 1984 Oct；12(4)391-8)。因此，美国FDA要求用Vero细胞生产的疫苗，生产过程中要有去除细胞的工艺，必须要保证成品中无残余的细胞(FDA letterto vaccine manufacturers concerning the use of Vero cells.http://www.fda.gov/cber/letters.htm)。
鉴于上述原因，需要对现有乙型脑炎病毒疫苗细胞系进行革命性地改造，寻找新的病毒培养细胞系，避免上述鼠脑组织、地鼠肾原代细胞和Vero细胞系存在的安全隐患，制备出能满足始于婴幼儿接种的乙型脑炎疫苗。
已证实，源于人的二倍体细胞由于其来源是相当清楚，包括捐献者的年龄、性别、种族、地域、体能及健康状况、细胞直接来源的组织或器官、细胞世代数等。人二倍体细胞系经过数十年的研究，其生长特性、遗传稳定的特性、外源因子(细菌、真菌、支原体及病毒)污染检查、致肿瘤阴性等特性被充分验证。更为重要的是人二倍体细胞本身是源于人体的细胞，当用于疫苗制造时人二倍体细胞的残余成分不会成为超敏反应原，基本不会引起接种者超敏反应。因此，从质量控制的角度看，相比较于上述鼠脑组织、地鼠肾原代细胞和Vero细胞系，人二倍体细胞没有潜在的不安全隐患，是制备疫苗理想的细胞系。
进一步证实，用人二倍体细胞系制备疫苗已经得到越来越多的应用，例如用MRC-5和/或WI-38细胞系制备的风疹病毒疫苗、用MRC-5细胞系制备的甲肝病毒疫苗、用FrhL-2细胞系制备的轮状病毒疫苗、用MRC-5细胞系制备的水痘病毒疫苗、国际上公认的金标准狂犬病疫苗也是人二倍体细胞培养疫苗。因此，用人二倍体细胞制备乙型脑炎病毒疫苗能显著性地提高现行乙型脑炎病毒疫苗的质量。
本发明的核心内容是，采用人二倍体细胞系作为乙型脑炎病毒培养繁殖的细胞基质，同时将乙型脑炎病毒在人二倍体细胞内进行驯化适应，并且病毒和细胞均有良好的稳定性，进而制备成乙型脑炎病毒疫苗。
综上所述，本发明的乙型脑炎病毒疫苗重点解决了，用人二倍体细胞替代鼠脑组织、地鼠肾原代细胞和Vero细胞进行乙型脑炎病毒培养，再进一步制成疫苗。用人二倍体细胞制备的疫苗可显著性地降低疫苗副反应尤其是过敏反应和动物源性病毒的危害，去除潜在的安全性隐患，保证了疫苗在儿童和青少年和非疫区的成人中使用的安全性。
为了克服现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种新的乙型脑炎病毒疫苗及其制备方法。
发明内容
为了完成本发明的目的，本发明提供一种乙型脑炎病毒疫苗，其特征在于，该疫苗所含的乙型脑炎病毒抗原是乙型脑炎病毒经人二倍体细胞培养、繁殖、纯化、提取获得的。所述的乙型脑炎病毒疫苗是灭活疫苗，也包括减毒活疫苗、裂解疫苗和/或亚单位疫苗和与其它疫苗的联合疫苗。
所述的乙型脑炎病毒疫苗是由乙型脑炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株、Nakayama株和乙脑病毒的其它分离株中任一株制备的。
所述的人二倍体细胞是2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL细胞系中的任一株。
本发明还涉及一种将乙型脑炎病毒驯化、适应和扩增于人二倍体细胞的方法。
换言之，本发明提供了将乙型脑炎病毒接种于人二倍体细胞进行培养，经过驯化、适应和扩增工艺处理，乙型脑炎病毒在人二倍体细胞内大量繁殖，再经灭活、浓缩、纯化配制成一种乙型脑炎病毒疫苗。本发明还提供了乙型脑炎病毒在人二倍体细胞内驯化、适应和扩增的方法。这种用人二倍体细胞制备的乙型脑炎病毒疫苗可以分别预防婴幼儿、儿童、青少年及成人因乙型脑炎病毒感染引起的乙型脑炎疾病。
本发明中重点引入的概念和方法是对现行的乙型脑炎病毒疫苗进行改造和升级使之达到更好的安全性和免疫效果。本发明是将人二倍体细胞替代鼠脑组织、地鼠肾原代细胞和Vero细胞用于乙型脑炎病毒培养，收获的病毒液经灭活、浓缩、纯化后经配制成为乙型脑炎病毒疫苗。这种用人二倍体细胞制备的乙型脑炎病毒疫苗，除含有作为免疫原性的病毒抗原存在外，不含任何源于动物组织或动物细胞的残余成分，从根本上排除了引起超敏反应的动物蛋白、核酸及脂质等。由于安全性显著性地提高，进一步使得疫苗可以提高免疫剂量，增加疫苗保护效力，从而能克服现行的乙型脑炎病毒商品疫苗具有的免疫局限性及接种后的不良反应。
本发明所用乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)毒种购买于中国药品生物制品检定所。毒种名称为SA14、SA14-14-2、P3、Nakayama。中国药品生物制品检定所负责制备和发放上述病毒毒种。
在本发明的一个实施方案中，乙型脑炎病毒培养可采用上述毒种SA14、SA14-14-2、P3、Nakayama中的任何一株。如果满足需要，也可采用其它合适的毒种，此处给出的毒种仅仅是为了例示性说明本发明。
本发明的乙型脑炎病毒培养体系是人二倍体细胞2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL细胞系中的任一株。如果满足需要，也可采用其它合适的人二倍体细胞，此处给出的细胞仅仅是为了例示性说明本发明。
本发明提供了将乙型脑炎病毒驯化、适应和扩增于人二倍体细胞的方法。具体而言，乙脑病毒在人二倍体细胞内的病毒滴度逐渐提高，≥7.5lgPFU/ml，并趋向于稳定。
本发明的乙型脑炎病毒疫苗每剂量为含有病毒蛋白5～90μg。至于用量的上限，本领域的技术人员可以根据疫苗人体临床试验数据而最终确定。
本发明的人二倍体细胞制备的乙型脑炎病毒疫苗具有良好的免疫原性，并且中和抗体滴度≥地鼠肾细胞和Vero细胞制备的乙型脑炎病毒疫苗。
本发明的人二倍体细胞制备的乙型脑炎病毒疫苗具有良好的保护效力，并且效力中和指数高于地鼠肾细胞和Vero细胞制备的乙型脑炎病毒疫苗。
本发明的乙型脑炎病毒疫苗可以和A、C群脑膜炎球菌多糖与一蛋白载体偶联形成的结合疫苗组成乙脑—流脑联合疫苗。
本发明的乙型脑炎病毒疫苗还可进一步和其它疫苗组成联合疫苗，如无细胞百白破疫苗—灭活脊髓灰质炎病毒疫苗—Hib疫苗—乙型肝炎疫苗—脑膜炎球菌结合疫苗—乙型脑炎病毒疫苗，麻疹—乙脑联合疫苗、麻疹—风疹—腮腺炎—乙脑联合疫苗、黄热—乙脑联合疫苗等。
本发明提供一种乙型脑炎病毒疫苗的制备方法，该疫苗在制备过程中病毒培养所用的细胞系是人二倍体细胞。在本发明的方法中所述的人二倍体细胞系选自2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL细胞系中的任一株。而且所述的乙型脑炎病毒疫苗可以是灭活疫苗，而灭活疫苗是由乙型脑炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株或Nakayama株或其它分离的乙型脑炎病毒株中任一株制备的。所述的乙型脑炎病毒疫苗也可以是减毒活疫苗、纯化疫苗、裂解疫苗/或亚单位疫苗。
另外所述的乙型脑炎病毒疫苗还可以是与其它疫苗的联合疫苗，包括麻疹—乙脑联合疫苗、乙脑—流脑联合疫苗、麻疹—风疹—腮腺炎—乙脑联合疫苗、黄热—乙脑联合疫苗。
经过本发明的方法能够制备出更高免疫原性和效力、更安全、更易被接种者接受的一种乙型脑炎病毒疫苗。
具体实施例方式
下面结合实施例描述本发明，将乙型脑炎病毒在人二倍体细胞内进行驯化、适应和扩增，将收获的病毒液进行浓缩和纯化，再经适当配制成乙型脑炎病毒疫苗。用二倍体细胞制备的乙型脑炎病毒疫苗经动物试验和实验室检定证实该种疫苗具有可靠的安全性和优良的免疫原性及卓越的保护效力。
实施例1
人二倍体细胞的制备
人二倍体细胞的制备以MRC-5为例细胞培养液为DMEM(也可用其它适宜的细胞营养液如MEM、199培养基、1640培养基等)，加入4～10％的胎牛血清(无外源因子污染)和浓度100～200U/ml的卡那霉素(或庆大霉素)，调pH至7.0～8.0之间。细胞用柯氏瓶或转瓶培养于35～37℃，4～8天后培养成致密的单层细胞后，以1∶2的比例扩增，直到扩增生产批用量时，经过3～5天培养，细胞长成致密的单层细胞，弃去细胞培养液。并用pH7.0～8.0的磷酸盐缓冲液淋洗细胞表面，洗掉残留的牛血清。准备用于病毒的接种。
实施例2
乙型脑炎病毒在人二倍体细胞内驯化、适应和扩增
以人二倍体细胞以MRC-5为例由于乙脑病毒在人二倍体细胞内的病毒繁殖滴度较低，因此必须将乙脑病毒逐渐在人二倍体细胞内驯化、适应。将乙脑病毒P3株(或SA14等其它病毒株)接种于已长满单层的人二倍体细胞内，于30～37℃继续培养。当细胞病变达到50～70％时收获细胞上清液，即为在人二倍体细胞内生长繁殖的乙脑病毒液。依次进行一代一代适应。当收获的乙脑病毒液中的乙脑病毒滴度达到7.5lgPFU/ml以上时即作为用于乙脑疫苗生产用的种子病毒。按《中国生物制品规程》(化学工业出版社，2000年)要求经各项试验检测合格后即可用于疫苗的生产制备。
实施例3
乙型脑炎病毒在人二倍体细胞内传代稳定性
按实施例2的试验步骤依次进行，可观察到乙脑病毒在人二倍体细胞内的病毒滴度逐渐提高，≥7.5lgPFU/ml，并趋向于稳定，各代次的病毒滴度见表1。
表1.乙型脑炎病毒在人二倍体细胞内传代稳定性
实施例4
乙型脑炎病毒灭活疫苗制备
按实施例1制备人二倍体细胞，依实施例3制备疫苗生产用的病毒种子。依实施例3选择病毒滴度达到疫苗生产要求的代次为疫苗生产用工作种子。将用磷酸盐缓冲液淋洗过的细胞以MOI为0.1～0.00001的比例接种乙脑病毒于人二倍体细胞中。细胞维持液为含0.1～0.5％的人血白蛋白的DMEM细胞营养液，pH7.0～8.0之间。30～37℃培养，3天后收获病毒上清液。(如用微载体培养可连续收获)收获后的病毒液病毒滴度达到7.5lgpfu/ml以上，无菌试验检测阴性，可将收获后的病毒液做适当合并。合并后的液体为疫苗原液。加入适当灭活剂1∶2000的甲醛溶液(或1∶4000的β-丙内酯，或其它适宜的灭活剂，此处仅为示例)。灭活病毒后得到粗制疫苗。再用截留量10～30万分子量的超滤器浓缩疫苗10～50倍，进行离子交换柱(DEAE-SepharoseFF)和凝胶过滤柱(Sepharose 4FF)经二步柱层析，得到纯化疫苗。加入人白保护剂，稀释后即可制成疫苗。
实施例5
乙型脑炎病毒疫苗的安全性试验
对人二倍体细胞制备的乙型脑炎病毒疫苗的安全性进行考核，分别采用小鼠、豚鼠异常毒性试验考核其安全性。选用体重250～350g的清洁级豚鼠，每种疫苗用2只豚鼠，每只腹腔注射5.0ml的乙型脑炎病毒疫苗，分别于注射前、注射后7天称体重，并随时观察疫苗接种后反应。选用体重18～20g的清洁级小鼠，用5只小鼠，每只腹腔注射0.5ml的乙型脑炎病毒疫苗，分别于注射前、注射后7天称体重，并随时观察疫苗接种后反应。试验结果列于表2。
表2.乙型脑炎病毒疫苗安全性试验
动物安全性试验表明，用人二倍体细胞制备的乙型脑炎病毒疫苗中没有不安全急性毒性因素，可以保证人体使用的安全。
实施例6
乙型脑炎病毒疫苗的免疫原性试验比较
每种疫苗选12～14g小鼠20只，每只腹腔免疫0.5ml，免疫两次，间隔7天。初免15天采血，2～8℃过夜。次日分离血清，56℃30分钟灭活。用蚀斑减少中和实验测定中和抗体滴度。乙型脑炎中和病毒株为SA14和P3株。试验结果见表3。
表3.乙型脑炎病毒疫苗中和抗体滴度试验
中和抗体滴度试验表明人二倍体细胞制备的乙型脑炎病毒疫苗具有良好的免疫原性，并且中和抗体滴度≥地鼠肾细胞和Vero细胞制备的乙型脑炎病毒疫苗。
实施例6
乙型脑炎病毒疫苗的保护效力试验比较
采用免疫小白鼠中和抗体测定法。中和抗体测定采用蚀斑减少试验。参考疫苗(RA和RB)及中和试验阳性血清购自中国药品生物制品检定所。将待测疫苗和参考疫苗(R)均分别稀释1∶32，分别腹腔免疫体重12～14g小鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，间隔7天。第2次免疫后7天采血，分离血清，同组小鼠血清等量混合，于56℃灭活30分钟，稀释血清、分别与稀释好的病毒(约200PFU/0.4ml)等量混合。同时将稀释好的病毒再1∶2稀释，作为病毒对照，置37℃水浴作用90分钟，接种6孔板BHK21细胞，每孔0.4ml，37℃培养90分钟，加入甲基纤维素的培养基覆盖物，于CO2孵箱中培养5天，染色，蚀斑计数，计算蚀斑减少率。病毒对照组的蚀斑平均数应在50～150之间，合格判定标准为T≥(RA+RB)/2-0.33，试验结果见表4。
表4.乙型脑炎病毒疫苗保护效力试验
效力试验表明人二倍体细胞制备的乙型脑炎病毒疫苗具有良好的保护效力，并且效力中和指数高于地鼠肾细胞和Vero细胞制备的乙型脑炎病毒疫苗。
权利要求
1、一种经人二倍体细胞培养制备的乙型脑炎病毒疫苗，其特征在于，该疫苗在制备过程中病毒培养所用的细胞系是人二倍体细胞。
2、根据权利要求1所述的乙型脑炎病毒疫苗，其特征在于，所述的乙型脑炎病毒疫苗在制备过程中病毒培养所用的人二倍体细胞系是2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL细胞系中的任一株。
3、根据权利要求1所述的乙型脑炎病毒疫苗，其特征在于，所述的乙型脑炎病毒疫苗是灭活疫苗。
4、根据权利要求1所述的乙型脑炎病毒疫苗，其特征在于，所述的乙型脑炎病毒疫苗还可是减毒活疫苗、纯化疫苗、裂解疫苗/或亚单位疫苗。
5、根据权利要求1所述的乙型脑炎病毒疫苗，其特征在于，所述的乙型脑炎病毒疫苗还可和与其它疫苗的联合疫苗，例如麻疹—乙脑联合疫苗、乙脑—流脑联合疫苗、麻疹—风疹—腮腺炎—乙脑联合疫苗、黄热—乙脑联合疫苗等。
6、根据权利要求3所述的乙型脑炎病毒疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗是由乙型脑炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株或Nakayama株或其它分离的乙型脑炎病毒株中任一株制备的。
7、一种乙型脑炎病毒疫苗的制备方法，其特征在于，该疫苗在制备过程中病毒培养所用的细胞系是人二倍体细胞。
8、根据权利要求7所述的乙型脑炎病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述的人二倍体细胞系选自2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL细胞系中的任一株。
9、根据权利要求7所述的乙型脑炎病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述的乙型脑炎病毒疫苗是灭活疫苗。
10、根据权利要求7所述的乙型脑炎病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述的乙型脑炎病毒疫苗是减毒活疫苗、纯化疫苗、裂解疫苗/或亚单位疫苗。
11、根据权利要求7所述的乙型脑炎病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述的乙型脑炎病毒疫苗是与其它疫苗的联合疫苗，包括麻疹—乙脑联合疫苗、乙脑—流脑联合疫苗、麻疹—风疹—腮腺炎—乙脑联合疫苗、黄热—乙脑联合疫苗。
12、根据权利要求9所述的乙型脑炎病毒疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗是由乙型脑炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株或Nakayama株或其它分离的乙型脑炎病毒株中任一株制备的。
全文摘要
本发明涉及一种乙型脑炎病毒疫苗及其制备方法，包括将乙型脑炎病毒接种于人二倍体细胞进行培养，经过驯化、适应和扩增工艺处理，乙型脑炎病毒在人二倍体细胞内大量繁殖，再经浓缩、纯化配制成一种乙型脑炎病毒疫苗。这种乙型脑炎病毒疫苗可以预防婴幼儿、儿童、青少年及成人因乙型脑炎病毒感染引起的乙型脑炎疾病。
文档编号A61K39/12GK1695736SQ200410037948
公开日2005年11月16日 申请日期2004年5月14日 优先权日2004年5月14日
发明者薛平 申请人:薛平