索拉胶作为制备促进皮肤伤口愈合药物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种索拉胶作为制备促进皮肤伤口愈合药物的应用。本发明所采用的动物模型为小鼠全皮层伤口模型，使用3％的索拉胶溶液涂抹伤口，可以减轻伤口处的炎症反应，降低感染的风险，加速伤口愈合过程。本发明采用的索拉胶还可以促进NIH3T3成纤维细胞增殖，促进皮肤中主要胶原蛋白Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的主要合成基因Col1α1和Col3α1的表达。
【专利说明】索拉胶作为制备促进皮肤伤口愈合药物的应用
【技术领域】
[0001] 本发明应用于医药【技术领域】，本发明涉及一种索拉胶作为制备促进皮肤伤口愈合 药物的应用。
【背景技术】
[0002] 皮肤是身体最大的器官，覆盖着皮肤下的肌肉组织。皮肤参与人体的代谢过程，保 持着人体内环境的稳定。因受伤或疾病而导致大面积的皮肤完整性的破坏可能会导致较大 的伤残甚至死亡，是临床治疗中的棘手问题。在美国每年有超过125万人烧伤，650万人因 压力、静脉淤滞或糖尿病而患有慢性皮肤溃疡。
[0003] 伤口愈合是机体对组织出现损伤后的一个复杂有序的、动态的、旨在恢复组织完 整性的生物学反应，涉及到各种细胞（角质细胞、纤维细胞、内皮细胞等）、细胞外基质、可 溶性介质和细胞分子间的相互作用。
[0004] Portera 等人（Browder W，Williams D，Pretus H，et al. 1990. Benefical effect of enhanced macrophage function in trauma patients. Ann Surg211:605 - 613)的石开 究表明，使用β -葡聚糖作为治疗伤口愈合的药物，可以降低死亡率，减轻感染，还可以使 受损皮肤恢复更好的弹性。Berdal 等人（Berdal M，Hege I，Appelborn BS，et al.2007. Aminated b_l, 3-glucan improves wound healing in diabetic db/db mice. Wound Rep egl5:825 - 832)的研究表明β-葡聚糖和巨噬细胞刺激剂的混合使用，可以加速糖尿病小 鼠的伤口愈合。研究表明，局部或全身性的葡聚糖治疗可以加速伤口周围巨噬细胞的渗透、 肉芽组织的形成、胶原蛋白的合成和提高新生皮肤的拉伸强度，从而促进伤口的愈合。
[0005] 索拉胶（Salecan)是一种由土壤杆菌Agrobacterium sp. ZX09分泌产生的胞外 多糖，是一种新型的β_葡聚糖并具有降血糖的作用。目前已发现索拉胶具有降低肝脂、 血脂、体脂、体重和胆固醇（中国专利，201010198223. 5)，预防和治疗便秘（中国专利， 201110028483. 2)以及抑制紫外线对皮肤损伤（中国专利，201310730754. 8)的作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种索拉胶在促进皮肤伤口愈合方面的的应用，该索拉胶 具有使用方便，可以加快皮肤的伤口愈合的功能。
[0007] 实现本发明目的的技术方案为：索拉胶作为一种具有促进皮肤伤口愈合的作用的 药物，可配制成溶液直接涂抹于伤口表面来促进伤口愈合，或用于制备具有促进伤口愈合 的外用药物的功能性产品。
[0008] 本发明所述的应用包括人在内的哺乳动物。
[0009] 本发明与现有技术相比，其显著优点是：
[0010] 1.本发明方法中的索拉胶生产、提取方法简便，产量大，可直接溶于冷水，而且安 全无毒，功效全面。
[0011] 2.索拉胶溶液可以促进皮肤成纤维细胞的增殖，提高了皮肤中主要胶原蛋白I型 胶原和III型胶原的主要合成基因 Coll α 1和C〇13a 1的表达。动物实验中，与正常小鼠比， 涂抹索拉胶溶液的小鼠皮肤伤口愈合速度明显加快，皮肤组织中的炎症细胞因子明显降 低。
[0012] 3.索拉胶配成溶液后可直接涂抹于哺乳动物皮肤，也可用于制备具有促进伤口愈 合的外用药物的功能性产品。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1是小鼠伤口的形态变化。
[0014] 图2是小鼠伤口愈合面积的变化。
[0015] 图3是小鼠伤口皮肤IL-1 β基因的表达。
[0016] 图4是小鼠伤口皮肤TNF- a基因的表达。
[0017] 图5是索拉胶对NIH3T3成纤维细胞增殖的影响。
[0018] 图6是索拉胶处理后NIH3T3成纤维细胞Coll a 1基因的mRNA表达。
[0019] 图7是索拉胶处理后NIH3T3成纤维细胞Col3 a 1基因的mRNA表达。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。
[0021] 实施例1 :索拉胶粗品的制备
[0022] 配置培养液，称取 lgNaH2P04, 3gKN03, 0· 07gCaCl2, 0· 3gMgS04 · 7H20， 0· 0125gFeS04 · 7Η20,0· 003gMnS04, 0· 0075gZnCl2, 20g 蔗糖，加入 H20 至体积为 lOOOmL，调 节pH至7。将培养液加热121°C灭菌20分钟，冷却至室温后接入平皿菌落液200 μ L，28°C 培养12h，为种子液。向灭过菌（121°C灭菌20分钟）的培养液中加入5%的种子培养液， 28°C发酵48h。在该发酵液中加入两倍体积的95%乙醇，沉淀多糖，将沉淀物于50°C抽真空 干燥，即得到索拉胶粗品。
[0023] 实施例2 :索拉胶粗品的纯化
[0024] 索拉胶粗品的纯度达不到实验要求，对其采用改进后的Sevag法纯化。纯化步骤 为
[0025] (1)配制0. 5 %的索拉胶溶液，加热（105 °C，15min)，待冷却至室温时， 7000r/10min，取上清，除去残余菌体和部分蛋白。
[0026] (2)按1:30的比例加入pH4. 0的乙酸一乙酸钠溶液，以除去DNA。
[0027] (3)按1:1的比例将上清与苯酚氯仿溶液（按1:1的比例配制成混合溶液）混合， 剧烈振荡约15min，7000r/10min，取上清。重复此步骤2?3次，以彻底除去蛋白。
[0028] (4)向上清液中加入2倍体积的工业酒精，重力离心沉淀。
[0029] (5)用75%的酒精洗涤沉淀2?3次，再用95%的酒精洗涤沉淀1?2次。
[0030] (6)真空冷冻干燥，得到索拉胶纯品。
[0031] 实施例3 :小鼠全皮层伤口模型的研究
[0032] 实验动物为6周龄的C57BL/6J雄鼠，购于扬州，饲养于22± 1°C，12小时光照一 12 小时黑暗循环的动物房，自由摄取食物和水。小鼠通过腹腔注射10%水合氯醛（4mL/kg) 麻醉，待麻醉充分时，固定小鼠使其背部朝上。以背部脊椎为中间线，用剪刀将背部鼠毛剪 去，大小约2cmX 2cm。两至三天后，将小鼠随机分为两组，一组为对照组（即CK组），一组 为索拉胶实验组。用70%的乙醇对背部皮肤进行清洁消毒，全皮层切除伤口分布在以背部 脊椎为中间线的两旁，用无菌的镊子挑起皮肤，用无菌的剪刀剪去直径大小约为6mm的皮 肤，深达肌肉层筋膜。以此，在小鼠背部共造成4个直径为6mm的圆形伤口，左右两侧各两 个伤口。对每个伤口利用带方格的纸进行伤口面积测量并拍照，拍照结束后，使用伤口愈 合快示格胶贴（安舒妥一OPSITE FLEXIGRID，Smith&N印hew Medical Limited)将伤口覆 盖，以保证伤口处于湿性愈合的状态。手术当天计为dayO,正常组小鼠的伤口涂抹200μ L 的生理盐水，索拉胶组的小鼠的伤口涂抹200μ L的3% (w/v)的索拉胶溶液，每三天涂抹 一次。实验一共分为两批，一批用来统计伤口愈合率，即在小鼠伤口愈合的过程中，分别于 dayO、day3、day6、day7、day9、daylO、dayll、dayl2 统计伤口面积，计算伤口愈合率；另一 批分别于dayl、day3、day6处死，收集伤口处皮肤，作皮肤RNA的抽提。CK组和Salecan组 的小鼠背部伤口的面积变化通过计算得到伤口愈合率，如图2所示，在伤口愈合过程中的 前期，CK组小鼠和Salecan组小鼠的伤口面积没有太大的变化，伤口愈合率基本相同，而随 着愈合时间的延续，Salecan组的小鼠伤口的愈合速率明显变快，伤口迅速收缩变小，第12 天其伤口愈合率为5. 38%，伤口已基本愈合，而对照组的伤口愈合率仍为24. 76%;外观上， Salecan组的小鼠伤口无明显的红肿、化脓等感染现象，部分CK组的小鼠则出现了感染现 象，表明索拉胶可以在一定程度上防止伤口感染。
[0033] 1)皮肤组织RNA的提取
[0034] 取小鼠背部伤口处直径约10mm皮肤组织，按照Invitrogen RNA提取试剂盒和 M-MLV逆转录试剂盒的说明，提取RNA和逆转录cDNA。cDNA原液稀释20倍后用于RT-PCR 反应，反应体系为20 μ L :
[0035] ddwalcr 4 μ?^ 2><SYBR Green PCR master mix 10 ^lL Forward primer 0.5 μ? Reverse primer 0_5 pL cDNA. 5 pL
[0036] PCR 扩增条件为：50°C，2min ;95°C，lOmin ;95°C，15s，60°C，30s (收集荧光信号）， 40 个循环；95°C，15s，60°C，30s，95°C，15s (溶解曲线）。
[0037] 基因表达相对量用2〃C11法分析，以GAPDH为内参。
[0038] 基因引物序列如表1所不：
[0039] 表 1
[0040]
【权利要求】
1. 一种索拉胶作为制备促进皮肤伤口愈合药物的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用包括人在内的哺乳动物。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的索拉胶可直接配制成溶液使用，或 用于制备具有促进伤口愈合的外用药物的功能性产品。
【文档编号】A61K31/716GK104116756SQ201410385771
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】张建法, 宁益春 申请人:南京理工大学