专利名称：减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法
技术领域：
本发明涉及减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗的后处理方法，属于医学生物
背景技术：
脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒I、II、III型引起的传播广泛且危害极大的急性传染病。临床症状引起肌肉特别是肢体松弛性麻痹，多发生于小儿，因此又称为“小儿麻痹症”。在疫苗问世前，该病在全世界范围内流行，当时我国的发病率为3.18/10万。50年代中后期，美国的两位科学家Dr.Salk和Dr.Sabin先后成功研制出脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)，从而为人类预防和消灭脊髓灰质炎提供了有力武器。实践证明这两种疫苗都是安全有效的。我国从1960年开始生产OPV供全国儿童服用。到目前为止总计供应了40多亿人份的三价OPV，取得了辉煌的成绩。然而，早期制造的IPV由于受到生产工艺的限制，抗原含量低，免疫效果不理想，尤其是随着全世界消灭脊髓灰质炎进程的推进，与OPV相关的病例(VAPP)和由疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒(VDPV)而引起的病例正受到人们的关注，如2000年在多美尼加和海地，2001年在菲律宾以及2002年在马达加斯加发生的疫苗衍生株引起的麻痺病例，此外疫苗病毒毒株在免疫缺陷的人体内可长期存在，。为此，一些发达国家开始改变疫苗使用方案，采取先用IPV再用OPV的方案，进而过渡到仅使用IPV的方案，因为只有使用IPV才能避免疫苗相关病例的发生。但采用常规的方法，既不能满足大规模生产的需要，也不能处理大规模生产的病毒液，因此，有必要对现有技术加以改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能处理大规模生产的病毒液，制备出高质量的疫苗，满足减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗生产需要的方法。
本发明通过下列技术方案实现一种减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法，其特征在于采用下列工艺步骤
1、澄清将大规模培养出来的病毒液经过1.0-0.6μm、0.6-0.45μm、0.45-0.22μm孔径的三级滤柱过滤、澄清，去除病毒液中的细胞碎片及杂质，并保持病毒液的无菌状态；2、浓缩将澄清过的病毒液，用10万截留分子量的超滤膜将病毒液浓缩200～400倍。
3、纯化a、凝胶过滤浓缩的病毒液用层析柱纯化，即用80mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液pH7.0-7.2，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰即为凝胶过滤纯化的病毒液；B、离子交换凝胶过滤纯化的病毒液用层析柱纯化，即用80mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液pH7.0-7.2，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰即为纯化的病毒液；4、除菌过滤纯化的病毒液用0.22μm的滤膜除菌过滤，之后加入10倍浓缩M199，使病毒液中含有原倍的M199；5、灭活在过滤的病毒液中，按终浓度为1/4000加入福尔马林灭活剂，在35-37℃温度下灭活12-14天，每天取样观察，灭活至第6天时，将病毒液用0.22μm滤膜过滤至另一无菌瓶中，继续灭活至12-14天，转入4℃保存，即为单价半成品。
病毒液在经过步骤3的纯化后，去除了细胞DNA及杂蛋白，使纯度达到要求。
本发明具有以下优点1、可大规模处理大量的病毒液，能够满足减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗的生产需求，且生产工艺稳定，重复性好(结果见表1、表2)。
2、用本发明生产的疫苗半成品，无外原因子污染，细胞DNA残留量少，灭活后的半成品经检查无活病毒存在，安全性好，半成品抗原含量高，能够满足成品生产的需要(结果见表3)。
3、用本发明生产的疫苗半成品制备的Sabin IPV成品疫苗，质量稳定可靠，安全性及免疫原性良好，经检定全部符合国家生物制品规程的要求(结果见表4)。
4、用本发明生产病毒液制备的疫苗，经25℃和37℃放置两周，以及4℃长期存放后，检测疫苗热稳定性，结果表明该疫苗稳定性良好，其有效期可达两年以上(结果见表5及表6)。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例11、澄清将550升发酵罐培养的病毒液350升，经孔径为0.75μm、0.45μm、0.22μm的三级滤柱过滤澄清，去除病毒液中的细胞碎片及杂质，并保持病毒液的无菌状态；2、浓缩将澄清的病毒液在Millipore交叉流超滤设备中，用10万截留分子量的超滤膜浓缩至1.4升；3、纯化A、凝胶过滤在Phamacia Index70层析柱中，装Sepharose CL-6B层析填料，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平，取病毒浓缩液，加入层析柱中，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰(病毒峰)约600毫升；B、离子交换在Phamacia Index100层析柱中，装入DEAE SephasoreFast Flow层析填料，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平，将凝胶过滤收集的600毫升病毒液加入柱中，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱，紫外吸收波长280测吸收值，收集出现的洗脱峰约800毫升，即为纯化的病毒液，层析柱用1mol/L NaCl洗脱，之后用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平备用；4、除菌过滤先将0.22μm的滤膜用50毫升10倍浓缩M199冲洗，滤液收集至一硅化的无菌1000毫升瓶中，再将离子交换收集的800毫升病毒液过滤到此瓶中，之后用40毫升10倍浓缩的M199及10毫升注射水洗膜，并将滤液同样收集到上述瓶中；5、灭活在过滤的病毒液900毫升中，加入10％福尔马林2.25毫升，使福尔马林终浓度为1/4000，放入37℃孵箱中灭活，每天取样观察，灭活至第6天时，将病毒液用0.22μm滤膜过滤至另一无菌已硅化1000毫升瓶中，继续灭活至12天，转入4℃保存，即为单价半成品。
实施例21、澄清将550升发酵罐培养的病毒液350升，经孔径为1.0μm、0.6μm、0.45μm的三级滤柱过滤澄清，去除病毒液中的细胞碎片及杂质，并保持病毒液的无菌状态；2、浓缩将澄清的病毒液在Millipore交叉流超滤设备中，用10万截留分子量的超滤膜浓缩至1.4升；3、纯化A、凝胶过滤在Phamacia Index70层析柱中，装Sepharose CL-6B层析填料，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)冲平，取病毒浓缩液，加入层析柱中，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗脱，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰(病毒峰)约600毫升；B、离子交换在Phamacia Index100层析柱中，装入DEAE SephasoreFast Flow层析填料，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)冲平，将凝胶过滤收集的600毫升病毒液加入柱中，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗脱，紫外吸收波长280测吸收值，收集出现的洗脱峰约800毫升，即为纯化的病毒液，层析柱用1mol/L NaCl洗脱，之后用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平备用；4、除菌过滤先将0.22μm的滤膜用50毫升10倍浓缩M199冲洗，滤液收集至一硅化的无菌1000毫升瓶中，再将离子交换收集的800毫升病毒液过滤到此瓶中，之后用40毫升10倍浓缩的M199及10毫升注射水洗膜，并将滤液同样收集到上述瓶中；5、灭活在过滤的病毒液900毫升中，加入10％福尔马林2.25毫升，使福尔马林终浓度为1/4000，放入35℃孵箱中灭活，每天取样观察，灭活至第6天时，将病毒液用0.22μm滤膜过滤至另一无菌已硅化1000毫升瓶中，继续灭活至14天，转入4℃保存，即为单价半成品。
用与实施例1相同的方法进行了九批生产规模的后处理，结果见表5和表6。
表1.九批生产规模澄清及浓缩结果0.1病毒收获液1.1澄清2.1浓缩批号 体 滴度体滴度体积滴度积 (logCCID50积 (logCCID50(L) (logCCID5SI 350 8.400 360 8.250 1.60 10.400SI 300 7.850 340 7.800 1.65 9.850SI 380 8.380 410 8.130 0.90 10.590SI 353 8.000 404 7.875 1.40 10.000SI 352 7.750 393 8.625 2.10 10.380SI 352 8.620 399 8.370 1.15 10.870SI 358 7.625 409 7.500 1.40 9.500SI 356 7.870 411 8.120 1.40 10.120SI 332 7.875 375 7.750 1.75 9.875表2.九批生产规模纯化及除菌过滤结果3.1凝胶过滤4.1离子交换5.1除菌过滤批号 体 滴度体 滴度 体积 滴度积 (logCCID50积 (logCCID50(L) (logCCID5SI 0.62 9.250 0.829.250 0.90 9.125SI 0.61 9.625 0.839.625 0.90 9.500SI 0.62 9.625 0.839.500 0.90 9.500SI 0.62 8.375 0.828.250 0.90 8.250SI 0.62 8.250 0.828.250 0.90 8.000SI 0.65 8.250 0.818.250 0.90 8.125SI 0.62 9.500 0.839.125 0.90 9.125SI 0.63 9.250 0.858.875 0.90 8.500SI 0.62 9.000 0.828.500 0.90 8.125
表3.六批疫苗半成品检定结果
表4.两批Sabin IPV成品检定结果项目SI 20021101 SI 20021201外观 橙红色透明液体 橙红色透明液体无菌试验阴性 阴性鉴别试验 Polio I+II+III Polio I+II+IIIDAg含量I30 II32 III45 I30 II32大白鼠效力试验 通过 通过异常毒性试验 通过 通过蛋白质含量 ＜10μg/剂量 ＜10μg/剂量牛血清蛋白残留量 ＜50ng/剂量＜50ng/剂量pH 7.13 7.13
表5 减毒株IPV25℃和37℃和热稳定性试验结果(D抗原回收率％*)批号 型别25℃3周37℃1周37℃2周SI001001 I95 90 75SI002001 II 100 100100SI003001 III 100 95 86SI001002 I85 80 53SI002001 II 100 100100SI003002 III 93 93 71*4℃DAg含量作为100％表6 减毒株IPV4℃稳定性试验结果DAgU/剂量 大白鼠效力试验(ED50)型别0月 12月 18月 24月0月 18月I20 20 18 18 2.19 2.08II 16 16 16 16 1.49 1.12III 30 30 30 28 1.82 1.6权利要求
1.一种减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法，其特征在于采用下列工艺步骤1)、澄清将大规模培养出来的病毒液经过1.0-0.6μm、0.6-0.45μm、0.45-0.22μm孔径的三级滤柱过滤、澄清，去除病毒液中的细胞碎片及杂质，并保持病毒液的无菌状态；2)、浓缩将澄清过的病毒液，用10万截留分子量的超滤膜将病毒液浓缩200～400倍。3)、纯化a、凝胶过滤浓缩的病毒液用层析柱纯化，即用80mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液pH7.0-7.2，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰即为凝胶过滤纯化的病毒液；B、离子交换凝胶过滤纯化的病毒液用层析柱纯化，即用80mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液pH7.0-7.2，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰即为纯化的病毒液；4)、除菌过滤纯化的病毒液用0.22μm的滤膜除菌过滤，之后加入10倍浓缩M199，使病毒液中含有原倍的M199；5)、灭活在过滤的病毒液中，按终浓度为1/4000加入福尔马林灭活剂，在35-37℃温度下灭活12-14天，每天取样观察，灭活至第6天时，将病毒液用0.22μm滤膜过滤至另一无菌瓶中，继续灭活至12-14天，转入4℃保存，即为单价半成品。
全文摘要
本发明提供一种减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法，它将大规模培养出来的病毒液经过1.0－0.6μm、0.6－0.45μm、0.45－0.22μm孔径的三级滤柱过滤、澄清，超滤浓缩，柱层析纯化及灭活等后处理工艺，将病毒液制备成纯度高、免疫原性及安全好、质量稳定的合格疫苗半成品，从而满足减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗的生产需要。本发明可大规模处理大量的病毒液，且生产工艺稳定，重复性好；用本发明生产的疫苗半成品，无外原因子污染，细胞DNA残留量少，灭活后的半成品经检查无活病毒存在，安全可靠，半成品抗原含量高，能够满足成品生产的需要；用本发明生产的疫苗半成品制备成Sabin IPV成品疫苗，其质量稳定，安全性及免疫原性良好，经检定全部符合国家生物制品规程的要求。
文档编号A61P31/14GK1616095SQ200410040720
公开日2005年5月18日 申请日期2004年9月16日 优先权日2004年9月16日
发明者褚嘉祐, 姜述德, 孙明波, 廖国阳, 张丽旌, 李卫东, 俞泳霆, 李平忠 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所