胸腺素β16促进血管形成、组织再生及伤口愈合的制作方法

专利名称：胸腺素β16促进血管形成、组织再生及伤口愈合的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组具有促进新血管形成、组织再生及伤口愈合作用的活性小分子多肽胸腺素β16，其药物组合物可用于促进皮肤、粘膜损伤的组织再生、修复及愈合，改善缺血组织的血液供应。本发明还可用于增进皮肤健康，使皮肤湿润、细嫩、柔软、洁白及毛发再生。
背景皮肤是包裹在整个身体表面的一层被膜状软组织，是人体最大和最重要的器官之一，具有感觉、调节体温、吸收、分泌与排泄等重要生理功能，其完整性对机体维持正常生命活动至关重要。皮肤充当抵御外部侵害的第一道防线，具有重要的屏障作用，因此也最易遭受各种损伤。常见的损伤因素有机械性如破裂、切割、摩擦；物理及化学性如烧烫伤、冻伤及强酸、强硷损伤；手术刀口；以及各种慢性疾病导致的皮肤损害如褥疮、皮肤溃疡等。机体具有一定的再生修复能力。正常情况下，一般伤口可以自然修复愈合。但往往因受病人身体素质、创伤大小及严重程度和有无并发感染等因素的影响，多数情况下的伤口愈合需要医疗干预。糖尿病所致的顽固性皮肤溃疡就是实例之一。糖尿病是一种常见的疾病，主要是由于血中胰岛素绝对或相对不足，及或靶细胞对胰岛素敏感性降低，导致血糖过高，出现尿糖，进而引起脂肪和蛋白质代谢障碍。目前糖尿病的发病率，在我国已经高达2％，其中30％-50％的病人伴有皮肤损害，出现久治不愈的皮肤溃疡，发生部位多在血液供应较差的下肢。许多糖尿病患者因为小小的伤口不能愈合，最后导致截肢，甚至因感染而死亡。代谢障碍引起的血管病变是造成这一皮肤组织病理性损伤的主要原因，治疗的关键是增强机体修复机能，提高组织的新陈代谢水平，改善微循环，促进皮肤组织再生愈合。
除了皮肤损伤外，胃肠粘膜也易受到损伤。在正常情况下，胃粘膜上有上皮细胞分泌的粘液覆盖，且与互相紧密联接的细胞及粘膜上皮有完整的上皮细胞膜，共同形成粘液-粘膜屏障，保护胃粘膜，使其不被粗糙食物机械磨损，十二指肠上皮细胞分泌碱性肠液中和胃酸。胃十二指肠粘膜有良好的血液循环，从而保证供给充分的营养物质，清除代谢废物，保证上皮细胞的不断更新，使粘膜具有完整性。持续或过度的精神紧张、情绪激动，会使神经系统和内分泌功能紊乱；饮食失调，如粗糙食物，骨刺等对粘膜的物理性损害；食用刺激性食物，如过酸、辛辣食物、酒精等；服用某些药物，如阿斯匹林、消炎痛、利血平等；不规则的进食时间等等都可引起胃粘膜损伤和胃液分泌功能的失常。抽烟会引起血管收缩，抑制胰液和胆汁的分泌，减少了在十二指肠内中和胃酸的能力，同时引起胆汁反流而破坏胃粘膜屏障，削弱了保护因素，引起胃肠粘膜损伤。
消化性溃疡是一种常见疾病，是由于胃酸—胃蛋白酶分泌与粘膜保护功能失去平衡，胃酸和胃蛋白酶腐蚀胃粘膜而形成的溃疡(组织缺失)，可穿透粘膜肌层，严重威胁人类的健康。据报道，消化性溃疡患者约占全世界人口的十分之一。全国以12亿人口计，则目前我国患消化性溃疡的人数已愈一亿。由于消化性溃疡很高的发病率，致使治疗该病的药物具有较为广阔的市场。消化性溃疡的发生与前列腺素生成、遗传因素、精神紧张、饮食不规则、吸烟、药物、环境等因素有关，并且大多数消化性溃疡患者的胃窦部粘摸存在幽门螺杆菌。消化性溃疡多发生在暴露于酸和胃蛋白酶的区域。最常见为十二指肠球部，称十二指肠球部溃疡胃小弯，称胃溃疡，还有幽门管溃疡，球后溃疡，憩室溃疡，吻合口溃疡，空肠溃疡和食管下的溃疡等。当免疫防御机能和修复机能低下时，不仅使其伤口感染率增加和病情加重，而且还造成组织修复的延迟甚至难以愈合，修复质量也较差，复发率较高，给患者带来极大的不便和痛苦，严重的还会引发其它并发症，如感染性休克、消化道穿孔、癌变等，可危及生命。因此，增强机体再生修复能力，使其溃疡早日愈合是治疗消化性溃疡的一个重要方面。
通常情况下，当伤口范围较小或损伤较轻时，可通过自然愈合过程进行修复。自然愈合的过程包括封闭伤口以限制血液流失并阻止感染；去除受损的组织及血凝块；继之周围组织中的成纤维细胞、纤维母细胞及血管内皮细胞侵入伤口部位并形成肉芽组织，各种组织细胞替代肉芽组织并重建组织结构，使伤口完全愈合。表皮及其组织的再生修复是通过上皮细胞迁移、细胞分裂和上皮分化三个过程来完成的。上皮受损后，缺损周围上皮断端的基底层细胞向创面移动，上皮细胞分裂活跃，逐渐覆盖伤口表面，上皮进一步分化，重建失去的组织结构和功能，如皮肤可以出现上皮的角化等。肉芽组织在伤口愈合过程中起以下几方面重要作用(1)抗感染及保护创面；(2)机化血凝快、坏死组织及其他异物；(3)填补伤口或其他缺损。大约从第三天开始，伤口底部长出肉芽组织，并向伤口内深入。肉芽组织的主要成分是旺盛增生的新生毛细血管以及增生的纤维母细胞，其中还有多少不等的中性白细胞、巨噬细胞等炎性细胞。最初由血小板发生聚集反应而分泌许多生长因子和细胞因子，然后由巨噬细胞对低氧和乳酸中毒反应而分泌，这些因子能够刺激血管生成。新生的毛细血管即开始从业已存在的小静脉抽芽并向受伤处生长，并相互连接形成毛细血管网。血管生成是组织损伤修复的一个重要特征。
目前临床上用于伤口愈合的新药主要是生长因子类蛋白，如表皮细胞生长因子，以及调节细胞增殖和分化的其它蛋白，例如蛋白转化因子-B家族(TGF-B)。基因重组牛硷性成纤维细胞生长因子(Recombinant bovine bFGF)及基因重组人表皮细胞生长因子(Recombinant human EGF)已经获得批准用于临床治疗伤口愈合。正在进行临床三期实验的还有四种基因重组蛋白，包括人成纤维细胞生长因子等。在伤口愈合疗法中使用的这类治疗蛋白昂贵，储存不稳定并且使用麻烦，蛋白的不稳定性(蛋白分解产物)可能导致意外的对宿主有毒的炎症性反应。
我们经过系列研究发现胸腺素β16具有明显的促进新血管形成，促进上皮细胞角化、组织再生及伤口愈合作用。胸腺素是存在于人体及动物体内的一组小分子多肽，可分成α及β型。α型家族的主要代表是胸腺素α1，具有增强免疫功能的作用，已广泛应用于临床治疗肝炎。β型家族已发现16个成员，氨基酸序列具有高度同源性，其中含量最多、组织分布最广的是胸腺素β4，其次是胸腺素β10。胸腺素β4最早由胸腺中分离，具有43个氨基酸，分子量为4.9KDa，现已发现该蛋白具有多种功能，包括在内皮细胞分化和迁移、T细胞分化、肌动蛋白鳌合以及在血管形成中的作用。胸腺素β16最初发现于人神经母细胞瘤，由45个氨基酸组成，其氨基酸序列如表1所示，分子量为5KDa，存在于人的正常神经组织、腮腺组织、睾丸组织及角化上皮细胞内。胸腺素β16能结合到肌动蛋白单体上，从而抑制肌动蛋白的聚合。动物实验研究显示这些多肽小分子能使皮肤上皮细胞迁移到伤口，刺激伤口形成新生的毛细血管，刺激成纤维细胞及真皮细胞在伤口愈合过程中产生结构蛋白及其它连接组织成分，增强肉芽组织的形成，促进组织再生，进而促进伤口愈合。
胸腺素β16不同于市场上应用的或正在开发中的治疗伤口愈合的药物。胸腺素β16不是生长因子，与各种生长因子相比在治疗伤口愈合上有以下几方面优点1)特异性地刺激上皮细胞移动，促进上皮细胞角化；2)特异性地刺激内皮细胞移动，促进血管形成；3)分子量很小，只有45个氨基酸(生长因子属大分子蛋白)，易在组织内扩散；4)无副作用，可局部反复应用；5)不易被蛋白水解酶所降解，作用持续时间长，可减少用药次数；6)胸腺素β16能直接作用于细胞骨架系统，具有支持细胞结构稳定性的作用。因此，胸腺素β16在细胞再生修复，伤口愈合中具有非常特殊的作用，具有重要的临床应用价值。


图1小鼠皮肤伤口愈合实验。将小鼠分成胸腺素β16治疗组和生理盐水对照组，每组各8只小鼠。第7天测量伤口面积。胸腺素β16治疗组的面积明显小于对照组，统计学具有极其显著性差异(P＜0.001)。
本发明的描述本发明起始于研究胸腺素β16对细胞分化及对细胞迁移的影响。离体试验证明胸腺素β16作为细胞迁移促进因子可刺激人脐带静脉内皮细胞及表皮细胞的定向移动。用Boyden Chomber方法测试了多种不同类型的细胞，证明胸腺素β16能够特异性地刺激人脐带静脉内皮细胞及表皮细胞的运动。细胞运动在伤口愈合中起重要作用。新生的毛细血管即开始从业已存在的小静脉抽芽并向伤口处生长，需要细胞运动；缺损周围上皮断端的基底层细胞向创面移动覆盖伤口表面，需要细胞运动。胸腺素β16能促进细胞迁移，因此具有加速伤口愈合的作用。
本发明进一步确定了腺素β16能够在体内有效地促进血管内皮细胞移动，促进血管形成，促进组织再生及伤口愈合。鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管形成试验结果显示，胸腺素β16促进血管形成的效果与作为阳性对照的表皮细胞生长因子的效果相当或更好。动物伤口试验显示胸腺素β16具有加速伤口愈合的效应。伤口局部用胸腺素β16处理后，伤口面积比对照组缩小一倍，伤口局部有完整的表皮再生，广泛的新血管形成，胶原合成也明显增加，伤口愈合时间比对照组明显缩短。肌动蛋白是细胞内含量丰富的蛋白质，是细胞骨架蛋白，它能通过单体与聚合体形式的转换参与多种细胞功能活动，如细胞运动、细胞收缩、吸收、分泌、DNA复制、细胞分裂等等。胸腺素β16能结合到肌动蛋白单体上，通过抑制肌动蛋白的聚合来调节肌动蛋白的功能状态，加速细胞运动、细胞分裂等细胞功能活动，促进新血管形成、组织再生及伤口愈合。
因此，本发明提供一种含有效量的胸腺素β16或其可用盐或其生理功能衍生物，及可应用的载体配制而成的具有促进新血管形成、组织再生及伤口愈合作用的药物组合物。
本发明可局部用于治疗皮肤表层组织的擦伤、创伤、烧伤、烫伤、冻伤及其它形式的表面损伤，各种皮肤病引起的皮肤损伤，皮肤深层组织的感染性溃疡、营养障碍性溃疡、堵塞性溃疡，眼角膜损伤、眼角膜溃疡，也可用于某些疾病造成的胃肠粘膜损伤。另外，还可用本发明的组合物处理外科手术造成的伤口，例如在手术皮肤伤口上涂布活性药剂等，以加快手术伤口愈合。
本发明可用于治疗消化性溃疡。患有消化性溃疡的病人胃壁分泌粘液量减少，胃酸分泌量相应增多，过多的胃酸分泌对胃粘膜及对酸抵抗力较弱的十二指肠必然会导致消化与抗消化的平衡失调，防御机能减弱，造成组织的自我消化。胃十二指肠溃疡从粘膜开始并侵及粘膜下层，常深达肌层。胸腺素β16具有促进损伤局部血管形成，改善血液供应，使胃壁分泌粘液量增加，提高抗消化能力，促进损伤局部肉芽组织生长，填补缺损，促进组织再生，加速伤口愈合。
本发明可以用来治疗由糖尿病引起的皮肤溃疡。细小血管阻塞及循环障碍是长期患糖尿病患者中常见的病理变化。糖尿病患者由于血糖持续偏高而导致血脂升高，小动脉出现动脉粥样硬化及血管阻塞，使得流至下肢的血液量减少。血液的功能是把营养物质运送到身体的各部组织，同时也把各组织中产生的废物运送出体外，血液循环功能降低之后，首先受到影响的便是脚部，因为脚部距离心脏最远，血液最不容易到达。因此，下肢的皮肤及软组织容易缺血坏死，形成难以愈合的皮肤溃疡。胸腺素β16可用于下肢皮肤溃疡处，促进损伤局部血管形成，改善血液供应，促进伤口愈合。
本发明中的胸腺素β16可以用来治疗或预防由大疱性表皮松解症及其所有亚型引起的皮肤和周围组织的退化性、免疫性炎症和其它紊乱症状。大疱性表皮松解症是一种罕见的基因紊乱性疾病，表现为皮肤水泡，进而导致开放性疮伤、溃疡和结疤。这种疾病的程度可从轻微到严重性残疾，甚至危机生命。胸腺素β16具有促进修复、愈合及预防的能力，具有诱导末端脱氧核甘酸转移酶、降低炎症细胞因子或化学因子的水平，作为一种内皮细胞趋化因子和血管生成因子，从而治愈和预防患者的皮肤病变。
本发明可以用来刺激器官组织的再生和修复。例如手术切除部分结肠或其它组织后，在手术的器官组织部位涂上本发明药物组合物以促进器官组织的新生血管形成和组织再生，加快器官的愈合过程。
另一方面，本发明能减少疤痕组织的形成并促进由各种原因导致的疤痕组织的改建及吸收。导致疤痕组织的各种因素包括手术过程，辐射，破伤，化学毒素，病毒及细菌感染或创伤。本文使用的“疤痕组织”是指伤愈过程中和其它病理过程中形成纤维和胶原组织。例如，将胸腺素β16制成混合剂并投放在损伤组织附近，进而促进组织再生，血管增生及微循环系统形成，加速组织的改建，减少疤痕组织的形成。
本发明可用于改善皮肤状况及抗皮肤衰老作用，促进皮肤组织的代谢更新、增进皮肤健康，使皮肤湿润、细嫩、柔软、洁白。角化是表皮细胞的最重要功能之一。基底细胞逐渐移行到角质层，由圆椎形细胞演变成无核扁平形的角质细胞，这个演变所需的时间为生长周期，约需3～4周，各层细胞转换时间不同，称为表皮换新率。皮肤衰老时表皮换新率逐渐降低。胸腺素β16具有明显的促进上皮细胞迁移功能，能加速由深层的基底细胞向表面的角质层过渡，从而促进上皮细胞角化，维持表皮的不断代谢更新，因此具有抗皮肤衰老作用。胸腺素β16可能是与皮肤再生有关的具有维持皮肤正常代谢功能及抗衰老作用的特异分子。
本发明可以刺激内皮细胞的迁移及生长，刺激血管的增殖，增加组织的血流量，从而治疗心血管疾病。心血管疾病的特征是心脏或其它靶器官的血液供应受到损害。此处所用“心血管疾病”是指心脏及血管由于供血不足而导致的疾病，包括但不局限于，冠状动脉疾病，充血性心力衰竭和外周性血管病。心脏病是指由于冠状动脉的狭窄或阻塞而引起的心脏病变，特点是心脏所需的营养成分和氧不足而导致心肌梗死。有效剂量的胸腺素β16可以通过促进血管增生，诱导出额外的毛细血管，建立侧枝循环，从而增加心肌组织的血流量，提供心脏所需的营养成分，改善氧不足，使心肌组织的氧和作用增加，起到预防和治疗由于冠状动脉的部分或完全栓塞而引起的心肌缺血造成的组织损伤。
本发明还可用于预防和治疗血液供应不足引起的脑神经组织损伤，脊髓损伤和外周神经组织损伤，以及各种疾病及衰老引起的脑组织及神经组织损伤。这种对神经系统的预防、治疗及保护作用不仅限于胸腺素β16，还应包括胸腺素β16的多个同种异型体，如胸腺素β4、胸腺素β9、胸腺素β10、胸腺素β11、胸腺素β12、胸腺素β13、胸腺素β14、胸腺素β15及上述同种异型体的氧化型。
本发明为血液供应不足的某些组织提供了一种促进新血管增生的方法。例如，因各种原因导致的毛囊血液供应减少、毛囊营养不良(但无毛囊结构破坏)而引起的脱发。有效剂量的胸腺素β16可以通过促进毛囊组织的血管增生，诱导出额外的毛细血管，从而增加毛囊组织的血流量，改善血液供应，为缺血的毛囊组织提供营养。此外，胸腺素β16还具有促进毛囊基底干细胞移行并新生基底细胞的作用，改善毛囊组织的营养，促进毛发再生。
本发明阐述的方法也可以应用于诱导性组织再生工程。目前，医疗技术人员在进行创伤性手术时采用诱导性组织再生工程技术来促进和加快伤口愈合。方法是将具有促进组织细胞迁移、分化的生物活性物质殖入伤口处，使形成组织结构的细胞在伤口处大量聚集。本发明可以用于帮助人或动物肉芽组织的再生。方法是将含有生物可吸收性的多聚体，可溶性的溶剂和胸腺素β16的复合物放置于人或动物肉牙组织再生处。该复合物通过释放有效剂量的胸腺素β16促进人或其它哺乳动物的肉芽组织再生。
另外，实体瘤的生长和转移依赖血管生成。新生血管为肿瘤细胞提供充分的氧气和营养，新生血管的内皮细胞表达多种生长因子，刺激肿瘤细胞增殖。肿瘤血管缺乏周细胞，基底膜不完整，因此，肿瘤细胞易于进入血液循环。由于新血管形成在肿瘤生长中起重要作用，所以抑制肿瘤组织的血管生成是优选的肿瘤治疗实施方案之一。如果肿瘤组织中没有新血管形成，肿瘤组织就不会得到所需的营养，肿瘤生长缓慢或停止生长，退化并最终坏死。本发明中胸腺素β16具有促进血管生成作用。因此，胸腺素β16的抑制剂可用于抑制肿瘤组织的血管生成，从而达到治疗肿瘤的目的。
本发明描述的胸腺素β16是正常机体内固有的多肽成分。因此，使用高度纯化的胸腺素β16安全、可靠。本发明的实施方案中，胸腺素β16可以是从组织细胞中分离提取，可以是直接化学合成，也可以是人工表达。另外，任何具有能够诱发或刺激机体组织、细胞产生胸腺素β16的生物活性物质也可以加进本发明的皮肤护理组合物中。以上均属于本发明范畴。
胸腺素β16有多个同种异型体，氨基酸序列同源性可达80％或更高。胸腺素β16具有氨基酸序列LKKTNT，该序列与介导肌动蛋白的鳌合或结合相关。尽管不受任何特定理论的约束，胸腺素β16同种异型体的活性可能部分是由于具有调节肌动蛋白聚合的能力。例如，胸腺素β16能调节肌动蛋白的聚合(例如，β-胸腺素似乎能通过结合游离的G-肌动蛋白使F-肌动蛋白解聚)。胸腺素β16调节肌动蛋白聚合的能力全部或部分地由于它能通过LKKTNT序列结合或鳌合肌动蛋白。因此，其它具有鳌合或结合肌动蛋白或调节肌动蛋白聚合功能的蛋白质，包括含有氨基酸序列LKKTNT的胸腺素β16的同种异型体，也能够促进血管形成、改善组织代谢、加速伤口愈合的功能，因此也包括在本发明中。
胸腺素β16分布在许多组织和细胞中，因此能刺激胸腺素β16产生的试剂可添加到皮肤护理组合物中来促进组织和/或细胞产生胸腺素β16。这类试剂包括但不限于生长因子家族的成员，如胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板来源的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β(TGF-β)、基本成纤维细胞生长因子(BFGF)、胸腺素α1和血管内皮生长因子(VEGF)。尤其优选的试剂为转化生长因子β(TGF-β)或TGF-β超家族的其它成员。另一方面，能够调节胸腺素β16基因表达的制剂也可添加到本发明皮肤护理组合物中。
本发明的药物组合物中还可以入进具有抗感染作用的各种抗炎剂，具有抗感染作用的中药配方，以及具有抗感染作用的其它天然物质。抗炎剂是指各种甾族、非甾族抗炎剂及各种抗菌素。
在本文中，“有效量”是指含有胸腺素β16成分的需要量。在组织修复过程中这种成分使用到治疗剂量时就会促进组织再生效应。胸腺素β16能够促进及调理组织修复过程。组织修复过程常常发生在损伤性疾病之后。组织修复过程出现障碍往往是由于在伤口处的各种细胞如成纤维细胞、干细胞、血管内皮细胞、组织细胞对生长的反映不足而造成的。因此，加入能诱导或刺激细胞生长的活性剂会有利于组织的修复。本文使用的“促进”一词是指对细胞生长机制或过程具有激活作用，刺激作用，增强作用，起始作用及维持作用。这些细胞生长机制或发生过程是组织形成，修复或发育所必须的。
在本文中，“载体”是指含有活性胸腺素β16的基质或辅料，用来充当药物输送系统。在本发明中，“药物输送系统”指当药物组合物(药物配制品或剂型)被使用时，可以将活性胸腺素β16呈递给人或动物的机体。因此术语“药物输送系统”包括普通的药物组合物所能使用的所有形式的基质或辅料，如固体、半固体、和流体组合物。特殊相关的组合物是，例如，软膏、亲水软膏、乳膏、糊剂、霜、凝胶、水凝胶、溶液、乳液、悬浮液、洗液、擦剂、洗发剂、皂剂、粘贴物、喷雾剂、粉末、薄膜、垫料、敷剂、绷带、膏药等。
伤口局部应用本发明药物组合物优选是含有活性成分的软膏或霜。当制成软膏时，活性成分可以使用石蜡基或水混溶性软膏基，或者，制成活性成分含水相油霜基的霜剂。制备涂液、软膏等外用型组合物的例子，包括将有效剂量的和所需量的添加剂混合而成。这些添加剂通常选自外用药物或化妆品的常用基质或辅料，例如凡士林、液体石蜡、羊毛脂、硬脂酸单甘油脂、聚乙二醇、十六醇、甘油、乙醇和水等。
如果需要，霜的水相可以包括，例如，至少30％W/W的多元醇，即含有两个或多个基的醇，如丙二醇、丁-1，3-二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇以及它们的混合物。局部用制剂可以根据需要而增加或减少所含活性成分。
本发明的药物组合物还可以是注射液组合物，用于静脉内、肤膜内、肌内或皮下注射。制备注射液组合物的例子包括将有效剂量的胸腺素β16或其衍生物和所需量的液体基质混合制作而成，该基质的例子包括水或生理盐水，其中还可添加其它有益成分或辅料。
本发明的药物组合物可以是口服胶囊、片剂、粉剂等固体剂型组合物，包括将有效剂量的胸腺素β16或其衍生物干粉和所需量的药用辅料混合制作而成。本发明的药物组合物还可以是口服液组合物。制备口服液组合物的例子包括将有效剂量的胸腺素β16或其衍生物和所需量的液体基质混合制作而成，该基质的例子包括水或生理盐水，其中还可添加其它有益成分或辅料。
本发明还可以用可控制释放混合剂的方式使用。本文中的“可控制释放混合剂”是指任何一种复合物。这种复合物可以用来缓慢释放包含其中的有效胸腺素β16成分。这种复合物含有生物有效成分可以是固状的，渗透性的，半固状的，胶性的或液状的。
本发明的胸腺素β16还可用于化妆品或其它皮肤护理产品的组合物中。这些组合物包括但不限于清洁剂、眼霜、眼影、面霜、牛奶状洗剂、皮肤洗剂、香水、香粉、化妆用油、糊状香水、粉末、护肤膏、护肤凝胶、润肤膏、剃须用膏、剃须用洗剂、防晒油、抗晒油、防晒洗剂、抗晒洗剂、指甲膏、洁肤洗液、清洁霜、清洁露、洁肤奶、清洁乳、化妆基料、面膜、含锌化妆水、润手香脂、香粉、增白粉、粉底霜、化妆底粉、沐浴化妆品、胭脂、染眉毛油、唇膏、唇霜、眼线膏、生发油、美发液、发乳、发用凝胶、滋发剂、头发滋润剂、香波、护发素、除臭、科隆香水等。
本发明确定了胸腺素β16在体外能够有效地促进血管内皮细胞的移动，在体内能够诱导小鼠眼角膜血管形成。胸腺素β16促进血管形成的效果与作为阳性对照的表皮细胞生长刺激因子的效果相当、或更好。而且动物伤口试验显示胸腺素β16具有加速伤口愈合的功能。动物伤口局部用胸腺素β16处理后，与对照组相比较，有更多更广泛的新血管形成，伤口处胶原合成也增加，说明胸腺素β16能够加速伤口挛缩和促进伤口愈合。
实施例实施例1细胞培养人脐静脉内皮细胞(HUVECS)，用RPMI1640培养基培养。培养基内含有5％牛血清，100单位/毫升青/链酶素，50微克/毫升庆大酶素，2-7微克/毫升两性酶素B，5单位/毫升肝素及200单位/毫升血管内皮细胞生长因子等补充剂。人表皮角化细胞及前额纤维母细胞用DMEM及10％小牛血清培养，人体乳腺癌细胞株MDA-MB435细胞，用RPMI1640及10％小牛血清培养。中性粒细胞从新鲜的人外周血中分离而来。人体血管平滑肌细胞用平滑肌细胞培养基培养。
实施例2细胞迁移实验为了测试胸腺素β16刺激以后是否能引起特异性的细胞游走，我们使用Boyden Chomber方法对多种细胞株进行了测试。先将Boyden Chamber两室间隔的硝膜(孔径0.8mm)两侧均覆盖Fibronection，浓度为15微克/毫升，37℃下放置60分钟。上室加入细胞悬液，下室为完全培养液，5％CO2孵箱内静置4小时，取出滤膜，将上室面细胞刮除，经固定染色后，在显微镜下细胞计数。每组3张膜。统计变量以均数标准差表示。结果表明胸腺素β16能特异性的引起人脐静脉内皮细胞及人表皮角化细胞的游走，游走细胞的数量明显增多(结果见表2)。实验证明胸腺素β16在10到1000毫微克/毫升的浓度范围内均明显加速人脐静脉内皮细胞的游走，并呈量-效关系。相反，胸腺素β16未引起MDA-MB435人体乳腺癌细胞株和人体血管平滑肌细胞等细胞的明显游走。
实施例3“擦破”伤口关闭实验用一毫升吸管尖头将贴壁生长的单层人脐静脉内皮细胞划开一道擦痕，用PBS缓冲液洗净脱落的细胞。加不同浓度的胸腺素β16后继续培养，观察破痕关闭情况。1000毫微克/毫升的胸腺素β16处理4小时以后，人脐静脉内皮细胞向擦痕处移动的数量明显多于只加胚养基的对照组，擦痕关闭的时间也明显加快。
实施例4促进血管增生实验胸腺素β16对血管生成的促进作用采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验检测，在孵育7天的受精鸡胚蛋壳上开一1cm2左右窗口，将不同浓度的化学合成胸腺素β16蛋白加样于灭菌滤纸片上，并放置于CAM，然后在恒温恒湿培养箱37℃下继续培养48小时，观察血管生长情况。本实验以生理盐水为测试对照，phorbol myristate acetate(PMA)0.5微克/10微升为阳性对照。实验测定结果表明胸腺素β16蛋白加样组鸡胚绒毛尿囊膜血管生长明显旺盛，管径粗且分支多，呈叶状分布。以生理盐水组血管生长程度作为对照，胸腺素β165微克/10微升的血管增生程度比生理盐水组显著增多，10微克/10微升的血管增生程度与PMA阳性对照组血管增生程度相当或略多。这一实验结果表明胸腺素β16具有明显促进血管增生作用。
实施例5伤口愈合实验小鼠麻醉后，用4毫米的组织取样器除去小鼠背部的皮肤，造成直径约为4毫米大小的伤口，随后随机将动物分成胸腺素β16治疗组和对照组(每组8只动物)。50微升(含有5微克胸腺素β16)的药液滴于伤口上，对照组使用生理盐水。动物每隔一天接收一次治疗，连续观察7天后处死小鼠。伤口面积用于评估胸腺素β16的疗效。伤口皮肤固定于10％福尔马林溶液内。H&E和胶原染色法用于观察皮肤的病理学变化。重复实验结果相同。结果显示，胸腺素β16处理组的伤口面积比对照组缩小一倍，伤口局部有完整的表皮再生，广泛的新血管形成，胶原合成也明显增加。伤口愈合时间比对照组明显缩短，统计学具有极其显著性差异(P＜0.001)。这些结果表明胸腺素β16具有明显的促进伤口愈合作用(见附图1)。
表1胸腺素β16蛋白序列N-末端MSDKPDLSEVEKFDRSKLKKTNTEEKNTLPSKETIQQEKECVQTS C-末端表2胸腺素16对细胞游走的影响

注表中例出的数据是三次实验中细胞游走数的平均值序列表<110>王大公，宝勒日<120>胸腺素β16促进血管形成、组织再生及伤口愈合<160>1<210>1<211>45<212>氨基酸<400>1Met Ser Asp Lys Pro Asp Leu Ser Glu Val10Glu Lys Glu Asp Arg Ser Lys Leu Lys Lys20Thr Asn Thr Glu Glu Lys Asn Thr Leu Pro30Ser Lys Glu Thr Ile Gln Gln Glu Lys Glu40Cys Val Gln Thr Ser
权利要求
1一种促进新血管形成、组织再生及伤口愈合的药物组合物，含有效剂量的胸腺素β16、其生物活性变体或盐、和其可药用的载体。
2按照权力要求1所述，胸腺素β16是指胸腺素β16的全部氨基酸序列，也可以是部分氨基酸序列，更主要的是指具有肌动蛋白结合作用的功能片段LKKTNT，以及具有此功能片段的同种异型体。
3按照权力要求2所述，其胸腺素β16可以是自然提取、化学合成、或人工表达。
4按照权力要求1所述，其药物组合物可包括其它具有促进胸腺素β16生成的各种生长因子、细胞因子及其它因子。
5按照权力要求1所述，其药物组合物可局部用于治疗皮肤表层组织的擦伤、创伤、烧伤、烫伤、冻伤及其它形式的表面损伤，各种皮肤病引起的皮肤损伤，皮肤深层组织的感染性溃疡、营养障碍性溃疡、堵塞性溃疡，眼角膜损伤、眼角膜溃疡，各种疾病导致的慢性皮肤溃疡，糖尿病引起的皮肤溃疡，消化道溃疡，胃十二指肠溃疡、血液循环障碍性溃疡，外科手术伤口，还可用于化妆品改善皮肤状况及抗皮肤衰老。
6按照权力要求1所述，其药物组合物可用于治疗及预防由于供血不足而导致的心血管疾病，包括但不限于冠状动脉疾病、充血性心力衰竭和外周性血管病变，还可用于治疗皮肤毛囊血液供应减少而引起的脱发。
7按照权力要求1所述，其药物组合物可用于治疗、预防及保护脑组织及外周神经组织损伤，脊髓损伤，用于神经细胞保护及促进神经组织再生。
8按照权力要求1所述，其药物组合物可用于治疗或预防由大疱性表皮松解症及其所有亚型引起的皮肤和周围组织的退化性、免疫性炎症和其它紊乱症状。
9按照权力要求1所述，其药物组合物中可药用的载体包括普通的药物组合物所能使用的所有形式的基质或辅料，如固体、半固体、和流体组合物。特殊相关的组合物是，例如，软膏、亲水软膏、乳膏、糊剂、霜、凝胶、水凝胶、溶液、乳液、悬浮液、洗液、擦剂、洗发剂、皂剂、粘贴物、喷雾剂、粉末、薄膜、垫料、敷剂、绷带、膏药等。
10按照权力要求1所述，其药物组合物中可药用的载体可以是口服胶囊、片剂、粉剂等固体剂型组合物，还可以是注射液组合物，用于静脉内、肤膜内、肌内或皮下注射。
全文摘要
本发明涉及一组具有促进新血管形成、组织再生及伤口愈合作用的活性小分子多肽胸腺素β16，其药物组合物可用于促进皮肤、粘膜损伤的组织修复及愈合，改善缺血组织的血液供应。因此，含有效剂量的胸腺素β16、其生物活性变体或盐的药物组合物可用于治疗各种原因导致的伤口，促进其愈合，还可用于治疗供血不足而导致的心血管疾病及其它缺血性疾病。本发明可进一步用于增进皮肤健康，使皮肤湿润、细嫩、柔软、洁白及毛发再生。
文档编号A61K8/64GK1788790SQ20041009848
公开日2006年6月21日 申请日期2004年12月13日 优先权日2004年12月13日
发明者宝勒日, 王大公 申请人:宝勒日, 王大公