专利名称：一种建立转hCGβ基因的小鼠乳腺癌肿瘤模型的方法
技术领域：
本发明涉及一种建立转人绒毛膜促性腺激素β亚单位(hCGβ)基因的小鼠乳腺癌肿瘤模型的方法。
背景技术：
人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)是一种由α和β两个亚基组成的糖蛋白，其α亚基与FSH、LH和TSH等三种激素的分子结构相同，β亚基是其特异性的组成部分。近年来研究表明，绒毛膜促性腺激素β亚基CGβ蛋白除了在正常的妊娠滋养层细胞中分泌外，许多人类肿瘤细胞也大量分泌特征性hCGβ蛋白。这些癌变的细胞不仅发生在性腺来源的组织上(如子宫癌、乳腺癌、卵巢癌等)，肺癌、胰腺癌、结肠癌等非性腺起源的恶性细胞也能大量分泌hCGβ。多种组织的肿瘤选择性分泌单链hCGα、hCGβ、hCGβ的核心片段(hCGβ-cf)，比较HCG、HCG-α、HCG-β3种作为肿瘤的标志，其中hCG-β的敏感性和特异性最强。hCGβ蛋白作为一项重要的血清学指标已被广泛用于早期肿瘤的诊断。hCGβ在癌细胞中高效表达，并与肿瘤细胞的增殖、迁移和分化有一定的相关性，因此成为防治癌症的有效目标分子之一。研究认为hCG的抗肿瘤效果与该分子诱导的控制细胞分化途径进程的遗传变异有关.而且这种改变可以长期的印记于基因组，从而调节机体对于细胞癌变的反应。利用RT-PCR检测hCGβmRNA的方法可灵敏的检测到早期的细胞癌变，并与肿瘤的扩增与衰退呈相关性变化。
我国现有癌症病人300多万人，每年死于恶性肿瘤的患者约为130万人，并以3％的速度递增。子宫颈癌、乳腺癌等生殖系统的肿瘤是十大高发性肿瘤，攻克生殖系统肿瘤是关系到全人类健康的重要课题。
乳腺癌是一种严重危害人类，尤其是女性的健康的恶性肿瘤。研究表明100％的体外培养的乳腺癌细胞系表达hCGβ，76％的原位乳腺癌细胞表达hCGβ。而健康人不表达这个分子。CGβ作为肿瘤细胞分泌的特征分子之一，亦是防治癌症的有效靶分子之一。许多实验已证明利用CGβ纯化蛋白、重组蛋白及合成多肽制作的疫苗能够激发体内产生有效的免疫反应，从而抑制肿瘤细胞的生长。利用CGβ作为靶抗原，激发体液免疫反应产生保护性抗体，中和肿瘤细胞分泌的CGβ抗原，能抑制、阻断肿瘤细胞生长。
然而，时至今日，CGβ在防治癌症中仍无法进入临床应用，其瓶颈是缺乏分泌hCGβ肿瘤动物模型，因为目前只在灵长类(包括人类)和极少数的大型动物检测到CGβ表达，而在灵长类(包括人类)和极少数的大型动物建立分泌hCGβ中瘤动物模型是不现实的。而采用现有的技术将hCGβ转入小鼠，要使小鼠肿瘤细胞稳定表达hCGβ，即建立小型的动物模型是有难度的。因为hCGβ进入乳腺癌细胞后，引起细胞生长速度减慢，影响细胞周期，用目前现有的技术提取单克隆很难获得转hCGβ基因细胞。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术还没有建立分泌hCGβ肿瘤动物模型，采用带有绿色荧光基因与hCGβ基因的共同表达真核表达载体pEGFP，结合流式细胞仪经过三次富集筛选技术解决了现有技术提取单克隆很难获得转hCGβ基因细胞的难题，从而提供一种建立转人绒毛膜促性腺激素β亚单位(hCGβ)基因的小鼠乳腺癌肿瘤模型的方法。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的本发明提供的建立转hCGβ基因的小鼠乳腺癌肿瘤模型的方法，包括下述步骤1)制得全长基因hCGβ，该基因在基因文库编号为hCGβNM000737；1-1)提取人流产胎盘组织总核糖核酸；1-2)设计特异性引物上游引物5′-cgcaagcttgccaccatggagatgttccaggg-3′；下游引物5′-cgggatcctgtgggaggatcggggtg-3′；1-3)通过温度降落逆转录-聚合酶链式扩增方法，克隆得到全长基因hCGβ。
2)利用WizardPCR Preps.DNA纯化体系试剂盒回收纯化上述hCGβcDNA片段；3)将步骤2)得到的hCGβcDNA片段重组到带有pEGFP标记的真核表达载体中，构建成pEGFP-hCGβ真核表达质粒；4)将pEGFP-hCGβ真核表达质粒经脂质体转染小鼠乳腺癌细胞；所述的小鼠乳腺癌细胞优选绿色荧光基因与hCGβ的共同稳定表达的4T1小鼠乳腺癌细胞。
5)用流式细胞仪筛选荧光阳性pEGFP-hCGβ转基因小鼠乳腺癌细胞；6)使用Western-Blotting验证步骤5)中荧光阳性pEGFP-hCGβ转基因小鼠乳腺癌细胞中hCGβ蛋白表达；7)流式细胞仪三次富集筛选技术获得转hCGβ基因的小鼠乳腺癌细胞；8)将步骤7)中测得的pEGFP-hCGβ转基因小鼠乳腺癌细胞注射到小鼠的乳腺位置，得到了转hCGβ基因的小鼠乳腺癌肿瘤模型。
本发明提供的转hCGβ基因的小鼠乳腺癌肿瘤模型，填补了没有建立分泌hCGβ肿瘤动物模型的空白，可以用于研究hCGβ与乳腺癌肿瘤发生，增殖，迁移和分化的机理，为在体评价CGβ抗肿瘤的效果提供小型动物模型。这对CGβ在防治hCGβ分泌型肿瘤的基础理论研究和临床前的应用研究具有重要意义。另外，其使用绿色荧光基因与hCGβ的共同表达，使在体直接观察肿瘤的生长，转移成为可能。
图1为使用流式细胞仪分选488nm阳性的细胞的结果图；图2为转hCGβ-EGFP基因细胞在荧光显微镜下的照片，其中绿色荧光(箭头所示)为转hCGβ-EGFP基因细胞；图3为接种1×104个肿瘤细胞后生长曲线。
具体实施例方式
实施例1、本发明的pEGFP-hCGβ真核表达质粒的构建本发明的pEGFP-hCGβ的构建步骤如下1)提取人流产胎盘组织总核糖核酸取流产的胎盘(经过病人许可)。在冰浴中将0.5克胎盘组织投入6mL RNA变性提取液(其为Invitrogen公司购得的Trizol提取液)，用组织匀浆机充分破碎；加入0.6mL2mol/L乙酸钠、6mL体积比为125∶24∶1的酚∶氯仿∶异丙醇的混合液，充分振摇15秒，冰浴15分钟；在4℃以10000g的转速离心20分钟，分出上层清液，加入等体积的异丙醇，于-20℃放置30分钟；在4℃以10000g的转速离心10分钟，分出沉淀物，用70％7醇洗涤沉淀两次，真空干燥，加入无核酸酶水500μL溶解后，得到胎盘组织总RNA提取液，于-80℃保存；取此胎盘组织总RNA提取液(其为Invitrogen公司购得的Trizol提取液)，5μL，进行1.5wt％(重量百分比)甲醛变性琼脂糖凝胶(含EB0.2μg/mL)电泳检测，凝胶条带分析结果显示所制备的样品中28S rRNA的量约为18S rRNA的二倍，此结果证明了总RNA的完整性。。
2)设计特异性引物上游引物5′-cgcaagcttgccaccatggagatgttccaggg-3′；下游引物5′-cgggatcctgtgggaggatcggggtg-3′；3)通过TDRT-PCR(温度降落逆转录-聚合酶链式反应)扩增hCGβmRNA50μL的反应体系由10μL的AMV/Tfl5×反应缓冲液、2mM的dNTPs混合物、2mM的MgSO4、1μM的上游引物及上游引物、0.1U/μL的AMV逆转录酶、0.1U/μL的RNasin核糖核酸酶抑制剂(Ribonuclease Inhibitor)、2μg，步骤1)得到的总RNA和无核酸酶的水组成，并在此水溶液上覆盖50μL无核酸酶矿物油；逆转录反应在48℃反应45分钟，接着在95℃灭活5分钟，并启动TDRT-PCR扩增反应在第一个变性步骤时加入0.1U/μL的Tfl DNA聚合酶，在降落TDRT-PCR扩增阶段，变性温度为94℃，持续1分钟，退火温度从65℃开始，持续1分钟，然后以每两个循环下降1℃的速度降至55℃，出现1分钟，延伸温度为68℃，持续40秒；最后在以退火温度60℃分钟继续扩增15个循环；最后在72℃延伸10分钟；克隆得到全长基因hCGβ，该基因在基因文库编号为hCGβNM000737；4)通过TDRT-PCR扩增的hCGβ，方法同3)，利用WizardPCR Preps.DNA纯化体系试剂盒回收纯化hCGβcDNA片段，并将其重组到真核表达载体pEGFP中，构建成pEGFP-hCGβ真核表达质粒利用WizardPCR Preps.DNA纯化体系试剂盒回收纯化hCGβcDNA片段；纯化片段7μL用1μL HindHI和BamH I双酶切，真核表达质粒pEGFP-N1(该质粒购自Clontech公司)经过同样的双酶切。回收酶切产物，各取1μL建立连接反应，再加入无核酸酶的水至8.0μL，然后加入10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL和1U/μL T4 DNA连接酶，混匀后用微量离心机甩至管底，于16℃保温12小时，得到连接反应产物；
5)质粒热激转化将50μL的感受态细胞DH5α在冰上化冻后加入1～2μL步骤4)得到的连接反应产物，并在冰上放置30分钟。然后在42℃水浴中热激30秒，再迅速置于冰上冷却2分钟。加入250μL SOC培养基，于37℃在恒温摇床上以225转/分振荡培养1小时，使细胞恢复正常生长状态，并使转化子产生抗药性(KAN+)；将上述菌液摇匀后取50μL涂布于筛选LB平板上，其含有75μg/mL卡拉霉素，于37℃培养16～24小时；用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含有75μg/mL Amp的LB液体培养基中，于37℃振荡培养12小时；使用碱裂法提取质粒DNA，选择有正向插入外源DNA片断的重组克隆质粒；测序正确的菌再次摇菌，用Qiagen无内毒素试剂盒提取，得到pEGFP-hCGβ质粒，备用。
实施例2、将pEGFP-hCGβ真核表达质粒经脂质体转染4T1小鼠乳腺癌细胞。
在24孔板中长满90％的小鼠乳腺癌细胞4T1用无血清的DMEM培养液冲洗两遍。将2μg pEGFP-hCGβ质粒加入到100μL无血清的DMEM培养液中轻轻混匀，5μL脂质体加入到95μL无血清的DMEM培养液中轻轻混匀。将质粒和脂质体加到一个管中，轻轻完全混匀，室温放置20分钟后，把混合物加入到经过新鲜培养液冲洗的细胞上，补加300μL无血清的DMEM培养液。细胞放37℃，5％CO2培养12小时后，换加含10％胎牛血清的完全培养液继续培养12小时后将细胞用胰蛋白酶消化到60毫米培养皿中培养，24小时后，在培养液中加入800μg/mLG418硫酸盐酸盐。大约2周后，在培养皿中形成细胞集落，挑取集落继续培养准备进一步用流式细胞仪器筛选。
实施例3、使用流式细胞仪筛选488nm荧光阳性4T1小鼠乳腺癌细胞将实施例2中得到的经过药物筛选的细胞用DMEM培养液洗涤两遍后，加入1mL0.25％胰蛋白酶+0.04％EDTA消化液。待细胞完全消化成单细胞后，加1mL含血清的完全培养液终止消化。500g离心细胞5分钟后，细胞用100/200目细胞筛过滤去成团细胞。过滤后的单细胞用DMEM重悬成单细胞悬液。
流式细胞仪分选488nm阳性的细胞。用正常的4T1单细胞作为分选阴性对照。
分选出的阳性细胞继续培养，反复筛选三次后，细胞用流式细胞仪和荧光显微镜分析纯度。荧光显微镜和流式分析证明hCGβ-EGFP表达细胞纯度为97.8％。
如图1所示，流式细胞仪分选488nm阳性的细胞，即转入hCGβ的4T1小鼠乳腺癌细胞。用正常的4T1细胞作为分选阴性对照，结果显示转入hCGβ基因4T1细胞占细胞总数目的97.8％。P1是筛选的总细胞数，P2是没有转入hCGβ基因4T1细胞，P3是转入hCGβ的4T1细胞。
实施例4、使用Western-Blotting验证荧光阳性4T1小鼠乳腺癌细胞中hCGβ蛋白表达将实施例3中分选出的阳性细胞培养液弃去培养液后用室温的PBS冲洗2～3遍，用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间颠倒2～3次，将EP管置于0℃后在14000～16000g离心2min，待样品恢复到室温后上样。12％分离胶分离蛋白后湿法转到硝酸纤维素膜上。5％牛血清白蛋白封闭1小时，洗涤膜，加入鼠抗hCGβ单克隆抗体(该抗体购自calbiochemistry公司)后进行三次洗涤膜，膜上滴加HRP标记的抗鼠二抗(该二抗购自中山公司)；ECL显色，胶片感受化学发光。
结果证明hCGβ蛋白在4T1转基因细胞中表达，而对照细胞(未转入hCGβ的4T1小鼠乳腺癌细胞)无表达。
实施例5、荧光检测将实施例2中得到的转入hCGβ-EGFP基因的细胞在荧光显微镜观察，细胞质中有明显的绿色荧光表达，如图2箭头所示，证明hCGβ主要表达部位是细胞质。而作为对照的EGFP绿色荧光在细胞的各个部位均有表达，主要表达在细胞核。显微镜检测进一步证明所有镜检的4T1-hCGβ细胞均为阳性。
实施例6、表达hCGβ蛋白的小鼠乳腺癌动物模型构建1×104和1×105转基因细胞皮下注射BALB/C小鼠的乳腺位置，第九天成瘤率100％(N＝20)。每隔三天测量一次小鼠肿瘤大小，计算公式肿瘤体积＝4/3π(1/2长)×(1/2宽)2。结果如图3所示，小鼠肿瘤大小生长相对稳定，与接种天数成正比关系。
实施例7、表达hCGβ蛋白的小鼠乳腺癌动物模型利用表达hCGβ蛋白的小鼠乳腺癌动物模型，进行pCR3.1-rmCGβ基因疫苗免疫治疗乳腺癌的动物实验。
1.构建PCR3.1-rmCGβ，构建步骤如下1)胎盘组织总RNA提取用常规方法提取恒河猴胎盘组织总RNA；
2)克隆得到恒河猴CGβ(rmCGβ)的全长基因，该基因已登入基因文库rmCGβAY011015；3)通过TDRT-PCR(温度降落逆转录-聚合酶链式反应)扩增rmCG mRNA；4)通过TDRT-PCR扩增的rmCGβ，利用WizardPCR Preps.DNA纯化体系试剂盒回收纯化rmCGβ cDNA片段；5)质粒热激转化将50μL的感受态细胞DH5α在冰上化冻后加入2μL0.5Mβ-ME，1-2μL步骤4)得到的连接反应产物，并在冰上放置30分钟。然后在42℃水浴中热激30秒，再迅速置于冰上冷却2分钟。加入250μL SOC培养基，于37℃在恒温摇床上以225转/分振荡培养1小时，使细胞恢复正常生长状态，并使转化子产生抗药性(Amp+)；将上述菌液摇匀后取50μL涂布于筛选LB平板上，其含有75μg/mL Amp，且表面涂有50μg/mL X-gal，于37℃培养16-24小时；用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含有75μg/mL Amp的LB液体培养基中，于37℃振荡培养12小时；使用碱裂法提取质粒DNA，选择有正向插入外源DNA片断的重组克隆质粒；2.用表达hCGβ蛋白的小鼠乳腺癌动物模型进行pCR3.1-rmCGβ基因疫苗免疫治疗乳腺癌的动物实验。
将BALB/c小鼠分成4组，每组10只，第4组为20只第1组注射转入hCGβ的小鼠乳腺癌4T1细胞，1周后不接种任何物质；第2组注射转入hCGβ的小鼠乳腺癌4T1细胞，1周后接种100μl生理盐水；第3组注射转入hCGβ的小鼠乳腺癌4T1细胞，1周后接种100μl pCR3.1空质粒(100μg)；第4组注射转入hCGβ的小鼠乳腺癌4T1细胞，1周后接种100μl pCR3.1-rmCGβ(100μg)。
上述转入hCGβ的小鼠乳腺癌4T1细胞量均为1×103；每隔一周加强一次，共免疫三次。每隔三天测量一次肿瘤大小。
从注射转入hCGβ的小鼠乳腺癌4T1细胞开始计时观察，每隔三天测量一次肿瘤大小，结果为第1组、第2组、第3组共30只小鼠12天后均发现肿瘤块，其大小为30-50mm3；27天时检查，其中4只小鼠死亡，另26只小鼠均仍有肿瘤块，其大小为360-410mm3；36天时检查，肿瘤块大小为780-820mm3；
第4组的20只小鼠在12天后检查，均发现肿瘤块，其大小为20-30mm3；27天时检查，其中5只肿瘤块长大，其大小为220-410mm3，15只小鼠仍有肿瘤块，但其大小为未见增大(有些肿瘤块变小)；36天时检查，小鼠肿瘤块大小仍未见明显增大。
利用表达hCGβ蛋白的小鼠乳腺癌动物模型，进行上述pCR3.1-rmCGβ基因疫苗免疫治疗乳腺癌的动物实验，结果显示抑癌率达到70％。
权利要求
1.一种建立转hCGβ基因的小鼠乳腺癌肿瘤模型的方法，包括下述步骤1)制得全长基因hCGβ，该基因在基因文库编号为hCGβNM000737；2)回收纯化上述hCGβcDNA片段；3)将步骤2)得到的hCGβcDNA片段重组到带有pEGFP标记的真核表达载体中，构建成pEGFP-hCGβ真核表达质粒；4)将pEGFP-hCGβ真核表达质粒经脂质体转染小鼠乳腺癌细胞；5)用流式细胞仪筛选荧光阳性pEGFP-hCGβ转基因小鼠乳腺癌细胞；6)使用Western-Blotting验证步骤5)中荧光阳性pEGFP-hCGβ转基因小鼠乳腺癌细胞中hCGβ蛋白表达；7)流式细胞仪三次富集筛选技术获得转hCGβ基因的小鼠乳腺癌细胞；8)将步骤7)中测得的pEGFP-hCGβ转基因小鼠乳腺癌细胞注射到小鼠的乳腺位置，得到了转hCGβ基因的小鼠乳腺癌肿瘤模型。
2.如权利要求1所述的建立转hCGβ基因的小鼠乳腺癌肿瘤模型的方法，其特征在于，所述的全长基因hCGβ的制备是通过1)提取人流产胎盘组织总核糖核酸；2)设计特异性引物上游引物5′-cgcaagcttgccaccatggagatgttccaggg-3′；下游引物5′-cgggatcctgtgggaggatcggggtg-3′；3)通过温度降落逆转录-聚合酶链式扩增方法，克隆得到全长基因hCGβ。
3.如权利要求1所述的建立转hCGβ基因的小鼠乳腺癌肿瘤模型的方法，其特征在于，所述的小鼠乳腺癌细胞是绿色荧光基因与hCGβ的共同稳定表达的4T1小鼠乳腺癌细胞。
全文摘要
本发明涉及一种建立转人绒毛膜促性腺激素β亚单位(hCGβ)基因的小鼠乳腺癌肿瘤模型的方法，其为采用带有绿色荧光基因与hCGβ基因的共同表达真核表达载体pEGFP，结合流式细胞仪经过三次富集筛选技术，解决了现有技术提取单克隆很难获得转hCGβ基因细胞的难题，填补了没有建立分泌hCGβ肿瘤动物模型的空白，可以用于研究hCGβ与乳腺癌肿瘤发生，增殖，迁移和分化的机理，为在体评价CGβ抗肿瘤的效果提供小型动物模型。这对CGβ在防治hCGβ分泌型肿瘤的基础理论研究和临床前的应用研究具有重要意义。另外，其使用绿色荧光基因与hCGβ的共同表达，使在体直接观察肿瘤的生长，转移成为可能。
文档编号A61K49/00GK1935266SQ20051008651
公开日2007年3月28日 申请日期2005年9月23日 优先权日2005年9月23日
发明者石树群, 彭景楩 申请人:中国科学院动物研究所