专利名称：一种对水溶性药物有较高包封率的脂质体的制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种药物载体脂质体的制备方法。
背景技术：
脂质体是一种由磷脂双分子层形成的闭合囊泡。作为药物的载体，可以提高药物的靶向性、改善药物的释放特性，其在药物传输过程中的特殊作用已使得其成为重要的药物传输系统。脂质体的制备技术一直是限制脂质体应用的主要原因之一。到目前为止，尽管文献和专利报道的脂质体制备技术很多，但这些方法或者需要复杂的设备和工艺条件(如挤压法)，或者可应用的药物非常有限，或者需要以一些经过修饰的昂贵的磷脂为原料；而一些简单便于工业化的方法，药物包封率通常较低。
由于脂溶性药物和水溶性药物在脂质体中的包封位置不同，因而实现包封的方法也不尽相同。相对于脂溶性药物，水溶性药物因其在分散体系具有较高的溶解度，包封于脂质体更困难，一般采用乳化技术，利用乳状液中连续相和分散相的转化完成包封。以此原理为基础的反相蒸发法是最常用的方法之一。
反相蒸发法是将磷脂等膜材溶于有机溶剂(如氯仿、乙醚等)，加入含有药物的水溶液，进行短时超声，形成稳定的W/O型乳状液。药物溶解于水相而存在于乳滴的内部。此后，减压蒸发除去有机溶剂。随着有机溶剂的蒸发，以磷脂分子为界面的乳滴不断集中，当有机溶剂几乎蒸发完全时，以磷脂分子为界面的乳滴堆积在一起，形成凝胶状的粘稠结构；进一步蒸发有机溶剂，在亲油基团的相互作用下，相临乳滴的界面结合，形成双分子膜结构；与此同时，一部分乳滴破裂，其中含有药物的水溶液泄漏出来，形成水相的连续相，从而形成了脂质体的悬浮液。可见，在反相蒸发形成脂质体的过程中，必然伴随着药物的泄漏，一般情况下，反相蒸发制备的脂质体对水溶性药物的包封率不超过50％。
对上述过程的分析表明，造成反相蒸发法对药物的包封率比较低的主要原因就是在完成由油相连续相到水相连续相转变的过程中，由于水溶液的泄漏，而造成了药物的泄漏。如果能得到一种实现连续相转变的过程，在此过程中乳滴中的水渗出而药物仍然吸附或保留在乳滴内，就可以获得较高的包封率。本专利正是提供了实现这样一个过程的一种途径。
发明内容
本发明的目的是为克服已有技术的不足之处，提出一种对水溶性药物具有较高包封率的脂质体的制备方法。该方法以反相蒸发法为基础，利用电场对磷脂膜的致孔作用，提高脂质体对水溶性药物的包封率。
本发明提出的对水溶性药物具有较高包封率的脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤a、以天然或合成磷脂及附加剂为材料加入溶剂溶解，通过反相蒸发法得到含有脂类物质和待包封药物的凝胶状脂质，并停止蒸发溶剂；b、将得到的凝胶状脂质置于恒定电流强度的电场中，并缓慢向体系中加入脂质溶液，直至形成脂质体的悬浮液，通过氮气吹扫除去体系中存在的少量有机溶剂；c、将得到的脂质体采用探头式超声均化后得到纳米脂质体。
上述步骤a具体包括以下步骤(1)将物质的量之比为2∶1～4∶1的磷脂和附加剂置于容器中，加入氯仿或氯仿和甲醇以体积比1∶1～2∶1混合的混合溶剂，形成每mL溶剂含有60μmol～150μmol磷脂的溶液；减压蒸发溶剂，在容器内壁形成一层脂质膜；所述磷脂为主要成分为磷脂酰胆碱的天然或合成磷脂的一种或其任意比例的组合，磷脂酰胆碱的质量分数大于80％；附加剂为胆固醇、脱氧胆酸钠中的一种或其任意比例的组合；(2)在容器内加入作为反相蒸发油相的有机溶剂和作为水相的含有药物的水溶液；油相和水相的体积比为2∶1～4∶1；有机溶剂为乙醚或甲醇中的一种，或者两者以任意比例混合的混合溶剂；有机溶剂的使用量应使每mL有机溶剂中含有磷脂80μmol～120μmol；采用水浴式超声使形成乳状液，该乳状液室温下放置至少30分钟不分相。形成的乳状液中，待包封药物和磷脂的物质的量之比为1∶40～1∶400；(3)将所述乳状液进行减压蒸发去除有机溶剂，至形成凝胶状脂质；上述步骤b具体包括以下步骤(1)将凝胶状脂质通过盐桥施加电流强度为0.2mA～2mA(最好为0.5mA～1mA)的电场，并保持该电流强度恒定，且以0.01～0.001hz的频率变换电流的方向，直到凝胶状脂质崩解，形成脂质体悬浮液；施加电场的过程中要使用冰水浴对体系进行冷却；(2)施加电场的同时，向体系内注入脂质的溶液，注入的脂质溶液中溶质和步骤a)中使用的脂质的组分和组成相同，注入脂质的总质量为步骤a)中使用的脂质质量的10％～30％，溶剂为乙醚、甲醇中的一种，或者两者以任意比例混合的混合溶剂；溶液中每mL溶剂含有磷脂100μmol～150μmol；磷脂溶液的注入可以采用恒速的滴加装置进行，也可采用注射器通过注入通道缓慢注入；(3)在形成的脂质体的悬浮液中加入磷酸盐缓冲液，使磷脂的浓度保持于150～250μmol/mL；向悬浮液中通氮气，除去残留的有机溶剂；上述步骤c具体包括以下步骤(1)将形成的脂质体的悬浮液用冰水浴冷却，并使用氮气保护，再经超声破碎均化；(2)超声完成后，使该脂质体悬浮液在室温氮气保护下融合1～2小时；
(3)该脂质体悬浮液经微孔滤膜过滤，除去未分散物质和相应的杂质得到纳米脂质体。
本发明的原理本发明以反相蒸发法为基础，通过施加电场并补加磷脂从而获得对水溶性药物较高包封率的脂质体。
研究表明，在电流的作用下，磷脂膜结构会松散而形成一些非常细小的孔道，水分子可以渗出；如果控制一定的电流强度，不使大分子药物渗出而将磷脂膜内部的部分水导出，并同时向体系中加入新的磷脂分子，就可在保持反相蒸发过程中形成的乳滴不被大量破坏的情况下，形成脂质体，并且获得较高的药物包封率。
本发明的优点及积极效果1、采用本发明制备的脂质体对水性药物的包封率可以达到70％。
2、本发明采用未经特殊修饰的磷脂，如天然大豆磷脂提取精制的磷脂酰胆碱就可制得包封率较高的脂质体；3、本发明制备的脂质体经过超声后包封率并无明显的下降。
图1为本发明方法中的施加电场的装置的实施例示意图。
具体实施例方式
本发明提出的对水溶性药物具有较高包封率的脂质体的制备方法，结合实现设备及附图详细说明如下本发明的方法包括以下步骤(1)将物质量之比为2∶1～4∶1的磷脂和附加剂置于圆底容器中，以氯仿或氯仿和甲醇以体积比1∶1～2∶1混合的溶剂溶解；形成的溶液的浓度为每mL溶剂含有磷脂60μmol～150μmol于旋转蒸发仪上减压(水泵)蒸发溶剂，直到在瓶内壁形成一层脂质膜；其中的磷脂的主要成分为磷脂酰胆碱，其质量分数大于80％；附加剂为脱氧胆酸钠、胆固醇或两者任意比的混合物物质(加入适量的脱氧胆酸钠可以提高脂质体的变形性，制备的脂质体可以用于经皮给药系统)；(2)瓶内加入有机溶剂(油相)溶解磷脂，使形成的溶液中每mL有机溶剂中含有磷脂80μmol～120μmol；再加入含有待包封药物的缓冲液(水相)，使油相和水相的体积比2∶1～4∶1，待包封药物和磷脂的物质的量之比为1∶40～1∶400，采用水浴式超声仪超声(保持温度为0～4℃)使形成乳状液，该乳状液室温下放置至少30min不分相；其中有机溶剂为乙醚或甲醇中的一种，或者其中两者任意比例混合的混合溶剂；(3)将乳状液置于旋转蒸发仪减压蒸发(水泵减压，转速大于60r/min)去除有机溶剂，至形成凝胶状脂质；其中减压蒸发的温度应在磷脂的相变温度以下(即20～30℃)；所述凝胶状脂质，是指当体系中有机溶剂基本蒸发完后，由于乳滴紧密堆积而形成的粘稠状物质，是一个热力学不稳定的体系；(4)对上述凝胶状脂质施加电场，装置和方法如图1所示将凝胶状脂质2转移到U形管1中。在U形管的两端安装盐桥3，盐桥3与电解液5接触，电极4伸入电解液5中，构成施加电场的电流通路。由恒流电源7施加电流强度恒定的电场，电流强度为0.2～2mA(最好为0.5～1mA)。通过由方波发生器8控制的继电器6以一定的频率(0.01～0.001hz)变换电流的方向，直到凝胶状物质崩解，形成脂质体悬浮液；(5)在施加电场的同时，向U形管1内通过通道10滴加脂质的溶液。溶质和步骤1)中所采用的原料脂质的组份和组成相同，脂质的总注入量为原料脂质的10％～30％；溶剂为乙醚、甲醇中的一种，或者两者以任意比例混合的溶剂；溶液中每mL溶剂含有磷脂100μmol～150μmol。整个过程中，对U形管内的凝胶状脂质2使用冰水浴9进行冷却，并使用磁力搅拌器11和放置于U形管中的磁力搅拌子12进行搅拌，以防止形成局部溶液通道。所述形成脂质体的悬浊液后的一个明显特征是，施加的电场的电压由不断下降变为基本保持不变；根据所采用的电流强度的不同，由凝胶状脂质到脂质体的悬浊液的时间约为10min～40min。
(6)在形成的脂质体的悬浮液中加入磷酸盐缓冲液，使磷脂的浓度保持于150～250μmol/mL；向体系中通氮气，除去残留的有机溶剂；(7)将形成的脂质体的悬浮液转入金属容器中，冰水浴冷却，并用氮气保护，使用探头式超声破碎仪超声均化，控制每个超声脉冲之间的间隔时间大于2s，以避免体系的局部温度升高；(8)超声完成后，使脂质体在室温下融合1～2小时(氮气保护)；(9)脂质体悬浮液经微孔滤膜过滤，除去未分散物质和相应的杂质。
本发明的一个重要特征是，在实施时需要对不同的包封体系施加电场时产生的电流的强度进行优化。电流强度过小，不能明显的提高包封率，电流强度过大，会造成磷脂的相变和磷脂膜结构的破坏，从而使药物大量泄漏。因此在进行大规模的制备前，应先通过实验选择合适的电流强度。
本发明的具体制备方法，由下面的实施例进一步说明，但本发明的保护范围，不局限于此。
实施例1本实施例为采用本发明提出的方法制备盐酸二甲双胍脂质体。步骤1将磷脂酰胆碱200mg(相当于270μmol，纯度为90％，下同)、胆固醇40mg(相当于100μmol)，置于50mL茄形瓶，加入氯仿和甲醇的混合溶剂3mL(两者的体积比为2∶1)，在35℃下减压蒸发约15min，瓶内壁形成一层脂质膜；加入乙醚2 mL溶解脂质膜，加入1mL含有待包封药物的PBS缓冲溶液(其中盐酸二甲双胍的浓度为0.5mg/mL，相同于3μmol/mL)，超声约2min形成乳状液；在旋转蒸发器上减压蒸发，真空度为0.03～0.04MPa，温度为25℃，旋转速度为80转/分钟，大约15min后形成凝胶状脂质；步骤2将凝胶状脂质转移到U形管中；将U形管置于冰水浴中，将冰水浴放置在磁力搅拌器上，通过磁力搅拌器对凝胶进行搅拌。在U形管的两端通过盐桥施加电场，保持电流强度为1mA，每100s变换一次电流方向；同时向U形管中滴加磷脂的甲醇溶液0.5mL，含有磷脂酰胆碱30mg(相当于40μmol)，胆固醇6mg(相当于15μmol)；约20min后凝胶崩解形成脂质体的悬浊液，而电压降也基本保持不变；步骤3在形成的脂质体悬浊液中加1mL PBS稀释后，使用氮气吹除去剩余的乙醚和甲醇。用体积排阻色谱法分离脂质体和游离药物，用HPLC法测定游离药物的量，计算包封率(包封率＝(1-游离药物/投入药物)×100％)，脂质体的包封率为71.4±4.9％。采用动态光散射法测定脂质体的粒径，平均粒径为734±121nm。
步骤4超声均化脂质体。将制备的脂质体置于金属容器中，将金属容器至于冰水浴中，保持接触良好。采用Φ6的超声探头进行超声，输出功率为50W，超声(每次2s，间隔3s)100次后，平均粒径降至94±13nm；包封率为72.3±4.1％。与超声前相比，包封率不但没有下降，反而有所升高。
实施例2电流强度大小的对脂质体包封率的影响。按实施例1中的步骤1制备含有盐酸二甲双胍的凝胶状脂质，并分别对凝胶状脂质施加不同强度的电场，即电流强度依次为0.5mA、1mA、2mA、5mA；在每种电流强度下均为每100s变换一次电流方向。施加电场的同时按实施例1中步骤2的的方法和处方添加磷脂。在上述4种电流强度的电场下，凝胶崩解所需的时间依次大约为30min，20min，20min，15min。在形成的脂质体悬浊液中加1mL PBS稀释后，使用氮气吹初期剩余的有机溶剂；上述电流强度下的包封率依次为52.3％、71.4％、46.6％、16.5％。说明电流的强度对药物的包封率有显著的影响。
实施例3添加磷脂对脂质体包封率的影响。按照实施例1的方法对在含有盐酸二甲双胍的凝胶状脂质施加电场的同时，缓慢注入磷脂的溶液。溶剂的组成同实施例1。溶液中每mL溶剂中含有磷脂75mg(相当于100μmol)，滴加的溶液中含有磷脂酰胆碱的量依次为0、20mg、30mg、60mg； 溶液的浓度为每mL甲醇中含有磷脂胆固醇的量依次为0、4mg、6mg、12mg。按照实施例1中的后续方法制得脂质体并测定包封率。上述磷脂滴加加量下的包封率依次为54.2％、64.7％、71.4％，69.2％；说明附加一定量的磷脂有助于提高脂质体的包封率。在上述相同的条件下，采用乙醚作为添加磷脂的溶剂，在上述四种磷脂和胆固醇的添加剂量下，得到的脂质体的包封率48.3％、57.3％、66.5％，67.1％。
实施例4
本实例为载药量对包封率的影响。按照实施例1的方法制备盐酸二甲双胍的脂质体，其中盐酸二甲双胍的投入量分别为0.2mg、0.5mg、1mg(相当于1.2μmol、3μmol、6μmol)，但是水相的体积均保持1mL不变。制得的脂质体的包封率依次为77.6％、71.4％、65.3％。
实施例5本实施例是采用本发明提出的方法制备具有柔性的纳米胰岛素脂质体。将磷脂酰胆碱200mg、胆固醇20mg(相当于52μmol)、脱氧胆酸钠10mg(相当于24μmol)，置于50mL茄形瓶中，加入氯仿和甲醇的混合溶剂4mL(两者的体积比为1∶1)，在35℃下减压蒸发约20min，瓶内壁形成一层脂质膜。将胰岛素溶解在pH＝6左右的磷酸盐缓冲液中，含量为4mg/mL(相当于0.7μmol/mL)。加入乙醚2mL、甲醇1mL溶解脂质膜，加入1mL胰岛素溶液，超声约2min形成乳状液。在旋转蒸发器上减压蒸发，真空度为0.03～0.04 MPa，温度为25℃，旋转速度为80转/分钟，大约20min后形成凝胶状脂质。
按实施例1中的步骤2的方法施加电场，电流为0.5mA；同时向U形管中滴加磷脂的溶液1mL，溶剂为乙醚，溶质含磷脂酰胆碱20mg、脱氧胆酸钠2mg、胆固醇1mg，约25min后凝胶崩解形成脂质体的悬浊液，加1mL PBS稀释；通氮气除去残留的少量有机溶剂。制得脂质体的包封率为71.2±5.3％；平均粒径723±117nm；按实施例1步骤4中的方法超声均化后，包封率为73.2±4.1％，平均粒径为104±201nm。
对比实施例本实施例为采用传统的反相蒸发法制备水溶性药物盐酸二甲双胍脂质体和胰岛素脂质体的实例。按实施例1的步骤1制得含有盐酸二甲双胍凝胶状脂质，按实施例5制得含有胰岛素的凝胶状脂质。在得到凝胶状上述脂质后；将真空度提高到0.06～0.07MPa，进一步减压蒸发溶剂直至凝胶崩解，停止减压蒸发，在崩解的脂质中加入1mL PBS，振荡直至形成脂质体的悬浊液。使用氮气吹扫除去残留的有机溶剂。测得脂质体对盐酸二甲双胍的包封率为37.0±5.2％，平均粒径为679±132nm。采用实施例1中步骤4的方法超声均化后，包封率为33.7±2.4％，平均粒径为97±15nm。胰岛素脂质体的包封率为37.7±6.1％，平均粒径为713±92nm；采用实施例1中步骤4的方法超声均化后，包封率为33.2±3.0％，平均粒径为101±11nm。
权利要求
1.一种对水溶性药物具有较高包封率的脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤a、以天然或合成磷脂及附加剂为材料加入溶剂溶解，通过反相蒸发法得到含有脂类物质和待包封药物的凝胶状脂质，并停止蒸发溶剂；b、将得到的凝胶状脂质置于恒定电流强度的电场中，并向体系中加入脂质溶液，直至形成脂质体的悬浮液，通过氮气吹扫除去体系中存在的少量有机溶剂；c、将得到的脂质体悬浮液采用探头式超声均化后得到纳米脂质体。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a具体包括以下步骤(1)将物质的量之比为2∶1～4∶1的磷脂和附加剂置于容器中，加入氯仿或氯仿和甲醇以体积比1∶1～2∶1混合的混合溶剂，形成每mL溶剂含有60μmol～150μmol磷脂的溶液；减压蒸发溶剂，在容器内壁形成一层脂质膜；(2)在容器内加入作为反相蒸发油相的有机溶剂和作为水相的含有药物的水溶液；油相和水相的体积比为2∶1～4∶1；有机溶剂的使用量应使每mL有机溶剂中含有磷脂80μmol～120μmol；采用水浴式超声使形成乳状液，该乳状液室温下放置至少30分钟不分相。形成的乳状液中，待包封药物和磷脂的物质的量之比为1∶40～1∶400；(3)将所述乳状液进行减压蒸发去除有机溶剂，至形成凝胶状脂质。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述磷脂为主要成分为磷脂酰胆碱的天然或合成磷脂的一种或其任意比例的组合，磷脂酰胆碱的质量分数大于80％；附加剂为胆固醇、脱氧胆酸钠中的一种或其任意比例的组合；所述有机溶剂为乙醚或甲醇中的一种，或者两者以任意比例混合的混合溶剂。
4.、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，上述步骤b具体包括以下步骤(1)将凝胶状脂质通过盐桥施加电流强度为0.2mA～2mA的电场，并保持该电流强度恒定，且以0.01～0.001hz的频率变换电流的方向，直到凝胶状脂质崩解，形成脂质体悬浮液；施加电场的过程中用冰水浴对凝胶状脂质进行冷却；(2)施加电场的同时，向体系内注入脂质的溶液，注入的脂质溶液中溶质和步骤a)中使用的脂质的组分和组成相同，注入脂质的总质量为步骤a)中使用的脂质质量的10％～30％；溶液中每mL溶剂含有磷脂100μmol～150μmol。(3)在形成的脂质体的悬浮液中加入磷酸盐缓冲液，使磷脂的浓度保持于150～250μmol/mL；向悬浮液中通氮气，除去残留的有机溶剂。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中的，溶剂为乙醚、甲醇中的一种，或者两者以任意比例混合的混合有机溶剂；所述磷脂溶液的注入采用恒速的滴加装置进行或采用注射器通过注入通道缓慢注入。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述电流的强度的范围为0.5～1mA。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在施加电场的同时，使用磁力搅拌器对凝胶状脂质进行搅拌。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c具体包括以下步骤(1)将形成的脂质体的悬浮液用冰水浴冷却，并使用氮气保护，再经超声破碎均化；(2)超声完成后，使该脂质体悬浮液在室温氮气保护下融合1～2小时；(3)该脂质体悬浮液经微孔滤膜过滤，除去未分散物质和相应的杂质得到纳米脂质体。
全文摘要
本发明涉及一种对水溶性药物有较高包封率的脂质体的制备方法，属于生物医药技术领域。该方法以反相蒸发法为基础，包括a、以天然或合成磷脂及附加剂为材料加入溶剂溶解，通过反相蒸发法得到含有脂类物质和待包封药物的凝胶状脂质，并停止蒸发溶剂；b、将得到的凝胶状脂质置于恒定电流强度的电场中，并缓慢向体系中加入脂质溶液，直至形成脂质体的悬浮液，通过氮气吹扫除去体系中存在的少量有机溶剂；c、将得到的脂质体采用探头式超声均化后得到纳米脂质体。本发明通过在优化的电场条件下制备得到的脂质体对水溶性药物的包封率可达70％以上。
文档编号A61K47/24GK1633990SQ20041009607
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月29日 优先权日2004年11月29日
发明者蒋国强, 朱德权, 昝佳, 林莹, 丁富新 申请人:清华大学