专利名称：Hiv－1病毒样颗粒及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种HIV-1病毒样颗粒及其制备方法与用途，本发明还涉及一种稳定表达人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白的细胞系，其构建方法及用途。该细胞系可持续表达分泌经过人工修饰的gag、pol和env核苷酸序列的病毒样颗粒，可用作HIV-1病毒样颗粒疫苗的基质细胞。
背景技术：
艾滋病被认为是世界上直接威胁人类健康的第一大传染病，世界卫生组织(WHO)和联合国艾滋病规划署(UNAIDS)在2004年11月23日公布的《2004年全球艾滋病流行报告》指出，目前全世界艾滋病感染者人数已经突破3900万，今年新增感染者490万，另有300多万患者在今年死亡。
我国艾滋病流行情况也不容乐观，目前中国的艾滋病病毒感染者每年以40％的速度递增，艾滋病的流行趋势处于世界第14位，在亚洲排名第二位。自1985年中国首次发现首例艾滋病病例后，截至今年四月，全国已有艾滋病病毒感染者84万，患者8万人，估计已死亡的艾滋病患者约达16万左右。(国务院防治艾滋病工作委员会《2004年中国艾滋病防治联合评估报告》)虽然近几年抗艾滋病药物的“鸡尾酒”疗法在发达国家有效地控制了HIV的蔓延，但是昂贵的价格(在我国该药物价格大约为3000-10000元人民币/人/月)，耐药病毒株的产生，长期用药的副作用以及最终无法彻底清除患者体内病毒等方面的不利因素显示，只有艾滋病疫苗才能真正有效地预防和控制艾滋病。所以艾滋病疫苗研制势在必行。
用HIV-1疫苗防治AIDS的方法被国际上认为是目前最行之有效的，已成为世界上许多科研机构研究的热点。自八十年代发现艾滋病以来，人们就开始进行艾滋病疫苗的研究。目前，尚无一种艾滋病疫苗被批准上市。传统疫苗可分为三类减毒活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗。一般来说，减毒活疫苗和灭活疫苗能产生较好免疫保护性反应，但安全性较差，不适用于作为艾滋病疫苗。亚单位疫苗安全性虽然较好，但用这一方案难以诱导出对艾滋病毒有效的免疫保护反应。随着人类对艾滋病认识的不断提高，越来越多的证据显示阳性CD8介导的CTL在控制艾滋病毒感染中起举足轻重的作用，CTL能特异地杀死病毒感染的细胞还能妨碍病毒在外周血淋巴细胞的复制，所以有效地诱导针对Gag等较保守区域的CTL是设计有效的艾滋病疫苗的重要手段。另一方面，诱导产生有效的中和抗体是一个疫苗成功与否的重要指标，也是十几年来艾滋病疫苗研究的主攻方向之一，这是因为中和抗体的产生在阻止病毒感染过程中起着关键的作用，中和抗体可以清除感染者细胞外游离的病毒。动物模型的试验数据表明，中和抗体在阻止病毒感染中起着重要作用，在小鼠模型中，中和抗体能防止小鼠被HIV-1感染，针对HIV-1env的抗体能够对原代的病毒有中和作用，这种中和作用在不同亚型间也可以实现。在灵长类动物中，用人的单克隆抗体被动免疫可以保护动物不被感染。目前已有三种HIV-1的中和性单克隆抗体进入I期临床。现在HIV-1疫苗研究方向是能够诱导有效的CTL，CTL虽可以在慢性感染时控制病毒血症，但并不能阻止病毒感染，另外病毒逃逸突变也使CTL的作用降低。用SHIV89.6p感染动物，当细胞质中病毒RNA迅速上升，细胞中病毒载量很低，CD4T细胞数量仍维持一定时，仍有很高的中和性抗体出现，这提示我们在缺乏细胞免疫时，抗体可以作为控制血液中HIV-1病毒载量一道重要防线。但直至今日尚无办法诱导出有效的中和抗体，而病毒样颗粒(virus-like particles，VLP)可能是唯一诱导中和抗体的方法。
VLP疫苗正逐渐成为越来越被看好的HIV-1候选疫苗。这是一类HIV-1核心蛋白gag为基础的复合疫苗。这类疫苗含有与天然病毒相同的抗原但无病毒核酸，免疫原性强又没有感染性。它还可以任意改造，所以能更好的刺激机体产生保护性免疫反应。又由于其本身抗原性极强，所以接种剂量可以很小，十分经济。另外，VLP疫苗在动物实验中已证实可诱生很强的CTL及抗体反应，还有证据表明VLP可以不受免疫途径的限制，经不同途径免疫均可获得较强的免疫效果。因此，VLP疫苗以其安全性高、抗原性强、接种剂量小，应用广泛等优势为艾滋病疫苗的研制开辟了一个新的途径，可望成为新一代HIV-1疫苗。
以往的研究中有过许多关于HIV-1病毒样颗粒疫苗的报道，人们用不同的表达系统形成了VLP，Malcolm Haddick用pBCCX-CSF质粒产生除了HIV-1Nef基因的VLP，用COS细胞表达，产生与成熟病毒结构相似的颗粒，但在3天后表达量迅速下降；C.JANE PALE构建了HPV和SHIV(SIV gag27，HIV Tat Rev)嵌合的VLP，通过全身及黏膜免疫动物，虽然产生抗体和T细胞免疫反应，但免疫反应低；Shiwen Peng等构建HPV和HIV gp160或gp120嵌合病毒表达VLP，免疫动物后能够产生针对HPV的抗体，而产生HIV的抗体相对较少；其它病毒表达系统还有减毒痘苗病毒，canarypox，COXACKIE，FOWLPOX，VSV等，但其安全性和有效性仍然值得考虑，这些系统也难以连续产生VLP，另外必须先用DNA疫苗进行初次免疫才能获得高滴度抗体；因此，如何克服上述困难，建立一个安全有效且能持久产生VLP的系统是HIV-1VLP疫苗研究者正面临和祈待解决的关键问题。
发明内容
本发明提供一种HIV-1病毒样颗粒及其制备方法，作为治疗艾滋病的病毒样颗粒(VLP)疫苗，该VLP疫苗是表达人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白的病毒样颗粒。所述病毒样颗粒是由一种可稳定表达HIV-1主要结构蛋白的细胞系所分泌的，该细胞系可用作生产HIV-1疫苗的细胞基质，其所分泌的HIV-1VLP可以作为治疗艾滋病的VLP疫苗。本发明的一个重要方面，该细胞系所分泌的VLP表达人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的结构蛋白。进一步包括人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的完整核心蛋白gag、编码酶类蛋白pol和外膜蛋白env。其中编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白gag、pol和env的核苷酸序列来源于经过人工修饰的编码野生型中国流行株人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重组型的结构蛋白的核苷酸序列。本发明的另一重要方面所构建的稳定细胞系所采用的方法为共转染，所选用的真核细胞表达质粒为真核细胞表达质粒，与之共转染的载体为pcDNA3.1，以真核细胞抗性基因为抗性筛选标记，进一步包括新霉素抗性基因(neomycin)嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)，筛选出了稳定表达HIV-1主要结构蛋白gag、pol和env的细胞系，进一步包括293细胞系、vero细胞系和BHK细胞系。该VLP所用纯化方法为蔗糖密度梯度离心。
HIV-1病毒样颗粒的制备方法，包括下列步骤a)、选择质粒与抗性筛选标记所选用的质粒为真核细胞表达质粒，该质粒能在人细胞中高效表达人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的主要结构蛋白gag、pol和env，与之共转染的载体为pcDNA3.1，以真核细胞抗性基因作为抗性筛选标记；b)、筛选出高效、稳定表达HIV-1主要结构蛋白gag、pol和env的细胞系，该细胞系所表达的蛋白自我组装成了含有人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的完整核心蛋白gag、编码酶类蛋白pol和外膜蛋白env的病毒样颗粒(VLP)；c)、纯化该VLP。
其中b)步骤具体包括下列步骤I)共转染将目的基因质粒与真核细胞表达载体pcDNA3.1以脂质体(lipofectmine2000)为介质共同转染人类细胞，转染摩尔比为目的基因质粒∶pcDNA3.1＝3∶1。
II)单克隆细胞的筛选 所用筛选药物为针对真核细胞抗性基因的筛选药物。
III)确定表达最强的细胞克隆 挑选生长状态良好的细胞克隆并继续在抗性培养基中将之扩大培养，分别收获并检测各细胞克隆的表达情况，确定最强的细胞克隆。
此外，本发明还提供了免疫接种受试者治疗艾滋病感染的组合物，其中包括表达人类免疫缺陷病毒-1主要结构蛋白的病毒样颗粒和可药用的载体或稀释剂，该组合物中可药用的载体或稀释剂可以为生理盐水、缓冲盐水等。
该疫苗组合物可以包括可以增强免疫反应的佐剂，例如氢氧化铝、氟氏佐剂等。还可以包括细胞因子如IL-2、IL-12、GM-CSF、TNF、IFN等。
本发明的优点及有益效果(1)编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白gag、pol和env的核苷酸序列来源于经过人工修饰的编码野生型中国流行株人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重组型的结构蛋白的核苷酸序列。
(2)目前人们构建的VLP表达系统多为瞬时表达，存在不能连续产生VLP这一缺点，我们通过共转染及单克隆细胞筛选的方法建立了稳定表达的细胞系。该细胞系可稳定持续的分泌HIV-1病毒样颗粒。
(3)该病毒样颗粒不含病毒核酸，具有很好的安全性。
(4)所构建的VLP在组装形式上更趋合理，与天然病毒结构更为相似，不仅包括主要的结构蛋白gag、pol和env，而且使中和抗体的主要决定簇env暴露于颗粒的表面从而大大地提高了中和抗体产生的可能性。又由于其可能具有极强的免疫原性，故还有望打破HIV-1感染者及病人的免疫耐受，成为HIV-1治疗性疫苗。
图1显示为D-GPEi质粒与pcDNA3.1的图谱。
图2显示共转染并加入G418抗性培养基后，选取生长状态良好的单克隆细胞裂解并以免疫印迹检测各个细胞克隆蛋白表达情况1JurkatB2neo细胞；2293空白细胞；3-9细胞克隆1-7。
图3显示10-40％蔗糖垫中蛋白不同分布情况比较。收获阳性细胞克隆上清液，置于10-40％蔗糖垫上，2,6000rpm超速离心4小时，收获各层蔗糖用TCA(三氯乙酸)法沉淀蛋白免疫印迹检测。1Marker；2蔗糖垫底部沉淀；340％蔗糖垫中蛋白；430％蔗糖垫中蛋白；520％蔗糖垫中蛋白；610％蔗糖垫中蛋白；7上清中蛋白。
图4显示细胞培养经30％蔗糖密度离心后(26000rpm/min，1.5h，4℃)，收取沉淀，2×蛋白上样缓冲液溶解后进行Western-blot检测。
1293阴性细胞上清；2阳性克隆细胞上清。
图5显示阳性细胞克隆及提纯后VLP分别以抗-env抗体和抗-P24抗体为一抗作用，免疫印迹验证表达情况.1空白293细胞上清；2阳性293细胞裂解物；3提纯后VLP；4表达HIV-1gagpol的293细胞裂解物；5空白293细胞裂解物。
图6显示阳性克隆确定之日起1至12月的细胞表达情况。1筛选后2个月细胞；2筛选后4个月细胞；3筛选后6个月细胞；4筛选后8个月细胞；5筛选后10个月细胞；6筛选后12个月细胞图7显示细胞及纯化后HIV-1VLP透射电镜照片。
图8显示免疫后小鼠血清双抗原夹心ELISA检测抗P-24抗体产生情况(P24蛋白包被酶标板，血清稀释倍数为1∶256)。
图9显示免疫后小鼠血清双抗原夹心ELISA试剂盒检测抗-env抗体产生情况(包被抗原为gp41和gp36，稀释倍数为1∶2)。
图10显示最后一针免疫5天后取小鼠脾淋巴细胞进行CTL检测。以与P7G共孵育的P815作为靶细胞，脾淋巴细胞作为效应细胞；未加P7G的P815细胞作对照组。按一定比例稀释效应细胞测定靶细胞被特异性裂解的比例。
图11显示最后一针免疫5天后取小鼠脾淋巴细胞进行ELISPOT检测。淋巴细胞为靶细胞，加入Balb/C小鼠MHC-I类分子特异性的短肽P7G刺激剂的作实验组，未加P7G刺激作对照组。图A为ELISPOT实验结果扫描，图B为根据A图结果所作效应细胞为1X106时柱形图(空白组与10微克免疫组)。
图12显示最后一针免疫5天后取鼠脾淋巴细胞，P24刺激后细胞特异性增殖结果。
具体实施例方式
实施例1.选择质粒与抗性筛选标记D-GPEi质粒我们选择了真核细胞表达质粒D-GPEi，该质粒由本实验室构建，将中国流行株(区域性)HIV-1的主要结构蛋白基因Gag、Pol和Env克隆到自行开发构建的新一代表达载体pVR载体上(具体构建方法见专利公开号CN1631441A)。该载体由CMV启动子，卡那霉素抗性基因，原核细胞高拷贝因子，内含子A等常规部件组成，符合美国FDA有关人体临床试验的安全标准，并具有稳定和高效表达外源基因等特点。所构建的质粒所含有的抗原基因是经过修饰的HIV-1中国流行株的GagPol和Env，基因表达产物与原基因相同，但消除了原基因序列中存在的大量表达抑制因子，大大提高了基因的表达效率。该DNA质粒转录2个RNA产物用于表达HIV-1的结构蛋白Gag，Pol和Env。D-GPEi质粒已证实能在人细胞中高效表达HIV-1核心结构蛋白Gag、酶蛋白Pol和外壳蛋白Env，全长13Kb。并经动物实验证明具有可靠的安全性和良好的免疫原性，现已作为DNA疫苗进入I期临床实验阶段。
pcDNA3.1pcDNA3.1来源于pcDNA3，为在哺乳动物宿主中高水平的稳定及瞬时表达而设计。此载体上带有用新霉素筛选稳定细胞系的neomycin抗性基因。表达该抗性基因的细胞能在G418抗性的培养基中生存，反之则会在筛选过程中死去。我们将带有目的基因的质粒与pcDNA3.1共同转染真核细胞，这样宿主细胞在整合抗性基因的同时也整合我们的目的基因，从而使我们的目的基因能在哺乳动物细胞中稳定的表达。(D-GPEi质粒与pcDNA3.1的图谱见图1)。
实施例2. 293稳定细胞系的构建1.材料、试剂及仪器
25cm2细胞培养瓶、六孔板、96孔板、CO2培养箱(Thermoforma)、293细胞、质粒D-GPEi(本实验室构建)、载体pcDNA3.1(购自invitrogen)、lipofectmine2000(购自invitrogen公司)、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(Bio-Rad)、G418(购自鼎国，gemview分装)；HIV阳性血清(采自广西阳性病人)；HRP-IgG(Jackson ImmunoResearchlaboratories，INC)。
细胞裂解液DTT 0.617g，SDS 0.8g，1M Tris-HCl pH6.83.2ml，甘油4ml，溴芬兰10.08g，水12.8ml；5xTris-甘氨酸电泳缓冲液15.1g Tris碱，44g甘氨酸，5g SDS，加水至1000ml；转移缓冲液在800ml水中溶解2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS、200ml甲醇，定容至1000ml。
2.方法步骤2.1.共转染为了获得稳定表达HIV-1结构蛋白gag，pol和env的293细胞系，我们将目的基因质粒D-GPEi与真核细胞表达载体pcDNA3.1以脂质体(lipofectmine2000)为介质共同转染293细胞。转染摩尔比D-GPEipcDNA3.1为3∶1。具体操作步骤如下①于25cm2细胞培养瓶加入2.0×106个细胞(293细胞株)，5ml细胞培养液(DMEM，10％小牛血清)，置于37℃5％CO2培养箱孵育24小时至70-80％单层；②D-GPEi质粒与pcDNA3.1质粒共8ug按3∶1摩尔比以500ul无抗性培养基稀释；③lipofectmine2000 20ul溶于500ul无抗性培养基混匀，室温作用5分钟；④将上述两种溶液混匀，室温作用20分钟；⑤将④加入293细胞培养瓶，轻轻混匀；置于37℃5％CO2培养箱孵育，48小时后检测瞬时表达情况。
2.2单克隆细胞的筛选转染48小时后收获部分细胞以1500转/分钟离心后加入细胞裂解液，取裂解液上清进行免疫印迹检测，转染细胞瞬时表达为阳性，同时进行细胞计数并用含有浓度为1mg/ml的G418抗性的培养基按有限稀释法稀释并回贴细胞。细胞在含有浓度为1mg/ml的G418抗性的培养基培养15-20天后，非G418抗性的细胞已陆续死亡，而具有G418抗性的细胞则重新贴壁生长，并有单个的细胞克隆长出。我们从生长状态良好的细胞克隆中挑出7个，用胰蛋白酶扣取消化单克隆细胞并继续在1mg/mlG418的抗性培养基中将之扩大培养，分别收获各个单克隆的部分细胞(各个克隆收获细胞数相同)，细胞裂解液上清经免疫印迹检测细胞的蛋白表达情况。
3.结果成功筛选到高效稳定表达HIV-1主要结构蛋白Gag、GagPol和Env的细胞克隆。筛选的各个细胞克隆的表达情况如图2所示，所用一抗为中国广西HIV-1阳性病人血清。图2中lanel为JurkatB2Neo细胞是已确定表达了gp160，gp120，pr55，gp41，p24的阳性细胞对照。从图中我们可以看出克隆5无目的蛋白表达；克隆1与克隆6只表达了pr55；克隆3只表达了gp160，gp120，且表达较弱；克隆2、4、7虽然都正确表达了pr55，gp120，gp160，gagpol160，但克隆4和克隆7所表达的gp160，gp120较弱，而克隆2的蛋白pr55，gp120，gp160，gagpol160表达最强。这种情况的产生是因为我们的目的基因与筛选标记并未在同一个表达载体上，所以存活下来的G418抗性细胞有的可能仅整合了pcDNA3.1的基因，而没有我们的目的基因所以没有目的蛋白的表达；又由于整合能力的不同，有的细胞虽然整合了我们的目的基因但却有可能存在某个基因的缺失或者表达的情况较弱。所以我们从中挑出克隆2并将克隆2的细胞进一步扩大培养并检测其上清中VLP的分泌情况。
实施例3.Vero稳定细胞系的构建
1.材料、试剂及仪器25cm2细胞培养瓶、六孔板、96孔板、CO2培养箱(Thermoforma)、Vero细胞、质粒D-GPEi(本实验室构建)、载体pcDNA3.1(购自invitrogen)、lipofectmine2000(购自invitrogen公司)、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(Bio-Rad)、G418(购自鼎国，gemview分装)HIV阳性血清(采自广西阳性病人)；抗人IgG(Jackson ImmunoResearchlaboratories，INC)。
细胞裂解液DTT0.617g，SDS0.8g，1M tris-HCl pH6.83.2ml，甘油4ml，bromphenol0.08g，H2O12.8ml；5xTris-甘氨酸电泳缓冲液15.1g Tris碱，44g甘氨酸，5g SDS，加水至1000ml；转移缓冲液在800ml水中溶解2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS、200ml甲醇，定容至1000ml。
2.方法步骤2.1.共转染为了获得稳定表达HIV-1结构蛋白Gag，GagPol和Env的Vero细胞系，我们将目的基因质粒D-GPEi与真核细胞表达载体pcDNA3.1以脂质体(lipofectmine2000)为介质共同转染Vero细胞。转染摩尔比D-GPEi∶pcDNA3.1为3∶1。具体操作步骤如下①于25cm2细胞培养瓶加入2.0×106个细胞(Vero细胞株)，5ml细胞培养液(DMEM，10％小牛血清)，置于37℃5％CO2培养箱孵育24小时至70-80％单层；②D-GPEi质粒与pcDNA3.1质粒共8ug按3∶1摩尔比以500ul无抗性培养基稀释；③lipofectmine2000 20ul溶于500ul无抗性培养基混匀，室温作用5分钟；④将上述两种溶液混匀，室温作用20分钟；⑤将④加入细胞培养瓶，轻轻混匀；置于37℃5％CO2培养箱孵育，48小时后检测瞬时表达情况。
2.2单克隆细胞的筛选转染48小时后收获部分细胞以1500转/分钟离心后加入细胞裂解液，取裂解液上清进行免疫印迹检测，转染细胞瞬时表达为阳性，同时进行细胞计数并用含有浓度为1mg/ml的G418抗性的培养基按有限稀释法稀释并回贴细胞。细胞在含有浓度为1mg/ml的G418抗性的培养基培养15-20天后，非G418抗性的细胞已陆续死亡，而具有G418抗性的细胞则重新贴壁生长，并有单个的细胞克隆长出。我们从生长状态良好的细胞克隆中挑出7个，用胰蛋白酶扣取消化单克隆细胞并继续在1mg/mlG418的抗性培养基中将之扩大培养，分别收获各个单克隆的部分细胞(各个克隆收获细胞数相同)，细胞裂解液上清经免疫印迹检测细胞的蛋白表达情况。
实施例4.BHK稳定细胞系的构建1.材料、试剂及仪器25cm2细胞培养瓶、六孔板、96孔板、CO2培养箱(Thermoforma)、BHK细胞、质粒D-GPEi(本实验室构建)、载体pcDNA3.1(购自invitrogen)、lipofectmine2000(购自invitrogen公司)、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(Bio-Rad)、G418(购自鼎国，gemview分装)；HIV阳性血清(采自广西阳性病人)；抗人IgG(Jackson ImmunoResearchlaboratories，INC)。
细胞裂解液DTT0.617g，SDS0.8g，1M tris-HCl pH6.8 3.2ml，甘油4ml，bromphenol0.08g，H2O12.8ml；5xTris-甘氨酸电泳缓冲液15.1g Tris碱，44g甘氨酸，5g SDS，加水至1000ml；转移缓冲液在800ml水中溶解2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS、200ml甲醇，定容至1000ml。
2.方法步骤2.1.共转染为了获得稳定表达HIV-1结构蛋白Gag，GagPol和Env的BHK细胞系，我们将目的基因质粒D-GPEi与真核细胞表达载体pcDNA3.1以脂质体(lipofectmine2000)为介质共同转染BHK细胞。转染摩尔比D-GPEipcDNA3.1为3∶1。具体操作步骤如下①于25cm2细胞培养瓶加入2.0×106个细胞(BHK细胞株)，5ml细胞培养液(DMEM，10％小牛血清)，置于37℃5％CO2培养箱孵育24小时至70-80％单层；②D-GPEi质粒与pcDNA3.1质粒共8ug按3∶1摩尔比以500ul无抗性培养基稀释；③lipofectmine2000 20ul溶于500ul无抗性培养基混匀，室温作用5分钟；④将上述两种溶液混匀，室温作用20分钟；⑤将④加入细胞培养瓶，轻轻混匀；置于37℃5％CO2培养箱孵育，48小时后检测瞬时表达情况。
2.2单克隆细胞的筛选转染48小时后收获部分细胞以1500转/分钟离心后加入细胞裂解液，取裂解液上清进行免疫印迹检测，转染细胞瞬时表达为阳性，同时进行细胞计数并用含有浓度为1mg/ml的G418抗性的培养基按有限稀释法稀释并回贴细胞。细胞在含有浓度为1mg/ml的G418抗性的培养基培养15-20天后，非G418抗性的细胞已陆续死亡，而具有G418抗性的细胞则重新贴壁生长，并有单个的细胞克隆长出。我们从生长状态良好的细胞克隆中挑出7个，用胰蛋白酶扣取消化单克隆细胞并继续在1mg/mlG418的抗性培养基中将之扩大培养，分别收获各个单克隆的部分细胞(各个克隆收获细胞数相同)，细胞裂解液上清经免疫印迹检测细胞的蛋白表达情况。
实施例5.HIV-1病毒样颗粒的分离提纯1.VLP在不同浓度蔗糖中的分布我们将筛选出的细胞克隆扩大培养一段时间后收获细胞上清液，2000rpm，4℃离心20分钟去除细胞碎片并用0.22μm滤膜过滤，进行蔗糖垫密度梯度离心(2,6000rpm/min 4℃4h)，共分四个浓度层，由上至下依次为10％、20％、30％、40％蔗糖垫，收获各蔗糖层，经TCA沉淀蛋白后，Western Blot检测各浓度蔗糖中蛋白分布情况，结果见图3。可见目标蛋白主要分布于40％及30％蔗糖层，在上清及低浓度蔗糖中没有蛋白分泌，此结果证实了我们所表达的蛋白组装成了病毒样颗粒(VLP)，而且该颗粒中包含了HIV-1的主要结构蛋白gagpol和env。因为游离的蛋白沉降速率慢，应分布于低浓度蔗糖中；而颗粒则沉降速率较快，可穿过低浓度蔗糖分布于较高浓度蔗糖层。通过图3.3我们还可以看出，VLP在40％蔗糖层分布最多，这说明VLP可以绝大多数穿过30％蔗糖层，所以我们选择30％浓度蔗糖来进行VLP的初步分离提纯。
2.上清中VLP的分离提纯用30％蔗糖垫密度离心来初步分离纯化上清中的VLP，收获一定量的细胞上清液，2000rpm，4℃离心20分钟去除细胞碎片并用0.22μm滤膜过滤，上清经30％蔗糖垫密度超速离心(2,6000rpm/min，4℃1.5h)，沉淀用2×蛋白上样缓冲液溶解，进行Western-blot检测，结果如图4所示。可以看出，上清经30％蔗糖垫密度超速离心后可以收获大量的VLP。这就提示我们今后大规模的疫苗生产可以从细胞培养上清中收获并纯化，从而为该VLP成为疫苗的可行性提供了重要依据。但这种方法只是初步的分离纯化，要适应大规模的生产还应通过进一步的实验选择更为合适的纯化方式。
实施例6.HIV-1细胞及提纯后病毒样颗粒的免疫印迹检测为了更特异的验证gagpol和env表达的可靠性，避免HIV-1阳性血清的非特异性的干扰，我们分别将阳性克隆细胞及其提纯后的VLP分别用抗-Env与抗-p24的单克隆抗体为一抗进行Western-blot检测，结果如图5所示。从图中我们可以清楚的看到阳性细胞裂解物和提纯后VLP均有env与gagpol特异的蛋白表达带，而只表达gagpol的细胞对照则没有env表达。从图5我们还可以看出在细胞内gag、gagpol、env的表达量基本相等，且env是以gp160和gp120两种情况存在的，而上清中env大多数是以gp120形式存在的，这是由于env的前体gp160在组装成颗粒时被细胞蛋白酶水解为gp120和gp41，而上清中env表达量较低则可能是由于env包装进颗粒的效率较低造成的。
实施例7.表达细胞系的稳定性对于一个疫苗的生产来讲，细胞种子表达的稳定性显得至关重要。而已往所报道的产生HIV-1VLP系统很多都只是瞬时表达。所以为了确定我们所建立的细胞株是否可以稳定持续的表达，我们跟踪监测了细胞表达的稳定性。我们将筛选出的细胞克隆进行连续传代培养，定期收获了相同数量的细胞进行免疫印迹检测，其蛋白的表达情况见图6。结果表明细胞持续培养12个月，细胞表达情况无明显差别。这充分说明了我们所筛选出的单克隆细胞株具有良好的表达稳定性，有望成为HIV-1VLP疫苗生产用基质细胞。
实施例8.HIV-1病毒样颗粒的形态学为了进一步确认该细胞系确实可以分泌形成HIV-1VLP，对HIV-1VLP进行形态学检测，我们将阳性克隆细胞及经蔗糖垫密度离心提纯后的VLP进行透射电镜观察，结果见图7。A图为细胞透射电镜照片，可见细胞膜处6个刚刚分泌出的病毒样颗粒，图B为提纯后VLP电镜照片。可以看出HIV-1VLP电镜下为直径100nm左右的空心球体。电镜照片结果从宏观上证明了我们所表达的HIV-1的主要结构蛋白gagpol和env的确形成了VLP。
实施例9.HIV-1病毒样颗粒的免疫原性1.免疫动物经过30％蔗糖垫初步纯化的HIV-1VLP通过考马斯亮蓝测定蛋白浓度后免疫BalB/c鼠，设两个实验组0.5μg和10μg和一个阴性对照组，每组5只。采用双下肢肌肉两点注射法进行免疫。每组5只小鼠，每两周免疫一次，共免疫5次，每次免疫后一周尾静脉取血，收集血清样本用免疫印迹及ELISA检测抗-P24与抗-env抗体产生情况。并于最后一次免疫5天后脱臼处死老鼠，提取被免疫和对照鼠的淋巴细胞，分别用CTL、ELISPOT和T细胞增殖实验进行细胞免疫测定。
2.体液免疫效果分析通过酶联免疫吸附实验(ELISA)测定HIV-1病毒样颗粒在动物体内所诱导的抗--P24抗体与抗-env抗体水平。
(1)抗-P24抗体产生情况以HIV-1的p24蛋白包被96孔板，用间接ELISA法测量不同稀释度血清的OD值，通过OD值来分析抗-P24抗体滴度。
从图7中我们可以看出，一针免疫后即有微弱的P24抗体产生，随着HIV-1VLP免疫次数的增多，小鼠产生的体液免疫逐渐增强，到第3针后已经产生了足够强的抗-P24的血清抗体；图中还反映出10微克与0.5微克剂量组在第一针免疫后抗体水平基本持平，而随着免疫次数的增加10微克剂量组产生的抗体水平要比0.5微克剂量组高一些，但差别并不显著。这说明以0.5微克剂量免疫小鼠已足够引起较强的抗P24的抗体。
(2)抗-env抗体产生情况用HIV-1env的gp41和gp36抗原包被的双抗原夹心ELISA试剂盒检测抗-env抗体的产生情况。我们将第3、4、5周的血清倍比稀释进行检测，结果见图8。从图中结果可以看出，10微克剂量组在3针免疫后有微弱的抗-env抗体产生，第4针后抗env抗体有明显升高。而0.5微克剂量免疫产生的抗-env抗体水平较低。
(3)综合上述抗-p24与抗-env抗体产生的情况，可以得出如下结论a.从免疫水平上进一步证实了HIV-1的包膜蛋白env已经组装进了我们所构建的HIV-1VLP疫苗。病毒样颗粒中env的存在对体液免疫致关重要，尤其是对中和抗体的诱导具有重大意义。因为产生中和抗体的决定簇主要存在于env蛋白，并且env蛋白的成功组装使VLP在构建形式上更趋合理，属于typeII型与天然病毒颗粒更为接近，更容易引起机体的免疫反应。
b.从免疫剂量上看，针对抗-P24抗体的产生情况，0.5微克与10微克剂量并无明显差别，这说明0.5微克免疫已足够引起较强的抗-P24抗体；而对于抗-env抗体的产生，0.5微克要比10微克免疫低的多，说明0.5微克并没有达到抗-env抗体的产生的阈值，而要免疫10微克才可能引起较强的抗-env的抗体。
c.抗-env抗体的水平较低可能与病毒样颗粒中的env蛋白的掺入量相关，因为有资料显示包膜蛋白env的组装效率较低；还可能与抗原抗体的特异性结合能力有直接关系。
3.细胞免疫效果分析于最后一次免疫5天后脱臼处死老鼠，提取被免疫和对照鼠的淋巴细胞，分别用CTL、ELISPOT和T细胞增殖实验进行细胞免疫测定。
(1)特异性CTL反应。
检测被HIV-1VLP疫苗免疫后的Balb/c小鼠在体内产生的与CD8阳性T淋巴细胞相关的特异性CTL反应。免疫后的小鼠脾细胞作为效应细胞，加入与Balb/C小鼠MHC-I类分子特异性结合的短肽P7G(AMQMLKETI)共孵育的P815做为靶细胞；未加P7G-的P815作阴性对照。按一定比例混合上述脾细胞和靶细胞，测定靶细胞P815被裂解的比例，用来表征该疫苗在小鼠体内诱导的特异性CTL反应强度。结果如图9。以MHC-I类分子特异性结合的短肽P7G(AMQMLKETI)共孵育的靶细胞P815被裂解的比例进行分析，可以得出结论，10微克剂量组与空白组相比产生了较强的特异性的CTL反应。
(2)ELISPOT实验ELISPOT实验中斑点的个数可以反应在抗原特异性短肽刺激时T细胞分泌IFN-γ的能力，而分泌IFN-γ的能力可以作为测量细胞免疫水平的指标。HIV-1VLP疫苗免疫后小鼠淋巴细胞产生对HIV-1相关抗原(如P24)的记忆。用P24中MHC class-I抗原决定簇小肽(AMQMLKETI，对Balb/c小鼠具有特异性)刺激被免疫小鼠脾细胞，应使其分泌细胞因子(如INF-γ)，从而反映出疫苗诱导的与CD8阳性T淋巴细胞相关的，对HIV-1P24抗原的特异性细胞免疫反应。因此通过测定被免疫小鼠100万个脾细胞中能分泌INF-γ的淋巴细胞的数量，可以用于表示特异性细胞免疫反应强度。以免疫后的小鼠脾细胞为靶细胞，加入Balb/C小鼠MHC-I类分子特异性的短肽(P7G)作为刺激剂，未加P7G作对照。显色后膜取下扫描，显微镜下读取阳性细胞点数。结果如图10HIV-1VLP疫苗免疫后小鼠淋巴细胞产生对HIV-1相关抗原(如P24)的记忆。用P24中MHC class-I抗原决定簇小肽(AMQMLKETI，对Balb/c小鼠具有特异性)刺激被免疫小鼠脾细胞，应使其分泌细胞因子(如INF-γ)，从而反映出疫苗诱导的与CD8阳性T淋巴细胞相关的，对HIV-1P24抗原的特异性细胞免疫反应。因此通过测定被免疫小鼠100万个脾细胞中能分泌INF-γ的淋巴细胞的数量，可以用于表示特异性细胞免疫反应强度。以免疫后的小鼠脾细胞为靶细胞，加入Balb/C小鼠MHC-I类分子特异性的短肽(P7G)作为刺激剂，未加P7G作对照。显色后膜取下扫描，显微镜下读取阳性细胞点数。结果如图10所示。可以看出，10微克HIV-1VLP疫苗免疫小鼠可以产生较强的细胞免疫，这与CTL结果相吻合。
(3)细胞增殖实验应用合适的刺激剂可以使细胞进入增殖周期，获得数量上的增加。在本实验中用新型四唑氮盐MTS做比色分析测定细胞增殖效应。以免疫后小鼠脾细胞作为靶细胞，加入HIV-1p24蛋白作为刺激剂，此为实验组；以未刺激细胞为阴性对照；以IL-2蛋白为阳性对照。结果如图11所示。两个实验组均出现了细胞增殖反应，而10微克组要比0.5微克组产生的细胞增殖反应强很多。
综合上述CTL反应、ELISPOT与细胞增殖实验结果来看，我们所构建的HIV-1VLP疫苗可以动物的细胞免疫。可以得出如下结论(1)从细胞免疫水平上进一步证实了我们所表达的HIV-1的主要结构蛋白gag、gagpol和env的确组装成了病毒样颗粒，因为游离的外源蛋白并不能由树突状细胞交叉递呈进入MHC I途径而引起细胞免疫。(2)从细胞增殖实验结果来看，10微克剂量要比0.5微克免疫效果好，能够引起较强的细胞免疫。
实施例10 药用组合物HIV-1病毒样颗粒与生理盐水的重量体积比为150μg/ml，每次注射2ml，注射3次。
实施例11 药用组合物HIV-1病毒样颗粒与生理盐水的重量体积比为200μg/ml，每次注射2ml，注射3次。
实施例12 药用组合物HIV-1病毒样颗粒与生理盐水的重量体积比为250μg/ml，每次注射2ml，注射3次。
权利要求
1.HIV-1病毒样颗粒的制备方法，包括下列步骤a)、选择质粒与抗性筛选标记所选用的质粒为真核细胞表达质粒，该质粒能在哺乳细胞中高效表达人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的主要结构蛋白gag、pol和env，与之共转染的载体为pcDNA3.1，以真核细胞抗性基因作为抗性筛选标记；b)、筛选出高效、稳定表达HIV-1主要结构蛋白gag、pol和env的细胞系，该细胞系所表达的蛋白自我组装成了含有人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的完整核心蛋白gag、编码酶类蛋白pol和外膜蛋白env的病毒样颗粒VLP；c)、纯化该VLP。
2.根据权利要求1所述的HIV-1病毒样颗粒的制备方法，其中b)步骤具体包括下列步骤I)共转染 将目的基因质粒与真核细胞表达载体pcDNA3.1以脂质体为介质共同转染人类细胞；II)单克隆细胞的筛选 所用筛选药物为针对真核细胞抗性基因的筛选药物；III)确定表达最强的细胞克隆 挑选生长状态良好的细胞克隆并继续在抗性培养基中将之扩大培养，分别收获并检测各细胞克隆的表达情况，确定最强的细胞克隆。
3.如权利要求2所述的HIV-1病毒样颗粒的制备方法，其特征在于所用人类细胞为293细胞、Vero细胞或BHK细胞。
4.如权利要求1所述的HIV-1病毒样颗粒的制备方法，其特征在于真核细胞表达质粒为D-GPEi。
5.如权利要求1所述HIV-1病毒样颗粒的制备方法，其特征在于抗性筛选标记为新霉素(neomycin)、嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)。
6.含有包括人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的完整核心蛋白gag、编码酶类蛋白pol和外膜蛋白env的病毒样颗粒，且该病毒样颗粒是非复制型的。
7.如权利要求6所述的HIV-1病毒样颗粒，其特征在于其中编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白gag、pol和env的核苷酸序列来源于经过人工修饰的编码野生型中国流行株人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重组型的结构蛋白的核苷酸序列。
8.一种用于治疗艾滋病的病毒样颗粒疫苗，其特征在于它包含了如权利要求6所述的病毒样颗粒。
9.一种稳定表达HIV-1主要结构蛋白的人类细胞系。其特征在于其细胞基因组整合有HIV-1主要结构蛋白，包括人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的完整核心蛋白gag、编码酶类蛋白的pol和外膜蛋白env蛋白。
10.如权利要求8所述的用于治疗艾滋病的病毒样颗粒疫苗，其特征在于还包括稀释剂或载体。
11.如权利要求10所述的用于治疗艾滋病的病毒样颗粒疫苗，其特征在于还包括佐剂。
全文摘要
本发明涉及一种HIV－1病毒样颗粒及其制备方法与用途。属于生物技术领域。含有包括人类免疫缺陷病毒－1(HIV－1)的完整核心蛋白gag、编码酶类蛋白pol和外膜蛋白env的病毒样颗粒，且该病毒样颗粒是非复制型的，及其该病毒样颗粒的制备方法与用途。本发明的优点及有益效果通过共转染及单克隆细胞筛选的方法建立了稳定表达的细胞系。该细胞系可稳定持续的分泌HIV－1病毒样颗粒。该病毒样颗粒不含病毒核酸，具有很好的安全性。所构建的VLP在组装形式上更趋合理，与天然病毒结构更为相似，可作为HIV－1治疗性疫苗。
文档编号A61K39/12GK1772892SQ200510017118
公开日2006年5月17日 申请日期2005年9月9日 优先权日2005年9月9日
发明者孔维, 张喜珍, 于湘晖, 赵东海, 田春娟, 于晓方 申请人:吉林大学, 长春高新百克药物研究院有限公司