专利名称：嘧啶(硫)酮类化合物在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及嘧啶(硫)酮类化合物在制备治疗分泌型腹泻及常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。本发明还涉及一种建立非人类哺乳动物囊性纤维化模型的方法。
背景技术：
囊性纤维化跨膜电导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator，CFTR)是一种受环腺苷单磷酸(adenosine 3’5’-cyclic monophosphate acidcAMP)激活的Cl-通道蛋白，该蛋白在哺乳类动物的气道、小肠、肾脏、胰腺及睾丸等处的上皮细胞中表达。激素(如β-肾上腺素)或者毒素(如霍乱毒素)等通过提高体内的cAMP水平来激活依赖于cAMP激活的蛋白激酶，由此引起CFTR的磷酸化，从而使CFTR Cl-通道开放。CFTR在上皮细胞上大量表达，它为Cl-跨越上皮细胞的顶膜提供了通道，同时它还是跨上皮细胞的盐和水的转运的调控点。CFTR Cl-通道的作用与很多种疾病如囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)、男性不育、多囊肾病及分泌型腹泻有关。
一、CFTR与分泌型腹泻腹泻可因暴露于各种病原或致病因子而引发，这些因素包括霍乱毒素、致病性大肠杆菌内毒素、AIDS引起的腹泻、溃疡性结肠炎引起的腹泻、食物中毒或通过CFTR引起肠道分泌增加的其它因素。分泌型腹泻是发展中国家儿童死亡的主要原因，大约每年有500万儿童死于此种疾病(Gabriel et al.，1994 Science 166107-109))。在经济发达国家，腹泻的致病性和致死性也较高。在美国，每年有8百万人患有急性腹泻，入院人数达250000，死亡人数超过500人。此外，传染性分泌型腹泻也是危害多种经济动物的主要疾病之一。应用小鼠的研究表明CFTR Cl-通道是各种激动剂引起肠道Cl-分泌的最终共同途径(Snyderet al.1982 Bull.World Health Organ.60605-613；Chao et al 1994 EMBO J.131065-1072；Kimberg et al.1971 J.Clin.Invest.501218-1230)。
液体分泌在胃肠道生理中起至关重要的作用。正常情况下肠道主要对肠腔中的液体、电解质和营养物质进行吸收，同时进行少量的基础分泌维持肠粘膜湿化和帮助混合进入肠腔中的食物。肠道的液体分泌是肠腺上皮细胞从基底测向肠腔侧主动转运Cl-所驱动的跨上皮液体移动过程(Thiagarajah JR.，et al.，2003，Current Opinion in Pharmacology 3594-599)。肠腺上皮细胞基底膜上的Na+K+-ATP酶和K+通道作用下产生的Na+和Cl-浓度差驱动Cl-从基底膜一侧通过NKCC共转运器进入细胞内；Cl-靠电化学作用通过顶膜上的CFTR氯离子通道分泌进入肠腔；Na+和水随着Cl-通过细胞间途径进入肠腔。许多生理和病理因素可以激活Cl-和肠液的分泌。例如肠道分泌的神经调节途径通过肠道嗜铬细胞释放五羟色氨，导致胆碱能和血管活性肠肽能神经元的激活和腺上皮内cAMP和Ca+增加，进而激活Cl-通道和肠液分泌过程。炎症介质如前列腺素、组胺和白细胞介素等也可通过不同的信号途径激活肠道Cl-分泌。另外，核苷酸和嘌呤能信号途径也能通过Ca++和cAMP信号途径刺激肠道Cl-分泌。
CFTR氯离子通道在肠道液体分泌活动中起至关重要的枢纽作用。CFTR敲除小鼠由于肠道分泌减少和吸收增加而引起肠梗阻(Grubb BR.，et al.，1997，Am J Physiol，273258-266)；霍乱毒素在正常小鼠引起小肠液体的大量分泌，而在CFTR敲除小鼠却无此作用。另外，体外实验也证明各种激动剂引起的肠粘膜和培养的肠上皮细胞Cl-分泌可被阴离子通道阻断剂格列苯脲和5-硝基-2-(3-苯丙基胺)苯甲酸[5-nitro2-(3-phenylpropylamino)benzoate，NPPB]抑制。
由于腹泻最终都会导致脱水，因此，治疗的目标之一是纠正脱水，目前通常采用补液和喂食等方法。高亲和力的CFTR抑制剂在治疗分泌型腹泻方面将具有重要的作用。虽然联苯胺-2-羧酸(diphenylamine-2-carboxylate，DPC)、NPPB和格列苯脲在高浓度的条件下也能够抑制CFTR的活性，但是它们的上述活性是非特异性的(Cabantchik et al.，1992，Am.J.Physiol.262C803-C827；McDonough et al.，1994，Neuron 13623-634；Schultzet al.，1999，Physiol.Rev.79S109-S144.Edwards et al.，1993，Br.J.Pharmacol.1101280-1281；Rabe et al.，1995，Pflugers Arch.429659-662；Yamazaki et al.，1997，Circ.Res.81101-109)。到目前为止，还没有通过特异性抑制CFTR Cl-通道功能来治疗分泌型腹泻的有效药物。
二、CFTR与常染色体显性遗传性多囊肾病多囊肾病(Polycystic kidney disease，PKD)是一种常见的遗传性疾病，以肾小管形成多个进行性增大的囊肿为特征，是终末期肾衰的主要原因之一(Wilson PD.2004，NEngl J Med.350151-164)。多囊肾病按遗传方式可分为常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)和常染色体隐性遗传性多囊肾病(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD)两种。ARPKD发病率低，约为1/20000，多见于婴幼儿，患儿多在早期死亡。ADPKD的人群发病率较高，约为1/400～1/1000。大约50％的ADPKD患者在60岁前进入终末期肾衰，临床上接受肾移植和透析的患者中8～10％是ADPKD的终末期肾衰患者(Hateboer N.，et al.，1999，Lancet，353103-107)。ADPKD除了肾脏表现外，病变还涉及其他多个器官，例如肝脏、胰腺、脾脏的囊肿形成以及颅内动脉瘤、二尖瓣脱垂等。目前已经发现三个ADPKD的致病基因位于16p13.3的PKD1、位于4q21-23的PKD2和PKD3(Ariza M.，et al.，1997，J Med Genet，34587-589)。ADPKD基因都比较大且突变谱比较复杂，无明显的突变热点，各种突变分布于整个基因。ADPKD的发病机理在细胞和分子水平上还不十分清楚，致使ADPKD至今仍缺乏有效治疗手段。
ADPKD病理学变化包括肾小管上皮细胞异常增生及凋亡、肾小管内液体异常分泌导致的肾小管扩张以及细胞外基质异常重塑(GRANTHAM，J.J.1993，J.Am.Soc.Nephrol，31841-1857)。研究证明，囊肿衬里上皮细胞的液体分泌与多囊肾组织中异常增高的cAMP水平有关，在ADPKD囊肿形成和发展中起关键作用。越来越多的证据表明受cAMP激活的CFTR氯离子通道介导的Cl-分泌在ADPKD囊肿内液体积聚过程中起重要作用(Perso A.，etal.，2000，J Am Soc Nephrol.112285-2296；Murcia NS.，et al.，1999，Kidney Int.551187-1197；Hanaoka K.，et al.，1998，J Am Soc Nephrol.9903-916)，提示通过抑制CFTR Cl-转运活性来阻断ADPKD囊肿中液体的积聚从而阻止囊肿的形成和发展可能成为ADPKD治疗的一个新策略。
三、CFTR与囊性纤维化囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)是一种由CFTR隐性突变引起的致命性遗传疾病。通过对囊性纤维化患者和CF老鼠模型研究结果表明CFTR在小肠和胰腺的液体转运及男性生育中起重要作用(Grubb et al.，1999.Physiol.Rev.79S193-S214；Wong，P.Y.，1997，Mol.Hum.Repord.4107-110)。尽管进行性肺功能病变是造成CF患者发病和死亡的常见原因，然而CFTR突变引起囊性纤维化患者气道病变的机理目前仍不清楚(Pilewski et al.，1999，Physiol.Rev.79S215-S255)。利用人体组织或动物建立囊性纤维化模型对阐明囊性纤维化引起的肺部损伤及致病机制具有极其重要的意义。越来越多的研究表明肺部囊性纤维化产生的原因是因为气道粘膜下腺液体分泌不足及大分子过度分泌导致了肺绒毛清除功能丧失及细菌的感染。然而由于来自肺移植手术的气道材料都有严重的病变，研究受到了极大的限制。利用CFTR抑制剂建立大动物囊性纤维化模型对研究粘膜下腺CFTR在水、盐和大分子分泌过程中所起的作用将具有极其重要的意义。高亲和力的CFTR抑制剂的发现将在建立CF大动物模型方面发挥重要作用，同样其对研究CF发病机理及寻找有效的治疗途径也具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供嘧啶(硫)酮类化合物在制备治疗分泌型腹泻及常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。本发明的另一个目的是提供一种建立非人类哺乳动物囊性纤维化模型的方法。
本发明提供高亲和力嘧啶(硫)酮类CFTR抑制剂及用其处理受治疗者囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)离子转运功能异常有关的症状或状况方法。嘧啶(硫)酮类化合物是通过利用针对筛选与CFTR直接结合的抑制剂的模型筛选了大量的化合物的基础上发现的。由于在模型的设计过程中考虑到CFTR的多种激活途径，并且将多种激活途径联合应用到筛选过程中，因而本发明中的嘧啶(硫)酮类化合物认为是结合在Cl-转运通道处。通过对含有100,000种结构多样的组合化学库中的化合物进行筛选我们获得了几种属于嘧啶(硫)酮类化合物的能够有效地抑制CFTR Cl-转运功能的化合物。这些化合物与已知的CFTR抑制剂或激活剂在结构上都不同。其中活性最强的CFTR抑制剂的在浓度为10M时既能有效抑制人气道细胞Cl-电流。当浓度为100μg/kg时能够有效地抑制霍乱毒素引起的小鼠小肠内液体积聚。当给予发生腹泻的仔猪按0.25mg/kg每日一次进行注射、连续7天即能有效地预防仔猪腹泻的发生，而不表现出明显的体内毒性作用。当浓度为500μg/kg时能够有效地抑制常染色体显性遗传性多囊肾囊肿衬里上皮细胞液体分泌。另外我们所发现的CFTR抑制剂对CFTR的抑制作用迅速、可逆并且是CFTR特异的。
本发明中的嘧啶(硫)酮类化合物的结构包括一个由六个原子所组成的杂环，杂环上连有一个羰基或硫脲基，当杂环上连有一个羰基时为嘧啶酮类化合物，当杂环上连有一个硫脲基时为嘧啶硫酮类化合物。特别是本发明中嘧啶(硫)酮类化合物分子式中，其中X分别是氢、任意有机基团、任意卤族原子、硝基、偶氮基团、羟基或巯基；Y1、Y2分别是氢、任意有机基团、任意卤族原子、硝基、偶氮基团、羟基或巯基；A1是氧原子或硫原子；A2分别是氢、任意有机基团、任意卤族原子、硝基、偶氮基团、羟基或巯基。
某些具体情况下嘧啶(硫)酮类化合物有以下分子式 X是甲基、乙基、丙基、异丙基或烯丙基，Y1是C1-C6的烷基或氢，Y2是C1-C6的烷基或氢，Y1与Y2相同或不同，A1是氧原子或硫原子，A2是C1-C6的烷基或氢。
本发明中的化合物的一些具体形式为(1)N-(2，3-二甲基苯基)-6-甲基-2-硫-4-(4-甲基苯基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-酰胺(2)N-(2，4-二甲基苯基)-6-甲基-2-硫-4-(4-甲基苯基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-酰胺(3)N-(2，3-二甲基苯基)-4-(4-乙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-酰胺(4)N-(2，4-二甲基苯基)-4-(4-乙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-酰胺(5)N-(2，3-二甲基苯基)-4-(4-异丙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-酰胺(6)N-(2，4-二甲基苯基)-4-(4-异丙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-酰胺(7)4-(4-烯丙基苯基)-N-(2，3-二乙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-酰胺(8)4-(4-烯丙基苯基)-N-(2，4-二乙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-酰胺(9)N-(2，6-二甲基苯基)-6-甲基-2-硫-4-(4-甲基苯基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-酰胺(10)N-(2，6-二甲基苯基)-4-(4-乙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-酰胺(11)N-(2，6-二甲基苯基)-4-(4-异丙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-酰胺(12)4-(4-烯丙基苯基)-N-(2，6-二乙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-酰胺本发明还涉及上述嘧啶(硫)酮类化合物制备治疗分泌型腹泻及常染色体显性遗传性多囊肾病药物的剂型。本发明中的化合物可以与合适的、药用载体、稀释剂、赋型剂或佐剂等做成固体、半固体、液体或者气体的形式。例如片剂、胶囊、粉剂、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。本发明中的化合物能够通过多种途径给药。这些途径包括口服、口腔、直肠、静脉、腹膜下、皮下、气道等。
在剂型中本发明中的化合物可以是其药用盐形式，它们也可以单独或联合或与其它的药物活性化合物共同施用。
制成口服药时，本发明中的化合物可以单独或与适当的添加剂制成片形、粉末、颗粒或者胶囊。例如可以与乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉、土豆淀粉等常规的添加剂，或纤维素、纤维素衍生物、金合欢胶、玉米淀粉或明胶的结合剂，滑石粉、硬脂酸镁等润滑剂，或者是根据需要与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、保鲜剂及风味剂等混合制成口服药。
本发明中的化合物的注射剂型可以为将本发明中的化合物溶解、悬浮、乳化在水或非水溶剂(如植物油、合成的脂肪酸甘油酯、酯类、高级脂肪酸或丙二醇)中。需要时可以加入常规的助溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和保鲜剂。
本发明中的化合物可以制成气雾剂的形式通过吸入给药。本发明中的化合物可以与二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等压缩在一起制成气雾剂。
本发明中的化合物还可以与如乳化基质、水溶性基质等不同的基质混合制成栓剂。本发明中化合物制成的栓剂可以通过直肠给药。栓剂的载体可以是可可脂、碳蜡和聚乙烯醇等在室温下为固体，而在体温下熔化的载体。
以口服或直肠为给药形式时，本发明中的化合物可以与糖浆、配剂和悬浮剂等制成计量单位形式。计量单位可以为茶匙、汤匙、片或栓。每一计量单位中含有一定量的一种或多种抑制剂。以肌肉注射或静脉注射时可以是将本发明中的化合物溶解在无菌水、普通生理盐水中或其它容许药用的载体。
随着所治疗的对象或给药方式或给药途径不同，剂量也有所不同。由于不同哺乳动物所需要的剂量相差很大，例如单位体重下人比大鼠所需要的剂量低20、30甚至40倍，所以本发明中的化合物的剂量范围很宽，例如可以是0.1-10mg/kg/个体/天。同样不同的给药方式对给药剂量也存在影响。例如，腹腔注射10-20mg本发明中的化合物一次即可有效阻断由霍乱毒素诱导的小鼠腹泻，但是口服时剂量要提高数十倍才能达到同样效果。
典型的剂型可以是适于注射给药的溶液；每天服用2-6次的片剂；每天服用一次的缓释胶囊或片剂等等。缓释效果可以通过利用在不同pH条件下溶解的胶囊材料、或在不同渗透压下缓慢释放的胶囊、或其它已知的可控制的释放材料实现。
本发明中化合物可以与其它具有药物活性的制剂包括CFTR抑制剂一同使用。
药用赋型剂如稀释剂、载体、佐剂为常规易得，其它容许药用的附属物如pH调节剂、缓冲剂、渗透压调节剂、稳定剂、湿润剂等为常规易得。
使用剂量会由于本发明中特定化合物、疾病症状的严重程度、治疗对象对副反应的耐受程度有所变化。对于本发明中某一确定的化合物，通过不同方法确定使用剂量。
本发明中的CFTR抑制剂可以按50-500μg/kg体重的剂量，通过腹腔内、皮下或其它给药途径每天给药1-3次来制造非人类囊性纤维化动物模型。
本发明中的CFTR抑制剂能够有效地治疗分泌型腹泻及常染色体显性遗传性多囊肾病，作用迅速、可逆且不表现出明显的体内毒性作用。本发明中的CFTR抑制剂在进行长期、大量给药时能使猪、牛、羊等非人类哺乳动物出现与囊性纤维化类似的表型。
本发明中的CFTR抑制剂在治疗CFTR相关的症状或状况即任何与CFTR活动(如CFTR的离子转运活动)相关联的状况、紊乱、疾病、症状。这些CFTR相关的状况、紊乱、疾病、症状可以通过抑制CFTR的活动如CFTR离子转运活动进行治疗。
本发明的CFTR抑制剂能够用来治疗与小肠液体分泌的不正常增加尤其是急性的小肠液体的不正常增加相关的症状或状况。业已证明CFTR活性在包括霍乱毒素在内的各种激动剂的作用下引起肠道分泌增加，CFTR抑制剂在能够有效抑制CFTR离子转运的剂量下使用可以减少肠道液体分泌。对小鼠小肠液体分泌实验表明，给小鼠经腹腔注射非毒性剂量的CFTR抑制剂能够有效地抑制由霍乱毒素引起的小肠液体的过量分泌，因此CFTR抑制剂可以用于治疗肠道炎症性紊乱和腹泻，尤其是分泌型腹泻。
CFTR抑制剂还有可能用于治疗AIDs引起的腹泻(AIDs相关腹泻)和炎症性胃肠道紊乱诸如溃疡性结肠炎、炎症性肠道疾病(IBD)、克隆氏(Crohn’s)病及类似病症。
本发明中的CFTR抑制剂还可用于治疗诸如多囊肾一类的病症，并可以通过抑制睾丸中CFTR的活性而进一步开发为男性避孕药。
特别有意义的是，本发明中的CFTR抑制剂可在非人类动物用于诱导囊性纤维化病变。例如将有效抑制CFTR通道活性剂量的CFTR抑制剂在肺上有效地模拟了囊性纤维化中发现的CFTR功能缺陷。CFTR抑制剂的给药途径已经在上文中给与了详细论述。
适用于应用本发明中的抑制剂诱导动物模型的动物包括人和动物尤其是哺乳类动物，例如非人类灵长类(猴子、猩猩、大猩猩、黑猩猩等)、啮齿类(大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、兔子、雪貂等)、兔、猪、马、狗、猫等。其中最感兴趣的是大动物模型。
CFTR抑制剂还可与离体的人体组织接触制造体外疾病模型。这些组织可以与有效降低这些组织中CFTR活性剂量的CFTR抑制剂接触在15分钟到2小时内制造出体外人疾病模型。感兴趣的人体组织包括但不限于肺(包括支气管和气道)、肝脏、胰腺、睾丸等。应用CFTR抑制剂处理过的组织进行生理学、生物化学、基因组学或其它研究可以鉴定在疾病病理生理中起重要作用新型治疗性靶分子。例如从没有囊性纤维化的人类分离出来的离体组织可以暴露于足以诱导囊性纤维化病症的抑制剂，并且这类研究可以鉴定在囊性纤维化病理生理中起重要作用的新型治疗型靶分子。
图1为本发明的CFTR抑制剂筛选技术的原理示意图。利用多种激活剂激活稳定共转染猪CFTR和一种对Cl-/I-敏感的黄色荧光蛋白(YFP)的上皮细胞上表达的CFTR。当加入受试化合物后，向细胞培养孔中加入含I-溶剂测定I-的内流速度。
图2为筛选所获得的单一细胞培养孔中测定到的代表性荧光变化曲线。图中显示了无激活剂和受试化合物的对照组，无活性受试化合物组和有抑制CFTR氯离子通道开放活性的受试化合物组的荧光变化曲线。
图3a为筛选所得到的嘧啶硫酮类CFTR氯离子通道抑制剂的化学结构。
图3b为CFTR氯离子通道抑制剂完整的化学结构，相对活性分别为0.9(CFTRinh-1)，0.9(CFTRinh-2)，0.9(CFTRinh-3)，0.9(CFTRinh-4)，1(CFTRinh-5)，0.8(CFTRinh-6)，0.9(CFTRinh-7)，0.1(CFTRinh-8)，0.6(CFTRinh-9)，0.9(CFTRinh-10)，0.8(CFTRinh-11)，0.2(CFTRinh-12)。
具体实施例方式
实施例1本实施例描述CFTR小分子抑制剂高通量细胞筛选模型的建立研究细胞膜CFTR Cl-离子通道开放情况及筛选其抑制剂的基础是建立灵敏度高、特异性强、稳定可靠且适于进行高通量筛选的细胞模型。首先我们用猪CFTR表达质粒(SV40启动子，zeocin为选择标记)和对卤族元素敏感的荧光绿蛋白突变体YFP-H148Q表达质粒(CMV启动子，G418为选择标记)稳定共转染Fischer大鼠甲状腺(fischer rat thyroid，FRT)上皮细胞系。选择出荧光强度高、生长迅速、基础氯离子渗透性且在细胞质膜上稳定高表达的克隆FRT/pCFTR/YFP-H148Q/I152L。进行高通量筛选时，将FTR细胞悬浮于F-12Coon’s培养液(含有10％胎牛血清、2mM L-Gln、500u/mL青链霉素、500ug/ml Zeocin)中，将上述细胞悬液加入到黑壁透明底的96孔板(Corning-Costar 3904)中，每孔中细胞数量为20,000。培养16-24小时，使细胞长成单层，在FluoStar Galaxy荧光仪上测定氯离子通道功能。进行氯离子通道介导的短路电流测定时，将细胞培养在Snapwell支持载体(Corning-Costar)上，每孔数量为500,000左右。生长8-10天，待细胞间紧密连接(跨细胞电阻抗)形成后用Ussing Chamber进行氯离子跨膜电流测定。
实施例2本实施例描述CFTR小分子抑制剂高通量细胞筛选方法及结果1.化合物100,000种结构多样的类药小分子化合物(分子量范围在350-550道尔顿之间)库购自ChemBridge公司(ChemBridge Co.San Diego)。化合物的浓度为10mM的DMSO溶液，分装于96孔板上。初筛时，将上述小分子化合物进行筛选。对筛选到的阳性化合物进行二次筛选和量效分析。对确切的高亲和力阳性化合物进行结构分析，并购进或合成其类似物进行进一步检测。
2.CFTR抑制剂的高通量筛选系统初筛是在Beckman高通量细胞测定筛选系统上进行的。该系统主要由自动化机械手、3米长的滑道、二氧化碳培养箱、多功能载物台、识码机、洗板机、细胞培养板去盖装置、振荡器、封板机、液体转移装置及荧光检测仪等组成。荧光检测仪为FLUOstar(Galaxy，BMGLab Technologies)，该检测仪含有两个注射泵，激发波长为HQ500/20X(500±10nm)，发射波长为HQ535/30M(535±15nm)。该系统通过中央主机控制，控制软件由Beckman公司提供。
3.CFTR小分子抑制剂高通量细胞筛选方法将FTR/pCFTR/YFP-H148Q/I152L细胞按每孔20,000的密度铺于96孔板中，在二氧化碳孵箱中(37℃，湿度为90％，CO2浓度为5％，空气浓度为95％)培养至形成单层。以下全部筛选程序是由机械臂操作的自动化过程将细胞培养板从二氧化碳孵箱中取出，去盖，以磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞三次，每次300μl，最后一次保留50μl PBS，送到移液装置上，向每孔中加入10μl含有一种激活剂的混合物(含有5μM FSK，100μM IBMX和25μM APG)，5分钟后加入被测的小分子化合物至单个化合物的终浓度为10μM。15分钟后送到荧光测定仪，测定碘离子通过氯离子通道内流对细胞内YFP的荧光淬灭动力学。荧光分析的方法为以5点/秒的速度连续测定14秒，其中前2秒为基线。2秒后向细胞培养孔中快速注入160μl含有137mM NaI(取代NaCl)的PBS，继续测定12秒。利用自定义的三次方程计算荧光变化的初始速度。
4.初级筛选结果本研究的目的是找到能够直接阻断野生型CFTR氯离子通道的抑制剂，因此首先我们用一种激活剂的混合物(含有5μM FSK，100μM IBMX和25μM APG)使CFTR氯离子通道处于持续开放状态。化合物的筛选浓度为10μM。化合物加入后15min后向体系中快速注射I-，并测定细胞内荧光动力学变化(即I-的内流速度)情况(图1)。
我们以含有激活剂的混合物的PBS盐溶液作为阴性对照，曲线斜率越小表示在测定浓度下化合物活性越大(图2)。在所筛选的100,000种化合物中，在浓度为10μM时有99,995个化合物对I-的内流速度没有明显影响(曲线斜率降低程度＜10％)，有5个化合物使I-的内流速度降低了10-50％。所筛选到的阳性化合物都具有嘧啶(硫)酮类化合物核心结构(图3a)。
我们进而对196个具有嘧啶(硫)酮类化合物核心结构的化合物进行了荧光活性分析其中活性最高的如图3b所示。
实施例3本实施例描述CFTR小分子抑制剂性质测定方法及结果1.化合物FSK、IBMX、APG、购于Sigma公司(Sigma Chemical Co.St.Louis，Mo.)CFTRinh-1，CFTRinh-5，CFTRinh-7自行合成2.CFTR抑制剂抑制CFTR离子转运活性动力学分析将FRT/pCFTR/EYFP-H148Q细胞按每孔30,000个细胞的密度铺于黑壁透明底的96孔板(Corning-Costar 3904)，培养成份为F-12Coon’s培养液(含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、500u/mL青链霉素)，在二氧化碳孵箱中(37℃，湿度为90％，CO2浓度为5％，空气浓度为95％)培养24小时后形成单层后备用。
将细胞培养板从二氧化碳孵箱中取出，以磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞三次，每次300μl，最后一次保留40μl PBS，向每孔中加入10μl含有CFTR激活剂的混合物(5μM forskolin，100μM IBMX，50μM genistein)的PBS溶液，5分钟后，再加入10μl待测的CFTR抑制剂，分别于加入CFTR抑制剂的第2、4、6、8、10、15、20、30、60分钟，进行荧光分析。荧光分析的方法为以5点/秒的速度连续测定14秒，其中前2秒为基线。2秒后向细胞培养孔中快速注入160μl含有137mM NaI(取代NaCl)的PBS，继续测定12秒，细胞氯离子转运的功能实验直接用荧光值与时间变化曲线反映。计算荧光变化的初始速度。
结果表明，当CFTRinh-1浓度为0.4-0.7μM时即对野生型CFTR有显著的抑制作用。该活性在10min之内就可以达到最大值(t1/2＝5min)。当CFTRinh-5浓度为0.3-0.6μM时即对野生型CFTR有显著的抑制作用。该活性在10min之内就可以达到最大值(t1/2＝4min)。当CFTRinh-7浓度为0.3-0.6μM时即对野生型CFTR有显著的抑制作用。该活性在10min之内就可以达到最大值(t1/2＝5min)。
3.CFTR抑制剂抑制CFTR离子转运活性可逆性分析将FRT/CFTR/EYFP-H148Q细胞按每孔30,000个细胞的密度铺于黑壁透明底的96孔板(Corning-Costar 3904)，培养成份为F-12Coon’s培养液(含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、500u/mL青链霉素)，在二氧化碳孵箱中(37℃，湿度为90％，CO2浓度为5％，空气浓度为95％)培养24小时后形成单层后备用。
将细胞培养板从二氧化碳孵箱中取出，以磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞三次，每次300μl，最后一次保留40μl PBS，向每孔中加入40μl含有CFTR激活剂的混合物(5μM forskolin，100μM IBMX，50μM genistein)的PBS溶液，5分钟后，再加入10μl待测的CFTR抑制剂，作用15分钟后，以磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞三次，每次300μl，最后一次保留50μl PBS，向每孔中加入10μl含有CFTR激活剂的混合物(5μM forskolin，100μM IBMX，50μMgenistein)的PBS溶液，分别于加入激活剂的混合物后第5、10、15、20、30、60分钟，进行荧光分析。荧光分析的方法为以5点/秒的速度连续测定14秒，其中前2秒为基线。2秒后向细胞培养孔中快速注入160μl含有137mM NaI(取代NaCl)的PBS，继续测定12秒，细胞氯离子转运的功能实验直接用荧光值与时间变化曲线反映。计算荧光变化的初始速度。
结果表明，体系中去除CFTRinh-1 5min后CFTR的活性恢复1/2以上；体系中去除CFTRinh-5 5min后CFTR的活性恢复1/2以上；体系中去除CFTRinh-7 7min后CFTR的活性恢复1/2以上4.CFTR抑制剂通过与CFTR直接作用发挥其功能CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7三种抑制剂均能抑制由FSK、IBMX、APG对CFTR的激活作用，还能够抑制包括GEN、CPT-cAMP、CPX、8-MPO、UCCF-029及UCCF-853的活性。由于上述这些CFTR激活剂在结构上几乎没有相关性，因而我们认为CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7是通过与CFTR直接相互作用来发挥其功能的。
5.CFTR抑制剂抑制CFTR离子转运活性电生理测定结果将细胞培养在6孔Snapwell支持载体(Corning-Costar)上，每孔数量为500,000。生长8-10天，待细胞间紧密连接(跨细胞电阻抗)形成后，用Ussing Chamber进行氯离子跨膜电流测定将处于极性生长状态的单层FRT细胞的Snapwell放入Ussing chamber(Physiologic Instruments，Inc)中。然后将基底膜一侧加入含有130mM NaCl，2.7mMKCl，1.5mM KH2PO4，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，10mM葡萄糖，10mM Na-Hepes(pH7.3)溶液，而顶膜侧加入含有65mM葡萄糖酸钠，65mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，2mMCaCl2，0.5mM MgCl2，10mM葡萄糖，10mM Na-Hepes(pH7.3)的溶液。将系统于37℃连续通入空气，然后以250μg/ml两性霉素B对基底膜进行通透性处理。测定时将Ussing槽与DVC-1000电压钳相连(World Precision Instruments)，测定Ag/AgCl电极和1M KCl琼脂糖桥之间的短路电流。
我们利用电生理的方法研究了CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7抑制CFTR活性的特异性。我们在表达CFTR的FRT细胞的上皮膜一侧加入CFTRinh-1(或CFTRinh-5，或CFTRinh-7)，测定其对短路电流的影响。研究发现CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7均能够快速有效地抑制FRT细胞的短路电流，并且该抑制活性与其浓度呈正相关。
6.CFTR抑制剂毒性分析本实验对CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7的毒性分别进行了体外和体内分析。利用二氢罗丹明法对CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7的细胞毒性进行了测定。结果表明，在浓度为100μM时共同保温24小时，我们所发现的CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7对FRT细胞均没有明显的毒性。
给小鼠经腹腔注射上述化合物1毫克/公斤体重，每日注射一次，连续注射7天或一次性高剂量(10mg/kg)腹腔注射，小鼠饮食和饮水量正常、血清电解质、葡萄糖浓度、肝功能指数、血清肌酸、淀粉酶、血细胞比容等与正常对照鼠无显著差异。
7.CFTR抑制剂多重抗药性活性(MDR-1)分析结果由于CFTR在结构上与ABC(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白MDR-1具有同源性，因而我们研究了CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7对MDR-1的抑制作用。我们利用测定3H-长春新碱在人支气管细胞9HTEo-/Dx中的积累程度来测定多重抗药性蛋白(multidrug resistance protein-1，MDR-1)的活性。具体方法为以阿霉素诱导9HTEo-/Dx细胞表达MDR-1(Rasola et al.1994 J.Biol.Chem.2691432-1436)，然后将细胞按200,000/孔的量铺于24孔板中，48小时后将上述细胞用洗涤液(含130mM NaCl，2mM KCl，1mM KH2PO4，2mM CaCl2，2mM MgCl2，10mM Na-HEPES pH7.3)洗涤并与200μl含有3H-长春新碱(0.7μM；1μCi/ml)及待测样品的溶液在37℃保温1小时。最后将上述细胞用事先预冷的洗涤液洗涤3次，细胞以0.25M NaOH裂解后测定放射剂量。当CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7为5μM时其对MDR-1转运长春新碱的转运活性均没有抑制作用。
实施例4本实施例描述CFTR抑制剂小分子抑制剂抑制霍乱毒素诱导的小鼠小肠分泌实验方法及结果。
将实验动物禁食(不禁水)12小时后麻醉，手术于回肠部分别结扎三个2-10厘米长的结段。肠内给药时，向每段肠腔内注射0.2-2毫升磷酸缓冲液，内含如下成分第一段(无其它成分)；第二段(含10-100微克CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7)；第三段(含1-10微克霍乱毒素和10-100微克CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7)；第四段(含1-10微克霍乱毒素和10-100微克CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7无活性类似物)；第五段(含1-10微克霍乱毒素)。术后关闭腹腔，催醒动物，令其自由活动。于6小时处死动物，取出各段小肠，称重和测量长度，计算重量/长度比。结果发现，6小时后液体在注射了霍乱毒素的小肠内大量积聚，导致肠段极度膨胀，同时注射了霍乱毒素和CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7实验组液体在小肠内的积聚减少80％以上。
静脉给药时，将实验动物分为两组，所有动物于回肠部分别结扎二个2-10厘米长的结段。分别向每段肠腔内注射0.2-2毫升磷酸缓冲液，内含1-10微克霍乱毒素，术后关闭腹腔，维持动物的麻醉状态。于术后2小时起按0.25毫克/公斤体重给第一组动物静脉滴注CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7生理盐水溶液，第二组动物静脉滴注没有活性的CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7类似物生理盐水溶液4小时滴完。取出各段小肠，称重和测量长度，计算重量/长度比。结果发现，静脉注射CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7组，液体在小肠内的积聚减少60％以上。
实施例5本实施例描述CFTR抑制剂小分子抑制剂抑制对猪传染性腹泻的治疗作用实验方法及结果本课题在长春市城西种猪场进行了一项实地抗腹泻研究。当时该种猪场出现了严重的仔猪黄痢流行，主要发生于出生后3-10天的新生仔猪，多呈现整窝发病。病猪表现为水样腹泻、迅速消瘦和严重的脱水，发病后3-7天死亡。各窝死亡率高达50-100％。研究表明，单独使用合成的CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7(0.5毫克/公斤)对10头发生传染性腹泻和严重脱水的新生仔猪进行肌肉注射，结果8头病猪度过危险期并康复，疗效极为显著。而DMSO注射的10头仔猪中只有2头存活。
另外，在仔猪传染性腹泻高发期对随机选择的3窝共33头仔猪按0.25mg/kg进行每日一次、连续7天的预防性用药，结果仔猪30天内无一发生腹泻。血生化分析显示用药组和DMSO对照组的肝功能、肾功能、电解质、血糖以及血浆总蛋白等指标均无明显差异，表明无明显的体内毒性作用。
实施例6本实施例描述CFTR抑制剂小分子抑制剂诱导猪囊性纤维化模型实验方法及结果给新生仔猪按0.25mg/kg体重剂量肌肉注射CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7，每日两次(隔12小时)，连续注射给药。连续给药90天。肺部和支气管粘膜下腺体出现与囊性纤维化症状相似的病理变化。
实施例7本实施例描述CFTR抑制剂小分子抑制剂抑制对cAMP刺激的原代培养ADPKD囊肿衬里上皮细胞液体分泌速度的影响的实验方法及结果。
ADPKD囊肿衬里上皮细胞的原代培养将分离获得的ADPKD小鼠(Pkd2WS25/-型)和人肾囊肿组织(多囊肾组织和分离的单个囊肿来自临床上接受肾移植或由于并发症而部分或全部切除的病肾，事先征得患者同意。一般每月可获得1-2次标本)以PBS冲洗囊腔3次，以XIV型蛋白酶在4℃酶解过夜，然后以无血清DME-F12培养液冲洗囊腔，收集囊肿衬里上皮细胞。将上述上皮细胞继续在无血清DME-F12培养液(含有2％胎牛血清，胰岛素，转铁蛋白，乙醇胺，磷酸乙醇胺，氢化可的松，三碘甲腺原氨酸，视黄酸，牛垂体抽提液)培养、扩增。
ADPKD囊肿衬里上皮细胞CFTR介导的Cl-电流测定将上述细胞经胰酶消化，高密度铺在可渗透载质(Transwell-COL，Costar)上培养24小时，然后将底部培养液换成DME-F12混合培养液(含有2％胎牛血清，胰岛素，转铁蛋白，乙醇胺，磷酸乙醇胺，氢化可的松，三碘甲腺原氨酸，视黄酸，牛垂体抽提液)，顶部面对空气继续培养大约10天左右可获得具有极性的单层柱状上皮细胞层。用Ussing chamber测定CFTR介导的Cl-电流，测定方法为将处于极性生长状态的单层ADPKD上皮细胞的Snapwell放入Ussing chamber(Physiologic Instruments，Inc)中。然后将基底膜一侧加入含有130mM NaCl，2.7mMKCl，1.5mM KH2PO4，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，10mM葡萄糖，10mM Na-Hepes(pH7.3)及不同浓度的CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7溶液，而上皮膜一侧加入含有65mM葡萄糖酸钠，65mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，2mMCaCl2，0.5mM MgCl2，10mM葡萄糖，10mM Na-Hepes(pH7.3)的溶液。将系统于37℃连续通入空气，然后以250μg/ml两性霉素B对基底膜进行通透性处理。测定时将Ussing槽与DVC-1000电压钳相连(WorldPrecision Instruments)，测定Ag/AgCl电极和1M KCl琼脂糖桥之间的短路电流，研究发现CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7均能够快速有效地抑制FRT细胞的短路电流，并且该抑制活性与其浓度呈正相关。
ADPKD囊肿衬里上皮细胞液体分泌测定用滤纸法测定跨上皮液体分泌时将上述获得的具有极性的单层柱状上皮细胞层底部培养液中分别加入cAMP和不同浓度的CFTR特异性抑制剂CaCl2，0.5mM MgCl2，10mM葡萄糖，10mM Na-Hepes(pH7.3)及不同浓度的CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7。研究发现CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7均能够快速有效地抑制ADPKD囊肿衬里上皮细胞液体分泌。
实施例8本实施例描述CFTR抑制剂小分子抑制剂抑制离体培养ADPKD患者肾囊肿组织液体分泌速度的影响的实验方法及结果。
将新鲜的ADPKD肾保存在预冷的DME-F12组织培养液中，分离处于肾脏表面的体积重量为5-50g的囊肿组织。无菌注射器将囊肿腔液彻底吸出，准确记录个囊肿中液体体积，将囊肿分成A、B、C组。A组囊肿中重新注射1/3体积的混合囊肿腔液；B组囊肿中注射1/3体积的含有10mol/L CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7的混合囊肿腔液；C组囊肿中注射1/3体积的含有10mol/L CFTRact-09(一种CFTR特异的激活剂)混合囊肿腔液。将上述A、B、C三组囊肿分别置于含有10mol/L forskolin的DME-F12组织培养液(含有5％胎牛血清、胰岛素、转铁蛋白、硒、皮质醇、三碘甲腺原氨酸、青霉素和链霉素)中，在二氧化碳孵箱中(37℃，湿度为90％，CO2浓度为5％，空气浓度为95％)培养24小时后测定各组囊肿重量的变化，以囊肿重量的变化除以囊肿的表面积得到囊肿单位表面积液体分泌的速度。以A组为对照，结果发现CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7均能够显著抑制囊肿液体分泌速度。
权利要求
1.嘧啶(硫)酮类化合物在制药中的应用，其特征是嘧啶(硫)酮类化合物在制备治疗分泌型腹泻及常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。
2.嘧啶(硫)酮类化合物制备治疗分泌型腹泻及常染色体显性遗传性多囊肾病药物的剂型，其特征是嘧啶(硫)酮类化合物可以与合适的、药用载体、稀释剂、赋型剂或佐剂做成固体、半固体、液体或者气体的形式即片剂、胶囊、粉剂、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂；嘧啶(硫)酮类化合物能够通过多种途径给药包括口服、口腔、直肠、静脉、腹膜下、皮下、气道；嘧啶(硫)酮类化合物还可以是其药用盐形式，可以单独或联合或与其它的药物活性化合物共同施用。
3.一种猪囊性纤维化模型的建立方法，其特征是给新生仔猪按0.25mg/kg体重剂量肌肉注射CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7，每日两次，间隔12小时，连续注射给药90天，肺部和支气管粘膜下腺体出现与囊性纤维化症状相似的病理变化。
全文摘要
本发明涉及嘧啶(硫)酮类化合物在制备治疗分泌型腹泻及常染色体显性遗传性多囊肾病药物中的应用。囊性纤维化跨膜电导调节因子是一种受环腺苷单磷酸激活的Cl
文档编号A61P13/12GK1739521SQ20051001713
公开日2006年3月1日 申请日期2005年9月12日 优先权日2005年9月12日
发明者麻彤辉, 杨红 申请人:东北师范大学