专利名称：壳聚糖在制备幽门螺杆菌疫苗佐剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物用途发明领域，尤其是涉及一种壳聚糖在制备幽门螺杆菌疫苗佐剂中的应用背景技术壳聚糖(Chitosan)，又名几丁聚糖，化学名称为聚合β-(1，4)-2-氨基-D-葡萄糖，即在甲壳素2号位上脱去乙酰基暴露出-NH2基因而形成的产物，是一高分子量的直链多糖，分子式是(C6H11NO4)n，约在185℃时分解。它的平均分子质量为1MDa，分子链长度大约为5000个单位，但在实际应用中，它的分子量大小即聚合程度随着不同的需要而变化。壳聚糖为白色或淡黄色粉末，不溶于中性与碱性水溶液以及绝大部分有机溶剂，可溶于单价无机酸和有机酸。其溶解度取决于壳聚糖的脱乙酰度、分子量与溶液的pH值，一般情况下，其分子量越小、脱乙酰度越高，溶解性越好。随着脱乙酰度(DD)、分子量等理化性质的不同，壳聚糖的解离常数(pKa)也发生变化。当pH值低于pKa时，壳聚糖分子的氨基基团即质子化，从而使整个分子带正电荷，这是壳聚糖分子发挥其生物学特性的一个重要特点。壳聚糖广泛存在于甲壳动物外壳、节肢动物表皮、低等动物细胞膜、高等植物细胞壁等生物组织中，是自然界少见的带正电荷的聚合物。
由于壳聚糖安全无毒、几乎无免疫原性、可生物降解并有良好的生物相容性，并且具有增强免疫、促进伤口愈合、促进上皮细胞增生和血管生成、止血、抗菌、抑制肿瘤、降血糖、血脂等多种生理活性。因此近年来被广泛的应用于医学领域。
幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori，Hp)已被公认为慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的重要致病因子，世界卫生组织已将其列为I类致癌因子，因而有效根除幽门螺杆菌对于预防幽门螺杆菌相关性疾病，特别是胃癌的发生具有十分重要的意义。目前根除幽门螺杆菌虽有多种药物联合疗法，但仍存在许多问题，如幽门螺杆菌耐药菌株的产生，药物价格昂贵，副作用大以及病人依从性差等。因此，免疫防治成为解决这一难题的新途径。幽门螺杆菌疫苗包括全菌疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗和活载体疫苗等。前二者均为蛋白疫苗，由于幽门螺杆菌蛋白的免疫原性较低，需有免疫佐剂的参与方能发挥其免疫防治作用，而寻找安全有效的黏膜佐剂是增强其免疫应答的关键所在。目前最为有效且最常用的佐剂是霍乱毒素(CT)和大肠杆菌不耐热毒素(LT)，但其对人体的毒副作用大，不能应用于人体。近来人们将注意力集中在改建CT、LT以降低其毒性，如CT或LT的B亚单位、LTK631等，但目前尚无一种高效、无毒、完全适用于人类的佐剂。人们也在致力于研究不需佐剂的DNA疫苗和活载体疫苗，它们虽然具有很多优点，但其本身仍存在缺陷，如活载体本身能导致机体的免疫反应，从而抑制载体疫苗在体内的复制；DNA疫苗可较好的诱导抗幽门螺杆菌循环抗体的产生，但能否有效的诱导出胃黏膜局部的免疫反应，建立有效的黏膜免疫，还有待进一步的研究。因此，蛋白疫苗目前仍被认为是最有希望的疫苗，人们正在积极寻找高效无毒的新型佐剂，以期解决这一难题。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供成本低、对人体无毒副作用的壳聚糖的新用途，即壳聚糖溶液在制备幽门螺杆菌疫苗佐剂中的应用。
本发明的第二个目的在于提供成本低、对人体无毒副作用的壳聚糖的新用途，即壳聚糖颗粒在制备幽门螺杆菌疫苗佐剂中的应用。
本发明的第三个目的在于提供壳聚糖溶液或壳聚糖颗粒用作保护哺乳动物包括人免于幽门螺杆菌感染的预防性疫苗。
本发明的第四个目的在于提供壳聚糖溶液或壳聚糖颗粒用作感染了幽门螺杆菌的哺乳动物包括人的治疗性疫苗。
壳聚糖在制备幽门螺杆菌疫苗佐剂中的作用机理为壳聚糖具有良好的生物学特性及免疫活性，可增强抗原的免疫原性，促进胃肠黏膜对抗原的吸收，促进黏膜局部的免疫反应，调节TH1和TH2免疫反应的平衡，从而发挥其佐剂效应。
为了更好地理解本发明的实质，下面以实验和结果来证明壳聚糖的用途。
本发明分以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌疫苗的免疫保护作用和治疗作用两部分。
A、材料与方法一、材料1、药品与试剂88.5％脱乙酰度壳聚糖(上海其胜生物制品有限公司产品)；空肠弯曲菌琼脂基础、布氏肉汤培养基础(中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心产品)；无菌绵羊血(上海江南生物技术工程有限公司产品)；氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、蔗糖、过氧化氢、甘油(广东汕头市西陇化工厂产品，分析纯)；辣根过氧酶标记的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgA(美国Zymed-LABORATORIES INC产品)；辣根过氧酶标记的羊抗鼠IgG(美国Sigma-ALDRICH，INC.产品)；鼠IL-2、IL-4、IL-10定量ELISA检测试剂盒(美国Bender MedSystems产品)；兔抗鼠IgA，Zymed-LABORATORIES INC产品)；牛血清白蛋白(上海普飞生物技术有限公司产品)；幽门螺杆菌国际标准菌株SS1(由中国幽门螺杆菌菌株库提供)；链霉卵白素-过氧化物酶系列试剂盒(北京中山生物技术有限公司产品)；胎牛血清(上海江南生物技术工程有限公司产品)；Tween-20(美国Amresco公司产品)；霍乱毒素(CT)(美国Sigma产品)；
邻苯二胺(美国Amresco公司产品)；CO2、N2(南昌气体厂产品)；96孔聚乙稀酶标板(美国Corning公司产品)；实验用水均为双蒸水。
2、仪器湘仪——岛津-200型电子分析天平(湘代天平仪器厂进口组装)；MDF-U281-85℃低温冰箱(日本三洋公司产品)；YJ-1003A型超净工作台(苏州净化设备公司生品)；TE-A型微量振荡仪(江苏泰仓医疗器械厂产品)；MCO-175M型三气培养箱(日本三洋公司产品)；Olympus显微镜(日本Olympus公司产品)；2135型病理切片机(德国莱卡公司产品)；TCX-P病理显微图像分析仪(南昌玖玖电子总厂产品)；450型酶标仪(美国Bio-Rad公司产品)；贝克曼低温超速离心机(美国贝克曼公司产品)；VC100型超声粉碎仪(美国公司产品)；-40℃低温冰箱(日本三洋公司产品)；TS-12E自动脱水机(湖北孝感电子仪器厂产品)；YB-6型生物组织包埋机(湖北孝感亚光医用电子技术研究所产品)；PIPETMAN微量移液器(1～20ul)(法国GILSON公司产品)；电热干燥箱(上海医疗器械厂产品)；电热恒温水温箱(上海医用恒温设备厂产品)；热式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂产品)；TGLL-18B台式高速冷冻离心机(上海立信机械研究所江苏太仓医疗器械厂联营厂产品)；751-GW型分光光度计(上海分析仪器厂产品)。
3、实验动物和SPF级动物实验室雌性清洁级BALB/c小鼠，6～8周龄，平均体重22.5克，购自中科院上海实验动物中心(许可证号SCXK(沪)2002-0010)，并在SPF级实验室(江西省药物研究所)内饲养。
二、方法(一)、主要液体的配制1、pH值为7.4，浓度为0.01M的磷酸缓冲液(PBS)的配制NaCl 4g，KH2PO40.1g，Na2HPO4·12H2O 1.45g，KCl 0.1g，加入蒸馏水至1000ml即成，灭菌备用；2、pH值为7.4，浓度为0.15M的磷酸缓冲液(PBS)的配制Na2HPO4·12H2O 268.605g加500ml蒸馏水配成Na2HPO4·12H2O母液，NaH2PO4·2H2O 117.0075g加500ml蒸馏水配成NaH2PO4·2H2O母液，NaCl 7.65g加蒸馏水900ml配成NaCl母液。取Na2HPO4·12H2O母液81ml，NaH2PO4·2H2O母液19ml，NaCl母液900ml即配成1000ml浓度0.15M的磷酸缓冲液，灭菌备用；
3、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法所需溶液的配制(1)、包被缓冲液(pH9.6，0.1mol/L的碳酸缓冲液)Na2CO31.68g、NaHCO32.86g，加蒸馏水至1000ml；(2)、磷酸缓冲液(0.01mol/L、PH7.2)NaH2PO40.345g、Na2HPO42.68g、NaCl8.74g加蒸馏水至1000ml；(3)、洗涤液在上述磷酸缓冲液中加入Tween-20，配成含0.5％Tween-20的磷酸缓冲液，即为洗涤液；(4)、稀释液即为含1％小牛血清白蛋白的磷酸缓冲液；(5)、枸橼酸-磷酸缓冲液(0.1mol/L、PH5.0)枸橼酸7.3g、Na2HPO423.87g加蒸馏水至1000ml；(6)、底物液底物邻苯二胺以0.4mg/ml的比例溶于枸橼酸-磷酸缓冲液中，避光备用，临用前以0.6ul/ml的体积比加入30％双氧水；(7)终止液2mol/L H2SO4。
(二)、幽门螺杆菌的培养采用幽门螺杆菌标准菌株SS1，将其接种在含7.5％无菌绵羊血的空肠弯曲菌选择性培养琼脂基础上，微需氧条件下(O25％、CO210％、N285％)37℃培养2-3天，用布氏肉汤洗脱细菌收集，并在660nm波长下测细菌密度，1吸光度(OD值)为108CFU/ml(CFU集落形成单位)。
(三)、幽门螺杆菌抗原的制备SS1标准菌株培养2-3天后，以0.15mol/L、PH7.4的磷酸缓冲液洗脱，并洗涤3次，超声粉碎(输出功率60HZ，每分钟后间隔30秒，共20分)后，在4℃下以8000g离心30分，取上清，在280nm和260nm测吸光度，并按下列公式幽门螺杆菌蛋白含量(mg/ml)＝[(1.45×OD280)-(0.74×OD260)]×稀释倍数，进行蛋白定量后，置-85℃冰箱备用。
(四)、壳聚糖颗粒的制备88.5％脱乙酰度壳聚糖与生理盐水配成10mg/ml的溶液，再经超声(输出功率80HZ)处理2次，每次5分钟，间隔1分钟，以50g离心10分钟后取其上清，并以400目网筛过滤，再以1400g离心10分钟后收集其沉淀物，即为壳聚糖小颗粒。
(五)、壳聚糖酸溶液的制备将88.5％脱乙酰度壳聚糖按3％的比例溶解于0.8％乙酸盐水中即成壳聚糖酸溶液。
(六)、免疫保护作用的研究1、实验动物分组将小鼠按随机表格随机分为9组①空白对照组磷酸缓冲液，15只；②单纯壳聚糖酸溶液组，12只；③单纯壳聚糖颗粒组，13只；④幽门螺杆菌(HP)抗原组，15只；⑤幽门螺杆菌抗原+壳聚糖酸溶液组，15只；⑥幽门螺杆菌抗原+壳聚糖颗粒组，15只；⑦幽门螺杆菌抗原+霍乱毒素(CT)组，12只；⑧幽门螺杆菌抗原+壳聚糖酸溶液+霍乱毒素组，13只；⑨幽门螺杆菌抗原+壳聚糖颗粒+霍乱毒素组，14只；2、抗原与佐剂的剂量幽门螺杆菌抗原1.2mg/只/次，壳聚糖颗粒500μg/只/次，霍乱毒素5μg/只/次，壳聚糖酸溶液在所需各组中配成含壳聚糖0.5％的终溶液；BALB/C小鼠按上述分组和剂量，于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次，0.4ml/只/次，免疫后4周给予约1×109CFU/ml的SS1幽门螺杆菌活菌液0.5ml/只，攻击小鼠，隔日一次，共2次。含有壳聚糖颗粒组，灌胃前先经超声以20HZ的输出功率混匀。
3、标本采集于免疫后4周，攻击前自空白对照组、幽门螺杆菌抗原组、幽门螺杆菌抗原+壳聚糖酸溶液组及幽门螺杆菌抗原+壳聚糖颗粒组各随机取出5只，处死，取标本待测。其余均于末次攻击后4周处死。先腹腔内注射2％毛果芸香碱0.4ml，收集唾液后，摘除眼球取血，处死小鼠，无菌条件下，解剖取出鼠胃，沿胃大弯剪开，用无菌生理盐水轻轻冲洗掉胃内残留物后沿纵轴将胃切为三部分，一部分进行幽门螺杆菌分离培养，一部分用于免疫学检测，另一部分胃组织经10％甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，作伊红-苏木素(HE)染色、吉姆萨(Giemsa)染色、免疫组化检测。
(七)、免疫治疗作用研究1、实验动物分组将小鼠按随机表格随机分为组①空白对照组PBS溶液，12只；②幽门螺杆菌抗原组，11只；③幽门螺杆菌抗原+壳聚糖酸溶液组，12只；④幽门螺杆菌抗原+壳聚糖颗粒组，12只；⑤幽门螺杆菌抗原+霍乱毒素组，11只；⑥幽门螺杆菌抗原+壳聚糖酸溶液+霍乱毒素组，11只。
2、抗原与佐剂的剂量与(六)、免疫保护作用研究中的抗原与佐剂的剂量相同。
3、幽门螺杆菌感染动物模型的建立及免疫接种6-8周龄的清洁级的BALB/c小鼠，给予含1×109/ml的幽门螺杆菌标准菌珠SS1活菌液，0.5ml/只灌胃，隔日一次，共5次。末次灌胃12周后，取4只小鼠杀死后取胃粘膜进行病理检查和幽门螺杆菌培养，二者皆证实幽门螺杆菌感染模型已建立。
已确立幽门螺杆菌感染的小鼠，在末次灌菌12周时，分别按上述分组和剂量于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次，0.4ml/只/次，含有壳聚糖颗粒组，灌胃前先经超声以20HZ的输出功率混匀。
4、标本采集末次免疫后4周，处死所有小鼠取标本待测，标本采集方法同(六)、免疫保护作用研究中的标本采集。
(八)、胃黏膜内幽门螺杆菌的测定采用定量幽门螺杆菌培养和病理改良Giemsa染色法测定。二者皆阴性记为阴性，两者之一阳性记为阳性。
1、幽门螺杆菌的定量培养胃黏膜在无菌条件下称重，置于运输液中(10％胎牛血清蔗糖混合液，即蔗糖10g、胎牛血清50ml、蒸馏水50ml)，-85℃冻存，待培养时取出胃黏膜加布氏肉汤0.3ml匀浆，按一定比例(1∶1，1∶4，1∶8)稀释，取0.5ml涂布于含7.5％无菌羊血、甲氧苄氨嘧啶(TMP)5mg/L、万古霉素10mg/L和多黏菌素B2500IU/L的空肠弯曲菌琼脂基上，微需氧条件下培养2-3天。根据菌落形态、革兰氏染色、细菌形态、尿素酶、氧化酶和触酶实验，鉴定细菌后，计算幽门螺杆菌菌落数，结果以菌落数/g(湿重组织)表示。
2、Giemsa染色胃黏膜石蜡切片→常规脱蜡至水→Giemsa染液染色20分钟→95％乙醇I、II及100％乙醇分化各1～2秒→二甲苯I、II透明各10分钟→中性树胶封片。
在高倍镜下观察，见典型的紫兰色螺旋样菌为幽门螺杆菌，并根据下列标准记分0个记为0分，一个胃小凹内1～2个记为1分，3～10个记为2分，11～20个记为3分，大于21个记为4分。
(九)、幽门螺杆菌抗体的检测采用ELISA法测定1、抗原、标本和酶标二抗的浓度抗原浓度20ug/ml，血清1∶100稀释，唾液1∶5稀释，胃黏膜匀浆上清液(胃黏膜称重后以1.3ml磷酸缓冲液匀浆，2000～3000转/分的转速，4℃离心20分钟，取其上清)1∶2稀释。过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG1、IgG2a、IgA 1∶1000稀释，过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 1∶2000稀释。
2、操作步骤①以100ul/孔幽门螺杆菌抗原液包被96孔聚乙烯酶标板，加盖，4℃过夜→②弃孔内液，洗涤3次→③1％小牛血清白蛋白200ul/孔，37℃封闭1小时→④同②→⑤加待测标本100ul/孔，37℃温育1小时→⑥同②→⑦加酶标二抗100ul/孔，37℃温育1小时→⑧同②→⑨加邻苯二胺底物溶液100ul/孔，室温避光放置30分→⑩加2mol/L H2SO450ul/孔，终止反应，酶标仪上在492nm波长下测OD值。
3、结果计算每个标本做复孔，取其平均值计算。每板均设空白孔、标准阴性和标准阳性孔，以标阴/标阳之比作为质控，各板之间此值的变异系数在5％以内。结果以待测标本OD/标准阴性OD之比表示。胃黏膜内抗幽门螺杆菌IgA以待测标本OD/标准阴性OD/g胃黏膜湿重表示。以二只未免疫及未攻击小鼠的标本混合为标准阴性，以二只经幽门螺杆菌抗原+霍乱毒素免疫并被幽门螺杆菌攻击后小鼠的混合标本为阳性。空白孔仅加底物溶液和终止液，其余各步以稀释液替代。
(十)、细胞因子的定量检测采用双抗体夹心ELISA法测定
1、胃黏膜匀浆上清液的处理同抗幽门螺杆菌IgA测定，以1∶2稀释，测定辅助性T淋巴细胞1细胞因子(TH1)IL-2和辅助性T淋巴细胞2细胞因子(TH2)IL-4、IL-10浓度，按试剂盒操作说明书进行。具体操作如下①用洗涤液洗涤试剂盒中的已包被相应抗体的聚乙烯酶标板2次→②将按比例稀释的7种不同浓度的标准品/待测标本100ul加入每孔，以样本稀释液作为空白对照→③加按比例稀释的生物素标记的相应抗体50ul/孔，室温下，振荡器上振荡2小时→④弃孔内液，洗涤3次→⑤加辣根酶标记的链霉卵白素100ul/孔，室温下，振荡器上振荡1小时→⑥同④→⑦加TMB底物溶液100ul/孔，室温下，振荡器上振荡10分钟→⑧加终止液100ul/孔→⑨酶标仪上在450nm(测量波长)及630nm(参比波长)双波长下测OD值。
2、标准曲线IL-2以1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6(pg/ml)；IL-4以250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9(pg/ml)；IL-10以2500、1250、625、312.5、156.3、78.1、39.1(pg/ml)制备标准曲线，每一标准品测复孔，取其均数。曲线的回归方程为IL-2 Y＝-9.8196+344.231X-123.10X2+42.7796X3(R＝1.000)，Y＝-6.8186+333.480X-137.27X2+44.7122X3(R＝1.000)；IL-4 Y＝-5.0590+77.8719X-42.662X2+16.0525X3(R＝0.999)，Y＝-0.3542+59.8328X-10.133X2+7.2265X3(R＝1.000)；IL-10Y＝15.4248+983.702X-293.80X2+114.952X3(R＝1.000)，Y＝-5.1157+972.450X-225.08X2+67.6971X3(R＝1.000)。
根据标准曲线算出待测标本的IL-2、IL-4、IL-10含量，并除以胃黏膜湿重，结果以pg/mg湿重胃黏膜表示。
(十一)、胃黏膜病理学检测炎症程度采用HE染色，胃黏膜石蜡包埋切片→常规脱蜡至水→1％稀盐酸酒精分化约3秒→水洗→碳酸锂反蓝约3秒→水洗→伊红染液染色5分钟→85％酒精、95％酒精□、□、100％酒精□、□脱水各2分钟→二甲苯□、□透明各10分钟→中性树胶封片。
高倍镜下观察10个视野固有层慢性炎症细胞(淋巴细胞、浆细胞)浸润，对慢性炎症进行计分。慢性炎症0＝固有层偶见淋巴细胞，1＝固有层有散在的淋巴细胞、浆细胞，2＝固有层有较多的淋巴细胞、浆细胞，3＝固有层有大量的淋巴细胞、浆细胞。
(十二)、胃黏膜内非特异性分泌型免疫球蛋白A(sIgA)测定采用过氧化酶标记的链霉卵白素免疫组织化学染色法(SP免疫组化法)测定胃黏膜常规石蜡包埋切片，脱腊至水→3％过氧化氢封闭10分钟，消除内源性过氧化物酶活性→蒸馏水洗3次→磷酸缓冲液(PH7.4，浓度0.01M)浸泡5分钟→滴加正常羊非免疫血清，室温孵育10分钟，减少本底显色→倾去血清后，滴加1∶1000稀释的兔抗鼠IgA，阴性对照以磷酸缓冲液代替一抗→4℃冰箱过夜→磷酸缓冲液冲洗3次→滴加生物素标记的羊抗兔IgG→37℃孵育15分钟→磷酸缓冲液冲洗3次→滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液→37℃孵育15分钟→磷酸缓冲液冲洗3次→显微镜下邻苯二胺(DAB)显色→自来水冲洗，苏木素复染，脱水，透明，封片结果判断以腺腔染成黄或棕黄色为阳性，每张切片计算100个腺体，计算阳性腺体所占的百分比。
三、统计学处理计数资料采用卡方检验(精确概率法)和秩和检验，计量资料采用F-q检验。应用公用的统计软件包SPSS11.0和SAS6.12处理，P值＜0.05为有统计学差异。
B、结果第一部分免疫保护作用结果一、各组幽门螺杆菌感染情况1、免疫保护率表1攻击后各组免疫保护率
注a为P＜0.01vs①-④组；b为P＜0.05vs①④组，P＜0.01vs②③组；c为P＜0.001vs①-④组。
如表1所示，各组的免疫保护率有明显差异(P＜0.001)，其中有佐剂的幽门螺杆菌疫苗组的保护显著高于无佐剂组和无抗原组(P＜0.001-0.05)。壳聚糖和CT联合应用组的保护率比壳聚糖和CT单独为佐剂组高，但无统计学意义(P＞0.05)2、胃黏膜内幽门螺杆菌定植组织学评分表2各组胃黏膜内的幽门螺杆菌定植组织学评分
注a为P＜0.001vs①-⑤组；b为P＜0.01vs①-④组，P＜0.05vs⑤组；c为P＜0.01vs①-④组；d为P＜0.001vs①组；f为P＜0.05vs①⑤组；g为P＜0.01vs①组。
如表2所示，各组的幽门螺杆菌感染程度有明显差异(P＜0.001)，进一步进行两两比较发现含免疫佐剂组的幽门螺杆菌定植密度显著低于无佐剂组和无抗原组(P＜0.001-0.05)，壳聚糖和CT联合应用组的定植密度最低，显著低于单以CT为佐剂组(P＜0.001-0.05)，单纯幽门螺杆菌抗原组及壳聚糖组的定植密度显著低于对照组(P＜0.01-0.05)。
3、胃黏膜内幽门螺杆菌定量培养定植密度如表3和图1所示，各组幽门螺杆菌定植密度有明显差异(P＝0.001)，佐剂中含壳聚糖组均较对照组、单纯壳聚糖颗粒组、单纯幽门螺杆菌抗原组低(P＜0.005-0.05)，其中以CT+壳聚糖颗粒为佐剂组比单纯壳聚糖溶液组低(P＜0.05)。
表3各组胃黏膜内幽门螺杆菌定量培养定植密度的比较
图1注解⑨组P＜0.005vs①和③组，P＜0.05vs②和④组；⑥-⑧组P＜0.01vs①和③组，P＜0.05vs④组。
二、各组胃黏膜的炎症程度如表4所示，攻击后，各组胃黏膜的炎症程度有明显差异(P＝0.014)，壳聚糖溶液和CT联合应用组炎症程度显著高于对照组、单纯壳聚糖颗粒组及以壳聚糖颗粒为佐剂组(P＜0.05)，以CT为佐剂组高于以壳聚糖颗粒为佐剂组、单纯壳聚糖组及对照组(P＜0.05)，单纯幽门螺杆菌抗原组高于单纯壳聚糖颗粒组、对照组及以壳聚糖颗粒为佐剂组(P＜0.05)。
表4各组攻击后胃黏膜炎症程度比较
注攻击后a为P＜0.05vs①③⑦组；b为P＜0.05vs①-③及⑦组；c为P＜0.05vs①③⑥⑦组。
三、各组血清抗幽门螺杆菌抗体结果表5攻击前各组血清抗幽门螺杆菌IgG、IgG1、IgG2a结果
注a为P＜0.05vs①组。
如表5所示，攻击前与对照组相比，幽门螺杆菌抗原+壳聚糖颗粒组血清抗幽门螺杆菌IgG、IgG2a及幽门螺杆菌抗原+壳聚糖溶液组血清抗幽门螺杆菌IgG1升高(P＜0.05)，但其余各组之间血清抗幽门螺杆菌IgG、IgG1、IgG2a升高程度差异无显著性(P＞0.05)。
表6攻击后各组血清抗幽门螺杆菌IgG、IgG1、IgG2a结果
注a为P＜0.001vs①-④组；b为P＜0.05vs⑤-⑦组；c为P＜0.01vs①-④组；d为P＜0.005vs①-⑦组；e为P＜0.005vs①组；f为P＜0.05vs②和③组；g为P＜0.05vs②组；h为P＜0.005vs①-③组；i为P＜0.05vs①组；j为P＜0.001vs①-③组，P＜0.05vs④组；k为P＜0.05vs①组。
如表6所示，攻击后，各组血清抗幽门螺杆菌IgG、幽门螺杆菌IgG1、幽门螺杆菌IgG2a均有明显差异(P＜0.001)，进一步进行两两比较发现，抗幽门螺杆菌IgG在含佐剂组显著高于单纯幽门螺杆菌抗原组、单纯壳聚糖组及对照组(P＜0.001-0.05)，壳聚糖溶液与CT联用组显著高于单以CT或壳聚糖为佐剂组(P＜0.05)。抗幽门螺杆菌IgG1在壳聚糖与CT联用组显著高于其他各组(P＜0.005)，单一佐剂组显著高于单纯壳聚糖组及对照组(P＜0.005-0.05)，幽门螺杆菌抗原组显著高于对照组(P＜0.05)。抗幽门螺杆菌IgG2a在以壳聚糖颗粒为佐剂组及CT与壳聚糖联用组显著高于单纯幽门螺杆菌抗原组、单纯壳聚糖组及对照组(P＜0.001-0.05)，以CT或壳聚糖溶液为佐剂组显著高于对照组(P＜0.05)。
图2注解(1)、抗幽门螺杆菌IgG含量③组攻击后显著高于攻击前(P＜0.05)，其它各组攻击后虽都高于攻击前，但无统计学差异(P＞0.05)。
(2)、抗幽门螺杆菌IgG1含量②组攻击后显著高于攻击前(P＜0.05)，③④组攻击后显著高于攻击前(P＜0.01)，对照组攻击后虽都高于攻击前，但无统计学差异(P＞0.05)。
(3)、抗幽门螺杆菌IgG2a含量③④组攻击后显著高于攻击前(P＜0.05)，幽门螺杆菌抗原组及对照组攻击后虽都高于攻击前，但无统计学差异(P＞0.05)。
如图2所示，攻击后各组血清抗幽门螺杆菌IgG、IgG1、IgG2a高于攻击前，以壳聚糖为佐剂的各组更为明显(P＜0.01-0.05)。
四、各组唾液和胃黏膜内特异性抗幽门螺杆菌IgA和非特异性sIgA含量比较1、唾液和胃黏膜内特异性抗幽门螺杆菌IgA
表7攻击前各组唾液和胃黏膜内抗幽门螺杆菌IgA结果
注a为P＜0.005vs①组，P＜0.05vs②组；b为P＜0.05vs①-②组；c为P＜0.01vs①组；d为P＜0.05vs②组。
如表7所示，攻击前各组唾液(P＜0.05)和胃黏膜(P＜0.01)内抗幽门螺杆菌IgA有显著差异，胃黏膜内抗幽门螺杆菌IgA攻击前以壳聚糖为佐剂组明显高于对照组(P＜0.05)，以壳聚糖溶液为佐剂组还高于单纯幽门螺杆菌抗原组(P＜0.05)；唾液内抗幽门螺杆菌IgA攻击前以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌疫苗组高于未用佐剂组(P＜0.05)。
表8攻击后各组唾液和胃黏膜内抗幽门螺杆菌IgA结果
注攻击后a为P＜0.001vs①-⑦组；b为P＜0.001vs①-④组，P＜0.05vs⑤组；c为P＜0.05vs①-④组；d为P＜0.05vs①、③、④组；e为P＜0.01vs①-④组；f为P＜0.001vs①-⑥组，P＜0.01vs⑦和⑨组；g为P＜0.01vs①-④组；h为P＜0.05vs①-②组；i为P＜0.05vs①组。
如表8所示，攻击后，各组唾液和胃黏膜内抗幽门螺杆菌IgA均有明显差异(P＜0.001)，进一步进行两两比较发现，胃黏膜内抗幽门螺杆菌IgA水平，在佐剂中含有壳聚糖组显著高于幽门螺杆菌抗原组、单纯壳聚糖组及对照组(P＜0.001-0.05)，其中壳聚糖溶液与CT联用组还显著高于单一佐剂组(P＜0.001)，而壳聚糖颗粒与CT联用组显著高于以CT为佐剂组(P＜0.05)。唾液内抗幽门螺杆菌IgA水平在以壳聚糖颗粒为佐剂组及壳聚糖与CT联用组显著高于幽门螺杆菌抗原组、单纯壳聚糖组及对照组(P＜0.01)，壳聚糖溶液与CT联用组显著高于其他佐剂组(P＜0.01)，以壳聚糖溶液为佐剂组显著高于对照组及单纯壳聚糖溶液组(P＜0.05)，幽门螺杆菌抗原组亦显著高于对照组(P＜0.05)。
图3注解胃黏膜和唾液内抗幽门螺杆菌IgA含量③④组攻击后显著高于攻击前(P＜0.05)，幽门螺杆菌抗原组和对照组攻击前后无统计学差异(P＞0.05)。
如图3所示，以壳聚糖为佐剂各组攻击后唾液和胃黏膜内抗幽门螺杆菌IgA均显著高于攻击前。
2、胃黏膜内非特异性分泌型IgA(sIgA)表9攻击前胃黏膜sIgA阳性腺体百分率(％)
注a为P＜0.005vs①组；b为P＜0.05vs②组；c为P＜0.01vs②组。
如表9所示，攻击前胃黏膜sIgA阳性腺体百分率以壳聚糖为佐剂组高于无佐剂组和对照组(P＜0.005-0.05)。
如表10所示，攻击后，各组胃黏膜sIgA水平有明显差异(P＜0.001)，进一步进行两两比较发现，佐剂中含壳聚糖组显著高于无佐剂组和无抗原组(P＜0.001-0.05)，其中壳聚糖与CT联用组还显著高于仅以CT为佐剂组(P＜0.05)，而以CT为佐剂组及单纯壳聚糖组显著高于对照组(P＜0.05)。
表10攻击后胃黏膜sIgA阳性腺体百分率(％)
注a为P＜0.001vs①-④组，P＜0.05vs⑤组；b为P＜0.001vs①组，P＜0.05vs②-④组；c为P＜0.001vs①组；d为P＜0.05vs①组。
图4注解②组攻击后显著高于攻击前(P＜0.05)，③④组攻击后显著高于攻击前(P＜0.01)，对照组攻击前后无统计学差异(P＞0.05)。
如图4所示，以壳聚糖为佐剂组和幽门螺杆菌抗原组攻击后sIgA水平均高于攻击前(P＜0.001-0.01)。
五、各组胃黏膜内细胞因子比较表11攻击前各组胃黏膜内IL-2、IL-10和IL-4结果(ng/mg湿重组织)
注a为P＜0.01vs①组，P＜0.05vs②组；b为P＜0.05vs①和②组。
如表11所示，攻击前各组胃黏膜内IL-2无显著差异(P＞0.05)。IL-10(P＝0.005)和IL-4(P＝0.023)有显著差异，进行两两比较发现IL-10和IL-4以壳聚糖为佐剂组高于无佐剂组(P＜0.01-0.05)。
表12攻击后各组胃黏膜内IL-2、IL-10和IL-4结果(ng/mg湿重组织)
注a为P＜0.001vs①和②组，P＜0.01vs③组；b为P＜0.01vs①和②组，P＜0.05vs③组；c为P＜0.05vs①和②组；d为P＜0.05vs①组；e为P＜0.001vs①-⑧组；f为P＜0.001vs①和⑤组，P＜0.005vs②、⑧、⑨组，P＜0.05vs④组；g为P＜0.05vs①、②、⑤组；h为P＜0.05vs⑤组.。
如表12所示，攻击后，各组胃黏膜内IL-2(P＝0.002)、IL-10(P＜0.001)和IL-4(P＝0.003)有显著差异。进一步进行两两比较发现，IL-2的水平以壳聚糖溶液为佐剂组及壳聚糖颗粒与CT联合应用组显著高于无抗原组(P＜0.001-0.05)；以壳聚糖颗粒为佐剂组、CT与壳聚糖溶液联合应用组及单纯幽门螺杆菌抗原组显著高于对照组和单纯壳聚糖溶液组(P＜0.05)；以CT为佐剂组高于对照组(P＜0.05)。IL-10水平在壳聚糖颗粒与CT联合应用组显著高于其他组(P＜0.001)。IL-4的水平在以壳聚糖颗粒为佐剂组显著高于以CT为佐剂组(P＜0.05)；以壳聚糖溶液为佐剂组显著高于对照组、单纯壳聚糖溶液组、幽门螺杆菌抗原组及佐剂中含CT各组(P＜0.001-0.05)；单纯壳聚糖颗粒组高于对照组、壳聚糖溶液组和以CT为佐剂组(P＜0.05)。
图5注解(1)、IL-2含量②-④组攻击后显著高于攻击前(P＜0.05)，对照组攻击前后无统计学差异(P＞0.05)。
(2)、IL-10含量③④组攻击后显著低于攻击前(P＜0.05和0.001)，幽门螺杆菌抗原组和对照组攻击前后无统计学差异(P＞0.05)。
(3)、IL-4含量④组攻击后显著低于攻击前(P＜0.05)，①-③虽都低于攻击前，但无统计学差异(P＞0.05)。
如图5所示，攻击前后胃黏膜内IL-2、IL-10和IL-4水平有明显差异。IL-2含幽门螺杆菌抗原各组攻击前均显著高于攻击后(P＜0.05)。IL-10含佐剂组攻击后显著低于攻击前(P＜0.001-0.05)。IL-4以壳聚糖颗粒为佐剂组攻击后显著低于攻击前(P＜0.05)，其余各组虽都低于攻击前，但无统计学差异(P＞0.05)。
第二部分免疫治疗作用结果一、幽门螺杆菌感染动物模型的建立幽门螺杆菌末次灌胃12周后，宰杀4只小鼠，取胃粘膜幽门螺杆菌培养和Giemsa染色，幽门螺杆菌均阳性(图1)；病理学检测证实有胃黏膜炎症存在(图2)，证实幽门螺杆菌已定植。
二、免疫治疗各组幽门螺杆菌感染情况1、免疫清除率表13免疫治疗各组的幽门螺杆菌清除率
注a为P＜0.005vs③、④、⑥组，P＜0.05vs⑤组；b为P＜0.05vs③、④、⑥组。
如表13所示，各组的幽门螺杆菌清除率有明显差异(P＜0.001)，其中含壳聚糖各组显著高于对照组和单纯幽门螺杆菌抗原组(P＜0.05-0.005)，以CT为佐剂组显著高于对照组(P＜0.05)。
2、胃黏膜内幽门螺杆菌定植组织学评分表14免疫治疗各组胃黏膜内幽门螺杆菌定植组织学评分
注a为P＜0.001vs③、④、⑥组，P＜0.05vs⑤组；b为P＜0.05vs③、④、⑥组。
如表14所示，各组的幽门螺杆菌感染程度有明显差异(P＜0.005)，进一步进行两两比较发现含佐剂幽门螺杆菌定植密度显著低于对照组(P＜0.001-0.05)；以壳聚糖为佐剂组幽门螺杆菌的定植密度显著低于单纯幽门螺杆菌抗原组(P＜0.05)。
3、胃黏膜内幽门螺杆菌定量培养定植密度如表15所示，各组幽门螺杆菌定植密度有显著差异(P＜0.001)表15免疫治疗各组胃粘膜内幽门螺杆菌定量培养定植密度的比较
二、免疫治疗各组胃黏膜的炎症程度表16免疫治疗各组胃黏膜慢性炎症程度比较
注a为P＜0.001vs③、④组，P＜0.005vs⑥组；b为P＜0.05vs③、④组。
如表16所见，各组胃黏膜慢性炎症程度有显著差异(P＜0.001)，其中含壳聚糖各组的慢性炎症程度显著低于不含壳聚糖各组(P＜0.001-0.05).
如表17所见，各组胃黏膜急性炎症程度有显著差异(P＜0.001)，含佐剂各组的急性炎症程度显著低于对照组和单纯幽门螺杆菌抗原组(P＜0.001-0.05).
表17免疫治疗各组胃黏膜急性炎症程度比较
注a为P＜0.001vs为P＜0.001vs③、④、⑥组，P＜0.005vs⑤组；b为P＜0.005vs③、④、⑥组，P＜0.05vs⑤组。
三、免疫治疗各组血清抗幽门螺杆菌抗体结果表18免疫治疗各组血清抗幽门螺杆菌IgG、IgG1、IgG2a结果
注a为P＜0.001vs③-⑥组；b为P＜0.001vs③、⑤组，P＜0.005vs④、⑥组；c为P＜0.01vs③、⑤组，P＜0.05vs④、⑥组。
如表18所示，各组血清抗幽门螺杆菌IgG、幽门螺杆菌IgG1、幽门螺杆菌IgG2a均有明显差异(P＜0.001)，进一步进行两两比较发现，含佐剂各组显著高于对照组和单纯幽门螺杆菌抗原组(P＜0.001-0.05)。
四、免疫治疗各组唾液和胃黏膜内特异性抗幽门螺杆菌IgA和非特异性sIgA含量比较1、唾液和胃黏膜内特异性抗幽门螺杆菌IgA
表19免疫治疗各组唾液和胃黏膜内抗幽门螺杆菌IgA结果
注a为P＜0.001vs③、⑤、⑥组，P＜0.005vs④组；b为为P＜0.005vs③、⑤、⑥组，P＜0.01vs④组；c为P＜0.001vs③-⑥组如表19所示，各组胃黏膜和唾液内抗幽门螺杆菌IgA含量有显著差异(P＜0.001)，其中含佐剂各组显著高于对照组和单纯幽门螺杆菌抗原组(P＜0.001-0.01)。
2、胃黏膜内非特异性分泌型IgA(sIgA)表20免疫治疗各组胃黏膜sIgA免疫组化结果
注a为P＜0.001vs③-⑥组；b为P＜0.005vs③-⑥组。
如表20所示，各组胃黏膜内sIgA含量有显著差异(P＜0.001)，其中含佐剂各组显著高于对照组和单纯幽门螺杆菌抗原组(P＜0.001-0.005)。
五、免疫治疗各组胃黏膜内细胞因子比较表21免疫治疗各组胃黏膜内IL-2、IL-10和IL-4结果(ng/mg湿重组织)
注a为P＜0.001vs③、④、⑥组，P＜0.005vs⑤组；b为P＜0.05vs③-⑥组；c为P＜0.001vs③-⑥组；d为P＜0.001vs③、④、⑥组，P＜0.01vs⑤组；e为P＜0.01vs③、④、⑥组；f为P＜0.001vs③、④、⑥组，P＜0.05vs⑤组；g为P＜0.05vs③、④、⑥组。
如表21所示，各组胃黏膜内IL-2、IL-10、IL-4含量有显著差异(P＜0.001)。其中IL-2在含佐剂各组显著高于对照组和单纯幽门螺杆菌抗原组(P＜0.001-0.05)；IL-10在含佐剂各组显著高于对照组和单纯幽门螺杆菌抗原组(P＜0.001-0.01)，同时在以壳聚糖为佐剂组显著高于以CT为佐剂组(P＜0.01)；IL-4在以壳聚糖为佐剂组显著高于对照组、单纯幽门螺杆菌抗原组和以CT为佐剂组(P＜0.001-0.05)，同时在以CT为佐剂组显著高于对照组(P＜0.05)。
综上所述，本发明经动物实验证实(1)、以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌疫苗对幽门螺杆菌的感染的保护率和免疫清除率与CT一致，同时在幽门螺杆菌定植密度的检测中发现壳聚糖还可协同增强CT的佐剂效应，提示壳聚糖可作为幽门螺杆菌疫苗的黏膜佐剂；(2)、以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌疫苗可诱导胃黏膜产生特异性抗幽门螺杆菌IgA及非特异性分泌型IgA，并与CT合用有协同作用，同时单纯壳聚糖也能促进胃黏膜非特异性分泌型IgA分泌，说明壳聚糖能有效地促进局部黏膜免疫反应；(3)、以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌疫苗与CT一致，可促进细胞因子IL-2的分泌，并与CT有协同作用，说明其可促进TH1的免疫反应，这可能参与了其免疫保护作用；(4)、以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌疫苗在攻击前可明显促进TH2细胞因子IL-4、IL-10的分泌，同时能逆转攻击后TH2的抑制，恢复幽门螺杆菌感染所致的TH1/TH2失衡，这可能在其免疫保护中起重要作用；(5)、以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌疫苗在产生免疫保护和治疗作用的同时可减轻免疫后胃炎的严重程度；(6)、壳聚糖溶液或壳聚糖颗粒为佐剂可用作保护哺乳动物包括人免于幽门螺杆菌的预防性疫苗或用作感染了幽门螺杆菌的哺乳动物包括人的治疗性疫苗。
图1为各组幽门螺杆菌定量培养菌落数散点图；图2为攻击前后各组血清抗幽门螺杆菌IgG、幽门螺杆菌IgG1、幽门螺杆菌IgG2a比较图；图3为攻击前后胃黏膜和唾液内抗幽门螺杆菌IgA含量比较图；图4为攻击前后胃黏膜内sIgA阳性腺体百分数比较图；图5为攻击前后胃黏膜内IL-2、IL-10和IL-4含量比较图；具体实施方式
下面结合实施例作进一步详细说明本发明，但应理解本发明的范围并非仅限于这些实施例的范围。
实施例1用本技术领域公知的方法，以88.5％脱乙酰度壳聚糖为原料，将88.5％脱乙酰度壳聚糖按3％的比例溶解于0.8％乙酸盐水中即成壳聚糖酸溶液，再以壳聚糖酸溶液为黏膜佐剂，与幽门螺杆菌抗原制备成疫苗，用于幽门螺杆菌感染的预防与治疗。
实施例2用本技术领域公知的方法，以88.5％脱乙酰度壳聚糖为原料，将88.5％脱乙酰度壳聚糖与生理盐水配成10mg/ml的溶液，再经超声(输出功率80HZ)处理2次，每次5分钟，间隔1分钟，以50g离心10分钟后取其上清，并以400目网筛过滤，再以1400g离心10分钟后收集其沉淀物，即为壳聚糖小颗粒，再以壳聚糖小颗粒为黏膜佐剂，与幽门螺杆菌抗原制备成疫苗，用于幽门螺杆菌感染的预防与治疗。
权利要求
1.壳聚糖溶液在制备幽门螺杆菌疫苗佐剂中的应用。
2.壳聚糖颗粒在制备幽门螺杆菌疫苗佐剂中的应用。
3.如权利要求1所述的壳聚糖溶液为佐剂用作保护哺乳动物包括人免于幽门螺杆菌的预防性疫苗。
4.如权利要求1所述的壳聚糖溶液为佐剂用作感染了幽门螺杆菌的哺乳动物包括人的治疗性疫苗。
5.如权利要求2所述的壳聚糖颗粒为佐剂用作保护哺乳动物包括人免于幽门螺杆菌的预防性疫苗。
6.如权利要求1所述的壳聚糖颗粒为佐剂用作感染了幽门螺杆菌的哺乳动物包括人的治疗性疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种壳聚糖在制药领域中的新用途，即壳聚糖在制备幽门螺杆菌疫苗佐剂中的应用。本发明通过动物实验证实了壳聚糖可作为幽门螺杆菌疫苗的黏膜佐剂。壳聚糖在作为幽门螺杆菌疫苗的黏膜佐剂的作用机理为壳聚糖具有良好的生物学特性及免疫活性，可增强抗原的免疫原性，促进胃肠黏膜对抗原的吸收，促进黏膜局部的免疫反应，调节TH1和TH2免疫反应的平衡，从而发挥其佐剂效应。本发明通过动物实验还证实了对幽门螺杆菌感染胃黏膜局部的免疫调节作用。
文档编号A61K39/02GK1663611SQ20041009906
公开日2005年9月7日 申请日期2004年12月24日 优先权日2004年12月24日
发明者谢勇, 周南进, 龚燕锋, 吕农华 申请人:谢勇, 周南进