专利名称：用于加速伤口愈合的药物组合物和方法
用于加速伤口愈合的药物组合物和方法 发明领域和背景
本发明涉及用于加速伤口愈合过程的方法和药物组合物。具体地 说，本发明利用由脂肪细胞分泌的生物活性分子(脂肪细胞素
(adipokine))、和调节脂肪细胞分化、增殖和/或活性的生物活性分 子诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
伤口治疗的主要目标是使伤口得以闭合。开放性皮肤伤口是一种 主要的伤口类型，包括烧伤、神经性溃疡、褥疮、静脉淤滞溃疡和糖 尿病性溃疡。
开放性皮肤伤口通常通过包括下述六个主要环节的过程愈合(i) 发炎；(ii)纤维原细胞增生；(iii)血管增生；(iv)结締组织生成； (v)上皮形成；(vi)伤口收缩。当这些环节个别或者整体没有正常 运行时，就会影响伤口的愈合。很多因素都可能影响伤口愈合，包括 营养不良、感染、药理学试剂(如放线菌素和甾族化合物)、高龄和 糖尿病[参见Hunt和Goodson 的 Current Surgical Diagnosis & Treatment (Way; Appleton & Lange),第86-98页(1988)。在身 体各部分接受外科手术之后也会出现伤口愈合的常见问题，即手术取 得成功但开放性伤口未愈合。
皮肤是一种复层鳞状上皮，在其中进行生长和分化的细胞是有严 格区分的。在生理状态中，增殖限于附着在基底膜的基底细胞上。分 化是一种空间过程，其中基底细胞失去对基底膜的附着，中止DNA的 合成并进行一系列的形态和生物化学变化。最终的发育成熟步骤是角 质层的产生形成皮肤的防护屏障(1，2)。当基底细胞开始分化，可观 测到的最早变化与基底细胞脱离和远离基底膜(3)的能力有关。类似 的变化与伤口愈合过程有关，在该过程中细胞迁移入受伤区域和增殖 的能力均得到增强。为了皮肤层的重构并诱导表皮层的适当分化，这 些过程是必须遵循的。
随着用于小鼠和人体角质形成细胞(2,4)的培养体系的发展，极 大地促进了对表皮细胞增长、分化和迁移的调节机制的分析。在体外， 角质形成细胞能以高生长率作为基础增殖细胞运用。此外，分化可能在体内表皮的成熟模式之后在体外被引发出来。初期的现象包括半桥
粒部分(3，5)的损失和a6p4整联蛋白与基质蛋白细胞附着的选择性损 失。这表明，在整联蛋白表达方面的改变是在角质形成细胞分化中的 早期现象。早期的半桥粒接触损失导致角质形成细胞的上基部迁移， 并且与在培养的角质形成细胞中和在皮肤(1,3,6)中角蛋白1 (Kl) 的诱导有关。此外，对粒层表型的分化与下述因素有关(31和p4整联 蛋白表达的负调节、对所有基质蛋白的附着潜力的损失以及继之以角 质化包膜的形成和细胞死亡。分化细胞最终以成熟鳞屑(2，7)形式从 培养皿中脱落。上述体外分化程序紧接着体内表皮的成熟模式。
伤口愈合可以通过体内各种直接或间接加速表皮细胞增殖、分化 和/或迁移的生物活性试剂引发。因此，美国专利5，591，709和5，461，030 中记载了通过利用如胰烏素、生长激素、三碘甲状腺原氨酸和甲状腺 素的非甾族合成代谢激素诱导伤口闭合。美国专利5,145,679记载了通 过利用胰岛素和胰酶诱导伤口闭合。美国专利6,541,447记载了通过利 用生长因子和生长激素的混合物诱导伤口闭合，国际申请 PCT/IL01/00675记载了通过利用PKC调节试剂诱导伤口闭合。然而， 现有技术中没有关于利用脂肪细胞、脂肪细胞调节剂或脂肪细胞分泌 的分子来诱导或加速与伤口愈合有关的过程的教导。
因此，广泛认识到需要有一种促进伤口愈合的新方法，这将是非 常有益的。本发明提供了一种治疗伤口的新方法，所述方法利用脂肪 细胞、能够分化为脂肪细胞的细胞、由脂肪细胞分泌的产物和脂肪细 胞调节剂来诱导或加速与伤口愈合有关的过程。
发明概述
在进行伤口愈合研究的实验过程中，本发明的发明者发现，在早 期愈合过程期间，脂肪细胞与在伤口缝(gap)迁移性角质形成细胞密 切相关，这表明脂肪细胞、脂肪细胞调节剂和脂肪细胞素与伤口愈合 过程有关，因而可能用来影响伤口愈合的过程。
在对本发明进行实践时，如优选方案以及下述实施例部分中进一 步描述的那样，发现向伤口给药脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂确实实 质上有效地促进了伤口的愈合。
因此，根据本发明的一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的脂肪细胞 素，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的另一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的 方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的能够调节脂肪细胞 素的表达和/或分泌的药剂，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的又一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的 方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的能够调节脂肪细胞 分化的药剂，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的再一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的 方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的能够将脂肪细胞吸 引至皮肤伤口的药剂，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的又一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的 方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的能够增强脂肪细胞 在皮肤伤口中的增殖的药剂，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的又一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的 方法，所述方法包括在皮肤伤口中植入治疗有效量的脂肪细胞，从而 诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的又一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的 方法，所述方法包括在皮肤伤口中植入治疗有效量的前脂肪细胞，从 而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的又一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的 方法，所述方法包括在皮肤伤口中植入治疗有效量的干细胞，从而诱 导或加速皮肤伤口的愈合过程。
本发明的再一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的 方法，所述方法包括将皮肤伤口细胞转化至表达和分泌脂肪细胞素， 从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
根据本发明的再一方面，提供了一种用于诱导或加速皮肤伤口愈 合过程的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的作为活性成 分的脂肪细胞素、以及用于局部施用该药物组合物的可药用载体。
根据本发明的再一方面，提供了一种用于诱导或加速皮肤伤口愈 合过程的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的作为活性成 分的能够调节脂肪细胞素表达和/或分泌的药剂、以及用于局部施用该药物组合物的可药用载体。
根据本发明的再一方面，提供了一种用于诱导或加速皮肤伤口愈 合过程的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的作为活性成 分的能够调节脂肪细胞分化的药剂、以及用于局部施用该药物组合物 的可药用载体。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于诱导或加速皮肤伤口愈 合过程的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的作为活性成 分的能够将脂肪细胞吸引至皮肤伤口的药剂、以及用于局部施用该药 物组合物的可药用载体。
根据本发明的再一方面，提供了一种用于诱导或加速皮肤伤口愈 合过程的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的作为活性成 分的能够增强脂肪细胞增殖的药剂、以及用于局部施用该药物组合物 的可药用载体。
根据本发明的再一方面，提供了一种测量脂肪细胞素或脂肪细胞 调节剂诱导或加速伤口愈合过程的能力的方法，所述方法包括向伤口 给药脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂，然后评价所述伤口的角质形成细 胞迁移和/或表皮闭合，从而测量出所述脂肪细胞素或所述脂肪细胞调 节剂诱导或加速伤口愈合的能力。
根据如下所述的本发明优选实施方案中的其它特征，所述脂肪细 胞素选自降脂蛋白、脂连蛋白、抵抗素、瘦蛋白、脂蛋白脂肪酶、血
管紧张素原、血管紧张素样物质4(angiotesin-like4) 、 1-丁酰丙三醇、 基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、血管内皮细胞生长因子、白介 素6和肿瘤坏死因子cc。优选脂肪细胞素是降脂蛋白。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述脂肪细胞调节剂 是PPAR调节剂，优选PPAR-Y拮抗剂，更优选GW9662。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述脂肪细胞是人类 脂肪细胞。优选自体人类脂肪细胞。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述前脂肪细胞是人 类前脂肪细胞。优选自体人类前脂肪细胞。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述干细胞是人类干 细胞。优选自体人类干细胞。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述植入进一步包括调节脂肪细胞素的表达和/或分泌。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，通过分化而实现调节。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，通过将前脂肪细胞暴 露于能够增强前脂肪细胞分化为脂肪细胞的物质下而实现分化。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，通过将干细胞暴露于 能够增强干细胞分化为脂肪细胞的物质下而实现增强分化。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述伤口选自溃疡、 烧伤、裂伤和外科切口。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述药物组合物载体 选自水溶液、凝胶、乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分散液、 油膏和软膏。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述药物组合物包括 固体载体。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述脂肪细胞调节剂 是脂肪细胞分化调节剂或脂肪细胞活性调节剂。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述伤口是在实验动 物中造成的切口伤口。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述脂肪细胞素或脂 肪细胞调节剂的给药在以一种或多种浓度完成的。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述脂肪细胞素或脂 肪细胞调节剂的给药是以一或多次施用完成的。
本发明提供了用于治疗伤口的新药物组合物和方法，其利用脂肪 细胞、能够分化为脂肪细胞的细胞、脂肪细胞调节剂以及由脂肪细胞 分泌的分子来诱导或加速伤口的愈合。
除非另有描述，本文中使用的所有科技术语具有如本领域普通技 术人员通常所理解的相同含义。虽然那些与本发明相类似或等价的方 法和原料也可用于本发明的实践或实验中，但是这里仍然将适宜的方 法和原料描述如下。如果不相符，可参照包括定义在内的专利说明书。 此外，这些原料、方法和实施例仅仅是非限制性的说明。
附图简述下面仅参照附图举例对本发明进行说明。下面对附图给予详细具 体的说明，需要强调指出的是，附图详解仅仅是举例说明，并且仅仅 是对本发明优选实施方案进行示例性的描述，以及对本发明提供在最 大实用性和对本发明原理和概念的易理解方面的描述。关于这一点，对本发明的结构细节并未进行更详细的说明，更多的是对本发明基本 思路的必要性说明，对本领域技术人员而言，根据对附图的描述，在 实践中如何采取本发明的各种形式是显而易见的。在附图中
图1示例性说明了胰島素对伤口区域脂肪细胞的募集和表皮细胞 的迁移的影响。通过切割在C57BL小鼠背上得到一伤口。伤口按照每 日局部施用促愈胰岛素(1 pM)治疗六天，随后处死小鼠，分析其伤 口的表皮细胞迁移和脂肪细胞募集。表皮细胞迁移通过K14抗体染色 来测定，如果伤口沿着整个伤口缝为阳性染色，则认为为阳性。脂肪 蛋白的募集通过H&E染色来测定，如果在肉芽组织内检测到脂肪细 胞，则认为为阳性。暗柱代表胰烏素治疗，亮柱代表緩冲液处理的对 照。结果以闭合(阳性)伤口的百分比表示，每个柱代表六组重复实 验的平均值土标准误差。图2A-B是说明脂肪细胞与伤口愈合过程关联的组织化学显微照 片。通过切割在C57BL小鼠背上得到一伤口。受伤小鼠七天后处死， 随后切片并用K14抗体染色以突出迁移的表皮细胞。显微照片说明在 伤口愈合过程的早期，伤口缝存在大量募集的脂肪细胞(图2A， x20 放大；图2B， xlO放大)。图3示例性说明了 PPARy拮抗剂(GW9662)对体外初级角质形成 细胞迁移的影响。培养的角质形成细胞未经处理(对照)或用2 ]LiM GW9662处理。在光学显微镜下观察角质形成细胞的迁移。上栏表示 处理前(pre-treated) (O天)培养物的显微图，左下图和表栏分别表 示所得到的对照和经处理的培养物(第2天)。蓝线标记了迁移角质 形成细胞的边缘，箭头指示出GW9662处理的培养物相对于未处理的 对照品而言增强的迁移。图4是示例性说明PPA脚拮抗剂(GW9662)和降脂蛋白对体内伤 口愈合的影响的图表。通过切割在C57BL小鼠背上得到一伤口，随后 测量该伤口 ( 0天)。伤口区域按照每日局部施用PBS (对照)、降脂蛋白或2 pM的GW9662治疗六天。小鼠随后处死，测量其伤口区域(第 6天)。对每一处理计算六天内自最初伤口区域收缩的伤口区域部分(％ 伤口收缩)。该图表示出了相对于緩冲液处理的对照组而言，GW9662 和降脂蛋白都实质上促进了伤口的收缩。图5是示例性说明PPARy拮抗剂(GW9662)和降脂蛋白对体内伤 口闭合的影响的组织化学显微图。通过切割在C57BL小鼠背上得到一 伤口。随后测量伤口区域(0天)。伤口按照每天局部施用PBS(对照)、 lpM降脂蛋白或2nM的GW9662治疗六天。小鼠随后处死，其伤口 以多聚甲醛固定，在x5放大的双目显微镜下观测。显微照片示出了用 GW9662或降脂蛋白处理的伤口区域，其实质上小于緩冲液对照组的 伤口区域。图6示例性说明了降脂蛋白对表皮细胞迁移和伤口闭合的影响。 通过切割在C57BL小鼠背上得到一伤口 。每日按照1 )iM的降脂蛋白 局部施用治疗七天，随后处死，切片并通过K14抗体染色分析表皮闭 合和迁移。如果沿着整个伤口缝的伤口是阳性染色，则认为表皮闭合 是阳性。如果伤口是阳性染色但并不是完全沿着伤口缝，则认为表皮 迁移是阳性。柱状图表明降脂蛋白显著地增强了表皮闭合和表皮迁 移。每个柱条代表六组重复实验的平均值。图7是示例性说明PPARy拮抗刑(GW9662 )和降脂蛋白对伤口闭 合(收缩)的影响的组织化学显微图。通过切割在C57BL小鼠背上得 到一伤口 。每日用降脂蛋白(1 ) 、 GW9662 ( 2 nM )治疗6天，或 者不治疗(对照)。接受治疗的小鼠在伤害的六天后处死。进行组织 化学的伤口切片，通过H&E (上栏)或KH抗体(下栏)染色，在x5 放大的光学显微镜下观测。若皮肤伤口双侧(黑线标记)都能在单一 视区内观察到，则认为是阳性收缩。在未治疗的对照切片(右)的开 放性伤口区域太大，以至于不能被包含在单一视区中(因而认为是阴 性的皮肤收缩)，当用降脂蛋白治疗的切片(左)、用GW9662治疗 的切片(中间)则显示出阳性皮肤收缩。图8示例性说明了 PPARy激动剂(曲格列酮)对体外初级角质形 成细胞迁移的影响。培养的角质形成细胞未经处理(对照)，或者用 100pM曲格列酮处理，在光学显微镜下观察其迁移。上栏表示处理前 (0时间)培养物的显微图，左下图和右栏分别表示所得到的对照和经处理的培养物(48小时内)。线条标记了培养的角质形成细胞边缘， 这表明，相对于未经处理的对照组而言，用曲格列酮处理后的培养角 质形成细胞的迁移实质上得到抑制。图9是示例性说明胰岛素和PPARY激动剂(曲格列酮)对体内伤 口闭合的影响的组织化学显微照片。通过切割在C57BL小鼠背上得到 一伤口 ，每日按照局部施用PBS (对照)、胰岛素(10 nM)、曲格列 酮(100pM)或曲格列酮(100pM) +胰烏素(10nM)联合治疗6天。 小鼠随后处死，其伤口用多聚甲醛固定，在x5倍放大的双目显微镜下 观测。显微照片表明，用胰岛素治疗的伤口区域实质上小于緩冲液对 照组，而用曲格列嗣和曲格列酮+胰烏素治疗伤口则远远大于緩冲液对 照组。图IO示例性说明了胰烏素和PPARY激动剂(曲格列酮)对伤口闭 合的影响。通过切割在C57BL小鼠背上得到一伤口 。伤口每日按照局 部施用PBS (对照)、胰岛素(10 nM)、曲格列酮(100 ^M)或曲 格列酮(lOOpM) +胰岛素(10nM)联合治疗6天，随后处死，切片 并对伤口闭合进行分析。通过K14和Kl抗体染色测量伤口闭合。如 果沿着整个伤口缝的伤口是阳性染色，则认为伤口闭合是阳性。每个 柱条代表六组重复实验的平均值。优选实施方案说明本发明涉及加速伤口愈合过程的方法和药物组合物。具体而言， 本发明利用脂肪细胞、可分化为脂肪细胞的细胞、由脂肪细胞分泌的 生物活性分子(脂肪细胞素)以及脂肪细胞调节剂来加速皮肤伤口的 愈合过程。在详述本发明的至少一个实施方案之前，应当理解在下面实施方 案部分中的描述或说明中列举的构造详图和方案部分不对本发明的应 用构成限制。本发明可以以其他的方案实施、或者以多种方式实际操 作或完成。同样，应当理解在此使用的术语和专有名词是为了便于描 述，并不对其构成限制。成人皮肤包括两层，角质化分层上皮和提供支持和营养的下层厚 富胶原皮肤结締组织。皮肤是抵御外界的防护屏障。因此，任何皮肤 上的损伤或破裂必须得到迅速有效的修复。如上文中背景部分所述，栓塞最初伤口的凝块的形成是实现皮肤修复的第一阶段。此后，炎性 细胞、纤维原细胞和毛细管拥入凝块形成肉芽组织。接下来的阶段涉 及伤口处上皮的再生，其中基础角质形成细胞必须失去其半桥粒联系 并迁移入肉芽组织以覆盖伤口。在角质形成细胞迁移后，角质形成细 胞进入增生性的增加阶段，这能够替代伤口形成期间损失的细胞。单 层角质形成细胞覆盖伤口后(即表皮闭合)，形成新分层的表皮并重建新基底膜(8-11)。当在伤口愈合研究中进行实验时，本发明者意外地发现在早期伤 口愈合过程期间，脂肪细胞与受伤区域的迁移角质形成细胞密切相 关。因此，下述实施方案部分的实施例1说明，伤口缝出现的迁移角 质形成细胞与相同区域出现募集的脂肪细胞直接相关。此外，用胰岛 素治疗的伤口为伤口缝募集了更多的脂肪细胞，接下来比对照组、不 治疗的伤口愈合得更快。上述新发现的脂肪细胞和角质形成细胞迁移 与伤口愈合的密切关系、以及募集的脂肪细胞和伤口愈合效率之间的 直接相关性表明，脂肪细胞、脂肪细胞调节剂和脂肪细胞产物(脂肪 细胞素)与伤口愈合过程有关，因而可用于影响伤口的愈合过程。脂肪细胞分泌大量的生物活性分子，称为脂肪细胞素，其通过调 节胰岛素的分泌、胰岛素活性、葡萄糖和脂类代谢、能量平衡、发炎 和复制，在保持能量的动态平衡中起重要作用。然而，关于伤口愈合可能涉及脂肪细胞分泌的生物活性分子，现 有技术中并没有教导，也没有启示。基于上述的最初发现，同时进一步对本发明进行实践，本发明的 发明人预期并随后发现， 一种典型的脂肪细胞素即自已知的脂肪细胞 素中选出的降脂蛋白显著地加速了体外角质形成细胞迁移，并且有效 地促进体内皮肤伤口的愈合(见下文实施方案部分实施例3)。因而，根据本发明的一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口愈 合过程的方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的脂肪细胞 素，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。在此使用的术语"伤口 "概括性地包括以不同方式引发的对皮肤和 皮下组织的损伤(如长期卧床休养引起的褥疮、外伤(trauma)引起 的伤口、割伤、溃疡、烧伤、外科切口等)，并具有不定的特征。一般伤口按照伤口的深度分为以下四个级别(i)I级限于表皮的伤口； (ii)II级发展到真皮的伤口； (iii)III级发展到皮下 纟且织的伤口 ； ( iv) IV级(或全皮层伤口 ( full-thickness wound)): 伤口中暴露了骨骼(例如骨头外露的压迫点如更大的转节或骶骨)。在此使用的术语"部分皮层伤口 " ( partial thickness wound )包括 I-III级伤口；部分皮层伤口的实例包括烧伤、褥瘙、静脉淤滞溃疡和 糖尿病性溃疡。在此使用的术语"深度伤口 "意味着包括III级和IV级的伤口 。 在此使用的术语"慢性伤口 "指在三十天之内未愈合的伤口 。 关于伤口的术语"愈合"指经瘢痕形成而修复伤口的过程。 预期本发明可治疗包括深度伤口和慢性伤口在内的所有伤口类型。在此使用的术语"脂肪细胞素"指体内或体外脂肪细胞分泌的任何 生物活性分子，包括但不限于脂肪细胞分泌的酶、生长因子、细胞因 子和激素。优选本发明的脂肪细胞素选自补体D (降脂蛋白)、C3和 B;血管内皮细胞生长因子(VGEF)、脂连蛋白(Acrp30);抵抗素； 痩蛋白；脂蛋白脂肪酶(LPL);血管紧张素原；血管紧张素样物质4; 1-丁酰丙三醇(甘油一丁酸酯)；基质金属蛋白酶2和9;肿瘤坏死因 子a(TNFa)、和白介素6。优选的脂肪细胞素是降脂蛋白。除了向伤口给药脂肪细胞素外，根据本发明的某些实施方案，脂 肪细胞调节剂可以诱导或加速伤口的愈合。在此使用的用语"脂肪细胞调节剂"指任何能够调节脂肪细胞中的 脂肪细胞素的表达和/或分泌、脂肪细胞的分化、脂肪细胞的增殖、脂 肪细胞的迁移或者将脂肪细胞吸引至伤口的分子。脂肪细胞在通常所说的脂肪生成过程中自前脂肪细胞分化而成。 在培养物中，脂肪的生成完全依赖于胰烏素、地塞米松和异丁基甲基 黄噤呤，强调胰烏素、糖皮质激素和环磷腺苷路径的参与。当此过程中许多信号和生化途径起必要作用时，脂肪生成期间的 大多数已知变化是处于基因转录水平。与脂肪生成过程有关的关键转 录因子包括属于CCAAT/增强子结合蛋白家族的蛋白、脂肪细胞决定 和分化依赖因子l (亦称甾醇调节因子结合蛋白1)和过氧物酶体增殖 物活化剂受体Y (Rangwala和Lazar， Aim. Rev. Nutt. 20:535-539， 2000)。过氧物酶体增殖物活化受体(PPAR)包括三种类型PPARa、 PPARp和PPARy。它们是可受配体诱导的核受体，通过结合目标基因 启动子区域中指定的核苷酸序列而直接调节基因的活性。PPARy通过反式激活脂肪细胞特异性基因在终末分化中起决定性作用。最新研究 结果表明，在表皮中PPAR和胆固醇代谢路径之间存在干扰。所有的 PPAR同种型在未成熟和成熟的皮肤中表达。在胎儿成熟的后期， PPARY表达显著增加。在出生后，以及在成人皮肤中，PPARy表达减 少。在表皮形成期间，角质形成细胞分化中的PPARp和PPARa表现出 重要作用(WabliW" Swiss Med.Wkly. 132:83-91， 2002)。同样证明， 在受伤皮肤的边缘PPAR(3和PPARa是增量调节的，并且这些同种型的 空白样小鼠伤口愈合受到影响(Michalnik等，J. Cell Biol. 154:799-814， 2001 )。现有技术中对伤口愈合过程中PPARy的参与也无描述和 暗示。美国专利6，403，656描述了使用PPA脚活化剂来治疗与表皮细胞分 化异常有关的皮肤病。此外，国际申请PCT/US99/28101记载了利用如 前列腺素J2或D2的PPARy活化剂来治疗肥胖症和糖尿病。然而，这 些公开物没有教导或启示使用PPARY活化剂或抑制剂来使伤口愈合。在进一步对本发明进行实践的同时，本发明的发明人发现PPARy 活性对伤口愈合过程是逆向关联的。因此，下文实施方案部分的实施 例2对给药曲格列酮即一种PPARy激动剂抑制伤口收缩进行了示例性 说明。另一方面，PPARY拮抗剂GW9662的给药促进了伤口的收缩。因而，根据本发明的另一方面，提供了一种诱导或加速皮肤伤口 愈合过程的方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的能够调 节脂肪细胞分化的药剂，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。根据 本发明这一方面，所述药剂可以是参与脂肪细胞分化的任何因子如转 录因子的激动剂或拮抗剂，所述转录因子包括但不限于属于CCAAT/ 增强子结合蛋白家族的蛋白质、脂肪细胞决定和分化依赖因子和 PPAR丫。所述药剂优选为PPARy拮抗刑，更优选GW9662。除脂肪细胞分化调节剂之外，其他脂肪细胞调节剂的使用也可以 促进伤口愈合的过程。因此，根据本发明的教导，向皮肤伤口给药治 疗有效量的如下药剂能够诱导或加速皮肤伤口的愈合过程，所述药剂 能(i)调节脂肪细胞中的脂肪细胞素的表达和/或分泌，(ii)增强脂肪细胞的增殖，(ii)增强脂肪细胞的迁移，(iii)将脂肪细胞吸引 至伤口区域。相关领域的普通技术人员可以方便地按照在本发明上下文中所提 供的分析来确定具体的药剂，如脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂，以进 行关于任一上述具体药剂是否确实是伤口愈合过程的诱导物或促进剂 的测试。因此，通过向皮肤伤口给药被考虑的脂肪细胞素或脂肪细胞调节 剂，然后评价被治疗伤口的角质形成细胞迁移和/或表皮闭合，可以测 量出脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂诱导或加速皮肤伤口愈合过程的能 力。优选通过切割在C57BL小鼠背上得到皮肤伤口 ，然后以一或多次 施用进行治疗，每次施用使用一种或多种浓度的脂肪细胞素。在造成伤口后的理想时间，优选为约6天，对小鼠处死并对伤口 活组织(wound biopsies )进行采样。随后按照本々页域已知的方法，优 选使用实施例部分描述的步骤对伤口活组织分析角质形成细胞向伤口 缝的迁移和/或伤口缝的表皮闭合。相对于未接受治疗的对照组而言，如果角质形成细胞迁移和/或表 皮闭合的几率显著增加，则表明被测试的脂肪细胞素或脂肪细胞调节 剂能够诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。根据本发明的另一方面，将优选为自体脂肪细胞的脂肪细胞植入 伤口，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。脂肪细胞可从任一动物来源的脂肪组织中获得，优选来自人类供 体，最优选来自自体人类来源。按照公知流程，如外科手术、吸引术、 脂肪去除抽吸法、腹壁成形术(penniculectomy)或经活组织切片，可 以从皮下或肾周的位置采样脂肪组织，优选皮下的位置。优选使用破 坏细胞的物理联系的酶(如胶原酶)或用机械搅拌、声波或超声波能 量等从脂肪组织样本中分离脂肪细胞。分离脂肪细胞可以利用本领域 已知的适当组织培养技术进行，例如详述在国际申请PCT/US00/30623 中的技术。培养的脂肪细胞可以生长至达到接近汇合，随后从生长培 养基中轻刮出并植入在伤口上。也可从培养的前脂肪细胞生成脂肪细胞。在此使用的术语"前脂肪细胞"指能分化成脂肪细胞的任意一种细胞。前脂肪细胞优选为人类脂肪细胞，更优选为分离自病人自己的脂肪或其他组织的自体脂肪细 胞。使用公知流程，如外科手术、吸引术、脂肪去除抽吸法、腹壁成 形术或经活组织切片，可从皮下或肾周的位置采样脂肪组织。使用例如Rodbell等人描述的方法，可以从样品组织中分离出前脂肪细胞 (Meth. Enzymol. 31:103-114， 1974)。用Hauner等(Journal Clin. Invest" 34:1663-1670， 1989) 、 Digby等(Diabetes 5:138-141, 1998) 和国际申请PCT/US00/02208中描述的方法和步骤，可以将分离得到的 前脂肪细胞在体外培养、扩增并分化为脂肪细胞，可以使用Freshney 描述的培养法(Culture of Animal Cells第310-312页，第3版，1994) 从培养基中获得分化脂肪细胞，并优选使用如国际申请PCT/US97/0061 中描述的移植室将其植入在伤口上。至少1天后，从伤口去除移植室， 优选在脂肪细胞移植至少1星期后进行。任选将植入的脂肪细胞暴露 于脂肪细胞调节剂下，后者例如非限制性的PPARy拮抗刑，优选 GW9662。根据本发明的另一方面，将前脂肪细胞植入伤口中诱导或加速皮 肤伤口的愈合过程。采用上述用于脂肪细胞的方法和步骤但省略分化 步骤，能使前脂肪细胞在体外分离、培养并扩增。未分化的前脂肪细 胞从培养基中收获，用如上文所述脂肪细胞的步骤植入伤口中。任选 将植入的前脂肪细胞暴露于脂肪细胞调节剂下，后者例如非限制性的 PPARy拮抗剂，优选GW9662。脂肪细胞和/或前脂肪细胞可以从培养干细胞中产生。在此使用的 短语"干细胞"指未终末分化的未成熟或成熟细胞，其可以非限制性地 分裂，分裂得到细胞，这些细胞为干细胞、或者不可逆地分化产生新 类型的细胞例如前脂肪细胞或脂肪细胞。4吏用本领域^S知的方法可以完成干细胞的分离和体外扩增。例 如，Van Epps等(Blood Cells 20:411， 1994)和Emerson S. G. ( Blood 87:3082, 1996)描述了分离培养的步骤和来自骨髓、周围血液或初生 儿脐带血液的人类造血干细胞，及其在培养中的扩增。采用如美国专 利5,843,780和Reubinoff等(Nature Biotech. 18:399， 2000)所述方法， 人类胚胎干细胞(hESC)可以从人类胚泡细胞中制备得到，后者由人 类体内移植前胚胎或在体外增殖的胚胎获得。采用美国专利 5,197,985、 5，486，359和6,214，369中所述方法，可以分离和扩增人体间质干细胞(hMSC)。在骨髓、血液、真皮和骨膜中发现的hMSC能分 化成为任一特定类型的间质组织，如脂肪组织。干细胞可以直接在皮肤伤口上给药，在体内分化为脂肪细胞，其 中可包括或不包括促进上述分化的联合给药因素。换句话说，干细胞 可以离体分化为前脂肪细胞或脂肪细胞，然后将其植入伤口。采用美国专利6，322，784中所述方法，培养的hMSC可以被诱导进 行脂肪形成的分化。因此，通过将这些细胞暴露于糖皮质激素以及能 够增量调节cAMP生成的化合物下，或者通过抑制cAMP的降解，例 如磷酸二酯酶抑制剂，可以由初级hMSC生成得到脂肪细胞。接着收 获从干细胞中生成的脂肪细胞，并用如上所述的步骤植入伤口中，从 而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。本发明可供选择的实施方案是，将伤口细胞转化至表达并分泌脂 肪细胞素，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。伤口细胞可以是伤口愈合过程中所涉及的任意细胞类型，如角质 形成细胞、脂肪细胞或前脂肪细胞。可以用编码脂肪细胞素的多核苷 酸转化细胞，脂肪细胞素例如降脂蛋白、脂连蛋白、抵抗素、瘦蛋白、 脂蛋白脂肪酶、血管紧张素原、血管紧张素样物质4、 1-丁酰丙三醇、 基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9和肿瘤坏死因子a。或者，可用 编码具有脂肪细胞素活性的多肽的多核苷酸，例如美国专利5,223,425 中所述的编码降脂蛋白/补体D活性的多核苷酸转化细胞。通过本领域任一种已知方法，可以将适当的多核苷酸引入细胞。 这类方法可以参见广泛描述在Sambrook等[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989， 1992 )、Ausubel等[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989 )、Chang等[Somatic Gene Therapy, CRC Press, AnnArbor， MI (1995)、Vega等[Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor MI (1995 )、Vectors[A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses ， Butterworths， Boston MA (1988)和Gilboa等[Bioteclmiques 4 (6) :504-512 (1986)，并且 包括例如稳定的或瞬时转染、脂转染、电穿孔法和重组病毒载体的感 染。此外，参见关于涉及中枢神经系统的载体的美国专利4,866,042， 以及美国专利5,464,764和5,487,992，关于用正负选择法诱导同源重组。引入编码脂肪细胞素的多核苷酸进入伤口细胞内的优选方法是利 用病毒载体。病毒载体具有若干优势，其中包括在特殊细胞类型中更 高效率的转化、靶向、和繁殖。病毒载体还可以为特殊受体或配体修 饰，以通过特殊细胞受体改变靶特异性，如癌细胞受体。逆转录病毒载体代表了一类适合本发明的载体。缺陷逆转录病毒通常用于进入哺乳动物细胞的基因转移[参见综述Miller, A.D.， Blood 76:271 ( 19卯)。包括脂肪细胞素编码多核苷酸的重组逆转录病毒，可 以利用公知的分子技术来构建。为了实现逆转录病毒复制缺陷，可以 移除逆转录病毒基因组部分，随后将复制缺陷的逆转录病毒包装成病 毒粒子，其中通过使用辅助病毒和使用标准技术，病毒粒子可用于感 染靶细胞。制备重组逆转录病毒以及用这种病毒体外或体内感染细胞 的; 危程可见例如Ausubul等[编辑，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)]。逆转录病毒已经用 于引入各种基因进入许多不同的细胞类型中，包括上皮细胞、内皮细 胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞和骨髓细胞。其它适合的表达载体可以是腺病毒栽体。对腺病毒已经进行了广 泛的研究并且其已被常规地用作基因转移载体。腺病毒载体的关键优 势包括相对高的分裂和休眠细胞转导效率、对各种上皮组织的天然定 向和易产生的高滴定度[Russel， W. C.[J. Gen. Virol. 81:57-63 ( 2000 )。 腺病毒DNA被转运至核，但不与其整合。因此，采用腺病毒载体的诱 变风险被減到最小，而短期表达特别适合于治疗癌细胞，如多药耐药 性癌细胞。Seth等记载了用于试验性癌症治疗的腺病毒载体 [Adenoviral vectors for cancer gene therapy.于P. Seth ( ed.) Adenoviruses: Basic biology to Gene Therapy, Landes, Austin TX， (1999)第103-120页。也可以包括限制表达至特定细胞类型的特征。这种特征包括，例 如特异性针对预期细胞类型的启动子和调控元件。病毒载体也可包括 编码用于分泌抗体片段至细胞外部的信号的核苷酸序列。分泌信号通 常包括疏水氨基酸的短序列(7-20个残基)。本发明中适合的分泌信 号在本领域中普遍可得到并为大家所熟知，例如参见von Heijne[J.Mol. Biol. 184:99-105 (1985 )以及Lej等[J. Bacteriol. 169:4379 (1987 )。重组载体可以通过多种方式给药。若使用病毒载体，则可以利用 其靶向特异性，从而这种载体不必在肿瘤位置上局部给药。然而，局 部给药能提供更快速和更有效的治疗。病毒载体的给药还可以通过例 如静脉或皮下注射进入受试者来完成。注射之后，病毒载体可循环至 其识别出对感染具有适当靶向特异性的寄主细胞。
根据本发明的脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂本身或者作为药物组 合物中的活性成分可被用于治疗。
在此使用的短语"药物组合物"指在此记载的含有一种或多种活性 成分和其它化学成分例如生理学上适合的栽体和赋形剂的制备物。药 物组合物的目的是促进化合物向有机体的给药。
在下文中，短语"生理学可接受的载体"和"可药用载体"可互换使 用，指不对有机体引起显著刺激、不影响给药活性成分的生物活性和 性质的载体或稀释剂。辅料包括在此短语中。
在此术语"赋形剂"指加入至药物组合物中的惰性物质以更进一步 促进活性成分的给药。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钾、磷酸钓、 各种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
用于药物制剂和给药的方法可参见最新版"Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co" Easton， PA， 在此将 其引入作为参考。
本发明的药物组合物可通过本领域中公知的方法制备，例如通过 常规的混合、溶解、成粒、做出糖衣丸、研细、乳化、装入胶嚢、截 留和/或冷冻干燥过程。
利用包括赋形剂和辅料在内的一种或多种生理学可接受的载体， 可以以常规方式制备得到本发明的药物组合物，所述赋形剂和辅料改 善了将活性成分加工成药用制剂。
根据本发明，所述可药用载体适于局部施用，例如但不局限于在 下面进一步描述的凝胶、乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分 散液、油膏和软膏。固体载体还可以用于延迟活性成分在伤口内的释 放。
适用于本发明上下文的药物组合物包括如下组合物，其中包含对 实现本发明目的有效量的活性成分。更具体地说，治疗有效量意指对 诱导或加速伤口愈合有效的活性成分量。治疗有效量的确定是在本领域技术人员能力范围之内的，特别是 根据在此提供的现有技术的详述、在此公开的测定和下述部分的实施 例。
用于本发明方法中的任一制剂，治疗有效量或剂量可以利用上文 记载的实验动物，从皮肤的伤口最初估定。此类信息可用于更正确地 确定人有效剂量。
在此记载的活性成分的毒性和治疗效能可以通过体外、细胞培养 或实验动物中的标准制药步骤确定。从这些体外和细胞培养测定和动 物研究获得的资料，可用于配制供人用的剂量范围。剂量可以随使用 剂型和使用的给药途径变化而变化。可由医师个人根据病人情况选择
精确的组成、给药途径和剂量(参见如Fingl等，1975， "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 第1章，第1页)。
可分别将用药量和间隔调节至足以例如诱导伤口愈合的活性成分 水平(最小有效浓度，MEC) 。 MEC应随各种不同制剂变化而变化， 但其能从体外数据估计出。为实现MEC所必需的用药量取决于个体特 征和给药途径。
根据需治疗伤口的严重程度和响应性，剂量可以单一或分多次给 药，疗程持续多天至几周或至达到伤口缩小。
当然，给药组合物的量取决于接受治疗对象、伤口的严重程度、 给药方式、处方医师的判断等。
如果需要的话，本发明的组合物可以以包装袋或分配装置的形式 储存，如FDA许可的试剂盒，其中包括含有活性成分的一个或多个单 位剂型。例如，包装袋可以包括金属或塑料薄膜、形成用于分配局部 给药制剂的软管。包装袋或分配装置可以含有给药说明书。包装袋或 分配装置也可附有与管理生产的政府机构所规定形式的容器、药品使 用或销售有关的注意事项，其中注意事项是人用或兽用组合物形式通 过政府机构批准的反映。例如，此类注意事项可以是有关于经美国食 品与药物管理局批准的须医师处方才可买的药品的标签或有关于核准 产品附件。包括在适当药物载体中配制的本发明制备物的组合物也可 被制得、放入适当的容器中、标记用于指示病况的治疗，如上文中更 进一步地详述。
可以理解，本发明活性成分优选的给药模式是局部-区域性给药，然而不排除经可接受给药途径的系统给药，如本领域中公知的、使用 适当成分的口服、肌肉注射、静脉注射、皮下注射、经过皮肤给药、 腹膜给药等。
因而，本发明提供一种用于治疗伤口的新方法和药物组合物，其 使用脂肪细胞、能分化为脂肪细胞的细胞、脂肪细胞调节剂和脂肪细 胞分泌的分子，来诱导或加速伤口安全和有效地愈合。
对本领域普通技术人员而言，本发明其它的目的、优势和新特征 经研究下述非限制性实施例后将是显而易见的。另外，在本发明上文 中描述的每一实施方案和方面以及下面权利要求部分所要求的部分， 都可在下列实施方案中得到实验支持。
实施例
下面参考下述实施例、结合上述有关说明对本发明进行非限制性 的说明。
通常，在这里使用的命名法和本发明的实验室步骤包括分子、生
物化学、微生物和重组DNA技术。下述文献对上述技术进行了充分解 释。例如参见"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook 等.，(1989); "Current Protocols in Molecular Biology" l画3巻Ausubel， R. M., ed. (1994) ; Ausubel等""Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989 ); Perbal， "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York ( 1988 ) ; Watson等.，"Recombinant DNA"， Scientific American Books, New York; Birr en等.(eds ) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", 1-4巻，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York ( 1998 );在下面的美国专利中陈述了方法论4，666，828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659和5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", l-3巻Cellis, J.E.， ed.(1994); "Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique", Freshney， Wiley-Liss， N. Y. ( 1994 ) ， Third Edition; "Current Protocols in Immunology" l國 3巻Coligan J.E.， ed. (1994 ) ; Stites等.(eds ) , "Basic and Clinical Immunology"(第八版)，Appleton & Lange， Norwalk， CT (1994); Mishell和Shiigi ( eds ) ， "Selected Methods in Cellular Immunology",W. H. Freeman and Co., New York (1980);在专利和科学文献中广 泛地描述了可用的免疫测定，例如参见美国专利3,791， 932; 3，839，153; 3，850，752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4，879，219; 5，011，771和5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis "Gait, M.J" ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization "Hames， B. D"和 Higgins S. J.， eds. (1985 ) ; "Transcription and Translation"Hames， B. D.，和Higgins S. J.， eds. ( 1984 ); "Animal Cell Culture" Freshney， R. I" ed.( 1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986 ); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal， B.， ( 1984)和 "Methods in Enzymology" 1-317巻，Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods and Application", Academic Press; San Diego， CA (1990) ; Marshak等，"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996 );
所有参考文献在此以全文引入。此文中提供了其它的常用文献。其中 所述的步骤是为了方便阅读在此提供出来，且是本领域公知的。其中 包括的所有的信息都全部引入作为参考。
实验材料和方法
材料所有的标准化学试剂来自Sigma-Aldrich， St. Louis, USA。 副质包i里媒介(Paraplast Embedding Medium )也来自Sigma,抗角蛋 白14和抗角蛋白1多克隆抗体来自于Bacto誦Covance ( Richmond, CA USA)。生物素酰化山羊抗家兔抗体和链霉抗生物素-辣根过氧化物酶 (HRP)来自ZYMED实验有限>^司(San Francisco, CA USA)。 GW9662来自Cayman Chemicals (Ann Arbor Michigan USA)。降月旨 蛋白(补体因子D)来自Calibiochem ( San Diego CA USA)。苏木精 来自DAKO公司(Carpinteria CA USA)。曙红来自ICN生物医学有 限/〉司(Aurora Ohaio USA) ， entellan来自MERCK ( Darmstadt Germany)
鼠角质形成细胞的分离和培养按照文献18所述，从新生皮肤分 离初级角质形成细胞，角质形成细胞在包含8%的Chelex(Chelex-lOO, BioRad)已处理过的胎牛血清的Eagle，s极限必需培养基(EMEM )中培养。为了保持一个增殖性的基底细胞表型，最后的Ca^浓度被调整 到0.05 mM。实验在平皿接种后5-7天进行。
角质形成细胞迁移分析初级小鼠角质形成细胞用PPARy拮抗刑 GW9622 (pM)或者PPARY激动剂曲格列酮()处理或不处理。伤 口划线分析在处理后24小时进行，代表性视区在伤害后(0天)和48 小时后(第2天)立即照相。伤口闭合的平均数用与初期的伤口划线 宽度相比下的百分数表示。
伤口愈合分析通过在C57BL小鼠背部的20 mm切口产生伤口， 每天用各种物质进行处理，为期6天。小鼠在伤害的六天后处死。伤 口活组织取样检查、处理，在形态学和组织化学上对各种伤口愈合参 数分析，所述参数也就是伤口收缩、脂肪细胞迁移和分化、表皮的迁 移和闭合。
伤口收缩分析伤口区域在处理前后测量，并且计算伤口区域的 减少百分数。
石蜡包埋伤口切片的制备在4%的多聚甲醛中固定伤口活组织， 然后，进行脱水处理，使其乙醇的浓度增加(50-100%)。脱水制品首 先浸入石蜡(50%)和二甲苯(50%)的溶液中，然后，再浸入纯的石 蜡。石蜡块通过切片机切开，并且将切片装在Super Frost+TM载玻片 上。
H&E染色载入石蜡包埋伤口切片的载玻片在60*C温育60分钟， 然后，用甲苯(100%)冲洗载玻片2次，共10分钟，用乙醇(100%) 冲洗15分钟一次，用乙醇(100%)冲洗10分钟一次，进行去蜡处理。 这些去蜡的载玻片用苏木精(备用溶液)染色10分钟，用水冲洗，再 用曙红(0.5。/。于DDW中)染色5分钟，然后用70%的乙醇溶液洗涤1 分钟。此后，载玻片用95%的乙醇溶液冲洗一次，为时5分钟，用100% 的乙醇冲洗二次，为时5分钟，用100%的甲苯冲洗二次，为时10分 钟，来进行脱水处理，最后用entellan (MERCK Darmstadt Germany) 密封。
角蛋白4和角蛋白14染色载入石蜡包埋伤口切片的载玻片的去 蜡过程按照上述H&E染色的方法处理，并且在封闭溶液(5。/。BSA和 5%Tween 20TM的PBS溶液)中温育1小时。然后，用抗角蛋白1抗 体或用抗角蛋白14抗体(Babco-Covance )在(1:1000)封闭溶液(5%BSA和5。/oTween2(^M的PBS溶液)中在4t;下过夜温育载玻片。此 后，这些载玻片用洗涤緩沖液(5% Tween 2()TM的PBS溶液)洗涤5 次，紧接着，用悬浮(1:200 )在封闭溶液(5% BSA和5% Tween 20 的PBS溶液)的生物素酰化山羊抗家兔抗体(ZYMED Laboratories Inc.)温育l小时。然后，栽玻片用洗涤緩冲液洗涤3次，紧接着，用 二级生物素酰化链霉抗生物素抗体在封闭溶液(1:300)中在室温下， 温育1小时。此后，这些载玻片用洗涤緩冲液洗涤2次，为时5分钟， 用PBS洗涤一次，为时5分钟，用TRIS緩冲溶液(0.05M的PBS溶 液)洗涤一次，随后，在DAB试剂(溶解在DDW中的2片剂，金银 各一)中温育，用于显色。通过把载玻片浸入水中来终止此反应，紧 接着，用曙红(ICN， 0.5。/。的DDW溶液)来复染。
实验结果
实施例1
在伤口愈合过程中脂肪细胞与迁移角质形成细胞的关联 迁移表皮细胞(角质形成细胞)和募集的脂肪细胞在七天的伤口 组织上观察(图2A-B)。被观察的募集的脂肪细胞基本上无储藏脂肪 (也就是，早期脂肪细胞)。如图1所看到的一样，在约60%的未处 理伤口组中，沿着整个伤口缝观察到迁移角质形成细胞，而募集的脂 肪细胞也存在于约60%的未处理伤口组中。图1还显示，分别在约卯％ 和80°/。的胰岛素处理伤口组中观察到迁移角质形成细胞和募集的脂肪 细胞。
这些结果显示在伤口愈合的早期阶段，迁移到伤口缝区域的角质 形成细胞与脂肪细胞募集到同一区域是密切相关的。因此结果证实， 不完全分化为脂肪积累细胞的迁移脂肪细胞与伤口愈合过程有关。
实施例2
PPARY调节剂对角质形成细胞迁移和伤口收缩的影响 在体外评估抑制或者增强过氧物酶体增殖物活化受体Y (PPARy) 的活性对角质形成细胞迁移的影响。如图3所示，用PPARy拮抗刑 GW9662处理培养的初级小鼠角质形成细胞，促进了角质形成细胞的 迁移。另一方面，用PPARY激动剂曲格列酮处理培养的角质形成细胞， 抑制了角质形成细胞的迁移(图8)。
在体内也评估了分别使用PPARy拮抗剂和激动剂抑制或者增强PPARy的活性对伤口愈合的影响。相应地，在C57BL小鼠背部造成切 口伤口，每天用PBS緩冲液(对照)或者不同的药剂处理6天。小鼠 在伤害的6天后处死，之后对伤口进行分析。如图4， 5和6中所见， 与对照组相比，用GW9662 (—种PPARy拮抗剂)的处理促进了伤口 的收缩。另一方面，用曲格列酮(PPARy激动剂)的类似处理抑制了 伤口收缩(图9)。此外，曲格列酮妨害了胰岛素诱导的伤口愈合(图 9和10)。因此上述结果清楚证明，PPARY活性阻碍了伤口的愈合，PPARy 抑制能有效促进伤口的愈合过程。因此，结果表明如GW9662的PPARy 拮抗剂能用于有效加速伤口的愈合。实施例3降脂蛋白对角质形成细胞迁移和伤口收缩的影响 降脂蛋白(补体因子D，由脂肪细胞分泌)对伤口愈合的影响也 在体内评估。相应地，在C57BL小鼠的背部造成切口伤口 ，每天用PBS 緩冲液(对照)或者lpM的降脂蛋白处理6天。伤害的6天之后小鼠 处死，于是对伤口进行分析。如图4， 5和7中所见，降脂蛋白实质上 促进了伤口收缩(图4， 5和7)。另外，与緩沖液对照组相比(图6)， 降脂蛋白把表皮闭合从大约15%增加到大约30%，并且把角质形成细 胞迁移从大约30%增加到大约65%。这些结果证明，如降脂蛋白的脂肪细胞素能有效地诱导或加速伤 口的愈合。应当理解，为清楚起见在不同实施例中描述的本发明某些特征也 可以在一个实施例中加以组合。反过来，为简要起见在一个实施例中 描述的本发明各特征也可以单独实施或者进行适当的次组合。尽管本发明描述了各种具体实施方案，但是显然很多替代方案、 改进以及变型方式对本领域技术人员而言均是显而易见的。因此，包 含本发明的所有替代方案、改进和变型均落入所附权利要求书的内涵 和范围之内。在说明书中提及到的所有出版物、专利、专利申请以及 以其名称和/或数据库收录号标明的序列，都在此全文引入说明书作为 参考，等同于在此明确的单独引入各出版物、专利、专利申请或序列 作为参考。此外，本申请中对任何参考文献的引用或标注不应当被理 解为承认这些参考文献对本发明而言是可获得的现有技术。以数字引述的参考文献(其它参考文献在正文中引用)1. Hennings, H., Mchael， D" Cheng C" Steinert, P" Holbrook， KL,和 Yusp^ S.H. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse印idennal cells in culture. Cell, J化245-254, l诉O.2. Yusp^ S.H" Kilkenny, A-E.， SteineA P,M.,和Roop， D,R. Expression of taurine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracdlular calcium concentrations in vitro. J.Cell Biol, J0P: 1207-1217， 1989.3. Fuchs, E. Epidermal differetitiation: the bare essoitials. J.Cell Biol., 2807-2814,謂，4. Yuspa^ S.H. The pathogenesis of squamous cell cancer: lessons learned from studies of skin carcinogenesis—Thirty-third G.H.A. Clowes Memorial Award Lecture. Cancer Res., 54:1178-1189,1994.5. H^mings， H, 和Holkook, K.A. Calcium regulation of cell-cell contact and differentiation of epidermal cells in culture. An由astructural study. B邓.CellRes., 127-142,1983.6. Tennenbaum, T" L.， Belanger， A.J., De Lucaj L.M.，和Yusp^ S.H. Selective changes in laminin adhesion and ct邻4 integrin regulation axe associated with the initial steps in keratiaocyte maturation. Cell Growth Differ" 7: 615-628，画.7. Tennenbaun^ T.， Beknger， A.J.， Quaranta^ V"和 Yuspa, S.H. Differential regulation of integrins aiid extracellular matrix binding in epidermal differentiation and squamous tomor progression. J.Invest.Deraiatol.， /: 157-161, 996,8. Weinstein^ M.L. Update on wound healing: a review of the literature. Mil.Med., /狄620-624,謂.9. Singer, A丄 和 Cl魄 R人Cutaneous wound healing. N,Engl.LMed.,紙738-746， l卿.10. Whitby, D丄和Fergusorij M.W. Immunohistochemical localization of growth factors in fetal wound healing. Dev.Biol.， "7:207-215,1991.11. Kiritsy， C.P" Lynch, .B"和Lynchj S,E. Role of growth factors in cutaneous wound healing: a review. CritRev.Oral Biol.Med" 4: 729-760,1993.
权利要求
1.一种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的脂肪细胞素，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
2. 权利要求l的方法，其中所述脂肪细胞素选自降脂蛋白、脂连 蛋白、抵抗素、瘦蛋白、脂蛋白脂肪酶、血管紧张素原、血管紧张素 样物质4、 1-丁酰丙三醇、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、血 管内皮细胞生长因子、白介素6和肿瘤坏死因子a。
3. 权利要求2的方法，其中所述脂肪细胞素是降脂蛋白。
4. 权利要求l的方法，其中所述伤口选自溃疡、烧伤、裂伤和外 科切口。
5. 权利要求1的方法，其中所述脂肪细胞素被包含在适于局部施 用的药物组合物中。
6. 权利要求5的方法，其中所述药物组合物选自水溶液、凝胶、 乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分散液、油膏和软膏。
7. 权利要求5的方法，其中所述药物组合物包括固体载体。
8. —种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括向皮 肤伤口给药治疗有效量的能够调节脂肪细胞中脂肪细胞素的表达和/或 分泌的药剂，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
9. 权利要求8的方法，其中所述脂肪细胞素选自降脂蛋白、脂连 蛋白、抵抗素、痩蛋白、脂蛋白脂肪酶、血管紧张素原、血管紧张素 样物质4、 1-丁酰丙三醇、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、和 肺瘤坏死因子a。
10. 权利要求9的方法，其中所述脂肪细胞素是降脂蛋白。
11. 权利要求8的方法，其中所述伤口选自溃疡、烧伤、裂伤和外 科切口。
12. 权利要求8的方法，其中所述药剂被包含在适于局部施用的药 物组合物中。
13. 权利要求12的方法，其中所述药物组合物选自水溶液、凝胶、 乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分散液、油膏和软膏。
14. 权利要求12的方法，其中所述药物组合物包括固体载体。
15. —种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的能够调节脂肪细胞分化的药剂，从而诱导或 加速皮肤伤口的愈合过程。
16. 权利要求15的方法，
17. 权利要求16的方法剂。
18. 权利要求16的方法，
19. 权利要求15的方法 外科切口。
20. 权利要求15的方法 药物组合物中。
21. 权利要求20的方法，其中所述药物组合物选自水溶液、凝胶、 乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分散液、油膏和软膏。
22. 权利要求20的方法，其中所述药物组合物包括固体载体。
23. —种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括向皮 肤伤口给药治疗有效量的能够吸引脂肪细胞至所述皮肤伤口的药剂， 从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
24. 权利要求23的方法，所述伤口选自溃疡、烧伤、裂伤和外科 切口。
25. 权利要求23的方法，其中所述药剂被包含在适于局部施用的 药物组合物中。
26. 权利要求25的方法，其中所述药物组合物选自水溶液、凝胶、 乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分散液、油膏和软膏。
27. 权利要求25的方法，其中所述药物组合物包括固体载体。
28. —种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括向皮 肤伤口给药治疗有效量的能够增强脂肪细胞在所述皮肤伤口中的增殖 的药剂，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
29. 权利要求28的方法，所述伤口选自溃疡、烧伤、裂伤和外科 切口。
30. 权利要求28的方法，其中所述药剂被包含在适于局部施用的 药物组合物中。
31. 权利要求25的方法，其中所述药物组合物选自水溶液、凝胶、 乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分散液、油膏和软膏。其中所述药剂是PPAR调节剂。 ，其中所述PPAR调节剂是PPAR-y拮抗其中所述PPAR-y拮抗刑是GW9662。 ，其中所述伤口选自溃疡、烧伤、裂伤和，其中所述药剂被包含在适于局部施用的
32. 权利要求25的方法，其中所述药物组合物包括固体栽体。
33. —种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括在皮 肤伤口中植入治疗有效量的脂肪细胞，从而诱导或加速皮肤伤口的愈 合过程。
34. 权利要求33的方法，其中所述脂肪细胞是人类脂肪细胞。
35. 权利要求34的方法，其中所述人类脂肪细胞是自体人类脂肪 细胞。
36. 权利要求33的方法，其中所述伤口选自溃疡、烧伤、裂伤和 外科切口 。
37. 权利要求33的方法，进一步包括通过所述脂肪细胞调节脂肪 细胞素的表达和/或分泌。
38. 权利要求37的方法，其中所述调节通过调节所述脂肪细胞的 分化而实现。
39. 权利要求38的方法，其中所述调节通过将所述脂肪细胞暴露 于PPAR调节剂而实现。
40. 权利要求38的方法，其中所述PPAR调节剂是PPAR-y拮抗剂。
41. 权利要求40的方法，其中所述PPAR-y拮抗剂是GW9662。
42. —种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括在皮 肤伤口中植入治疗有效量的前脂肪细胞，从而诱导或加速所述皮肤伤 口的愈合过程。
43. 权利要求42的方法，进一步包括促进所述被植入所述皮肤伤 口中的前脂肪细胞的分化。
44. 权利要求43的方法，其中所述促进通过将所述前脂肪细胞暴 露于能够增强所述前脂肪细胞分化的物质下而实现。
45. 权利要求42的方法，其中所述前脂肪细胞是人类前脂肪细胞。
46. 权利要求45的方法，其中所述人类前脂肪细胞是自体人类前 脂肪细胞。
47. 权利要求42的方法，其中所述伤口选自溃疡、烧伤、裂伤和 外科切口。
48. —种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括在皮肤伤口中植入治疗有效量的干细胞，从而诱导或加速所述皮肤伤口的 愈合过程。
49. 权利要求48的方法，进一步包括促进所述被植入所述皮肤伤 口中的干细胞的分化。
50. 权利要求49的方法，其中所述促进通过将所述干细胞暴露于 能够增强所述干细胞分化为脂肪细胞的物质下而实现。
51. 权利要求48的方法，其中所述干细胞是人类干细胞。
52. 权利要求51的方法，其中所述人类干细胞是自体干细胞。
53. 权利要求52的方法，其中所述人类干细胞是间质干细胞。
54. 权利要求48的方法，其中所述伤口选自溃疡、烧伤、裂伤和 外科切口。
55. —种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法，所述方法包括将皮 肤伤口的细胞转化至表达和分泌脂肪细胞素，从而诱导或加速皮肤伤 口的愈合过程。
56. 权利要求55的方法，其中所述脂肪细胞素选自降脂蛋白、脂 连蛋白、抵抗素、瘦蛋白、脂蛋白脂肪酶、血管紧张素原、血管紧张 素样物质4、 1-丁酰丙三醇、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、 和肿瘤坏死因子oc。
57. 权利要求56的方法，其中所述脂肪细胞素是降脂蛋白。
58. 权利要求55的方法，其中所述伤口选自溃疡、烧伤、裂伤和 外科切口。
59. —种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的药物组合物，所述药物组 合物包括治疗有效量的脂肪细胞素作为活性成分、以及用于局部施用 该药物组合物的可药用栽体。
60. 权利要求59的方法，其中所述脂肪细胞素选自降脂蛋白、脂 连蛋白、抵抗素、瘦蛋白、脂蛋白脂肪酶、血管紧张素原、血管紧张 素样物质4、 1-丁酰丙三醇、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、 和肿瘤坏死因子a。
61. 权利要求60的方法，其中所述脂肪细胞素是降脂蛋白。
62. 权利要求59的药物组合物，其中所述载体选自水溶液、凝胶、 乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分散液、油膏和软膏。
63. 权利要求62的药物组合物，其中所述药物组合物包括固体载体。
64. —种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的药物组合物，所述药物组 合物包括治疗有效量的能够调节脂肪细胞中脂肪细胞素的表达和/或分 泌的药剂作为活性成分、以及用于局部施用该药物组合物的可药用载 体。
65. 权利要求64的药物组合物，其中所述载体选自水溶液、凝胶、 乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分散液、油膏和软膏。
66. 权利要求65的药物组合物，其中所述药物组合物包括固体载体。
67. —种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的药物組合物，该药物组合 物包括治疗有效量的能够调节脂肪细胞分化的药剂作为活性成分、以 及用于局部施用该药物组合物的可药用载体。
68. 权利要求67的药物组合物，其中所述药剂是PPAR调节剂。
69. 权利要求68的药物组合物，其中所述PPAR调节剂是PPAR-y 拮抗剂。
70. 权利要求69的药物组合物，其中所述PPAR-Y拮抗剂为 GW9662。
71. 权利要求67的药物组合物，其中所述载体选自水溶液、凝胶、 乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分散液、油膏和软膏。
72. 权利要求71的药物组合物，其中所述药物组合物包括固体载体。
73. —种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的药物组合物，该药物组合 物包括治疗有效量的能够将脂肪细胞吸引至皮肤伤口的药剂作为活性 成分、以及用于局部施用该药物组合物的可药用栽体。
74. 权利要求73的药物组合物，其中所述制剂选自水溶液、凝胶、 乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分散液、油膏和软膏。
75. 权利要求74的药物组合物，其中所述药物组合物包括固体载体。
76. —种诱导或加速皮肤伤口愈合过程的药物组合物，该药物组合 物包括治疗有效量的能够增强脂肪细胞增殖的药剂作为活性成分、以 及用于局部施用该药物组合物的可药用载体。
77. 权利要求76的药物组合物，其中所述载体选自水溶液、凝胶、乳膏、糊、洗液、喷雾、混悬液、粉末、分散液、油膏和软膏。
78. 权利要求77的药物组合物，其中所述药物组合物包括固体栽体。
79. —种测量脂肪细胞素或脂肪细胞调节剂诱导或加速伤口愈合 过程的能力的方法，所述方法包括向伤口给药脂肪细胞素或脂肪细胞 调节剂，然后评价所述伤口的角质形成细胞迁移和/或表皮闭合，从而 测量出所述脂肪细胞素或所述脂肪细胞调节剂诱导或加速伤口愈合的 能力。
80. 权利要求79的方法，其中所述脂肪细胞调节剂是脂肪细胞分 化调节剂或脂肪细胞活性调节剂。
81. 权利要求79的方法，其中所述伤口是切口伤口。
82. 权利要求81的方法，其中所述切口伤口是在实验动物中造成的。
83. 权利要求79的方法，其中所述给药是以一种或多种浓度完成的。
84. 权利要求79的方法，其中所述给药是以一或多次施用完成的。
全文摘要
本发明描述了一种用于诱导或加速皮肤伤口愈合过程的方法和药物组合物。所述方法包括向皮肤伤口给药治疗有效量的脂肪细胞素、脂肪细胞调节剂、脂肪细胞、能够分化为脂肪细胞的细胞、或者能够分泌脂肪细胞素的细胞，从而诱导或加速皮肤伤口的愈合过程。
文档编号A61KGK101287483SQ200480029538
公开日2008年10月15日 申请日期2004年8月5日 优先权日2003年8月7日
发明者I·索罗蒙尼克, L·布莱曼-威克斯曼 申请人:希尔洛有限公司