专利名称：：一种稳定的液体益生组合物、其制备和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及益生组合物，更特别地涉及一种制备液体益生组合物的方法，所述液体益生组合物包含可以以生物学活性形式长时间保存的非病原细菌菌株，还涉及组合物及其治疗方法。
背景技术：
：益生细菌是对人类和/或动物有益的细菌。利用益生细菌是本领域已知的，用于改善哺乳动物的肠道中的微生物平衡，来预防或治疗胃肠感染及其他疾病或失调，所述疾病或失调涉及和/或引起肠内微生物区系组成方面的变化，和/或产生微生物区系组成方面的任何变化，和/或维持这种变化，以及主动引起或强化这种疾病或失调的微生物区系组成的变化。然而，迄今为止进行的研究的结果是不一致和/或不明确的。例如，在某些研究中，与安慰剂相比，在病人中单独使用益生细菌来治疗“旅行者腹泻(traveler’sdiarrhea)”不足以提供显著的效果，而益生治疗与抗生素的组合被证明是高效的。其他的研究已经显示，单独的益生治疗具有有益效果，而这种效果通常需要3-6个月来察觉(还参见J.JAMA，1996，vol.275，No11，美国专利5433826，1995，美国专利5589168，1996等)。近来的研究已经致力于研究各种类型的益生细菌的效果，单独地或组合地；改善益生细菌的存活率和允许长期保存的方法；生物量积累，和在人和动物的防病和治疗方面使用益生细菌。已知约400种不同种类的细菌和类菌体存在于人类和其他哺乳动物的消化道中，可以提供约30-40％的粪便量。这些已知种类中仅详细地研究了约15种的特征和功能。这些种类的细菌的每一种都在消化道中占有自己的生态位，每种都具有最佳生存和增殖率的特定条件。可能导致各种疾病或失调的病原细菌也占有它们自己的特定环境生态位或生境。病原细菌和益生细菌之间的竞争可在各种条件下发生，但是，当病原细菌和益生细菌的最佳生存和增殖率的条件相似时，出现最大的竞争效果。在这种条件下，生存取决于对养分或生长因子的更严厉的竞争，以及协同的养分利用和对受体部位的竞争。一些因素，例如抗微生物物质的产生、增殖的强度、限制性环境的创造，包括免疫学过程的诱导和对上皮细胞更新(turnover)的刺激，在这种条件下也具有很大的意义。已经运用非病原E.coli与其他非病原细菌的培养物开发出益生组合物(美国专利No.5,340,577；美国专利No.5,443,826；美国专利No.5,478,557；美国专利No.5,604,127)。具有高度的对抗活性的乳糖阳性非病原E.coli菌株已经作为冻干制品在德国和俄罗斯生产(例如，E.coliM17的冻干制品Colibacterinsiccum的使用，描述于VidalHandbookPharmaceuticalpreparationsinRussia，AstraPharmService，1997，Moscow)。近年来，出现了开发包含大量(多至30种)不同种类的细菌和类菌体的益生制品的趋势(例如，美国专利No.5,443,826；美国专利No.5,478,557)。然而，使用这么多种不同细菌相对于仅包括一种或两种类型的制品的优点还未被证明。实际上，有些证据表明使用大量的种类可能发生效率降低。Behling等人研究了25种乳糖阳性E.coli，发现这些种类中的两种(E.coli125A和E.coli128)在小鸡中对S.enterids感染有抑制效果。然而，125A菌株的效果显著地大于128菌株的效果，这两种菌株的组合产生了比单独用125A所获得的更低的效果。研究显示，使用295种盲肠分离物的混合物对Salmonella没有保护作用(Gorenetal.，1984)，而使用仅4种分离物的混合物提供了保护作用(CA专利No.1,151,066)。由此看来，在使用的细菌菌株数和获得的保护水平之间没有清楚的关系。这主要是由于不同菌株之间的各种相互作用，其可能引起协同的或对抗的效应。已经使用被干燥并掺入微囊中的乳细菌(Lactobacteria)进行了研究(美国专利Nos.5,501,857；5,614,209；和5,635,202)。作者声称这种微囊化的制品在通过胃的时候比常规的形式有更高的稳定性。活细菌的保存方面的研究主要集中于冻干的制品，关于简化它们的应用的改进的生产方法和技术解决方案(美国专利Nos.5,139,792和5,401,501)。极少的现有技术专利涉及以悬浮形式，即，备用状态的液体形式保存细菌的方法。美国专利no.4,999,301教导了一种将Lactobacillusplantrum或Bacillussubtilis微生物在含有10-30％之间养分固体的浓缩培养基中保存两个月时间的方法。然而，它实际上描述了多阶段的生长周期，必需多次额外的操作。至少0.5％的细菌仍然是活的。美国专利no.4,518,696教导了一种使用与葵花籽油的油-细胞混合物的Lactobacili液体悬浮物。然而，活细胞在与油组合之前被干燥，并进一步的以具有低的内部水浓度为特征。
背景技术：
：的专利都没有教导或暗示液体的益生培养基，在其中细菌细胞维持了高水平的生物学活性。这样的培养基，例如对于如炎症性肠病的疾病，是明显需要的。炎症性肠病或IBD，是集合性的术语，包括相关的、但又不同的、胃肠道的慢性炎症性失调，例如克罗恩氏病(Crohn’sdisease)、溃疡性结肠炎(UC)、不确定性结肠炎(indeterminatecolitis)、显微结肠炎(microscopiccolitis)和胶原结肠炎(collagenouscolitis)，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎是最常见的疾病。胃肠道的另一种慢性失调是肠易激综合征(IBS)。对于大多数病人，IBD和IBS是具有持续数月到数年的症状的慢性状况。在年轻的成年人中是最常见的，但可以在任何年龄发生。它在世界范围内出现，但是在工业化国家，例如美国、英国和北欧最常见。例如，仅在美国IBD就影响了估计两百万人。还不了解IBD和IBS的确切原因。常见的假说包括，例如，免疫系统中的失调和前炎症性cytolines的作用和淋巴细胞亚类的选择性活化，它们保持了肠内炎症性反应的无限制的活化。病原性和潜在病原性细菌产生的代谢产物可能导致免疫系统的失调。由此，这些细菌可能与这种性质的紊乱有牵连，与肠内微生物平衡的紊乱有关。这种紊乱本身可能是病因，或作为选择(或组合地)，据相信，这种紊乱可能反过来引起自身免疫反应和/或免疫系统的其他反应。例如，近来证明，在患有IBS的病人中，多至70％的病人在肠系统中有细菌的过度生长；在患有IBS的许多病人中治疗这种过度生长引起症状的减小或甚至停止(来自加利福尼亚Cedars-Sinai医疗中心的Dr.MarkPimentel的研究)。对IBD和IBS还没有治疗法。被IBD或IBS折磨的病人当前一般用针对减少病人的炎性过程和减少炎性过程的影响的疗法来治疗。目前已知的IBD的医学治疗意图降低炎症性肠病急性恶化的次数、频率和严重度，和预防次级并发症，但在最佳的情况下，结果是令人失望的。目前已知的治疗IBD或IBS的方法未能为至少某些IBD或IBS患者提供解决办法，因为这些方法(i)未能提供对IBD的实质性治疗，而是提供对症状的治疗；和(ii)包括伴有严重不良副作用的药物治疗或侵入性外科疗法，都影响患者的生活质量。发明概述
背景技术：
没有教导或暗示一种稳定的、有效的液体益生组合物。
背景技术：
：也没有教导或暗示这种组合物用于治疗各种肠道失调，包括但不限于，微生物感染、肠易激综合征(IBS)和炎症性肠病(IBD)。本发明通过提供一种制备液体益生组合物的方法克服了
背景技术：
的这种缺陷，所述液体益生组合物包含至少具有基本生物学活性的细菌，其中所述细菌已经根据至少一种选择压力进行了选择，和其中所述组合物基本上不含适合于细菌生长、但不类似地适合于哺乳动物、特别是不适合于人类的物质，在下文中定义为“非适合物质(non-suitablesubstances)”。例如蛋白胨和缓冲盐，特别是磷酸盐，在小剂量可能不是有害的，但它们特别地不适合于人类。任选的，所述选择压力可以包括温度、时间(保存一段时间时的稳定性)和渗透压中的至少一种。本发明还提供了一种制备液体益生组合物的方法，包括根据选择压力选择细菌；和将所述至少具有基本生物学活性的细菌保存维持一段时间。本发明还提供了一种治疗受试者的方法，包括向需要这种治疗的受试者施用所述液体益生组合物。液体制剂在口服施用后立即有治疗活性，因此不需要在消化道中的生物量产生。优选的，所述方法用于治疗胃肠疾病或失调，所述胃肠疾病或失调期望或需要治疗，任选的和更优选的可包括微生物感染，例如细菌感染，和/或IBD和/或IBS。本发明对于治疗AAD(抗生素相关的腹泻，antibioticassociateddiarrhea)，以及任何形式的急性腹泻，例如由微生物(包括但不限于，产肠毒素E.coli、Salmonella、Proteus、Pseudomonas、Closttidium、Staphylococcus、Shigellaflexneri等等)，或由未被检出的病原体引起的急性腹泻；旅行者腹泻综合症；医院环境中的急性腹泻；以及对于治疗与腹泻相关的IBS(肠易激综合征)的症状，不管是粘液性的还是炎症性的，和治疗由放疗或化疗引起的腹泻，也是有用的。本发明对于治疗与胃肠道中微生物区系的“异常(abnormal)”或“异常”分布的存在有关的各种疾病状态；无论是粘液性的还是炎症性的IBD(炎症性肠病)、结肠痉挛、粘液性结肠炎、抗生素相关的结肠炎(antibiotic-associatedcolitis)、突发性或单纯性便秘、和特定微生物例如Clostridiumdifficile、Campylobacterjejuni/coli等和Candida的慢性肠胃感染；由抗生素、放疗或化疗、肠感染、消化道手术、免疫缺陷、不利的生态学的状况，包括更高的辐射和年龄变化所引起的消化道微生物平衡紊乱导致的慢性腹泻，也是有用的。根据本发明的其他优选实施方式，所述组合物和方法任选的对于治疗食物中毒、消化不良症状或急性腹泻的发作、或由未被检出的病原体或未知病因引起的腹泻是有用的。本发明任选的对于治疗消化道的疾病和失调也是有用的，所述疾病和失调由肠内微生物区系的微生物平衡的紊乱，和/或由小肠中细菌的过度生长导致或维持。本发明任选的对于预防或降低消化道微生物区系的微生物平衡紊乱的水平也是有用的，所述紊乱由抗生素治疗、放疗或化疗、消化道的疾病或失调，包括消化道手术所引起。根据本发明再其他的优选实施方式，所述组合物和方法任选地对于预防或治疗由消化道外的疾病、某些饮食和环境因素引起的消化道微生物区系的微生物平衡的紊乱是有用的。本发明对于改善或正常化老年人和受危害病人的胃肠道的生理活动也是有用的。在本发明的优选实施方式中，提供一种包含具有至少基本生物学活性的细菌的液体益生组合物，其中所述细菌已经根据至少一种选择压力进行了选择，所述选择压力选自温度、时间稳定性(保存的稳定性)和渗透压，其中所述组合物基本上不含适合于细菌生长的物质，包括细菌蛋白胨、盐，并且也缺少细胞自身在生长期期间产生的抑制因子。优选的，所述组合物包含在更早的制备阶段期间从细菌自身制备的自溶物，其提供了适合于使细菌维持在具有最小生物学活性的生存状态的必需养分，但其对于更低等的哺乳动物或人类是无害的。同样优选的，所述组合物的pH被调节到适合于维持细菌的生存力，更优选的是pH约6到pH约7。由而，根据本发明的一个方面，提供了一种在需要治疗的受试者中治疗炎症性肠病/肠易激综合征(IBD或IBS，等)的方法。该方法包括向受试者口服施用治疗有效量的液体制剂形式的益生Escherichiacoli菌株。所述治疗有效量优选的在每次施用约106和约1012个活菌之间，每天施用1到10次，优选的约2-4次。根据本发明的另一个方面，提供一种益生药物组合物，所述益生药物组合物包含液体制剂中的益生Escherichiacoli菌株作为活性成分。根据本发明的进一步的方面，提供了治疗微生物感染的方法，所述方法包括向受试者口服施用治疗有效量的液体制剂形式的益生菌株，优选的是Escherichiacoli菌株。下面的表格显示了根据本发明的组合物用于治疗各种疾病和失调的建议的剂量，仅用于说明性的目的，无论如何不希望受到限制。示范性的疾病/失调和建议的剂量服用法的表格本发明对于改善或正常化受试者的免疫系统也是有用的，所述受试者患有免疫系统失调，包括作为由治疗其他疾病引起的副作用的失调，以及对于治疗家养动物是有用的。根据描述的优选实施方式中更进一步的特征，益生非病原乳糖阳性菌株，例如Escherichiacoli菌株M-17，单独地或任选地与一个或多个E.coli菌株和/或其他菌株。根据描述的优选实施方式中更进一步的特征，所述液体制剂包含每ml约106到约1012CFU之间的益生Escherichiacoli菌株，更优选的每ml约107到约1010CFU的益生Escherichiacoli菌株。本发明通过提供一种方法和一种益生药物组合物来用益生E.coli菌株治疗细菌性感染、炎症性肠病/肠易激综合征(IBD或IBS，或其他)，成功地解决了目前已知配置(configurations)的缺点。这种益生治疗是高度有益的，与治疗如上所述的这些疾病或失调，或其他疾病或失调的当前方法相比，它是有效的、安全的、非侵入性的和无副作用的。本发明的一个特征是，E.coli或其他细菌是以生物学活性形式保存的。本发明的优点是，细菌的益生活动在到达胃肠道时立即开始。本发明的进一步的优点是，该制品可以保存很长时间而没有显著的细菌生存力损失。本发明的其他优点是，在通过胃时本发明的制品组合物显示了比干燥的制品更高的稳定性。本发明的其他优点是，与已知的益生制品相比时，该制品在更大的剂量显示了提高了多得多的效果。由于制备和保存的方式，本领域已知的益生组合物明显较差；例如，如上所述，许多这样的组合物依靠冷冻干燥，这引起生物学活性水平的严重降低。本发明还具有的优点是，液体益生组合物效力的广谱性容许不用先鉴定病原体和判定其对抗菌制品的敏感性而有效地治疗肠内感染。附图的简要说明参考附图，在此仅以举例的方式描述本发明附图1显示了取自根据本发明的液体组合物的细菌的生长速率与取自冻干的组合物的细菌的生长速率的比较；与后者相比，前者清楚地显示了更高的生长速率。详细说明本发明是关于制备包含非病原益生微生物的组合物的方法，和组合物，和其在治疗胃肠道的微生物感染，以及IBS、IBD、抗生素相关的腹泻(AAD)和任何其他类型的腹泻或综合症方面的用途。本发明包括含有益生细菌的液体组合物的用途。一开始通过应用选择压力因素选择细菌细胞，以选择在遭受不利于新陈代谢的条件时仍然存活的那些细胞。这些选择压力因素可以任选地和优选地包括时间稳定性(保存稳定性)、温度和渗透压条件的至少一个。由此，选择出具有最大生存能力的细菌。温度选择条件可以任选地和优选地包括使细胞经受超过活跃的重要细胞代谢的最适范围的温度，优选的40℃的温度，持续4到5天之间的时间。优选的，可以通过使细胞经受低于活跃的重要细胞代谢的最适温度范围的温度，优选的2到15℃之间的温度，持续1-12个月之间，更优选的3到12个月之间，来选择细胞。根据本发明的方法，选择的细菌优选的被用于接种生长培养基，用于生物量的产生以制备液体益生制剂，所述液体益生制剂含有选择的、存活的非病原细菌，任选地和优选地包含每ml约107到约108集落形成单位的选择的益生Escherichiacoli。悬浮培养基基本上不含生长培养基。悬浮培养基可以进一步包含物质的复合物，所述物质可被用于细菌细胞来以最小能量消耗和合成性代谢(plasticmetabolism)维持它们的基本生物学活性，用这种物质来补充所述悬浮培养基，所述物质作为一定条件下自溶作用的结果来自细胞悬浮液本身，所述条件防止细菌细胞的生物降解成分的产生。任选的可以通过应用机械作用和/或通过环境的组成来提高自溶作用。例如，可以通过在细菌细胞内的渗透压和悬浮培养基的渗透压之间造成渗透不平衡来诱导自溶作用。例如，可以通过使用具有低渗透压的适合的悬浮培养基，最优选的是0.3％-0.4％的氯化钠溶液，来诱导自溶作用。做为选择，可以通过对细菌悬浮液密度的改变来诱导自溶作用，例如使得所述密度优选的从约1011到约1012细菌数每ml(CFU；应当注意的是在本申请中可互换地使用这两个术语)。同样做为选择，可以使用另一个方法来防止细菌的生物降解成分的产生。例如，这样的方法的实例包括但不限于超声或其他方法。任选的和优选的，使所述细菌悬浮液经受有利于自溶作用的条件3-7天之间，以发生自溶物的积累，然后经受细胞内和适合的悬浮培养基之间的渗透平衡条件，优选的在约0.6％到约0.7％的范围内，最优选的约0.6％氯化钠溶液。细胞成分，例如核酸成分，在有利于自溶作用的情况下积累，数量上优选的达到90-110μg/ml，细胞浓度为1011-1012细菌数每ml。悬浮培养基将细胞维持在一定条件下，细胞不但存活，还将细胞维持在生物学活性状态。所述培养基优选的还包括用于维持细菌基本上不进一步生长或增殖(如上所述)的必需成分，并且所述培养基基本上不含通常由微生物在生长期间产生的抑制剂。所述制剂被保存在这样的条件下，所述条件以基本的生物学活性率将细菌维持在存活的、生物学活性状态下，持续最长的时期。这些条件包括约6.0到约7.0之间的pH值，优选的约6.5到约6.8之间，和约2到约10℃的温度。本发明的液体制剂可被用于治疗人类和动物。优选的，将10ml到20ml之间剂量的制剂施用给受试者，一天在2到4次之间。在下文中，术语“基本上不含”特定物质，优选的是指一种情况，其中所述物质以微小的量或痕量存在，更优选的低于约5％的重量比。如在此使用的，术语“方法”是指用于实现给定任务的方式、手段、技术和步骤，包括但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的，或易于从已知的方式、手段、技术和步骤发展出的那些方式、手段、技术和步骤。在此，术语“治疗”包括消除、显著抑制、减缓或逆转疾病的进展，显著改善疾病的临床症状或实质上预防疾病的临床症状的出现。术语“预防”是指首先防止受试者患上失调或疾病。如在此使用的，术语“炎症性肠病(IBD)”是指以胃肠道内的炎症性活动为特征的失调或疾病，可包括IBD的粘膜形式。可用本发明的益生菌株治疗的IBD的实例非限制地包括，克罗恩氏病(远端的和近端的)、溃疡性结肠炎、不确定性结肠炎、显微结肠炎、胶原结肠炎、小肠和/或近端肠的突发性炎症和与IBD有关的腹泻。在此使用的术语“施用”是指将益生E.coli菌株或其他菌株带入受疾病或失调影响的胃肠道中的区域或部位的方法。术语“治疗有效量”是指施用的益生E.coli菌株或其他菌株的数量，这种数量将至少在一定程度上减轻被治疗的疾病或失调的一种或多种症状。在下文中，术语“受试者”是指被施用治疗剂的人或更低等的动物。口服施用的组合物包括在水或非水介质中的悬浮液或溶液，或含有液体的胶囊剂。增稠剂、稀释剂、调味剂、助分散剂、乳化剂或粘合剂是可取的。剂量取决于症状的严重度和受试者对治疗剂的反应。本领域普通技术人员能容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。根据本发明的方法，治疗有效量范围优选的在每次施用约106到约1012个活细菌之间，更优选的在每次施用约107到约1010个活细菌之间，更优选的在每次施用约108到约1010个活细菌之间，最优选的在每次施用约5×109到约2×1010个活细菌之间。根据本发明的施用次数范围优选的在每天1到10次施用之间，更优选的在每天1到5次施用之间，最优选的在每天2到4次施用之间。每天施用的活细菌总数范围优选的在每天约109到约1011个活细菌之间，尽管其范围任选的可以在每天约106到约1012个活细菌之间。本发明的益生菌株优选的作为液体制剂被配制和施用，如在下文中详细描述的和在以下实施例部分进一步举例说明的。本发明的益生菌株的制剂以液体制剂的形式是高度有益的。在生物学活性状况之下，该制剂还充当了存活细菌的支持性培养基，与冻干的制剂，例如商售的M17制品正相反，在冻干的制剂中的细菌处于休眠状态。结果，本发明的液体制剂，例如，在口服施用后立即有治疗活性，不需要在消化道中的生物量(biomass)产生。根据本发明，益生E.coli菌株的液体制剂一般地包含在水溶液中的细菌的悬浮物。所述水溶液一般地主要包含蒸馏水，优选的包括来自细菌的自溶物，等渗数量的盐，可进一步包含其他成分，如下文中进一步详述的。优选的，将溶液的pH值调整到有利于维持生存力。优选的，所述溶液还包含氮源，但更优选的是相对小的数量，最优选的低于约0.3％，再更优选的低于约0.03％。应当注意的是，除非另有说明，在此给出的百分比是重量体积比。根据本发明，益生E.coli菌株的液体制剂一般地每ml包含约105到约1012CFU(集落形成单位)的益生Escherichiacoli菌株。优选的，所述液体制剂每ml包含约106到约1010CFU之间，更优选的每ml约107到约108CFU之间。根据本发明的优选实施方式，每天将10ml到20ml之间的液体制剂施用给受试者，一天在2到4次之间。本发明的上下文中使用的液体制剂是口服施用的，因而其优选的进一步包含一种或多种增味剂和/或一种或多种植物提取物。非病原乳糖阳性E.coli，例如菌株M17、菌株Nisle及其他菌株包含人和动物肠内的健康需氧微生物区系的主要类群，提供了微生物学的平衡，在营养和免疫方面起到重要的作用。这种细菌菌株与大多数引起腹泻的肠病原体属于相同的系统发生群，因而它们的存活条件是很大程度上相似的，引起了菌株之间的高水平的竞争性排斥。这种竞争效应包括在益生细菌的生长期间抗微生物物质的产生、对营养和生长因子的竞争、协同的养分利用，和对受体部位的竞争。增殖的速度是竞争对抗中的主要因素，本发明的菌株的增殖速度要高于，例如，Lactobacillus或B.Bifidus，至少与许多肠内病原体相当。此外，对于营养需求，本发明的菌株比例如Lactobacillus或B.Bifidus的菌株有低得多的选择性。当前可获得的益生制品使用干燥的细菌，使得细菌保持存活，但处于休眠(anabiotic)状态。在施用这种制品时，在重新获得生物学活性之前出现了停滞期。由于在腹泻时肠的内容物被快速地排出，施用的干燥的细菌制品仅一小部分被保留在结肠中以增殖和获得生物学活性。本发明的液体益生组合物允许将细菌保存在生物学活性形式，从而在到达胃肠道时立即开始细菌的益生作用，不需要适应时间。因而开始细菌生长所需的时间，本发明的液体组合物要比冻干的细菌的制品快得多。已经发现，本发明的益生组合物对细菌性病原体的对抗效应显著地高于来自冻干制品的益生细菌的对抗效应。应当注意的是，“对抗”意思是特定细菌菌株对抗其他细菌或其他微生物的生长的能力。已知的是，胃液主要包含盐酸，胃液的作用引起许多细菌的死亡。干燥形式的细菌比在液体培养基中含有的那些细菌更弱，因而对胃液的影响更加敏感。因此含在本发明的液体组合物中的细菌在通过胃时，比冻干制品中的那些细菌更加稳定。进入结肠的细菌开始增殖并发挥它们的对抗性质。然而，大多数肠病原体的主要作用的部位不是结肠，而是在胃肠道的上部。已知的益生制品不能将竞争性浓度的活细菌递送到肠的上部，因而在消除由肠道上部的微生态平衡紊乱引起的急性细菌性腹泻和状况方面实际上是无效的。使用常规的益生制品生产方法，提高制品的细菌数量是成问题的。在这种方法中，细菌与培养基一同被干燥，添加了各种稳定剂来提高细菌稳定性。因此，提高施用的细菌数量引起在其他成分的消耗水平方面的增加，这可能引起严重的副作用。与此相反，本发明的组合物包含生物学纯的细菌的液体悬浮物，从而在一定的体积，优选的多至约150ml和如上所述的浓度下，每天施用的细菌数量可以从几千万直到约2千亿个细菌之间变化。这允许提供一种在消化道的上部，即，在大多数肠病原体作用的部位就开始的细菌的功能性竞争浓度。目标部位决定了治疗疾病或失调所需的浓度。由于可以按照确定的给药频率来施用，本发明的液体益生组合物的有效性也被提高了，所述给药频率根据待治疗的疾病或失调被确定为提供最大的剂量依赖效力。例如，在治疗急性腹泻时，本发明的液体益生组合物可以按照用于治疗便秘的有效量的10-100倍的量来施用。在制备本发明的液体益生组合物时，具有最高的对抗活性的E.coli细菌细胞(或其他细菌细胞)和在长时间保存时，优选的多至约12个月，有最大持久性的细菌细胞，更优选地首先从具有有益的益生性质的乳糖阳性非病原E.coli物种中挑选。用于本发明的益生组合物的E.coli细胞或其他细菌通过对细胞施加选择压力来挑选，从而仅被选择的细胞仍然存活。选择压力的应用可以通过使用时间压力(时间稳定性)从而选择具有长期生存能力的细胞；应用渗透压；降低基础代谢；或提高温度来实现。温度选择任选地和优选地包括使细胞经历40℃的温度至少4天，和/或经历更高的温度更短的时间。用这种方法，仅从初始培养物中选择出具有很高生存能力的细胞。选出的细菌细胞被用于接种生长培养基，如下文中更详细描述的，参考实施例6和7。本发明的营养组合物可包含各种因子，例如参考实施例所描述的，例如来自酵母提取物和/或酵母自溶物的因子。本发明的生长培养基的营养组合物可以任选地包括生长因子，并由于添加这种生长因子，例如来自酵母提取物的生长因子，相对于用常规生长培养基所获得的，提供了在积累的细菌生物量方面可观的增加，其产生了经济效益。所述酵母提取物优选的以约5克每升到约25克每升的数量存在，更优选的从约15克每升到约20克每升。营养组合物的其他来源是可能的，但优选地包括
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中已知的所有必需营养、生长因子等，例如“ManualofMethodsforGeneralBacteriology”，P.Gerhardted.，AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，DC，USA，1981中描述的。本发明的方法提供了生物学上纯的细菌，不含培养基和通常由微生物在生长期间产生的抑制剂，所述培养基在大量施用时有与其相关的副作用，所述抑制剂延缓了细菌的活性和生长的开始。已知的是，在革兰氏阴性细菌，特别是E.coli的细胞内的渗透压在生长的对数期可高达15个大气压，在生长停滞期可达2-3个大气压。在本发明的方法的优选实施方式中，使用具有低渗透压，优选的低于1个大气压，更优选的约0.3到约0.4个大气压的悬浮培养基。在本发明的液体益生组合物的第一个制备阶段期间的渗透压不平衡和高细菌密度，创造了最弱的和最低稳定性的细菌细胞在对数生长期发生自溶作用的条件。这些裂解的细胞提供了悬浮培养基中来自细菌的细胞成分的积累，其提供了余下的细胞的营养需求。使用这种步骤，获得从1011到约1012个细菌每ml(CFU)的细胞浓度，尽管细胞浓度可以任选地处于更广的范围。如实施例1中所示，用于最大细胞稳定性的本发明的悬浮培养基的pH任选的和优选的在约6.0到约7.0的范围内。更优选的，悬浮培养基的pH是约6.5。如实施例2所示，本发明的细菌细胞任选地和优选地保存在约2到约20℃的温度范围内。更优选的，保存温度在约20到约10℃的范围内。最优选的，保存温度在约2到约4℃的范围内。在有利于细胞稳定的条件下(例如，适合的pH值，每ml107-108个细菌的细胞浓度，细菌细胞用于以最小能量消耗和合成性代谢维持它们的结构所用的物质的复合物等等(自溶物))，本发明的液体益生组合物产生了因子的组合，其不仅将细菌保持在存活状态，还保持在立即有活性的生物形式，持续至少12个月。应当注意的是，这个阶段的细菌浓度可以任选的在每ml约106到约1012个细菌的范围。这种物质的复合物优选的包括核酸、核酸成分、细菌脂多糖、肽聚糖、磷脂和许多其他合乎需要的物质。本发明的益生组合物可被用于治疗人类和动物。实施例参考以下的非限制性实施例说明本发明的益生组合物的制剂、制备和使用。实例1液体益生组合物的制备过程首先制备选出的细菌进行生长以形成浓缩形式的生物物质(biomass)，范围1011-1012CFU每ml，在0.3％-0.4％NaCl溶液中，以产生自溶物。为了制备液体益生组合物，将细胞浓缩物在0.6％-0.8％NaCl溶液中稀释到107个细胞/ml的细胞浓度(尽管任选的，所述细菌浓度可以在约106到约1012个细菌每ml的范围内)。将液体益生组合物的pH调整到有利于细胞生存。优选的pH是约6.5直到6.8。为了改善口味，可以添加一种或多种植物提取物、增味剂和/或其他添加剂，其不降低细菌长时间保存的生存力。以下在实施例15中提供了制备植物提取物的示范性方法的说明。液体益生组合物可以保存在冷藏条件下至少12个月而没有显著的生物学性质的损失。实施例2温度在+2～±8℃，细菌E.coliM-17*(CFU/ml)的生存力取决于悬浮培养基的pH值(0.7％的氯化钠溶液和自溶物，一同提供了渗透平衡的溶液)。如上所示，在保存在具有8.5的pH的悬浮培养基中时，活细胞的数量在一个月内大大地降低了。在低于5.5或大于7.5的pH值保存时，在2个月内可见显著的降低。在12个月的末尾，仅在具有6.0到7.0之间的pH值的那些培养基中保留了显著数量的活细胞。实施例3在悬浮液中，根据本发明选择抽样后(1)和从商售冻干的制品中分离的(2)E.coliM-17细菌细胞的生存力，取决于贮存温度。用0.7％氯化钠溶液作为悬浮培养基。悬浮液pH＝6.7。如上所示，在2到10℃之间的温度下经过12个月的保存期在悬浮液中活细菌数量降低的非常少，而在18-20℃保存相同的时期有显著的降低。在25-30℃的温度下，12个月后几乎没有活细胞余下。实施例4将来自冻干的活细菌(商售制品Colibacterin)和来自液体益生组合物(以生物学活性形式存在的细菌)的相同数量的细菌E.coliM-17(每个样品1ml108CFU)导入到营养肉汤样品(200ml)中。在37℃将混合物孵化90分钟。相对于它们最初的生长速率评估细菌性代谢活动的速率被降低的比率，即，它们对新环境介质条件的适应。为了获得这个数值，在将细菌导入营养肉汤后立即测定细菌的数量(C.F.U.每1ml)，随后在孵化过程期间每隔30分钟进行测定。使用取自液体益生组合物的细胞的细菌生长(O)比来自冻干的益生组合物的细胞的细菌生长速率(Δ)显著更快，如附图1所示。实施例5将S.flxneri和S.sonnei的10-20小时培养物在盐水中稀释到105CFU/ml的浓度。然后将这些单独地或与来自冻干的益生菌剂(Colibacterin)或来自液体益生菌剂(Bio-Co)的E.coliM17培养物(在盐水中稀释到1012CFU/ml的浓度)一同接种(1ml)到含有营养肉汤(5ml)的试管中。在37℃将试管孵化24小时。通过在营养琼脂上的平板计数来测定病原体和来自两种益生制品的E.coliM17的集落形成单位(CFU)数。这些数据在下表中示出。来自冻干的益生组合物和来自液体益生组合物的益生生物E.coliMl7对于各种Shigella菌株的对抗活性。实施例6用相同数量的细菌培养物E.coliM17接种培养基(固体和液体)，显示为胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)和胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)。对于TSA和TSB的组成和制备，是本领域公知的，参见例如“CultureMediaforMicrobiology”，FEROSA/Scharlau，1996，通过引用将其合并，如同在此完全阐述了一样。在最适温度(36℃)在有氧条件下将微生物培养24小时(固体培养基)和18小时(液体培养基)。然后通过营养琼脂上的平板计数测定每1ml的细菌浓度。在最佳生长培养基(T.S.A.和T.S.B.)上和根据本发明的生长培养基上非病原E.coli(E.coliM17)的生物量积累之间的对比在下表中说明。在不同培养基上生长的培养物实施例7在+2±4℃下保存样品3天和30天后，对0.4％氯化钠溶液中1011-1012CFU的细菌悬浮液样品进行核酸成分分析。最初，用0.45μ微生物学过滤器过滤样品来获得无细胞滤液。检查滤液中核酸成分(腺嘌呤和尿嘧啶)的存在。根据方法的敏感性，检测极限是2μgr/ml。这些数据在下表中示出。实施例8使用液体培养基产生细菌生物物质对于细菌生物物质制备可以使用标准的通风发酵容器。分两期添加细菌生长所需的营养。在典型的的发酵过程中，培养基可以由10.0g/l的蛋白胨、18.0g/l的酵母提取物、2.5g/l的葡萄糖、3.0g/l的氯化钠和足以提供中性或偏碱性pH(7.2±0.2)的磷酸氢二钠与磷酸二氢钾的组合而组成。在细菌生长过程期间向营养培养基中自动地添加其他营养物。应当随着培养物的生长不断地添加额外的葡萄糖，使得发酵肉汤中的葡萄糖浓度保持在2.5g/l的水平。在整个细菌生长期间进行额外的通风(0.5vvm.)。发酵肉汤的pH值通过不断添4NNH4OH来保持中性。在约32到约36℃的温度下孵化该肉汤直到生长周期到达静止期。16-18小时后，通过离心或超滤收获细胞，直到对于每ml悬浮液107-108个微生物细胞的细胞浓度残余的总氮量不超过0.3％，优选的不超过0.03％的水平，重悬浮在盐水中并重沉淀。在冷却到4-8℃的0.4％-0.6％NaCl溶液中制备1011-1012的细菌悬浮液，保存在冷藏条件下。应当注意的是，这个阶段(和/或用于向受试者施用)的细菌浓度可以任选的在每ml约106到约1012个细菌的范围。实施例9使用固体培养基产生细菌生物物质使用根据本发明的、提供最大细菌生物物质积累的营养物组合物，在固体培养基上生长非病原E.coli。所述培养基的成分如下配方(g/l)大豆蛋白胨10.0酵母提取物18.0葡萄糖2.5氯化钠4.0琼脂12.0最终pH7.0(约0.2)将制备的培养基注入相应的模具中，层厚5-7毫米。冷却后，用细菌培养物E.coliM-17接种该培养基。将模具置于孵化器中，在有氧条件下在最适温度(34-38℃)孵化约24-28小时。这个步骤产生了1010-1011个细胞/ml的培养基。在这期间，通过“干法”从平板上除下分离的纯培养物，其中，用工具，例如刮铲除去细菌，而不向平板上引入液体(或至少显著量的液体)。为此目的已经使用了对生物物质收集的专门调整。在0.4％-0.6％NaCl溶液中制备1011-1012CFU的细菌悬浮液。将悬浮液保存在冷藏条件下。实施例10-腹泻的治疗显示了取决于每天向病人施用的益生细菌数量，消除由Salmonella和病原不明的食物中毒引起的急性腹泻(包括旅行者腹泻)的发作的效果(依赖于剂量的效力)。用不同的治疗有效量的本发明液体益生组合物治疗了总共64位病人。这些数量在每天100-2000亿活细菌的范围内，被分成4-6剂。第一组病人的处方是每天含1千万细菌的治疗有效量的本发明的液体益生组合物。这些病人的85％在3天后急性腹泻的症状仍然存在。从第4天开始，这些病人的处方是每天2000亿细菌的治疗活性数量。在施用这个剂量的第一天内，94％的病人腹泻消失了或排便次数显著地下降。第二组病人从观察的第一天开始施用含2000亿活细菌的治疗有效量的本发明的液体益生组合物。甚至在施用所述液体益生组合物的第一天内就注意到了明显的效果(腹泻的消失或排便次数方面的显著下降)，主要是在第一个12-14小时期间。实施例11在用抗螺旋菌疗法治疗的病人中液体益生组合物对肠内微生物区系变化的特性的影响。用抗螺旋菌疗法治疗的104位病人的组被随机分为两个亚组。除了包括抗生素治疗的标准疗法之外，第二组的病人被施用了本发明的液体益生组合物。在25天治疗之后，在所有病人中测定被认为是健康微生物区系(需氧的和厌氧的)的主要代表的细菌的数量组成。结果在下表中示出。在肠中类型M17的非病原E.coli作为需氧微生物区系的主要代表。在施用本发明的液体益生组合物时，肠中的E.coli总数被标准化，它们的质量被改善了(即，乳糖阳性细菌的水平被提高，乳糖阴性细菌和低发酵活力的E.coli的水平被降低)。此外，双歧杆菌的数量提高了，双歧杆菌是健康的厌氧肠微生物区系的最重要的代表。实施例12益生组合物的制备-示范性的方法根据本发明的组合物可以任选的根据以下示范性的方法制备。益生E.coli(108-109个细胞)，任选的来自种子储备，使用标准的微生物发酵技术接种到液体或固体培养基成分中。生长条件优选的包括连续的通风、维持中性的pH和补充葡萄糖。这种生物优选的没有进行任何的遗传工程，而是从正常人胃肠道获得的微生物区系中分离的。制造任选的和优选的根据以下关键控制点进行控制●采取预防措施来接收和处理培养物●控制过程以确保适当的培养物状况●无菌性的维持●控制过程以确保最终产品中益生菌的正确水平任选的和优选的，种子储备本身可以如下制备。从-80℃的保存处移出一瓶冷冻的E.coliM-17菌株，在室温下解冻，然后无菌地转移到含有灭菌的胰蛋白酶大豆肉汤(Difco)的无菌有挡板的摇瓶中。生长15-20小时之后，显微检查该培养物，在BactomEndoAgarLES平板上划线来检查纯度。反应器制备在有培养基的情况下将每个反应器分批和灭菌。分别地将葡萄糖灭菌，在培养物接种前添加到2.5g/L的浓度。反应器接种将种子培养物无菌地转移到生物反应器，在设定的温度条件、pH、搅动和溶解氧下使培养物生长。孵化后四小时开始3.5到3.9g/L的葡萄糖供给。生长18-22小时之后，显微检查该培养物，在BactomEndoAgarLES平板上划线来检查纯度。然后将反应器冷却到＜10℃用于收获。微滤通过使用0.2μm孔径大小的切向流动微量过滤单元浓缩收获生物反应器内容物。用5倍体积的无菌盐水穿滤(diafilter)浓缩物，然后放入无菌瓶子中在4-6℃下保存。显微检查样品，在BactomEndoAgarLES平板上划线来检查纯度，通过平板接种到胰蛋白酶大豆琼脂平板上来计数。实施例13使用E.coli治疗IBD相关的腹泻研究了一名23岁的男性，其患伴有腹泻发作的肠蠕动缓慢(loosebowelmovements)两年，没有直肠流血或体重减轻。他的家族史对于肠疾病是不值得注意的。对该病人的实验室测试显示了血红蛋白＝17.6(吸烟者)，ESR＝10，血小板＝219，白蛋白＝4.1，组织转谷氨酰胺酶TTG＝29.8(正常＜20)此外，通过阳性H2呼吸测试发现病人具有乳糖不耐受性。然而，无乳制品的膳食没能改善他的状况。该病人的升高TTG值暗示了腹腔疾病的诊断结论。上部GI内窥镜检查显示了正常表观的小肠。十二指肠第二部分的随机活组织检查证明了正常小肠粘膜的存在。进行胶囊内窥镜检查研究，显示了近端小肠中的炎性变化，包括少许糜烂、粘膜出血、水肿和绒毛损失。用如实施例12的描述制备的益生组合物治疗病人，饭前约半小时每天两次一汤匙的服法。2周后病人的状况没有改善。继续进行病人的益生治疗，而将日剂量提高到每天四汤匙。随着这种治疗，病人报告了显著的改善，是两年来的首次。对小肠的第二次胶囊内窥镜检查表明了近端小肠的炎性过程的改善。实施例14用液体益生组合物治疗的方法如上所述，已经证明本发明的液体益生组合物能有效的治疗胃肠的疾病和状况，包括但不限于，微生物感染、IBS和IBD。以下实施例仅是治疗这种胃肠疾病或失调(或需要治疗的状况)、和其他任何适合于本发明的液体益生组合物的状况的方法的说明，并不意味着受到限制。该方法包括向待治疗的受试者施用液体益生培养基。根据有效的剂量给药方法学，按药学上有效量施用所述液体益生组合物，优选的直到达到预定的终点(endpoint)，例如胃肠疾病、失调或状况，和受试者中任何其他适合的状况的症状的消失，或在受试者中预防这种疾病、失调、状况或症状的出现。实施例15植物提取物的制备可以从任何适合的水果、蔬菜、植物的叶、茎或根，或从草本植物制备生物学活性的可食用提取物。植物可以是甘蓝、蒜、欧芹、莳萝、柠檬等，或草本植物例如薄荷等等。植物提取物可以任选的通过提供最多40℃的沸点温度减压蒸馏来制备。对于植物提取物的制备，可以使用市场上已有的设备，例如“Rotovapor”装置。制备用于添加到本发明的组合物的植物提取物的过程优选的包括1.研磨植物或植物部分来得到植物生物物质。需要强调的是，对于植物提取物的生产，使用新鲜制备的生物物质。优选的在室温下保存不超过1-2小时，因为在压碎水果、蔬菜或其他植物之后，微生物开始生物量上的发展，发生不受控制的发酵和其他反应。这显著地降低了获得的提取物的品质。在必需延长保存的情况下，研磨的植物物质应当保存在冷柜中不超过12小时。2.在减压情况下蒸汽蒸馏所述植物生物物质。3.收集从所述蒸汽蒸馏获得的挥发性馏分。可以用水进一步稀释这个馏分。该植物提取物可以任选地保存在冷藏条件下12个月而不失去其能力。这个馏分本身构成了食物/饲料添加剂，也可任选的通过混合多于一种的植物提取物来制备。尽管已经结合其具体实施方式描述了本发明，很明显的是，多种替换、修改和变体对于本领域技术人员是显而易见的。因此，意图包括所有落在附加的权利要求的精神和宽广范围内的这种替换、修改和变体。权利要求1.一种液体益生组合物，包括至少具有基本生物学活性的细菌和液体培养基，其中所述细菌已经根据至少一种选择压力进行了选择，和其中所述组合物基本上不含非适合物质。2.权利要求1的组合物，其中所述细菌包括至少一种E.coli菌株。3.权利要求2的组合物，其中所述细菌包括具有对抗性质的非病原乳糖阳性菌株。4.权利要求2的组合物，其中所述细菌包含多种Escherichiacoli菌株，或至少一种E.coli菌株和至少一种其他的细菌菌株。5.权利要求1的组合物，其中所述选择压力包括温度压力。6.权利要求5的组合物，其中所述温度压力包括升高含有所述细菌的培养基的温度。7.权利要求6的组合物，其中所述温度压力包括使所述细菌经历约36到约50℃的温度，其中所述细菌是悬浮的。8.权利要求7的组合物，其中使所述细菌经历约40℃的所述温度至少4天。9.权利要求5的组合物，其中所述温度压力包括降低含有所述细菌的培养基的温度。10.权利要求9的组合物，其中所述降低包括将所述温度降低到约1℃至约12℃至多12个月。11.权利要求10的组合物，其中降低所述温度至少约3个月。12.权利要求1的组合物，其中所述选择压力包括保存的时间，其中所述细菌被保存至少约一个月。13.权利要求12的组合物，其中所述细菌被保存至多约12个月。14.权利要求1的组合物，其中所述选择压力包括渗透压。15.权利要求14的组合物，其中所述选择压力包括低渗透压。16.权利要求15的组合物，其中所述渗透压包括低于约1个大气压的压力。17.权利要求16的组合物，其中所述渗透压包括约0.3到约0.4个大气压的压力。18.权利要求1的组合物，其中所述液体培养基包含水、自溶物和等渗数量的盐，特征是氮源以低于约0.3％的水平存在，任选的低于约0.03％。19.权利要求7的组合物，进一步的包含用于维持细菌基本上不生长或分裂的多种物质。20.权利要求1的组合物，包括每ml所述液体约107到约108集落形成单位的所述细菌。21.权利要求1的组合物，进一步的包含至少一种增味剂或来自植物的提取物。22.权利要求1的组合物，包含约6.0到约7.0的pH值。23.权利要求14的组合物，其中所述pH值是约6.5。24.权利要求1的组合物，包括一定剂型的该组合物，该剂型适合于每次施用约106到约1012个活细菌的施用。25.权利要求24的组合物，包括一定剂型的该组合物，该剂型适合于每天施用约1到约4次的施用。26.权利要求1的组合物，其中在与所述液体培养基结合之前使所述细菌经历自溶作用。27.权利要求26的组合物，其中所述自溶作用通过一定机制诱导，所述机制选自由机械搅拌、低渗透压和改变悬浮液中所述细菌的密度所构成的组。28.权利要求27的组合物，其中所述密度是每ml约1011到约1012个细菌。29.权利要求26的组合物，其中所述液体培养基包含由所述自溶作用形成的自溶物。30.一种制备液体益生组合物的方法，包括在生长培养基中使多数细菌生长以形成生物物质；根据选择压力选择细菌；和将所述至少具有基本生物学活性的细菌保存一段时间。31.权利要求30的方法，其中所述选择压力包括温度压力。32.权利要求31的方法，其中所述温度压力包括使所述细菌经历约36到约50℃的温度，其中所述组合物是悬浮的。33.权利要求32的方法，其中使所述细菌经历约40℃的所述温度至少4天。34.权利要求31的方法，其中所述温度压力包括降低含有所述细菌的培养基的温度。35.权利要求34的方法，其中所述降低包括将所述温度降低到约1℃至约12℃至多12个月。36.权利要求35的方法，其中降低所述温度至少约3个月。37.权利要求30的方法，其中所述选择压力包括保存的时间，其中所述细菌被保存至少约一个月。38.权利要求37的方法，其中所述细菌被保存至多约12个月。39.权利要求30的方法，其中所述选择压力包括渗透压。40.权利要求39的方法，其中所述选择压力包括低渗透压。41.权利要求40的方法，其中所述渗透压力包括低于约1个大气压的压力。42.权利要求41的方法，其中所述渗透压力包括约0.3到约0.4个大气压的压力。43.权利要求30的方法，进一步包括将所述生长培养基和抑制物因子与所述生物物质分离开；和使所述细菌经历自溶作用。44.权利要求43的方法，其中所述自溶作用通过一定机制诱导，所述机制选自由机械搅拌、渗透压改变、低渗透压和改变悬浮液中所述细菌的密度所构成的组。45.权利要求44的方法，其中所述密度是每ml约1011到约1012个细菌。46.权利要求45的方法，进一步包括用液体培养基保存所述细菌，其中所述液体培养基包含从所述自溶作用形成的自溶物。47.权利要求46的方法，其中所述保存包括调整所述液体培养基中所述细菌的浓度到约105至约1012CFU。48.权利要求47的方法，其中所述浓度是约107到约108CFU。49.权利要求30的方法，其中所述生长培养基包括固体或液体生长培养基。50.权利要求30的方法，其中所述生长培养基包含酵母提取物。51.权利要求50的方法，其中所述酵母提取物以约5到约25克每升的数量存在。52.权利要求51的方法，其中所述酵母提取物以约15到约20克每升的数量存在。53.权利要求30的方法，进一步包括通过研磨植物材料和蒸汽蒸馏所述研磨的材料制备植物提取物；和将所述植物提取物添加到所述组合物中。54.权利要求53的方法，其中所述蒸汽蒸馏在减压情况下进行。55.一种治疗受试者的方法，包括向需要治疗的所述受试者施用一种液体益生组合物，所述液体益生组合物包含至少具有基本生物学活性的细菌，其中所述细菌已经根据至少一种选择压力进行了选择。56.权利要求55的方法，用于治疗胃肠的疾病或失调。57.权利要求56的方法，其中所述胃肠疾病或失调包括微生物感染。58.权利要求56的方法，其中所述胃肠疾病或失调包括炎症性肠病。59.权利要求58的方法，其中所述炎症性肠病选自由克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、不确定性结肠炎、显微结肠炎、胶原结肠炎、小肠的突发性的炎症和与炎症性肠病有关的腹泻构成的组。60.权利要求56的方法，其中所述胃肠疾病或失调包括由肠病原体引起的胃肠感染，所述肠病原体选自由Salmonella、Shigella、产肠毒素E.coli和C.difficile构成的组。61.权利要求56的方法，其中所述胃肠疾病或失调包括食物中毒、消化不良症状或急性腹泻的发作，或由未被检出的病原体或未知的病因引起的腹泻。62.权利要求61的方法，其中所述腹泻包括旅行者腹泻和医院环境中的腹泻。63.权利要求55的方法，包括治疗消化道的疾病和失调，所述疾病和失调由肠内微生物区系的微生物平衡的紊乱，和/或由小肠中细菌的过度生长导致或维持。64.权利要求55的方法，包括预防或降低消化道微生物区系的微生物平衡紊乱的水平，所述紊乱由抗生素治疗、放疗或化疗、消化道的疾病或失调，包括消化道手术所引起。65.权利要求55的方法，包括预防或治疗消化道微生物区系的微生物平衡方面的紊乱，所述紊乱由消化道外的疾病、某些饮食和环境因素引起。66.权利要求55的方法，包括改善或正常化老年人和受危害病人的胃肠道的生理活动。67.权利要求55的方法，其中所述组合物任选的包含每ml约106到1012集落形成单位之间的所述细菌，优选的包含每ml约107到108集落形成单位之间的所述细菌。68.权利要求67的方法，其中每天向所述受试者施用约106到约1012个所述细菌。69.权利要求68的方法，其中每天向所述受试者施用约107到约109个所述细菌。70.权利要求69的方法，其中每天向所述受试者施用约107到约108个所述细菌。71.权利要求55的方法，其中所述组合物包含在等渗培养基中的自溶物。72.权利要求55的方法，其中所述组合物基本上不含非适合物质。73.权利要求55的方法，用于改善或正常化受试者的免疫系统，所述受试者患有免疫系统失调，包括作为由治疗其他疾病引起的副作用的失调。74.权利要求55的方法，用于治疗家养动物。全文摘要一种制备液体益生组合物的方法，所述液体益生组合物包含至少具有基本生物活性的细菌，其中所述细菌已经根据至少一种选择压力进行了选择，其中所述组合物优选的包括自溶物(用于维持细菌的完整物质)和其中所述组合物基本上不含适合于细菌生长、但不类似地适合于哺乳动物、特别地不适合于人类的物质。蛋白胨和缓冲盐，特别是磷酸盐，在小剂量可能不是有害的，但它们特别地不适合于人类，在由细菌产生的物质中不含这些物质。文档编号A61K45/00GK1867258SQ200480030642公开日2006年11月22日申请日期2004年8月16日优先权日2003年8月18日发明者N·克纳帕达卡申请人:生物平衡公司