专利名称：一种医用丝素蛋白材料的表面处理方法
技术领域：
本发明涉及一种医用丝素蛋白材料的表面处理方法，属于生物材料的表面改性技术领域。
背景技术：
丝素蛋白材料作为天然生物蛋白，因它具有良好的生物相容性和良好的机械性能与物理性能，近年来受到生物材料界越来越多的关注和研究。由于丝素蛋白天赋的优异性能有望被应用与机体组织中，如作为人造韧带、人造骨、人造血管等生物材料。
为了满足医用生物工程的需要，中国专利申请CN1475533A已成功地将丝素蛋白制成了二维薄膜和三维丝素管材料，并从物理角度解决了丝素蛋白材料的力学性能，而无需添加有害的有机溶剂和高分子物质就可以得到力学性能优异、不溶于水的丝素蛋白材料，继而通过乙醇消毒和紫外线或γ射线灭菌后供临床试用。但是作为医用生物材料，丝素蛋白还必须经得起医用生物学的考验。粗看起来，现有的丝素蛋白材料似乎已能满足医用材料的要求，其实不然，如当丝素蛋白作为人造韧带、人造骨、人造血管进入机体组织后，需要一个漫长的适应过程，这说明丝素蛋白材料与机体组织细胞间的亲和性还不够，或者说两者的相容性还不能满足要求，所以医务工作者和患者均期望有关的生物材料工作者做出进一步努力改变这种状况。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有医用丝素蛋白材料所存在的缺点，提出了一种医用丝素蛋白材料的表面处理方法，可大幅度改善丝素蛋白材料与机体组织细胞间的相容性，一旦丝素蛋白材料作为医用生物材料被植入机体组织后，它就能让机体组织细胞在材料的表面快速增殖生长，并尽快的融为一体。
发明人从体外细胞培养实验中发现，丝素蛋白作为生物材料植入机体组织后之所以需要一个漫长的适应过程，因为它作为一异体物质进入人类机体组织，它需要一个驯化过程，即一方面需要机体组织排出体液，逐步消除材料表面痕量污染所造成的不良的信息污染；另一方面需要营造一种机体组织细胞在材料生长的条件；换句话说，需要逐步提高丝素蛋白材料与机体组织之间的生物相容性。所以，如何预先在材料表面完成这个驯化过程，营造机体组织细胞在丝素蛋白材料优越的生长条件，这就是本发明所创造的构思。
本发明所说的医用生物材料的表面处理方法，主要包括如下两个方面
(1)在超声波和能发射远红外线的电气石的参与下，用活性水对材料进行深层次的清洗，以消除材料内的痕量污染，还材料固有的本性。
通常将加工成型的(如CN1475533A公开的)医用丝素蛋白材料(简称材料)按常规预处理，即先用酒精消毒、紫外线或γ射线灭菌处理，然后在无菌条件下，用双蒸水反复浸泡数次，使残留在材料表面上的酒精等杂质尽量洗除。但是，通过上述清洗处理的材料内仍然含有痕量的污染物，影响材料的固有本性，减少了它表面的应有活性。
为此，本发明将经过上述预处理材料置于盛有活性水的容器中，借助超声波和能发射远红外线的电气石的作用，对材料进行深层次清洗，将材料内的痕量污染物予以清除，并恢复材料固有的本性，即恢复材料表面的氨基酸基团固有的活性。
其中所说的活性水，是指恢复水本身固有活性的水，它是一种PH＝7.4，缔合度为6～8的小分子态的水，具有高的渗透力、溶解力、代谢力。
目前所说的净化水，包括采用一切净化措施获得的纯净水、蒸馏水、双蒸水在内，均是略带酸性的、缔合度大于36的大分子团的水，因为水中的痕量污染物，影响了水的本性。由于这种痕量污染物，用常规的仪器很难检测出来，因此有人称这种污染为信息污染，意思是污染物信息影响水的本性。
当材料用活性水清洗时，活性水易渗透丝素蛋白材料的内部，将污染垃圾带出除去，还材料的本来面目——一种洁净的活性的丝素蛋白。
其中，电气石的作用在于使水在电气石发出的远红外线作用下始终保持PH＝7.4，缔合度为6～8的小分子态，从而保持活性水固有的高效去污染能力，此外电气石发射的远红外线还具有活化丝素蛋白表面氨基酸分子的能力，有利于下一步的处理。
其中，超声波的作用主要在于借助超声波的能量作用以加速清洗速度，提高清洗效率，即在较短的时间内完成材料的清洗过程。此外超声波存在亦有利于活性水保持稳定的小分子团的尺度。
(2)用促进细胞生长的物质对材料表面进行改性处理，是促进细胞生长物质中的酸性基团与丝素蛋白材料表面上已被复活的赖氨酸、组氨酸等碱性氨基酸基团耦合，使材料表面含有促进细胞生长物质，从而大大提高了材料与机体组织之间的亲和性，创造适宜细胞在材料表面上生长的优化环境，是机体组织细胞在材料表面快速的增殖生长，并融为一体。
将经步骤(1)处理的材料，在无菌条件下取出沥干，置于盛有含促进细胞生长物质的溶液中，浸渍8～24小时，溶液中的促进细胞生长物质，由于其上酸性基团的作用会自动与材料表面上的碱性氨基酸基团耦合，从而在材料表面(宏观看)包围了一层促进细胞生长物质。取出后，在无菌条件下密封包装，并保存于-20℃以下的冰箱中，备用。
其中所说的促进细胞生长物质是指酸性成纤维细胞生长因子(简称为aFGF)或表皮细胞生长因子(简称为EGF)中的一种，用双蒸水配制成浓度为20～200ng/ml的溶液，供表面处理用。
为了验证本发明所说的经表面处理的丝素蛋白材料的良好的生物学性质，本发明将已处理过的丝素蛋白材料进行了生物学细胞培养试验，方法如下1.首先将表面处理过的丝素蛋白材料置于培养瓶(或培养管)中，用动物细胞复合培养基DMEM(为Dulbecco’s Modified Eagle Medium的简称，它是一种公知的培养基，故叙述从略)，在37℃培养箱中进行浸润数小时。
2.倒出DMEM，然后接种含有动物细胞的DMEM溶液，置于37℃的培养箱中，每隔24小时用倒置显微镜观察计数一次细胞的生长情况。
其中所说的动物细胞是贴壁依赖型的内皮细胞如人脐静脉血内皮细胞，或表皮细胞如中国仓鼠卵巢细胞中的一种。接种溶液中细胞密度为(3.5～3.75)×105个/ml。
培养24小时后，用倒置显微镜观察结果材料表面上的细胞生长良好，均匀密布，形态呈纺锥形；用细胞计数法测得细胞增至5.05×105个/ml。
培养48小时后，用细胞计数法测得细胞增至6.0×105个/ml。
由以上实验结果可以证明用本发明公开的方法经表面处理后的丝素蛋白材料，当它作为细胞培养机制材料时，由于有着良好的表面生长条件，促使动物细胞在表面快速生长，可以从一个侧面证明经表面处理后的丝素蛋白材料有着优良的生物相容性。因此亦可以这样说本发明的医用丝素蛋白材料的表面处理方法，为细胞在表面增长创造一种优越的生态环境，有效的改善了丝素蛋白材料的表面生物学特性，当它植入机体组织后，就能很快的和机体组织细胞融为一体，解决了医学生物工程所存在的难题，从而有效的推进了医用生物材料制备技术的进步。
具体实施例方式
下面结合实施例进一步阐明本发明的内容。
实施例1.医用丝素蛋白材料的精炼与表面处理。
1.取家蚕茧去蛹取蚕茧或收集丝织行业的废蚕茧作原料，将10g清洗的丝茧原料放在浓度为0.5％的碳酸钠溶液中煮沸，按丝茧与碳酸钠溶液之间的重量比1∶100反复精练两次，每次30分钟(沸腾态)，然后充分水洗至中性，在室温下干燥得到精炼的丝素蛋白6.7g。
2.将上述精炼所得的丝素蛋白按重量比1∶10放置在浓度9M的氯化钙溶液中，煮沸溶解，得丝素蛋白溶液。
3.用能截留分子量≥30,000Da聚醚砜膜对丝素蛋白溶液进行超滤，操作压力为1.0MPa，温度为25℃。通过超滤不仅可以去除氯化钙等杂质和分子量较小的蛋白与多肽，同时能获得分子量≥30,000Da的浓缩的丝素蛋白溶液A1200ml。用紫外分光光度法定量测定A1溶液中蛋白浓度为53.32mg/ml。
4.将上述溶液A1用蒸馏水稀释至蛋白浓度(指分子量≥30,000Da的丝素蛋白)为26mg/ml，倾倒在培养瓶中，倾倒量以能完全覆盖瓶底为度。将含有丝素蛋白溶液A1的培养瓶置于40℃的干燥箱中干燥24～48小时成膜，即得丝素蛋白膜材料，或者按CN1475533A专利申请公开的方法，制成二维薄膜或三维管状材料。
5.将步骤4所得丝素蛋白材料进行常规的消毒灭菌处理。将丝素蛋白材料先用75％的酒精浸泡消毒30分钟，再用紫外线或γ射线灭菌30分钟。然后在无菌条件下用双蒸水反复清洗丝素蛋白材料，尽可能的除去附着在丝素蛋白材料表面上残留的酒精等杂质(但是痕量的杂质污染单纯靠洗涤是去不掉的)。
6.对丝素蛋白材料进行深层次的清洗和“活化”，还丝素蛋白材料固有的本质本色。将活性水注入贮有丝素蛋白材料的培养瓶或培养管中，然后在无菌条件下引入超声波探头和能自动发射远红外线的电气石构件(或颗粒)，是水始终保持水分子活性态(即活性水的标准，PH＝7.4，缔合度为6～8。)，并借超声波的能量作用，不仅能快速的渗入丝素蛋白材料的内部，载带出痕量的污染杂质，予以除去，而且能使丝素蛋白材料表面的氨基酸分子从污染信息的束缚中解放出来，得到“活化”，还纯净丝素蛋白固有的本色。
为了达到深层次清洗丝素蛋白材料的目的，视材料表面结构的复杂情况不同，可按步骤6反复处理1～3次，每次至少半小时。处理完后，倒掉残余的活性水或取出丝素蛋白材料在无菌条件下沥干。注这里借用活化概念来形容被污染信息束缚中解脱出来的纯净的丝素蛋白的固有本质，所以在活化外加上引号。
7.用促进细胞生长物质对洗净的丝素蛋白材料进行表面处理。向存放有经步骤6处理的丝素蛋白材料的培养瓶中，加入酸性成纤维细胞生长因子aFGF的溶液，其浓度为20～200ng/ml，溶液加入量以能完全覆盖丝素蛋白材料表面为度。在无菌条件下浸渍8～24小时，一般aFGF浓度高，则浸渍时间可短一些。aFGF上的酸性基团能自动与被“活化”的丝素蛋白材料表面上的碱性氨基酸分子耦合，是丝素蛋白材料表面含有促进细胞生长物质。
8.用体外细胞培养法来检验或评估经表面处理的材料的生物学特性，并预期材料与机体组织之间的亲和性。其试验方法简述如下先将经步骤7处理的材料，至于装有DMEM溶液的培养瓶中，在37℃培养箱中放置12～24小时，使材料表面得到DMEM的浸润；然后倒去多余的DMEM，再在无菌条件下，接种用DMEM配置的人脐静脉血内皮细胞或中国仓鼠卵巢细胞溶液，所接种的溶液中细胞浓度为3.5×105个/ml，同时放入无菌的电气石微晶，使溶液中的水在电气石自动放射的红外线作用下瞬间变成活性水，置于37℃培养箱培养。培养24小时后，用倒置显微镜观察，材料的表面细胞生长良好，呈纺锥形，对于丝素蛋白薄膜材料试验来说，接种溶液量为3ml已足够，此时用细胞计数法测得细胞密度为5.01×105个/ml，比未经表面处理的材料，其细胞增长速率至少提高一倍，说明通过本发明处理的材料比未经处理的材料更适合于细胞的生长。
总之，从实施例中可以看出按照本发明所说的表面处理方法，可以大大改善丝素蛋白材料表面的生物学特性，为机体组织细胞在材料表面的增长创造了良好的生物学环境，从而推动医用生物材料的发展。
权利要求
1.一种医用丝素蛋白材料的表面处理方法，包括将已通过酒精消毒、紫外线或γ射线灭菌后的材料先用双蒸水反复清洗以尽量除去酒精等杂质；然后用活性水进行深层次清洗以除去材料内的痕量污染物，使材料表面活化，还丝素蛋白固有的本色，最后使材料表面上耦合促进细胞生长的细胞生长因子，创造适宜于细胞在材料表面上生长的优化的环境。其特征在于(1)所说的用活性水进行深层清洗是指在超声波和能自动发射远红外的电气石的存在下，用一种PH＝7.4，缔合度为6～8的小分子团的水清洗，利用活性水高渗透高净化特性将丝蛋白的材料内的痕量污染物予以清除，提高材料表面氨基酸“活性”，还丝素蛋白材料固有的本质；其中电气石作用在于使活性水始终保持PH＝7.4，缔合度为6～8的小分子态，超声波的作用除了能使水保持小分子团尺度外，主要在于借助超声波的能量加速清洗速度，提高清洗效率；(2)所说的使材料表面耦合促进细胞生长的物质，是指通过材料表面上碱性氨基酸基团和促进细胞生长物质上的酸性基团之间作用进行自动耦合，其中所说的促进细胞生长物质是指酸性成纤维细胞生长因子(简称为aFGF)或表皮细胞生长因子(简称为EGF)中的一种，用双蒸水配制成浓度为20～200ng/ml的溶液，在无菌条件下，将丝素蛋白的材料浸渍其中8～24小时，使材料表面上自动耦合有促进细胞生长的物质。
全文摘要
本发明公开了一种医用丝素蛋白材料的表面处理方法，首先通过一定条件下的深层次清洗，消除材料上的痕量污染，恢复丝素蛋白固有的本色，然后通过在材料表面耦合促进细胞生长的细胞生长因子，使材料表面含有细胞生长因子，从而大大提高和改善了材料表面与机体组织之间亲和性，创造了细胞在材料表面上生长增殖的优越环境，使机体组织与材料很快的融为一体，有力地推动了制备生物材料工程的进步。
文档编号A61L29/16GK1651101SQ20041008935
公开日2005年8月10日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者徐殿胜, 陆兵, 夏杰, 谢菁 申请人:华东理工大学