专利名称：标记前哨淋巴结的微纳米级染料及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种标记前哨淋巴结的微纳米级染料及将标记淋巴结的染料连接到由高分子形成的微米粒子或纳米粒子中的方法，并将连接在由高分子形成的微粒上的染料应用于标记识别前哨淋巴结。属于微纳米技术和临床医学基础的交叉领域。
背景技术：
前哨淋巴结的活检为肿瘤(如乳腺癌)患者免于肿瘤淋巴结清扫提供了有力的依据。因为前哨淋巴结是肿瘤向远处转移的第一站，大多数患者在经过前哨淋巴结活检后可正确判断剩余淋巴结的情况。尽早发现前哨淋巴结是否有转移，对肿瘤的临床分期以及据此对肿瘤进行相应的治疗至关重要。
临床医生寻找前哨淋巴结的方法通常是通过对前哨淋巴结进行标记示踪，常用方法有3种应用活性染料对淋巴进行染色，应用放射性核素进行淋巴造影，以及将这两种方法进行联合使用。
放射性核素进行淋巴造影可以精确地定位放射性最强的淋巴结，然后直接在该部位做皮肤切口，可使手术创伤降到最小。但该方法所使用的材料存在放射污染，同时价格昂贵。采用染料来标记淋巴结，一般在几分钟内就可发现淋巴管和淋巴结被染蓝，是一种目前较好的方法。将蓝染料与放射性核素联合使用可明显提高定位前哨淋巴结的准确性。如Jose M等人[Jose M，et al.Intraoperative sentinel node identification in early stagecervical cancer using a combination of radiolabeled albumininjection and isosulfan blue dye injection.GynecologicOncology，2004，92845-850]采用放射性物质标记的人血清白蛋白与异硫蓝(isosulfan)联合使用来辨认早期宫颈癌的前哨淋巴结，结果在23位病人中，总共有51枚前哨淋巴结被检测到，准确率达到100％。
然而，单纯地使用染料有很大缺陷。由于染料分子小，染料分子在到达前哨淋巴结后，将在几分钟内从前哨淋巴结流入下一组淋巴结，外科医生一般要在术中每隔15～20分钟要重新注射一次染料，否则染料将被淋巴通道快速转运而使前哨淋巴结颜色变淡，影响操作。由于染料往往快速流过前哨淋巴结，用染料制作的淋巴结定位图有时会发生错误。
因此，增大染料的尺度，则可以克服单纯地使用染料的不足。研究表明，当间质和腹膜内注射小于1000nm的胶体纳米粒子后，这些胶体粒子可被毛细淋巴管摄取，并畜积在淋巴结。注射微米级乳剂粒子时，可在附近的淋巴结内发现10μm以下的乳滴。
如果使染料能够被前哨淋巴结截留并能较长时间地停留在前哨淋巴结，则将显著减少染料注射的次数，给术者带来极大的方便。
发明内容
针对已有技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种提高前哨淋巴结活检的准确率的标记前哨淋巴结的微纳米级染料；本发明的目的之二在于提供这种染料的制备方法；本发明的目的之三在于提供这种染料的应用。
本发明的发明目的是通过以下技术方案实现的一种标记前哨淋巴结的微纳米级染料，其组成及配比(重量百分比)如下染料为0.01～5wt％，高分子纳米粒子或微米粒子为1～10wt％，其余为高分子粒子表面修饰的稳定剂和溶剂。
所述的高分子是指天然高分子、半合成高分子、合成高分子中的任意一种或几种的组合。
所述的高分子具有淋巴亲和性，生物相容性，生物可降解性，分子量不小于4000。
所述的由高分子形成的纳米或微米粒子为球形、椭球形、圆饼形或其他不规则形状。纳米粒子的粒径或当量粒径为5nm～1μm，微米粒子的粒径或当量粒径为1～10μm。
所述的标记淋巴结的染料是指可在临床上使用的染料，包括异硫蓝(isosulfan blue)，美蓝(methythionium)，专利蓝(patentblue)，伊文思蓝(evans blue)，靛卡红(indigocarmine)等任意一种及任意几种的组合。
本发明的制备方法如下本发明将标记淋巴结的染料连接到由高分子形成的微米或纳米粒子上，使小分子级的染料转变为纳米量级或微米量级的染料。并将连接了染料分子的由高分子形成的微米或纳米粒子用于标记识别前哨淋巴结。
所述的连接方法是指将染料分子通过吸附、包埋、化学键合等任意一种或几种方法结合到由高分子形成的微米或纳米粒子上。连接是在水相或有机相中进行或在水与有机溶剂的混合相中进行，连接时间为1分钟～10天，温度为1～100℃或不超过有机溶剂的沸点温度。
所述的高分子纳米粒子是在油包水型(W/O)微乳或水包油型(O/W)微乳中制备的。
所述的高分子纳米粒子是通过乳液聚合获得的，聚合方法是指种子乳液聚合或无皂乳液聚合。获得的高分子纳米粒子粒径分布在100nm～1μm。
所述的高分子微米粒子是在分散聚合体系中通过高分子单体聚合反应获得的，获得的高分子微米粒子粒径分布在1μm～10μm。
所述的高分子纳米粒子或微米粒子是通过直接将水不溶性高分子的有机溶液进行喷雾干燥获得的。通过调整喷雾干燥的条件如进料浓度、进料速度、干燥温度、雾化盘转速或喷射速度等，获得800nm～10μm的高分子粉末粒子。
所述的高分子纳米粒子或微米粒子是通过聚合反应、或交联作用、或沉淀析出等任意一种方法或几种方法获得的。
染料分子是在高分子纳米粒子或微米粒子形成前加入的，或形成过程中加入的，或形成后加入的。染料分子是通过吸附、包埋、化学键合等任意一种或几种方法连接到在高分子纳米粒子或微米粒子上的。
本发明在水相中，在加热和(或)加压的条件下通过高分子纳米粒子或微米粒子的溶胀效应，染料分子扩散进入高分子孔隙和吸附到高分子表面，从而将染料分子连接到纳米粒子或微米粒子上，具体方法是将高分子纳米粒子或微米粒子直接分散到去离子水或蒸馏水或0.9％的生理盐水或缓冲溶液中，或用去离子水或蒸馏水或0.9％的生理盐水或缓冲溶液和(或)不能溶解高分子纳米粒子的有机溶剂洗涤后再分散到去离子水或蒸馏水或0.9％的生理盐水或缓冲溶液中，然后加入标记前哨淋巴结的染料分子的水溶液或粉末，搅拌混合，混合体系中染料分子浓度为0.01～5wt％，高分子纳米粒子或微米粒子浓度为1～10wt％，其余为溶剂和高分子粒子表面修饰的稳定剂。染料分子与高分子纳米粒子或微米粒子发生作用的条件是在40℃～100℃和常压，或在1～100℃和1.2～5个大气压下进行的，混合时间为1min～10天，然后将高分子纳米粒子或微米粒子与染料分子的混合体系冷却到室温和(或)降压到常压状态以停止高分子的溶胀，通过离心将连接了染料分子的高分子纳米粒子或微米粒子从混合体系中分离，洗去游离的染料分子，最后将连接了染料分子的粒子分散到水相中保存或通过真空干燥或冷冻干燥成粉末。
本发明还在有机相或有机相与水相的混合液中，通过高分子纳米粒子或微米粒子的溶胀效应将染料分子连接到纳米粒子或微米粒子上，具体方法是将高分子纳米粒子或微米粒子直接分散到可使高分子纳米粒子或微米粒子发生溶胀的有机溶剂中，或用去离子水或蒸馏水或0.9％的生理盐水或缓冲溶液和(或)不能溶解高分子粒子的有机溶剂将高分子纳米粒子或微米粒子洗涤后再分散到可使高分子纳米粒子或微米粒子发生溶胀的有机溶剂中，然后加入标记前哨淋巴结的染料分子的粉末或其水溶液或其有机溶液，搅拌混合，混合体系中染料分子浓度为0.01～5wt％，高分子纳米粒子或微米粒子浓度为1～10wt％，其余为溶剂和高分子粒子表面修饰的稳定剂。在常压和不超过有机溶剂沸点的温度下混合1min～10天后，通过离心将连接了染料分子的高分子纳米粒子或微米粒子从混合体系中分离，用去离子水或蒸馏水或0.9％的生理盐水或缓冲溶液和(或)不能溶解高分子纳米粒子或微米粒子的有机溶剂进行洗涤，最后将连接了染料分子的粒子干燥成粉末或分散到水相中保存。
所述的可溶胀高分子纳米粒子或微米粒子的有机溶剂是指甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、庚烷、乙醚、石油醚、甲醛、乙醛、丙醛、丙酮、环己酮、四氢呋喃、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、三氯甲烷、苯、甲苯、苯甲醇、间甲苯、硝基苯、甲酸、二甲亚砜、二硫化碳中的任何一种或任意几种的任意比组合。
所述的高分子纳米粒子或微米粒子染料，表面修饰有增强它们水溶液稳定性的稳定剂，表面的修饰度为0-99％摩尔比，修饰方式为物理作用或化学键合。稳定剂分子是指亲水性高分子，疏水性高分子，表面活性剂，电解质，等，及其任意组合。这些稳定剂是在染料分子与高分子纳米粒子或微米粒子连接前加入的，或在连接过程中加入的，或在连接后加入的。
本发明将染料分子连接在由高分子形成的纳米粒子或微米粒子上之后，进行灭菌，灭菌方式为加热灭菌或热压灭菌或滤过除菌或紫外灯辐照或其他无菌操作中的任意一种。
本发明获得的标记前哨淋巴结的微纳米级染料，其应用领域为普外科，尤其是肿瘤前哨淋巴结的活检。
本发明将标记淋巴结的染料通过吸附、包埋、化学键合等任意一种或几种方法连接到通过多种方法获得的高分子纳米粒子或微米粒子上，使小分子级的染料转变为纳米量级和微米量级的染料，并将连接了染料的高分子纳米粒子或微米粒子用于标记识别前哨淋巴结，借助高分子纳米粒子或微米粒子的体积效应以及高分子对淋巴的亲和性的优势，使染料能被前哨淋巴结截留或减慢流过前哨淋巴结的速度，避免了单纯的染料因分子体积小而容易流过前哨淋巴结的缺陷，在普外科领域具有重要的应用价值和广阔的应用前景。
具体实施例方式
下面结合具体的实施例进一步说明本发明是如何实现的实施例1将精确量取的10mL环己烷、2mL Triton X-100和2mL正己醇混合，向混合液中加入3mL浓度为1w％pH为3.5的壳聚糖溶液和适量异硫蓝水溶液，振荡后得澄清透明的蓝色微乳液。然后向微乳中滴加适量0.1％的戊二醛，搅拌1h后，加入分散剂和氨水，继续搅拌，即得到壳聚糖纳米球。
以12857g的离心力离心10min，用去离子水和乙醇交替洗涤沉淀3次。然后将沉淀分散于去离子水中，并移入10mL的安瓿中，100℃蒸汽灭菌30min。
产物外观呈蓝色，透射电子显微镜观察表明，所得产物除了少部分颗粒发生了团聚外，大部分粒子为50～100nm。
实施例2将精确量取的10mL环己烷、2mL Triton X-100和2mL正己醇混合，向混合液中加入3mL浓度为1w％pH为3.5的壳聚糖溶液，然后向微乳中滴加适量0.1％的戊二醛，搅拌1h后，加入异硫蓝水溶液，继续搅拌1h，然后加入分散剂和氨水溶液至pH＝9，搅拌1h，即得到蓝色壳聚糖纳米球。
以12857g的离心力离心10min，用去离子水和乙醇交替洗涤沉淀3次。然后将沉淀分散于去离子水中。
所得产物结果与实施例2接近。沉淀呈现蓝色，粒子主要分布在50～70nm左右。
实施例3将精确量取的10mL环己烷、2mL Triton X-100和2mL正己醇混合，向混合液中加入3mL浓度为1w％pH为3.5的壳聚糖溶液，振荡后得澄清透明的无色微乳液。然后向微乳中滴加适量0.1％的戊二醛，搅拌1h后，加入分散剂和氨水，继续搅拌1h，即得到壳聚糖纳米球。
向壳聚糖纳米球微乳液中加入1mL异硫蓝水溶液，在35～38口条件下搅拌5h。然后以12857g的离心力离心10min，用去离子水和乙醇交替洗涤沉淀3次，将沉淀分散于去离子水中。
所得产物外观呈蓝色，大部分粒子亦为50～70nm左右。
实施例4按实施例3制备不含异硫蓝的壳聚糖纳米粒子，然后用去离子水和乙醇交替洗涤所得的壳聚糖纳米粒子3次，再将壳聚糖纳米粒子分散于水相中，并加入美蓝溶液。混合液中，壳聚糖纳米粒子的比例占10wt％，蓝染料占0.5wt％，其余为溶剂相。将混合液分成三份，一份置于100℃水浴中，常压下搅拌30min；一份置于70℃水浴中，常压下搅拌2天；另一份置于40℃水浴中，常压下搅拌10天。然后将混合液冷却至室温，离心分离沉淀并用去离子水洗涤3次。
结果均得到了蓝色的沉淀，部分粒子聚集成亚微米尺度，但约40％左右的粒子仍主要分布在50～150nm。
实施例5将经过氢氧化纳洗涤的60mL苯乙烯单体和300mg的K2S2O3加入到1000mL含NaCl的去离子水中，在氮气保护和75℃下高速搅拌回流反应0.5h，用甲醇分离产物，并用去离子水和甲醇反复洗涤分离出的沉淀，然后冷冻干燥。结果得到粒度主要分布在50～150nm的球形聚苯乙烯粉末粒子。按下面的方法将美蓝分子连接到聚苯乙烯粒子上。
(1)取聚苯乙烯粉末适量，分散到水相中，加入适量美蓝水溶液，混合液中，聚苯乙烯微球占10wt％，蓝染料占5wt％，其余为水相。然后在60℃和5个大气压下处理30min，再冷却至室温。离心并用去离子水洗涤沉淀3次。
(2)取聚苯乙烯粉末适量，分散到水相中，加入适量美蓝，混合液中，聚苯乙烯微球占1wt％，蓝染料占0.01wt％，其余为水相。将混合液分成三份，一份在60℃和5个大气压下处理1min；一份在1℃和5个大气压下处理2h；另一份在100℃和1.2个大气压下处理10天，然后分离微球，进行分析。
(3)取聚苯乙烯粉末适量，分散到含10mL丁醇和0.5mL的三氯甲烷的混合液中，加入异硫蓝溶液。常温常压下混合24h，然后离心并用去离子水洗涤沉淀3次。
结果，白色聚苯乙烯微球均转变成了蓝色微球，粒度主要分布在70～400nm，适当控制上述条件可得到100nm左右的具有较好分散性的蓝色微球。
实施例6将经过氢氧化纳洗涤的30mL苯乙烯单体、6mL丙烯酸、400mg的K2S2O3和0.4g聚乙烯醇加入到500mL去离子水中，在氮气保护和75℃和高速搅拌下回流反应10h.用甲醇分离产物，并用去离子水和甲醇反复洗涤分离出的沉淀，然后冷冻干燥。结果得到粒度主要分布在800nm～15μm的球形表面带羧基的聚苯乙烯粉末粒子。
取聚苯乙烯粉末300mg，分散到含10mL丁醇和0.5mL的三氯甲烷的混合液中，加入异硫蓝溶液，45℃和常压下混合2h，然后离心并用去离子水洗涤沉淀3次，最后将微球分散到含PEG2000的水相中。
结果得到蓝色微球并具有良好的分散性。
实施例7将精确称取的牛血清白蛋白和异硫蓝溶于水溶液中，牛血清白蛋白的浓度为0.07g·mL-1，异硫蓝浓度为0.01g·mL-1。然后喷雾干燥，条件是进风温度为110℃，出风温度为75±2℃，进料速度为3mL·m in-1，雾化盘转速为20000r·m in-1，空气为载气。
结果得到蓝色粉末样品，扫描电子显微镜观察发现，大部分粉末粒子主要为实心球形、少部分微球有孔洞和凹陷，粒度主要分布在2～5μm。
实施例8先按实施例5制备100nm左右的包埋美蓝的聚苯乙烯微球，经过灭菌后，将其配制适当浓度的无菌生理盐水溶液，超声分散2分钟。
取成年健康雌性新西兰大白兔1只，体重约2.5kg，以4％的水合氯醛将其麻醉。取仰卧位将其固定，煎去胸部至腋窝处体毛，在左右两侧第2对乳腺上方开始切开皮肤约8cm长，暴露引流第2对乳腺的腋窝淋巴结，然后于两侧乳晕四周分上下左右注射包埋美蓝的聚苯乙烯微球混悬液1mL，轻轻按摩注射部位约2min。
结果约10min左右便可在每侧腋窝处能辨认蓝染的淋巴结，约2小时后，染色处亦未明显褪色。
权利要求
1.一种标记前哨淋巴结的微纳米级染料，其组成及配比(重量百分比)如下染料为0.01～5wt％，高分子纳米粒子或微米粒子为1～10wt％，余量为高分子粒子表面修饰的稳定剂和溶剂。
2.根据权利要求1所述的一种标记前哨淋巴结的微纳米级染料，其特征在于所述的高分子为具有淋巴亲和性、生物相容性、生物可降解性、分子量不小于4000的天然高分子、半合成高分子、合成高分子中的任意一种或一种以上的混合物。
3.根据权利要求1所述的一种标记前哨淋巴结的微纳米级染料，其特征在于所述染料为异硫蓝、美蓝、专利蓝、伊文思蓝或靛卡红中的一种或一种以上的混合物。
4.根据权利要求1所述的一种标记前哨淋巴结的微纳米级染料，其特征在于所述稳定剂分子为亲水性高分子、疏水性高分子、表面活性剂、电解质中的一种或一种以上的混合物。
5.根据权利要求1或2任意一项权利所述的一种标记前哨淋巴结的微纳米级染料，其特征在于所述的高分子纳米粒子或微米粒子是通过聚合反应、或交联作用、或沉淀析出等任意一种方法或几种方法获得的。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的一种标记前哨淋巴结的微纳米级染料，其制备方法如下将染料分子通过吸附、包埋、化学键合方法中的一种或一种以上结合到由高分子形成的微米或纳米粒子上，连接是在水相或有机相中进行或在水与有机溶剂的混合相中进行，染料分子是在高分子纳米粒子或微米粒子形成前或形成过程中或形成后加入的，连接时间为1分钟～10天，温度为1～100℃或不超过有机溶剂的沸点温度，将高分子纳米粒子或微米粒子与染料分子的混合体系冷却到室温和(或)降压到常压状态以停止高分子的溶胀，通过离心将连接了染料分子的高分子纳米粒子或微米粒子从混合体系中分离，洗去游离的染料分子，最后将连接了染料分子的纳米粒子或微米粒子分散到水相中保存或通过真空干燥或冷冻干燥成粉末。
7.根据权利要求6所述的一种标记前哨淋巴结的微纳米级染料的制备方法，其特征在于所述的可溶胀高分子纳米粒子或微米粒子的有机溶剂是指甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、庚烷、乙醚、石油醚、甲醛、乙醛、丙醛、丙酮、环己酮、四氢呋喃、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、三氯甲烷、苯、甲苯、苯甲醇、间甲苯、硝基苯、甲酸、二甲亚砜、二硫化碳中的任何一种或一种以上的混合物。
8.根据权利要求6或7任意一项权利要求所述的一种标记前哨淋巴结的微纳米级染料的制备方法，其特征在于将染料分子连接在由高分子形成的纳米粒子或微米粒子上之后，进行灭菌，灭菌方式为加热灭菌或热压灭菌或滤过除菌或紫外灯辐照或其他无菌操作中的一种。根据权利要求1-5所述的一种标记前哨淋巴的微纳米级染料，应用在普外科中，尤其应用于肿瘤前哨淋巴结的活检。
全文摘要
本发明公开了标记前哨淋巴结的微纳米级染料及其制备方法和应用，本发明将标记淋巴结的染料通过吸附、包埋、化学键合等任意一种或几种方法连接到高分子纳米或微米粒子上，使小分子级的染料转变为纳米量级和微米量级的染料，并将连接了染料的高分子纳米粒子或微米粒子用于标记识别前哨淋巴结，所提供的由高分子形成的纳米粒子或微米粒子连接的染料，可借助高分子纳米粒子或微米粒子的空间体积的位阻效应以及高分子对淋巴亲和性的优势，使染料能被前哨淋巴结截留或减慢流过前哨淋巴结的速度，可成为肿瘤前哨淋巴结活检的新型标记示踪材料，在临床上具有广阔的应用前景。
文档编号A61K49/06GK1698908SQ200510025588
公开日2005年11月23日 申请日期2005年4月29日 优先权日2005年4月29日
发明者储茂泉, 金鑫 申请人:同济大学