专利名称：黄芪甲苷在制备治疗糖尿病周围神经病变药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及黄芪甲苷(ASI)的新用途，特别是涉及黄芪甲苷在制备治疗糖尿病周围神经病变的药物中的应用。
背景技术：
据统计，目前我国的糖尿病患者超过3000万，WHO预测到2025年中国糖尿病人数将达5000万，我国已成为仅次于印度的世界第二大糖尿病国家[1]。糖尿病的危害主要来自并发症，包括神经病变、视网膜病变、血管病变和糖尿病肾病等。因为神经细胞能量的获得主要依赖于葡萄糖，所以高血糖引起的代谢紊乱很容易诱发神经的病变；糖尿病神经病变是糖尿病并发症中发病最早和发生率最高的并发症之一，病变累及周围神经和中枢神经，尤以前者多见。糖尿病患者5年、10年和20年后周围神经病变的发病率分别达到30％、60％和90％。糖尿病周围神经病变(diabetes peripheral neuropathy，DPN)可累及全身的感觉神经、运动神经和自主神经，其中以感觉神经最为常见。糖尿病患者并发周围神经病变时，早期出现肢端感觉异常，痛觉过敏(疼痛)以及随后的痛觉迟钝(麻木)等感觉神经病变的症状，晚期可表现为肌张力下降，肌力减弱，甚至肌萎缩和瘫痪等运动神经病变的症状。诸如糖代谢紊乱，神经血管的损害，神经营养因子缺乏，氧化应激损伤、免疫损伤和遗传因素等[2，3]诱因的共同作用，促使DPN的发生发展。由于DPN对神经功能的损害几乎不可逆性，目前临床缺乏特异性治疗方法，多采用控制血糖、调节代谢及改善微循环，以期纠正神经缺血缺氧，增加神经传导功能。还有抗氧化、补充神经营养因子、免疫抑制剂等方法。可通过服用药物来改善症状，因而有效的预防用药和早期治疗用药显得尤为重要。
治疗糖尿病的中医方剂多数含有黄芪成分，现代实验科学也充分肯定黄芪对糖尿病的治疗作用。本课题组在1984年最早报道了黄芪甲苷的抗炎作用，1987与本校化学教研室合作，从黄芪中成功提取了单体化合物黄芪甲苷(Astragaloside IV，AS-IV)，并运用质谱和核磁共振进行了定性，在此基础上相继报导了AS-IV的诸多药理活性。AS-IV的药理作用包括抗炎、免疫调节作用、降血压、抗心肌损伤、改善异常血液流变性、刺激骨髓造血机能、抗氧化应激、抗肝损伤、抗衰老和镇静作用，以及防治糖尿病。本课题组实验研究还发现，AS-IV能有效防治糖尿病肾病黄芪可以减少糖尿病大鼠的尿蛋白排出量，抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)的合成与分泌，阻断内皮素受体，抑制肾脏NO的产生，抑制血小板聚集、改善微循环等，从而缓解肾小球肥大、减轻GBM增厚、抑制系膜外基质增生而阻止肾小球硬化。而DPN与糖尿病肾病的发病机理有诸多共通之处。基于DPN的发病机制和已有的工作基础，我们拟研究AS-IV对大鼠糖尿病神经病变的防治作用。
但至今未见到黄芪甲苷能治疗糖尿病周围神经病变的有关报导。
发明内容
1.发明目的本发明的目的在于提供黄芪甲苷的新用途，即在制备治疗糖尿病周围神经病变药物中的新应用。
2.技术方案本发明涉及黄芪甲苷作为制备治疗糖尿病周围神经病变(diabetes peripheralneuropathy，DPN)的药物中的应用。
在黄芪甲苷中加入适当的辅料，用常规的制备方法，可以制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液等口服制剂。
黄芪甲苷的药理试验，以观察其对糖尿病周围神经病变的治疗作用，实验证明(1)、黄芪甲苷(AS-IV)中高剂量治疗组(100、200mg/kg)血糖和HbA1C与DPN模型组比较，表现出明显的降血糖作用(P＜0.05，P＜0.01)。而且血浆胰岛素的含量比DPN模型组明显增多(P＜0.05，或P＜0.01)。
(2)、黄芪甲苷(AS-IV)低中高剂量治疗组坐骨神经GSH-Px的活力比DPN组显著增加(P＜0.05，P＜0.01)。显示黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠神经组织有抗氧化作用。
(3)、糖尿病状态下COX-2/COX-1活性大幅增加。黄芪甲苷(AS-IV)低中高剂量组的PGE2尿排泄率较DPN组明显减少(P＜0.05或P＜0.01)，说明黄芪甲苷(AS-IV)能抑制COX-2的活性；而TXB2排泄率的降低则不明显，表明AS-IV对COX-1的抑制作用不明显。
(4)、黄芪甲苷(AS-IV)低剂量治疗组(50mg/kg)的神经和血清中AGEs含量较DPN组下降不明显，黄芪甲苷(AS-IV)中高剂量治疗组降低神经和血清中AGEs含量的作用非常显著(P＜0.01，或P＜0.05)。
(5)、黄芪甲苷(AS-IV)低中高剂量治疗组神经和红细胞中AR活性较DPN组显著降低(P＜0.01)，表明黄芪甲苷(AS-IV)对AR有明显的抑制作用.
(6)、黄芪甲苷(AS-IV)中高剂量治疗组甩尾温度均比DPN组低，有非常显著性差异(P＜0.01)。运动神经传导速度(MNCV)测定结果表明，DPN组的传导速度较正常组大鼠显著降低(P＜0.01)，而黄芪甲苷(AS-IV)中高剂量组对DPN的传导速度下降有显著的改善作用(P＜0.01)。
(7)、黄芪甲苷(AS-IV)低中高剂量治疗组均能显著地提高糖尿病大鼠Na+-K+-ATP酶活性(P＜0.05，或P＜0.01)。
(8)、黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠神经组织光镜下形态学显示，与正常大鼠相比，DPN组大鼠坐骨神经神经外膜有大量的伊红色无结构的沉积物(糖基化蛋白)，并伴有纤维化形成。黄芪甲苷(AS-IV)低剂量组大鼠的形态学病变仅见轻微改善，而黄芪甲苷(AS-IV)中高剂量组改善则更为明显。
(9)、黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠神经组织电镜下形态学显示AS-IV低中高剂量组和EPS组的有髓纤维面积比DPN组显著增加(P＜0.05，或P＜0.01)，AS-IV低中高剂量组的有髓纤维密度比DPN组减少(P＜0.05，或P＜0.01)。AS-IV低剂量组有髓神经纤维髓鞘厚度不一，轴突有比较明显的脱髓鞘改变；AS-IV中高剂量和EPS组病理改变则明显减轻3.有益效果从以上药理试验结果，可以得出本发明具有以下优点(1)本发明对已知黄芪甲苷(AS-IV)发现了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，(2)本发明的黄芪甲苷(AS-IV)药理效果好，作用强，预示着有良好的药用前景，(3)本发明的黄芪甲苷(AS-IV)具有非常显著的降低血糖和糖化血红蛋白以及促胰岛素分泌的作用，且呈明显的剂量相关性。
(4)黄芪甲苷(AS-IV)低中高剂量治疗组增加坐骨神经GSH-Px的活力，抑制COX-2的活性示黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠有抗氧化和抗炎作用。
(5)黄芪甲苷(AS-IV)具有显著降低神经和血清中AGEs的含量，且呈明显的剂量相关性。
(6)黄芪甲苷(AS-IV)具有非常显著的降低醛糖还原酶(AR)的活性，呈明显的剂量相关。
(7)黄芪甲苷(AS-IV)中高剂量治疗组均能提高痛阈，提高糖尿病大鼠外周神经内Na+-K+-ATP酶活性，增加运动神经传导速度。
(8)光镜或电镜下形态学显示黄芪甲苷(AS-IV)有明显的减轻DPN大鼠神经组织的病理改变因此黄芪甲苷(AS-IV)作为AR的抑制剂对DPN有很好的治疗效果。
具体实施例方式
实施例1黄芪甲苷(AS-N)对DPN大鼠一般生理状况的影响(1).材料和方法1实验动物雄性Sprague-Dawley品系大鼠，体重180～210g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证号SCXK(沪)2003-0003。
2药品、试剂和仪器黄芪甲苷(Astragaloside IV，AS-IV)，分子量784，由江苏省&中国科学院药用植物研究所从黄芪中提取，运用HPLC经归一法证实AS I纯度大于99％。链脲霉素(Streptozotocin，STZ)购自Calbiochem公司，批号Lot.B51229。血糖检测药盒购自浙江东瓯生物工程有限公司，批号Lot2004030266。胰岛素放免检测药盒购自北京中国原子能科学研究院，批号Lot20040701。依帕司他(epalrestat，EPS)由江苏扬子江药业集团惠赠。大鼠尿白蛋白放免分析药盒购自北京福瑞生物工程公司，批号Lot20050301。PGE2放免分析药盒购自解放军总医院科技开发中心放免所，批号Lot20040625。TXB2放免分析药盒购自解放军总医院科技开发中心放免所，批号Lot20040625。Na+-K+-ATP酶测试盒购自南京建成生物工程研究所，批号Lot20040702。羟脯氨酸测试盒购自南京建成生物工程研究所，批号Lot20040702。β-NADPHP购自Sigma公司(Sigma Co.St，Louis，USA)批号123K7012。DL-甘油醛购自Sigma公司(Sigma Co.St，Louis，USA)，批号Lot023K2512。其余化学试剂皆为分析纯。
3糖尿病造模和药物治疗雄性SD大鼠，禁食12h后，腹腔一次性注射STZ75mg.kg-1(临用前溶于0.1mmol.L-1柠檬酸钠缓冲液，pH4.3)，72h后尾静脉取血，测定空腹血糖＞13.9mmol.L-1者为造模成功。75只糖尿病大鼠按照血糖平行分组分为病理模型组(DPN)，黄芪甲苷(AS-IV)低剂量治疗组(BL)，黄芪甲苷(AS-IV)中剂量治疗组(BM)，黄芪甲苷(AS-IV)高剂量治疗组(BH)，依帕司他治疗组(EPS)，每组15只，另设10只正常大鼠为对照组(NS)，南京医科大学实验动物中心SPF级动物房饲养。糖尿病成模当日作为实验第一天，黄芪甲苷(AS-IV)治疗组的低中高剂量分别为3，6，12mg·kg-1，早晚各灌胃给药一次，EPS治疗组50mg.kg-1每天给药一次，黄芪甲苷(AS-IV)和EPS均用1％羧甲基纤维素(1％CMC)配成混悬液，按5.0ml.kg-1体重灌胃给药。实验中观察各组大鼠的体重、进食水量、尿量、毛发等一般状态，每周称体重1次。实验12周末测定各组大鼠的摆尾温度阈值，收集24小时尿液，20％乌拉坦5ml.kg-1麻醉，八道生理记录仪PowerLab/8SP测定大鼠坐骨神经传导速度，处死大鼠，腹主动脉收集血液，剥取两侧坐骨神经，进行各指标测定。
4指标测定用大鼠 摆尾温度值(Tailflick threshold temperature，TTT)测定痛阈；用八道生理记录仪(Powerlab/8SP，澳大利亚ADInstruments公司)，以单脉冲方波刺激进行坐骨神经传导速度(MNCV)测定；用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖；HbA1C以亲和层析法测定；BUN用化学比色法测定，血浆胰岛素、尿白蛋白、尿PGE2和TXB2由南京医科大学同位素室采用放免法测定；血清和神经组织中AGEs的含量用荧光分光光度法测定。红细胞和坐骨神经AR活性用荧光分光光度计测定；红细胞和坐骨神经Na+-K+-ATP酶活性测试盒按南京建成生物工程研究所试剂盒说明进行；坐骨神经谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的测定用紫外分光光度法；腓肠神经纤维形态学采用光镜，电镜观察和图像分析。
5统计学处理 所有测定结果用x±SD表示，各组间比较采用单因素方差分析ANVOA，药物治疗组与DPN组比较采用Dunnett’s检验，P＜0.05认为有统计学意义。
6.结果(1).黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠一般生理状况的影响正常对照组大鼠精神振奋，毛发纯白光泽，活动频繁；进食量和饮水量正常，尿量尿量正常，垫料干燥，体重增长快。DPN病理模型组大鼠毛发枯黄、无光泽，精神萎靡，下腹部鼓胀，活动少，耳廓、眼球苍白，尾巴苍白湿冷，竖毛弓背，摄食量多，饮水量较正常组明显增多，尿量较正常组明显增多且粘性，垫料极易潮湿，体重增长缓慢，与DPN模型组相比，黄芪甲苷(AS-IV)高剂量治疗组大鼠在以上各方面皆有有明显改善，接近于正常对照组大鼠。黄芪甲苷(AS-IV)低剂量治疗组的精神、活动、外观、摄食量和尿量则接近于DN模型组。黄芪甲苷(AS-IV)中剂量治疗组和EPS阳性治疗组的整体表现则介于黄芪甲苷(AS-IV)低剂量治疗组和高剂量治疗组之间。每组均有若干只大鼠因相互撕咬或其他原因受伤感染致死。
至第7～8周开始同时并发白内障，并且随着时间的延长，发病率和病情呈显剂量相关。明显加重。与DPN病理模型组相比，黄芪甲苷(AS-IV)高剂量治疗组大鼠在各方面皆有很明显的改善，白内障发病率很低且病情明显减轻；黄芪甲苷(AS-IV)中剂量治疗组外观、精神、活动接近高剂量治疗组，但摄食量、饮水量和尿量较之略多；黄芪甲苷(AS-IV)低剂量治疗组毛发偏黄、无光泽，精神不振，摄食量、饮水量和尿量较中剂量组多，但比DPN模型组明显少。EPS阳性治疗组的整体表现则介于黄芪甲苷(AS-IV)中剂量治疗组和高剂量治疗组之间。
(2).黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠肾功能的影响DPN组大鼠的肾指数、尿蛋白排泄率和血肌酐比正常组均明显增高，表明糖尿病大鼠的肾功能损害比较严重。AS-IV低中高剂量治疗组血肌酐比DPN组减少，(P＜0.05或P＜0.01)；AS-IV高剂量治疗组尿蛋白排泄率比DPN组明显减少(P＜0.05)(见表1)。
表1.AS-IV对DPN大鼠肾指数，尿蛋白排泄率和血清肌酐的作用(x±s)
注正常对照组与DPN组相比，##P＜0.01实施例2黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠血糖和糖化血红蛋白的影响1.材料和方法(同实施例1)2结果DPN组大鼠的血糖和糖化血红蛋白(HbA1C)明显高于正常对照组，有非常显著性差异(P＜0.01)。AS-IV低剂量治疗组大鼠的血糖和HbA1C与DPN组相比，血糖下降不明显；而AS-IV中高剂量治疗组与DPN组比较，表现出明显的降血糖作用(P＜0.01)，且HbA1C也明显降低(P＜0.05)(见表2)。
表2.AS-IV对DPN大鼠血糖和糖化蛋白的作用(x±s)
注NS组与DPN组相比，##P＜0.01；药物治疗组与DPN组相比，*P＜0.05，**P＜0.01实施例3黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠的促胰岛素分泌作用AS-IV对DPN大鼠的促胰岛素分泌作用正常组大鼠血浆胰岛素的含量比DPN组显著增多(P＜0.01)，AS-IV低剂量治疗组胰岛素含量仅轻微增加，AS-IV中高剂量组血浆胰岛素的含量比DPN组明显增多(P＜0.05)，提示AS-IV具有促胰岛素分泌的作用。(见表3，)。
表3.AS-IV对DPN大鼠血浆胰岛素的作用(x±s)
注NS组与DPN组相比，##P＜0.01；药物治疗组与DPN组相比，*P＜0.05，**P＜0.01实施例4黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠神经组织AR和红细胞AR的抑制作用1材料和方法(同实施例1)2结果DPN组大鼠坐骨神经和红细胞中AR活性较正常组显著升高(P＜0.01)，表明高血糖时组织中AR活性被显著激活。AS-IV中高剂量治疗组AR活性较DPN组低(P＜0.01)，表明AS-IV对AR有抑制作用。EPS治疗组AR活性与AS-IV中高剂量组接近，显著低于DPN组(P＜0.01)，对AR表现出很强的抑制作用(见表4)。
表4.AS-IV对DPN大鼠神经组织和红细胞醛糖还原酶的作用(x±s)
注NS组与DPN组相比，##P＜0.01；药物治疗组与DPN组相比，**P＜0.01
实施例5黄芪甲苷(AS-IV)对糖尿病肾病大鼠的抗氧化作用及对DPN大鼠尿中COX-2的影响1材料和方法(同实施例1)2结果(1).黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠神经组织的抗氧化作用DPN组大鼠与正常大鼠相比，坐骨神经谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力明显降低(P＜0.01)。AS-IV低中高剂量治疗组坐骨神经GSH-Px的活力比DPN组显著增加(P＜0.05，P＜0.01)(见表5)。
表5.AS-IV对DPN大鼠神经组织谷胱甘肽-过氧化物酶的作用(x±s)
注NS组与DPN组相比，##P＜0.01；药物治疗组与DPN组相比，*P＜0.05，**P＜0.01(2).黄芪甲苷(AS-IV)对对DPN大鼠尿中COX-2的影响正常组大鼠尿PGE2和TXB2排泄率极低，DPN组大鼠PGE2的排泄率是正常组的9倍，TXB2的排泄率是正常组的7倍，表明糖尿病状态下COX-2/COX-1活性大幅增加。AS-IV低中高剂量组的PGE2排泄率较DPN组明显减少(P＜0.05或P＜0.01)，说明AS-IV能抑制COX-2的活性；而TXB2排泄率的降低则不明显，表明AS-IV对COX-1的抑制作用有限(见表6)。
表6.AS-IV对DPN大鼠尿PGE2和TXB2排泄率的作用(x±s)
注NS组与DPN组相比，##P＜0.01；药物治疗组与DPN组相比，*P＜0.05，
实施例6黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠神经组织AGEs和血清AGEs的影响1材料和方法(同实施例1)2结果DPN组大鼠神经组织中的AGEs相对含量和血清中的AGEs相对含量与正常对照组相比明显升高，有非常显著性差异(P＜0.01)。AS-IV低剂量治疗组的神经和血清中AGEs含量较DPN组下降不明显，ASI中高剂量治疗组降低神经和血清中AGEs含量的作用非常显著(P＜0.01，或P＜0.05)。EPS治疗组神经和血清中AGEs含量也都有显著性降低(P＜0.01)，说明AS-IV和EPS有降低AGEs的作用，且ASI的作用呈剂量依赖性(见表7)。
表7.AS-IV对DPN大鼠神经组织AGEs和血清AGEs的作用(x±s)
注NS组与DPN组相比，##P＜0.01；药物治疗组与DPN组相比，*P＜0.05，**P＜0.01实施例7黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠摆尾温度和运动神经传导速度的影响1材料和方法(同实施例1)2结果DPN病理模型组大鼠的摆尾温度值与正常组大鼠相比，显著增高。AS-IV中高剂量治疗组甩尾温度均比DPN组低，有非常显著性差异(P＜0.01)。运动神经传导速度测定结果表明，正常组大鼠MNCV均值54.42m/s，符合正常生理情况下的神经传导速度，DPN组的传导速度较正常组大鼠显著降低(P＜0.01)，而AS-IV中高剂量组对DPN的传导速度下降有显著的改善作用(P＜0.01)。EPS对DPN大鼠的摆尾温度和MNCV均有显著的改善作用(P＜0.01)(见表8)。
表8.AS-IV对DPN大鼠摆尾温度值和运动神经传导速度的作用(x±s)
注NS组与DPN组相比，##P＜0.01；药物治疗组与DPN组相比，*P＜0.05，**P＜0.01实施例8黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠坐骨神经组织和红细胞Na+-K+-ATP酶活性的影响1材料和方法(同实施例1)2结果DPN组大鼠神经组织和红细胞Na+-K+-ATP酶活性较正常组显著降低(P＜0.01)。
与DPN组相比，AS-IV低中高剂量治疗组均能显著地提高糖尿病大鼠Na+-K+-ATP酶活性(P＜0.05，或P＜0.01)。阳性药EPS治疗组也能显著提高DPN组大鼠神经组织和红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性(P＜0.05，或P＜0.01)(见表9)。
表9.AS-IV对DPN大鼠坐骨神经组织和红细胞Na+-K+-ATP酶活性的作用(x±s)
注NS组与DPN组相比，##P＜0.01；药物治疗组与DPN组相比，*P＜0.05，**P＜0.01实施例9黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠神经组织形态学的影响1材料和方法(同实施例1)
2结果(1)黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠神经组织光镜下形态学的影响与正常大鼠相比，DPN组大鼠坐骨神经神经外膜有大量的伊红色无结构的沉积物(糖基化蛋白)，并伴有纤维化形成。AS-IV低剂量组大鼠的以上形态学病变仅见轻微改善，而AS-IV中高剂量组和EPS组的形态学改善则较为明显(见表10)。
表10.AS-IV对DPN大鼠神经外膜糖基化蛋白的作用
(2)黄芪甲苷(AS-IV)对DPN大鼠神经组织电镜下形态学的影响NS组大鼠有髓神经纤维表面Schwann细胞膜完整，髓鞘结构清晰，电子密度一致，轴突内轴丝结构清晰；DPN组大鼠有髓神经纤维髓鞘厚度不一，电子密度不等，轴突有明显的节段性脱髓鞘现象，且Ranvier结分布不均。AS-IV低剂量组有髓神经纤维髓鞘厚度不一，轴突有比较明显的脱髓鞘改变；AS-IV中高剂量和EPS组病理改变则明显减轻(Fig11.)神经纤维图像定量分析结果，DPN组大鼠的有髓纤维面积比正常组显著减少，而有髓纤维密度反而增加，与文献报道一致。AS-IV低中高剂量组和EPS组的有髓纤维面积比正常组显著减少，但比DPN组显著增加(P＜0.05，或P＜0.01)，AS-IV低中高剂量组的有髓纤维密度比正常组增加，ASI低高剂量组比DPN组减少(P＜0.05，或P＜0.01)。各组的轴突/髓鞘比值无显著变化(见表11)。
表11.AS-IV对DPN大鼠腓肠神经中有髓纤维为形态学的作用(x±s)
注NS组与DPN组相比，##P＜0.01；药物治疗组与DPN组相比，*P＜0.05，**P＜0.0权利要求
1.黄芪甲苷在制备防治糖尿病周围神经病变的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的黄芪甲苷，其特征是在黄芪甲苷中加入适当的辅料，用常规的制备方法可以制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液。
全文摘要
本发明公开了黄芪甲苷的新用途，即在制药中的新应用。实际上是涉及黄芪甲苷在制备治疗糖尿病周围神经病变药物中的应用。经药效学实验研究证明苄达赖氨酸具有非常显著的降低血糖和糖化血红蛋白以及促胰岛素分泌的作用，能增加坐骨神经GSH－PX的活力，抑制COX－2的活力，BDL对DPN大鼠有显著的抗氧化和抗炎作用；具有显著降低神经和血清中AGES的含量，还具有显著降低醛糖还原酶(AR)的活性，能提高痛阈，提高糖尿病大鼠外围神经内Na
文档编号A61K9/16GK1759843SQ20051009427
公开日2006年4月19日 申请日期2005年9月8日 优先权日2005年9月8日
发明者张银娣, 余俊先, 孙视, 沈建平, 张涵庆, 刘玥辉 申请人:南京医科大学