专利名称：结核转基因疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学预防学领域。具体地说，本发明涉及利用卡介苗作为载体，采用自杀载体和整合载体介导的方式将外源基因esat-6和/或cfp10导入卡介苗基因组中，制备了转基因疫苗，命名为转基因卡介苗，可用于结核病的预防。
背景技术：
结核病作为一种严重危害人类健康的传染病，是我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题。近年来，随着人口流动增加、艾滋病的流行和耐多种药物的结核出现，全球结核病疫情出现回升，引起了国际社会的高度重视，世界卫生组织已将结核病作为重点控制的传染病之一，并宣布全球结核病处于紧急状态。目前全世界已有19亿人感染结核杆菌，每年新增结核病例1000万例，死亡300万，居各种传染病死亡人数之首，并且由于结核病多重耐药现象十分突出，治疗困难逐渐显现。据2000年第四次全国流行病学抽样调查结果表明，我国现有活动性肺结核患者约450万，其他结核病，如肾结核、骨结核、皮肤结核和结核性脑膜炎等尚未纳入统计数据，初步估计有4～5亿人已受过结核杆菌感染。因此，我国结核病的防治任务尤其紧迫。降低结核病发病率及死亡率的关键是安全、高效的结核疫苗的应用。
自从1921年以来，卡介苗一直广泛应用于结核病的预防，但其对结核病的预防作用十分有限，在不同地区其免疫保护作用差异很大，效果不稳定，给艾滋病等免疫功能受损的患者接种后还可能导致严重的播散性结核病。虽然卡介苗存在缺点，但仍具有许多其它疫苗无法比拟的优点首先，卡介苗是目前世界上应用最广泛的疫苗，至今已接种了超过30亿人；其次，卡介苗在婴儿出生后即可接种，且不受来自母体的抗体的影响，是世界卫生组织(WHO)推荐的两种出生时即可接种的活疫苗之一；第三，卡介苗本身是一种极强的免疫佐剂，具有增强人体免疫功能的作用；第四，卡介苗培养简单、价格低廉、热稳定性强、便于保存；第五，卡介苗是一种减毒多价活疫苗，它可以克服亚单位疫苗和DNA疫苗成分单一的缺点。而且，近年来卡介苗作为肿瘤基因治疗和传染病疫苗载体的研究也取得了重要成果。因此，利用基因工程的方法增强其保护效果，并去除毒力，使其成为安全、高效的新一代结核疫苗，这是新形势下我国控制结核病的正确策略，对于结核病的预防具有十分重要的科学价值和现实意义。
1998年，英国Sanger中心和法国Pasteur研究所科学家合作完成了结核分枝杆菌H37Rv株的全基因组测序工作，从而彻底改变了长期困扰着人们的结核分枝杆菌遗传背景不清的传统观念，为对结核分枝杆菌进行高水平高层次的研究提供了很好的机遇。现阶段预防结核病的新型疫苗研究主要有蛋白质亚单位疫苗、DNA疫苗、减毒活疫苗和重组卡介苗，综合分析各项研究结果表明，前三者疫苗免疫保护效果均不及卡介苗，而利用穿梭质粒构建的重组卡介苗，其缺点在无抗生素筛选时不能长期稳定地表达外源基因。
esat-6基因是由Anderson等首先发现的，他们从结核杆菌短期培养液中分离纯化出6kDa的分泌型蛋白，命名为esat-6，首次对esat-6基因进行了克隆和DNA序列测定，表明该编码95个氨基酸的蛋白质能引起强烈的抗结核记忆性T细胞应答。Berthet等将esat-6上游34bp处的一个基因命名为lhp(L45homologous protein)，与esat-6的方向是相同的，位于同一个超纵子内，共同转录，编码蛋白为CFP10，故该基因又名cfp10。Harboe等从基因和蛋白表达的水平对卡介苗和结核分枝杆菌进行了比较分析，结果表明esat-6和cfp10基因普遍存在于人型和牛型结核分枝杆菌中，而不存在于卡介苗和其他环境分枝杆菌中，他们还通过实验进一步证明了esat-6蛋白多肽链中含多个B淋巴细胞特异性识别表位。此后，Ravin和Skjot等研究表明，ESAT-6蛋白多肽链中还存在多个T淋巴细胞特异性识别表位，而CFP10表现出与ESAT-6相当的强的T细胞性免疫反应，诱导的IFN-γ的释放水平与ESAT-6相当。近来人们又将上述基因通过穿梭载体转入卡介苗中，发现重组卡介苗的毒力没有改变，而免疫原性增加了。综合以上研究结果，表明esat-6和cfp10基因都是卡介苗体外传代培养过程中丢失了的具有重要免疫保护作用的抗原基因。
基因打靶(Gene Targeting)又叫基因同源重组(HomologousRecombination)技术，是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术，也是研究基因功能最直接最有效的手段之一。早在1990年，Husson等就用基因定点同源重组技术对分枝杆菌进行分子遗传学操作，成功地将麻风分枝杆菌65kDa的热休克蛋白编码基因导入耻垢分枝杆菌基因组DNA中进行表达。Mederle等把猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的基因nef和gag整合到卡介苗基因组，与多拷贝质粒表达外源基因相比，克服了染色体外质粒易丢失的缺点，即使在染色体上是单拷贝，表达水平和介导细胞免疫的程度，也丝毫不逊色，从而为我们采用基因定点同源重组技术改造卡介苗提供了科学依据。
转基因技术是利用物理、化学和生物学的方法把重组基因转移给动物、植物和微生物并使之表达、稳定地传给后代。Gordon等1980年首次将外源基因通过显微注射法导入小鼠受精卵原核中，成功地获得了转基因小鼠。此后，转基因技术就用在了动物、植物和微生物的改造中，在医学中的应用也十分广泛，比如转基因植物生产疫苗、遗传病的治疗、恶性肿瘤的治疗、传染病的治疗和药用蛋白的生产等。随着同源重组技术的发展，转基因技术在微生物中的研究也是目前研究的热点之一。也为本发明的研究技术奠定了基础。
本发明的构思是利用传统卡介苗的种种优点，将其缺失的esat-6和cfp10基因转入体内表达，在不改变其毒力的基础上增加其免疫原性和免疫保护性，采用转基因技术，克服穿梭载体表达外源基因不稳定的缺点，制备了转基因卡介苗，达到了优于传统卡介苗的效果，可用于结核病的预防。
发明内容
本发明一方面，通过基因工程手段，将卡介苗缺失的基因esat-6和cfp10从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中扩增出来，装载在合适的载体中，将其转化入宿主菌，表达并纯化相应的蛋白，制备抗体。
本发明另一方面，以卡介苗基因组为模板，扩增α-Ag信号肽序列，插入T-Vector中，转化宿主菌，备用。
本发明的又一方面，采用重叠延伸剪接技术，将α-Ag信号肽序列分别与esat-6和cfp10连接，通过自杀载体或整合载体，转入卡介苗基因组中。
本发明的再一方面，将esat-6和cfp10的融合基因通过自杀载体或整合载体，转入卡介苗基因组中。
将上述制备的转基因疫苗进行动物实验，检测其毒性、免疫原性和免疫保护性，用于结核病的预防。
具体实施例方式
1)以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组为模板，设计esat-6和cfp10基因引物，并加上合适的酶切位点，克隆esat-6和cfp10基因。
2)通过基因工程手段，将esat-6和cfp10基因转入合适载体，并将其转化宿主菌，如大肠杆菌，测序证实序列正确后，用IPTG诱导蛋白表达，纯化目的蛋白，制备相应的抗体。
3)以卡介苗基因组为模板，扩增α-Ag信号肽序列，插入T-Vector中，转化宿主菌，提取质粒备用。
4)采用重叠延伸剪接技术(splicing by overlap extension，SOE)，将α-Ag信号肽序列分别与esat-6和cfp10连接，通过自杀载体或整合载体，转入卡介苗基因组中，应用PCR、Southern blot、Northern blot、Western blot和ELISA等方法检测外源基因的定点转入和表达情况。
5)采用重叠延伸剪接技术(splicing by overlap extension，SOE)，将esat-6与cfp10连接，并将融合基因通过自杀载体或整合载体，转入卡介苗基因组中，同样用上述方法检测外源基因的定点转入和表达情况。
6)转基因卡介苗的毒力检测以豚鼠作为实验对象，将豚鼠随机分成两组，一组注射转基因卡介苗，另一组注射传统卡介苗作为对照，观察豚鼠的成活时间。将转基因卡介苗加入体外培养的巨噬细胞中，显微镜下观察转基因卡介苗侵入巨噬细胞的能力及其在巨噬细胞内的增殖能力。
7)转基因卡介苗的体液免疫反应检测转基因卡介苗体外培养至OD600达1-1.5，收集菌体用于免疫动物，以BALB/c小鼠作为实验对象，将小鼠随机分成三组，第一组注射生理盐水，第二组注射传统卡介苗，第三组注射转基因卡介苗，4周后小鼠断尾取血，用PPD作为已知抗原通过ELISA检测小鼠体内的特异性抗体水平。
8)转基因卡介苗的细胞免疫反应检测仍以BALB/c小鼠为实验对象，按上述方法免疫接种，末次免疫6-16周后，分离小鼠脾淋巴细胞体外培养，然后加入PPD刺激，用3H-TdR掺入法检测淋巴细胞的增殖程度，进一步可作IFN-γ，IL-2等细胞因子含量测定。
9)转基因卡介苗动物免疫保护性实验以BALB/c小鼠作为实验对象，仍按上述方法免疫接种，末次免疫4周后，通过雾化吸入或腹腔注射结核杆菌H37Rv株进行攻击实验，4周后取肺、肝、脾等脏器组织作镜检，观察组织有无病变及其病变程度，病变组织进一步作结核杆菌培养，以检测病变组织的含菌量，并将实验组与对照组进行比较。
实施例实施例1基因克隆及蛋白表达结核分枝杆菌标准株H37Rv接种Sauton液体培养基，于37℃培养28天收集细菌，1×TE(10mmol/L Tris.HCl，lmmol/L EDTA，pH8.0)重悬细菌后置100℃水浴煮沸30分钟灭活，将灭活的菌体置洁净研磨器中进行适当研磨，将研磨后的菌液转入EP管中，加溶菌酶(50mg/ml)使其终浓度为5μg/ml，37℃水浴放置8小时，然后加入蛋白酶K(20mg/ml)至终浓度为100μg/ml，并加入10％的SDS使其终浓度为4.0％，37℃孵育过夜，次日以12000转/分4℃离心5分钟，将上清转入另一洁净EP管中，加等体积酚∶氯仿(1∶1)混匀，12000转/分离心5分钟，取上清加入RNase至终浓度为20μg/ml，37℃孵育1小时，再用酚∶氯仿抽提1次，上清转入另一洁净EP管中，加入2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃放置2小时，4℃以12000转/分离心10分钟，沉淀用70％乙醇洗涤2次，真空干燥后，溶于50μl 1×TE，-20℃贮存备用。
根据GenBank上公布的esat-6和cfp10基因序列，设计引物，引物的两端分别加上BamH I和EcoR I的酶切位点，以上述提取的基因组为模板，PCR扩增后纯化，再用BamH I和EcoR I酶切，同时酶切融合表达载体pGEX-1λT(Invitrogen公司)，将目的基因重组到载体中，转化大肠杆菌JMl09，用IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳，再用GST融合蛋白专用纯化试剂盒(Bulk and RediPack GST Purification Modules，Amersham Biosciences)纯化，冻干，得到目的蛋白。
实施例2esat-6转基因卡介苗的制备根据卡介苗基因组α-Ag信号肽、结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组esat-6基因前后序列设计引物，引物两端加上合适的酶切位点，以卡介苗基因组为模板，分别扩增卡介苗α-Ag信号肽和hsp60下游3kb片段、以结核分枝杆菌标准株基因组为模板，扩增esat-6基因。
利用重叠延伸剪接术(splicing by overlap extension，SOE)，将卡介苗α-Ag信号肽序列与esat-6分别连接起来，同时通过反向PCR的方法，将卡介苗hsp60下游3kb片段从中分开，并加上合适的酶切位点，经酶切后，其间插入卡介苗α-Ag信号肽-esat-6基因，将该基因片段插入自杀载体p2NIL，再插入来源于pGOAL的含有标志基因(hygromycin，Ag85-LacZ，Phsp60-sacB)的插入片断(Marker genecassette)，构建用于基因打靶(基因重组)的载体。
以电穿孔法将构建的重组载体转入卡介苗中，用潮霉素选择培养基进行第一步筛选，所得阳性克隆再用蔗糖选择培养基进行第二步筛选，再用酶切、PCR和Southern blot进一步证实，阳性克隆即为转基因卡介苗。经热休克诱导后，通过SDS-PAGE和Western blot进一步证实转基因卡介苗能高效表达esat-6基因编码产物。
实施列3转基因卡介苗动物免疫保护性实验1、动物免疫取BALB/c小鼠36只，随机分为3组，每组12只。第一组为空白对照组，每只小鼠于后背部皮下注射生理盐水100μl；第二组为卡介苗组，每只鼠皮下注射卡介苗100μl(106CFU)；第三组为转基因卡介苗组，每只鼠皮下注射转基因卡介苗100μl(106CFU)。
2、攻击试验疫苗接种8周后，各组行结核分枝杆菌H37Rv株攻击，即腹膜内注射100μl菌液(105CFU)。
3、脾重量指数及脏器活菌计数在结核分枝杆菌攻击后第4、8周时，每组取3只小鼠断颈致死，无菌操作下，解剖后肉眼观察肺、脾、肝变化，脾称重，将右肺和脾置于5ml含0.05％吐温80的PBS中，剪碎后匀浆，取50μl匀浆液分别稀释5倍、10倍、20倍后，取100μl涂布于Sauton平板上(其中卡介苗、转基因卡介苗的平板中加入2μg/ml thiophene carboxamic hydrazide以抑制残存卡介苗的生长)，37℃培养3-4周，计数菌落。结果接种转基因卡介苗组脾重量低于卡介苗组，肺脾含菌量转基因组也低于卡介苗组，实验组均低于对照组，统计学分析差异有显著性。
4、肺部病理改变在攻击后第4、8周时，每组取3只小鼠处死，取左肺于10％甲醛中固定，常规石蜡切片，HE染色后进行组织形态学观察。结果显示转基因卡介苗组肺组织病变也轻于卡介苗组和阴性对照组，证明转基因卡介苗具有抗结核的保护作用，但其效力较之传统卡介苗有提高。
权利要求
1.结核转基因疫苗，其特征在于，以卡介苗作为载体，将外源基因转入卡介苗基因组内制备结核疫苗，可用于预防结核病。
2.如权利要求1所述的新型疫苗，以卡介苗为载体，命名为转基因卡介苗。
3.如权利要求1所述的转基因疫苗，其特征在于，作为载体的卡介苗基因组中导入编码分泌蛋白ESAT-6和CFP10的多核苷酸或与之互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的转入卡介苗基因组的分泌蛋白编码基因可以是单独的esat-6或cfp10，也可以是二者连在一起的融合基因。
5.如权利要求3所述的分泌蛋白编码基因可以是单独的esat-6或其前端连接促分泌的修饰基因(如α-Ag信号肽序列等)。
6.如权利要求3所述的分泌蛋白编码基因可以是单独的cfp10或其前端连接促分泌的修饰基因(如α-Ag信号肽序列等)。
7.如权利要求4所述的融合基因可以是esat-6在前，也可以是cfp10在前，二者的前端也可加促分泌的修饰基因(如α-Ag信号肽序列等)。
8.如权利要求1所述的转基因疫苗，可由特殊的自杀载体(如p2NIL等)通过同源重组技术定点整合入卡介苗的基因组中。
9.如权利要求1所述的转基因疫苗，可由特殊的整合载体(如pMV361等)通过整合酶的作用定点整合入卡介苗的基因组中。
全文摘要
结核转基因疫苗及其制备方法属于生物技术和医学领域，本发明涉及一种用于结核病预防的转基因疫苗及其制备方法。本发明用于结核病预防的转基因疫苗是在卡介苗的基础上，利用特殊载体，采用定点同源重组技术和整合酶定点插入技术将外源基因片段esat－6和cfp10插入卡介苗基因组中，命名为转基因卡介苗，该方法在不改变卡介苗毒力的情况下增加了免疫原性和免疫保护性，同时克服了利用穿梭载体表达外源基因容易丢失的缺点，作用优于传统的卡介苗，可用于结核病的预防。
文档编号A61P31/00GK1748796SQ20041004068
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月15日 优先权日2004年9月15日
发明者鲍朗, 赵明才 申请人:四川大学