专利名称：天然脱落酸用于制备肿瘤细胞“分化诱导剂”药物的新用途的制作方法
一.所属领域本发明涉及一种天然物质的新用途，具体涉及天然脱落酸的新用途。
背景技术：
长期以来，人们同威胁人民健康的主要疾病之一的肿瘤进行了不懈的斗争，手术、放疗、化疗成为肿瘤治疗的三大手段。但这三种手段毒副作用大，选择性差。近年来，肿瘤分化诱导和分化治疗在世界各地广泛开展，国际上先后召开了4次专题讨论会，并且已把肿瘤细胞的分化诱导治疗从基础推向临床，从而为肿瘤的治疗开辟了新途径。
大量的研究证实，应用一些化学物质可以使恶性肿瘤细胞逆转，向正常细胞分化；这些能使恶性细胞向正常细胞转化的物质，被称为“分化诱导剂”。在“分化诱导剂”作用下，去分化的肿瘤细胞可被诱导向正常细胞方向分化，从而表现出正常细胞的生物学特征，甚至可完全转变成为正常细胞。这种“分化诱导治疗”与传统的治疗措施最大的不同在于，不是通过杀伤瘤细胞，而是通过引导恶性肿瘤细胞向正常细胞转化来达到治疗肿瘤的目的。
肿瘤细胞自发分化及在某些化学物质的作用下被诱导分化的发现，使人们努力寻找肿瘤细胞的分化诱导剂。自1971年发现二甲亚砜(DMSO)能使Frind红白血病细胞分化以来，先后发现多种肿瘤细胞能被某些化合物诱导分化。如r-干扰素100-1000μ/ml浓度下抑制视网膜母细胞瘤细胞的增殖并诱导分化；神经节苷脂GM3可以诱导早幼粒白血病HL-60细胞向单核细胞分化；丁酸在1400μM浓度下诱导K562细胞向红细胞方向分化；六甲撑二乙酰胺(HMBA)在5×10-3M浓度下可诱导90％以上的Frind红白血病细胞分化；人参皂甙Rh2具有明显诱导小鼠B16细胞分化的功能，细胞被阻断在G1期而不能增殖；维甲类化合物主要由环己乙烯侧链及极性基团组成，能诱导早幼粒白血病HL-60细胞向成熟粒细胞分化，使U937细胞向巨噬细胞分化，最近的临床研究证明，维甲酸对急性早幼粒白血病有明显疗效。
天然脱落酸[(+)-cis，trans-Abscisic Acid，ABA]是一种植物内源抗逆物质，在植物的生长、发育中起着非常重要的作用，其微量天然存在于各种植物体内，包括各种粮食作物，蔬菜、瓜果、坚果等，目前主要由真菌规模发酵生产获得。ABA的分子式为C15H20O4，分子量264.33，其化学名称为5-(1’-羟基-2’，6”，6”-三甲基-4’-氧代-2’-环己烯-1’-甲基)-3-甲基-2-顺-4-反-戊二烯酸，化学结构式如下 ABA是一种以异戊二烯为基本单位的倍半萜羧酸，与维甲酸化学结构极为相似，都是由环己烯、侧链和一个极性基团构成；ABA是类胡萝卜素的一种衍生物，类胡萝卜素在人体内可代谢为维甲酸。众所周知，维甲类化合物是人类发现的最为有效的、作用机理研究最为深刻的一类分化诱导剂，但由于明显的毒副作用而限制了其开发应用。ABA在结构和功能上与维甲酸有极高的相似性，而且经严格的毒理学试验证明，在极大剂量(SD大鼠LD50＞5000mg/Kg)时，对生物和环境无任何毒副作用，因而有望成为治疗人类恶性肿瘤的有效分化诱导剂。
发明内容
我们在研究过程中发现，天然脱落酸对多种肿瘤细胞具有分化诱导剂的功能，即可以诱导恶性细胞向正常细胞转化，于是完成了本发明。
本发明的目的在于公开一种天然脱落酸用于制备肿瘤细胞“分化诱导剂”药物的新用途。
天然脱落酸用于制备肿瘤细胞“分化诱导剂”药物的有效使用浓度，一般在5g/L-1×10-6g/L，较好为2g/L-1×10-3g/L，最佳为1g/L-5×10-2g/L，可通过在低于50℃的温度下，常规制剂方法制备；其制备的药物可为口服剂型、外用剂型和滴注剂型，作用方式可以为活体注射或内服，在体内进行诱导分化；也可以外敷外涂等或用于肿瘤细胞组织培养，进行体外诱导分化。
研究表明，ABA可使癌细胞向正常细胞方向转变，其作用机理为ABA使大量增殖期细胞停滞在S期，使其无法实现细胞分裂而有效地抑制了肿瘤细胞的增殖，同时诱导肿瘤细胞凋亡；ABA可以作用于肿瘤细胞内细胞骨架结构，改变癌细胞的恶性增殖能力，诱导其向正常细胞方向发展，起到抑制癌细胞增殖的作用；应用动物模型研究，发现ABA能较好地抑制肿瘤癌周血管的生成，从而起到抑制肿瘤生长的作用；同时发现，ABA能降低肿瘤细胞Ki67的表达，使其增殖活性减低，因此证实ABA具有体内诱导肿瘤细胞向正常细胞转化和抑制其增殖的作用。
本发明具有以下优点1、分化诱导效果好，能很好的抑制癌细胞和肿瘤的生长；2、天然脱落酸属天然药物，对正常细胞损伤小，毒副作用很小；3、使用方便，操作简单。
具体实施例方式实施例1天然脱落酸对前列腺癌细胞的分化诱导研究将处于对数生长期的前列腺癌DU-145细胞分为实验组、对照组两组，实验组加入20ul2×10-2g/L ABA(溶于无水乙醇)，使培养液中ABA终浓度为I0-2g/L，对照组加入20ul无水乙醇，培养液中小牛血清浓度为130mI/L，常规方法培养细胞。加药48h后常规更换培养液，维持相同的药物浓度(ABA浓度为I0-2g/L)。培养过程中，倒置光学显微镜动态观察DU-145细胞形态上的改变。
结果细胞形态及超微结构的观察离心收集培养及ABA作用36h的DU-145细胞，0.01mol·L-1PH7.4PBS洗涤两次，用3％戊二醛固定，锇酸固定后，脱水，包埋，超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，透射电子显微镜观察肿瘤细胞形态及结构的改变。结果发现，肿瘤细胞出现生长状态不佳，核固缩现象增多，细胞器数量减少，张力原纤维消失，细胞间隔变大，并出现小片状无细胞生长区等现象。对照组细胞分布均匀，大小一致，未见明显异常。
流式细胞仪检测及分析ABA作用前列腺癌DU-145细胞72h后，收集肿瘤细胞的实验组及对照组细胞，以0.01mol·L-1PH7.4PBS洗涤两次，用70％冰乙醇固定，置于4℃冰箱，检测前再次离心，弃上清液，PBS洗涤两次，4℃下溴化丙锭染色30min，用流式细胞仪测定DNA含量的变化，分析细胞凋亡及细胞周期紊乱情况。
ABA作用后肿瘤细胞流式细胞仪检测结果显示实验组ABA作用DU-145细胞72h后，DU-145细胞经流式细胞仪检测出现典型的亚二倍体“凋亡小峰”，肿瘤细胞凋亡率高达32％，大量增殖期细胞停滞在S期，使其无法实现细胞分裂，阻断细胞周期的进行，从而抑制DU-145细胞的增殖，诱导肿瘤细胞发生凋亡。对照组流式细胞仪检测结果无明显异常发现。
实施例2天然脱落酸对早幼粒白血病HL-60细胞的分化诱导研究将处于对数生长期的早幼粒白血病HL-60细胞分为实验组、对照组两组，实验组加入10ul 5×10-1g/L ABA(溶于无水乙醇)，使培养液中ABA终浓度为1×10-1g/L，对照组加入10ul无水乙醇，培养液中小牛血清浓度为130mI/L，常规方法培养细胞。加药48h后常规更换培养液，维持相同的药物浓度(ABA浓度为1×10-1g/L)。培养过程中，透射电子显微镜动态观察HL-60细胞形态上的改变。
细胞形态及超微结构的观察 离心收集培养及ABA作用24h的HL-60细胞，用0.01mol·L-1PH7.4PBS洗涤两次，用3％戊二醛固定，锇酸固定后，脱水，包埋，超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，透射电子显微镜观察肿瘤细胞形态及结构的改变。
ABA作用HL-60细胞24h后，透射电子显微镜观察显示肿瘤细胞核膜的微绒毛消失，细胞器数量减少，张力原纤维消失，可能与肿瘤细胞恶性表型减轻有关；而部分肿瘤细胞出现典型的凋亡超微结构特征。而电镜观察显示相应的对照组细胞核内染色质分布均匀，核仁存在，未见明显异常。
流式细胞仪检测及分析 收集ABA作用12h和24h的HL-60实验组及对照组肿瘤细胞，以0.01mol·L-1PH7.4PBS洗涤两次，用70％冰乙醇固定，置于4℃冰箱，检测前再次离心，弃上清液，PBS洗涤两次，4℃下溴化丙锭染色30min，用流式细胞仪测定DNA含量的变化，分析细胞凋亡及细胞周期紊乱情况。
检测结果表明ABA作用HL-60细胞后，能够通过影响肿瘤细胞的DNA合成，使大量增殖期细胞停滞在S期，使其无法实现细胞分裂，阻断细胞周期的进行，从而抑制细胞的增殖；同时，通过上调cAMP/PKA途径，诱导癌细胞分化，进入细胞程序化死亡，有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡。对照组流式细胞仪检测结果均无明显异常发现。
实施例3.
3.天然脱落酸对裸鼠移植瘤成瘤能力的影响1).材料(1)3周龄Balb/c.nu裸小鼠，平均体重约20g左右，均为雄性。
(2)裸鼠SPF饲养用屏障系统。
(3)人口腔癌Tca8113细胞株2.
2)方法2.1)接种细胞制备按照试验一方法培养Tca8113细胞至对数生长期，将贴壁生长的肿瘤细胞用消化液使之脱壁、分散，用无血清培养液离心洗涤2次，计数活细胞，用PBS液调整为2×107/ml细胞悬液。用带6号针头的注射器抽取适量的瘤细胞悬液接种裸鼠，每只动物接种1个部位(接种于裸鼠的腋下)，每个部位注射0.2ml瘤细胞悬液，含活细胞4×106。
2.2)药物处理待肿瘤增殖至可清楚摸到瘤结(瘤结Φ2-4mm)时，将动物随机分为对照组和治疗组，对照组3只，治疗组4只。分组给药ABA治疗组，经腹腔注射给药，2次/周、20mg/kg/次；对照组，PBS液代替ABA，给药方法与实验组相同。连续给药4周，共8次，脱颈处死裸鼠，终止试验。切取瘤块称重后，将肿瘤组织分为数块，用福尔马林固定者，用于HE染色组织学观察、诊断及免疫组化检测；用3％戊二醛固定者，用于透射电镜观察超微结构改变。
2.3)计算肿瘤生长抑制率(％)处死动物进行瘤体解剖，电子天平(精度0.0001g)称取并记录瘤重，计算抑瘤率，公式如下肿瘤生长抑制率(％)＝对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重×100％2.4)组织学观察观察瘤组织组织学特点及癌周血管变化情况3)结果(1).组织学观察结果裸鼠瘤组织块中，细胞特点与原细胞株完全一致，可明确诊断为人口腔癌Tca8113细胞株所致的移植瘤。对照组瘤周组织中，有大量新生血管形成，而实验组则比对照组明显减少。
(2).实验结束时，发现ABA实验组动物的转移瘤瘤块明显小于PBS对照组动物的瘤块(图4-1、图4-2)。实验组4只裸鼠移植瘤瘤重分别为1.9890g、2.3515g、2.4053g、2.6804g，平均瘤重为2.3565g；PBS对照组3只裸鼠瘤重分别为4.5420g、4.6053g、4.8734g，平均瘤重为4.6736g。实验组动物的平均瘤重明显大于对照组动物的平均瘤重，经统计学分析，两者间的差异有明显著性(P＜0.05)；计算ABA对移植瘤的生长抑制率为49.6％。
(3).对照组大量细胞的细胞核中布满棕褐色阳性颗粒，颗粒分布不均，细胞核深浅不一，每个高倍视野中约有多于2/3的细胞呈Ki67阳性表达；实验组的每个高倍视野中，仅有约1/4的细胞核呈现棕褐色阳性表达，阳性颗粒分布较一致。
权利要求
1.天然脱落酸用于制备肿瘤细胞“分化诱导剂”药物的新用途。
2.根据权利要求1所述的天然脱落酸用于制备肿瘤细胞“分化诱导剂”药物的新用途，其特征为制备的肿瘤细胞“分化诱导剂”药物中天然脱落酸的有效使用浓度一般在5g/L-1×10-6g/L。
3.根据权利要求2所述的天然脱落酸用于制备肿瘤细胞“分化诱导剂”药物的新用途，其特征为制备的肿瘤细胞“分化诱导剂”药物中天然脱落酸的有效使用浓度较好为2g/L-1×10-3g/L，最佳为1g/L-5×10-2g/L。
4.根据权利要求1所述的天然脱落酸用于制备肿瘤细胞“分化诱导剂”药物的新用途，其特征为其制备的药物可为口服剂型、外用剂型和滴注剂型。
5.根据权利要求1所述的天然脱落酸用于制备肿瘤细胞“分化诱导剂”药物的新用途，其特征为在低于50℃的温度下，常规制剂方法制备。
全文摘要
本发明涉及一种天然物质的新用途，具体涉及天然脱落酸的新用途。针对目前肿瘤发生率高，本发明公开了一种天然脱落酸用于制备肿瘤细胞“分化诱导剂”药物的新用途，即采用5g/L－1×10
文档编号A61P35/00GK1748674SQ20041004068
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月14日 优先权日2004年9月14日
发明者谭红, 雷宝良, 李志东, 周金燕, 杨杰, 钟娟 申请人:中国科学院成都生物研究所