专利名称：一种玄参总苷提取物及其制备方法和在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药制药领域，涉及一种从中药玄参中提取分离的用于治疗缺血性脑中风的玄参总苷提取物，本发明还涉及含有该提取物的药物组合物、该提取物的制备方法和该提取物在制药中的应用。
背景技术：
缺血性脑中风即脑梗塞，包括脑血栓形成、脑栓塞等，其主要病理变化是在脑动脉硬化的基础上，血管内形成血栓，阻塞了血流，造成脑组织的缺血、缺氧和坏死。脑中风是中老年人最常见的疾病之一，具有发病率和复发率高、致死率和致残率高的特点，是目前人类三大死因之一。据统计，我国脑中风发病率为248.58/10万人，每年新增病例约250万人；我国每年有约160万人死于脑中风，多数患者由于偏瘫致残丧失劳动力和生活自理能力。西医治疗缺血性脑中风的抗血小板和抗凝剂多有严重的胃肠道反应、皮疹、降低血小板和白细胞、有出血倾向等副作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种从玄参中提取的纯度较高的疗效好、用量低、基本无毒副作用的中药提取物。
本发明的另一个目的是提供含有该提取物的药物组合物。
本发明的再一个目的是提供该提取物的制备工艺。
本发明还有一个目的是提供该提取物或含有该提取物的药物组合物在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。
本发明的目的可通过下列措施来实现一种玄参总苷提取物，其中玄参总苯丙素苷类的含量大于40％，玄参总环烯醚萜苷类的含量大于10％。
所述的玄参总苷提取物，该提取物是经过下列步骤制备得到的(1)取玄参药材，用5～20倍生药量的40～90％的乙醇提取1～3次，每次1～3小时，提取液过滤，浓缩；
(2)浓缩液加乙醇至含醇量40～80％，静置沉淀，上清液过滤，浓缩；(3)浓缩液用非极性或弱极性大孔吸附树脂柱层析，用水洗脱，至流出液无还原糖反应后，再用3～20倍生药量的浓度为20～90％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；(4)洗脱液浓缩，干燥，即得玄参总苷提取物。
所述的玄参总苷提取物，其中非极性或弱极性大孔吸附树脂柱的型号是HPD-100、HPD-400、AB-8、D-101、D-301、NKA-9。
含有上述的玄参总苷提取物的药物组合物。该药物组合物，由所述的玄参总苷提取物和药学上可接受的载体组成；还可以添加其他活性成分组成药物组合物。药学上可接受的载体是指一种或几种惰性的、非毒性的固体或液体填充物、稀释剂、助溶剂等，它们不逆向与活性化合物或病人发生作用。
所述的药物组合物，其制剂形式为片剂、胶囊、软胶囊、丸剂、滴丸、栓剂、口服液、混悬液、注射液或注射用冻干粉等药剂学上常用的剂型。
所述的玄参总苷提取物的制备方法，经过以下步骤(1)取玄参药材，用5～20倍生药量的40～90％的乙醇提取1～3次，每次1～3小时，提取液过滤，浓缩；(2)浓缩液加乙醇至含醇量40～80％，静置沉淀，上清液过滤，浓缩；(3)浓缩液用非极性或弱极性大孔吸附树脂柱层析，用水洗脱，至流出液无还原糖反应后，再用3～20倍生药量的浓度为20～90％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；(4)洗脱液浓缩，干燥，即得玄参总苷提取物。
所述的玄参总苷提取物的制备方法，其中非极性或弱极性大孔吸附树脂柱的型号是HPD-100、HPD-400、AB-8、D-101、D-301、NKA-9。
所述的玄参总苷提取物或药物组合物在制备治疗和/或预防缺血性脑中风的药物中的应用。
本发明的提取物中含有苯丙素苷类、环烯醚萜苷类和其他物质，一般地，提取物中玄参总苯丙素苷类的含量大于40％，玄参总环烯醚萜苷类的含量大于10％，因此在质量控制中可以用总苯丙素苷类的含量和总环烯醚萜苷类的含量作为质量指标。
本发明的有益效果本发明提取物疗效好、用量低、基本无毒副作用，其制备工艺简单、提取纯度高。
以下是部分药效学实验及数据
一、对小鼠凝血时间的影响实验目的通过玻片法判明玄参总苷对小鼠凝血时间的影响。
实验材料动物健康ICR小鼠(18-22克，雌雄各半，60只，由南京军事医学研究所提供，动物许可证号SCXK(苏)2002-0025)。器材载玻片、大头针、秒表。药品与试剂玄参总苷(由深圳市凯尔腾科技有限公司提供，批号040819，按本发明实施例1制备，下同)，血塞通片(生产厂家云南金泰得三七产业股份有限公司；产品批号040511)；每天用生理盐水新鲜配制(表1)表1 剂量换算表(小鼠给药体积为0.2ml/10g，每天称量体重后给药)
实验方法1、取18～22g小鼠60只，雌雄各半，随机共分为5组(见实验分组设计)，称重。
I、阴性对照 生理盐水II、阳性对照血塞通片(1.95mg/ml)III、试验组1玄参总苷(0.975mg/ml) 等效剂量组IV、试验组2 玄参总苷(1.95mg/ml)2倍等效剂量组V、试验组3 玄参总苷(3.9mg/ml) 4倍等效剂量组2、每组按上述剂量灌胃(0.2ml/10g/day)，灌胃持续7天。
3、第8天用玻片法取血测定凝血时间。
玻片法用眼科弯镊迅速摘去一侧眼球，即有血液流出。于载玻片两端各滴一滴血，血滴直径约为5mm，立即用秒表计时。每隔5秒用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动一次，并观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝止，所历时间即为血凝时间。另一滴血供最后复验。记录凝血时间，作均数显著性测验。
实验结果见表2表2 玄参总苷对小鼠凝血时间的影响(玻片法)(X±SD，n＝10)
(*p＜0.05，**p＜0.01，与阴性对照比较。)实验结论通过玻片法判断玄参总苷三个不同剂量和血塞通片对小鼠凝血时间的影响，结果表明玄参总苷具有良好的抗凝血作用，与阴性对照组比较有非常显著性差异，并明显优于阳性对照组，其口服作用剂量为19.5mg/kg。
二、对胶原蛋白-肾上腺素诱发小鼠体内血栓形成的抑制作用实验目的测定玄参总苷对胶原蛋白-肾上腺素诱发小鼠体内血栓形成的抑制作用实验材料动物健康ICR雄性小鼠(25～34g，60只，由南京军事医学研究所提供，动物许可证号SCXK(苏)2002-0025)。仪器与器材小鼠尾静脉注射液装置，灌胃器。药品与试剂玄参总苷(由深圳市凯尔腾科技有限公司提供，批号040819)，阿司匹林肠溶片(生产厂家南京白敬宇制药有限责任公司；产品批号040901)，胶原蛋白(南京大治生物科技有限公司)，肾上腺素(天津金耀氨基酸有限公司，产品批号0306051)，生理盐水。
表3 剂量换算表(小鼠给药体积为0.2ml/10g，每天称量体重后给药)
实验方法取60只小鼠，随机分成5组，称重。
I、阴性对照 生理盐水II、阳性对照阿司匹林肠溶片(1mg/ml)III、试验组1玄参总苷(0.975mg/ml) 等效剂量组IV、试验组2 玄参总苷(1.95mg/ml)2倍等效剂量组V、试验组3 玄参总苷(3.9mg/ml) 4倍等效剂量组对照组等容积的生理盐水，实验组分别给玄参总苷(0.975mg/ml，1.95mg/ml，3.9mg/ml三个剂量组)，阿司匹林肠溶片(1mg/ml)，均灌胃给药(每组按上述剂量灌胃0.2ml/10g/day)，灌胃持续8天。
第9天给药1小时后尾静脉注射胶原蛋白(225ug/只)与肾上腺素(9ug/只)的混合诱导剂(体积0.09ml/10g)。
注射后即观察5分钟之内小鼠死亡数或15分钟小鼠偏瘫的未恢复数。
计算药物对小鼠脑血栓的保护率，x2检验。
1.6尼龙栓子的制备参照文献方法，将一长50mm，直径0.24mm的尼龙线的一端加热熔成光滑的球形，并在距球端18.0mm处标记，酒精擦拭后备用。
2.试验方法2.1实验方案采用Longa的方法，并加以改进，用颈内动脉线栓法制备该模型。取大鼠72只，分为6组，即假手术组，血塞通片组，模型组，玄参总苷高、中、低剂量组。每组12只，灌胃给药，半小时后以10％水合氯醛麻醉(350mg/kg，ip)，仰位固定于手术台上，颈部正中切口，切开皮肤后，钝性分离，找出颈总动脉(CCA)，继续向下分离并结扎颈外动脉(ECA)及颈外动脉各分支(枕动脉、甲状腺上动脉、舌动脉和面动脉)，轻轻剥离迷走神经，分离出颈内动脉(ICA)和翼腭动脉，ECA近心端备线，用动脉夹夹闭ICA和CCA，在ECA距ICA2mm处剪一小口，将一尼龙线(直径0.24mm)插入ECA并进入CCA，轻扎备线，防止出血，剪断ECA，松开ICA的动脉夹，牵引ECA，使其和ICA约成一直线，轻轻回抽尼龙线，使其顺入ICA，继续向下推进(尼龙线插入深度约为18mm，表明尼龙线已经穿过大脑中动脉(MCA)起始段，到达大脑前动脉(ACA)近端，阻断了MCA的所有血供来源，包括来自ICA和ACA及大脑后动脉的血液供应。松开CCA动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤，回笼饲养。
缺血3h后再灌注，再灌注时轻拉尼龙线，使尼龙线拔出颅外，血流再通，修剪尼龙线，缝合皮肤，回笼自然喂养。以上过程均在室温恒定(24～25℃)情况下进行，以利于评价脑缺血情况。观察对大鼠局灶性脑缺血行为评分和脑梗塞面积的影响。
2.2大鼠实验性脑缺血行为评分法参考Bederson等的方法对术后动物的行为缺陷进行分级评分，分级标准如下
(等级分数越高，表明动物的行为缺陷越严重)2.3脑梗塞面积的测量2，4，5-三苯基四氮唑(TTC)染色测量脑梗塞面积大鼠中动脉线栓(MCAO)后24小时断头取脑，将脑置冰冷的生理盐水中(2～3℃)10min，去除嗅球、小脑和低位脑干后，用生理盐水冲洗大脑使表面不留血污，吸干周围水分后，沿冠状切四刀，切成五片。第一刀在脑前极与视交叉连线中间；第二刀在视交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。然后迅速将脑片置5ml含有1％TTC的磷酸缓冲溶液中，避光温孵30分钟，其中每隔7～8分钟翻动一次，经染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而梗塞组织呈白色，且界限分明。温孵完毕后将脑片照相，剪下红白颜色区称重计算之。然后根据重量求面积法，分别计算出五个脑片共10个平面的总面积和梗塞区域的面积，求出梗塞区面积占半球总面积的百分比，即梗塞率。
2.4脑含水量的测定动物处死后，取出大脑称湿重后将脑组织置于115℃电热干燥箱中烘至恒重，称干重，按下列公式计算脑含水量含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％脑指数＝(脑湿重/体重)×1002.5病理组织检查重复2.1试验，动物处死后，取其脑组织置于10％福尔马林内固定，常规取材、石蜡包埋，切片厚4～5μm，HE染色，病理专业人员阅片，根据病变轻重程度，依次半定量为“+”，“++”，“+++”，“++++”，无病变正常组织标记为“-”，又分别记分为1分，2分，3分，4分，0分，累加所有分数，得出总分，计算出每组动物的均分(X±SD)，分值越高提示损伤越严重，反之则说明经药物处理后损伤减轻，治疗有效。
2.6数据处理对所有数据使用Microsoft Excel软件进行数据处理，并经t检验统计分析结果。
3.结果3.1玄参总苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠的行为学评分的影响结果见表5表5 玄参总苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠的行为学评分的影响
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。与假手术组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
从上表可以看出，4h和24h时，所有试验动物均出现了不同程度的神经功能障碍。4h时，各给药组动物的行为学得分与模型组比较无显著性差异，在24h后，玄参总苷各剂量组动物的行为学评分均呈下降趋势，且显著低于模型组，经统计学处理，有显著性差异，提示玄参总苷可以改善模型动物的行为学障碍。
3.2对脑梗塞面积和梗塞率的影响见表6。
表6 对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗塞面积及梗塞率的影响(X±SD)
注与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。与假手术组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
由表2结果显示，各给药组大鼠的脑梗塞面积和梗塞率均明显低于模型组，经统计学处理，有显著性差异，提示玄参总苷可以明显缩小模型大鼠的脑梗塞面积，降低梗塞率。
3.3对脑含水量和脑指数的影响见表7。
表7 对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑指数及脑含水量的影响(X±S)
注与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。与假手术组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
由表3结果显示，模型大鼠脑指数和含水量均高于假手术组，玄参总苷高剂量、中剂量可降低模型大鼠的脑指数及脑含水量，与模型组比较均有显著性差异。提示玄参总苷可以减轻脑水肿。
3.4对缺血性脑中风病理组织学的影响见表8。
表8 玄参总苷对缺血性脑中风大鼠大脑病理组织学的影响
注与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。与假手术组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
病理组织学观察，线栓法复制出缺血性中风大鼠模型，表现为脑组织灰质和/或白质不同程度水肿，神经细胞轻度变性、坏死。阳性药及玄参总苷对脑中风模型在不同程度上有减轻脑组织损伤作用，其效果按递减次序依次为玄参总苷高剂量组，中剂量组，阳性药组，低剂量组。
4.结论从以上结果表明，玄参总苷可以改善模型动物的行为学障碍，可以明显缩小模型大鼠的脑梗塞面积，降低梗塞率；降低缺血脑组织的含水量，减轻脑水肿。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1取玄参药材，加5倍量70％乙醇回流提取1次，每次1小时，提取液过滤，浓缩；浓缩液加乙醇至含醇量为40％，静置沉淀，上清液过滤，浓缩；浓缩液上HPD-100大孔吸附树脂柱，用水洗脱至流出液无还原糖反应后，用15倍量30％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得玄参总苷提取物，其中玄参总苯丙素苷类的含量为42.7％，玄参总环烯醚萜苷类的含量为10.3％。
实施例2取玄参药材，切片，加10倍量90％乙醇回流提取2次，每次2小时，提取液过滤，浓缩；浓缩液加乙醇至含醇量为60％，静置沉淀，上清液过滤，浓缩；浓缩液上HPD-400大孔吸附树脂柱，用水洗脱至流出液无还原糖反应后，用10倍量60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得玄参总苷提取物，其中玄参总苯丙素苷类的含量为45.0％，玄参总环烯醚萜苷类的含量为12.5％。
实施例3
取玄参药材，粉碎，加15倍量40％乙醇回流提取3次，每次3小时，提取液过滤，浓缩；浓缩液加乙醇至含醇量为80％，静置沉淀，上清液过滤，浓缩；浓缩液上AB-8大孔吸附树脂柱，用水洗脱至流出液无还原糖反应后，用5倍量90％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得玄参总苷提取物，其中玄参总苯丙素苷类的含量为46.8％，玄参总环烯醚萜苷类的含量为15.9％。
实施例4每片含有100mg玄参总苷提取物的片剂的制备取实施例1方法得到的玄参总苷提取物100g，按片剂常规制备工艺，加入淀粉50g，羧甲基纤维素50g，混合均匀，2％淀粉浆为润湿剂湿法制粒，烘干、整粒，加入1％微粉硅胶，混匀压片，压制成1000片，即得。
实施例5每粒含有100mg玄参总苷提取物的胶囊的制备取实施例2方法得到的玄参总苷提取物100g，按胶囊剂常规制备工艺，加入淀粉50g，羧甲基纤维素50g，混合均匀，2％淀粉浆为润湿剂湿法制粒，烘干、整粒，加入1％微粉硅胶，混匀装胶囊，制成1000粒，即得。
实施例6每瓶含有100mg玄参总苷提取物的注射剂的制备取实施例3方法得到的玄参总苷提取物100g，按注射剂常规制备工艺，加入氯化钠900g和注射用水90000ml，搅拌溶解，加入20g活性炭80℃搅拌30分钟，初滤；再加注射用水至100000ml，精滤，分装于100ml注射用输液瓶中，灭菌，即得。
实施例7每瓶含有100mg玄参总苷提取物的冻干粉的制备取实施例3方法得到的玄参总苷提取物100g，按冻干粉常规制备工艺，加注射用水1500ml搅拌溶解后，加入甘露醇100g，搅拌溶解，再加入10g活性炭80℃搅拌30分钟，初滤；再加注射用水至2000ml，精滤，每瓶2ml分装于西林瓶中，冷冻干燥，即得。
权利要求
1.一种玄参总苷提取物，其特征在于，玄参总苯丙素苷类的含量大于40％，玄参总环烯醚萜苷类的含量大于10％。
2.根据权利要求1所述的玄参总苷提取物，其特征在于，该提取物是经过下列步骤制备得到的(1)取玄参药材，用5～20倍生药量的40～90％的乙醇提取1～3次，每次1～3小时，提取液过滤，浓缩；(2)浓缩液加乙醇至含醇量40～80％，静置沉淀，上清液过滤，浓缩；(3)浓缩液用非极性或弱极性大孔吸附树脂柱层析，用水洗脱，至流出液无还原糖反应后，再用3～20倍生药量的浓度为20～90％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；(4)洗脱液浓缩，干燥，即得玄参总苷提取物。
3.根据权利要求2所述的玄参总苷提取物，其特征在于非极性或弱极性大孔吸附树脂柱的型号是HPD-100、HPD-400、AB-8、D-101、D-301、NKA-9。
4.含有权利要求1或2所述的玄参总苷提取物的药物组合物。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物制剂形式为片剂、胶囊、软胶囊、丸剂、滴丸、栓剂、口服液、混悬液、注射液或注射用冻干粉。
6.权利要求1所述的玄参总苷提取物的制备方法，其特征在于经过以下步骤(1)取玄参药材，用5～20倍生药量的40～90％的乙醇提取1～3次，每次1～3小时，提取液过滤，浓缩；(2)浓缩液加乙醇至含醇量40～80％，静置沉淀，上清液过滤，浓缩；(3)浓缩液用非极性或弱极性大孔吸附树脂柱层析，用水洗脱，至流出液无还原糖反应后，再用3～20倍生药量的浓度为20～90％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；(4)洗脱液浓缩，干燥，即得玄参总苷提取物。
7.根据权利要求6所述的玄参总苷提取物的制备方法，其特征在于非极性或弱极性大孔吸附树脂柱的型号是HPD-100、HPD-400、AB-8、D-101、D-301、NKA-9。
8.权利要求1或2所述的玄参总苷提取物或权利要求4所述的药物组合物在制备治疗和/或预防缺血性脑中风的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种玄参总苷提取物及其制备方法和在制药中的应用。该提取物中玄参总苯丙素苷类的含量大于40％，玄参总环烯醚萜苷类的含量大于10％。该提取物的制备方法是将玄参药材经醇提，过滤浓缩；浓缩液加乙醇沉淀，上清液过滤浓缩；浓缩液用大孔吸附树脂柱层析，用水洗脱至流出液无还原糖反应后，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；洗脱液浓缩，干燥，即得。该提取物可用于制备治疗缺血性脑中风药物。本发明提取物疗效好、用量低、基本无毒副作用，其制备工艺简单、提取纯度高。
文档编号A61P9/00GK1679810SQ200510037738
公开日2005年10月12日 申请日期2005年2月2日 优先权日2005年2月2日
发明者陈彬辉, 何凌云, 王雪根, 王乃利, 任宇, 赵万洲, 李正荣 申请人:深圳市凯尔腾科技有限公司