专利名称：一种治疗和预防血栓症的血栓解药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗和预防血栓症的血栓解药物组合物及其制备方法
背景技术：
血栓性疾病是一类严重危害人类健康和生命的疾病，它包括冠心病、心肌梗塞、缺血性脑中风、静脉血栓形成和肺血栓栓塞等许多常见病和多发病，其发病率、致残率和死亡率都很高。我国中医药文化博大精深，传统方剂更是一个新药开发的宝库，从中开发治疗和预防血栓症的新型药物意义重大。血栓解是古方，由水蛭、郁金和川芎三味药材组成，用于破血逐瘀通经，主治偏枯意识障碍，偏瘫，口眼歪斜，语言不利，舌淡红有瘀斑，脉弦涩。
水蛭用于治病在国内外都有相当的历史，我国始载于《神农本草经》，水蛭可治疗高脂血症，有抗血栓形成和溶栓作用。其有效成分主要为一种抗凝血物质，名为水蛭素(Hirudin)″它能阻止凝血酶对血小板的作用，抑制血小板受凝血酶的刺激而释放，从而延缓或阻止血液的凝固″。同时有扩张血管的作用，并能缓解动脉痉挛，降低血液粘稠度，改善微循环，对缺血性中风者的血细胞比容、血浆比粘度、全血比粘度、红细胞电泳时间、纤维蛋白原含量及血沉方程k值，也具有明显的降低作用。
川芎为伞形科植物川芎(Ligusticum wallichii Frannch.)的根茎。为临床常用中药，具有活血行气、去淤止痛的功效。现代研究表明川芎的主要有效成分为川芎嗪和阿魏酸，川芎对多系统均有强弱不等的作用，概括起来主要有以下几个方面①扩张冠脉，增加冠脉流量；②扩张血管，降低血压；③改善微循环；④抑制血小板聚集、抗血栓形成及溶解已形成的血栓；⑤调节血脂和抗动脉粥样硬化。
该处方若以药材直接用药，使用不方便，药物利用率低，疗效不能保证，质量不能控制。因此有必要用现代提取分离方法和制剂手段对该药进行开发。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种治疗和预防血栓症的血栓解的药物组合物，本发明的另一个目的是提供该药物组合物的制备方法，本发明还有一个目的是提供该药物组合物在制备治疗和预防血栓症药物中的应用。
一种治疗和预防血栓症的血栓解药物组合物，是由质量比1-3份水蛭，1-3份郁金，2-4份川芎制成的提取物和相应剂型的药用辅料组成。
优选质量比1.5份水蛭，2份郁金，3份川芎制成的提取物和相应剂型的药用辅料组成。
可以是由质量比1.5份水蛭，2份郁金，3份川芎制成的提取物和冻干辅料制成注射用冻干粉针剂。
可以是由质量比1.5份水蛭，2份郁金，3份川芎制成的提取物和相应剂型辅料制成注射液、片剂、胶囊或软胶囊。
一种血栓解的药物组合物，是按以下步骤制成的1)水蛭粉碎成粗粉，用70-90％的乙醇提取两次，每次5-8倍量，合并两次提取液过滤，滤液用层析柱或分子筛树脂分离，洗脱液浓缩后，用超滤柱超滤，截取分子量3000-20000之间的溶液，超滤液减压浓缩低温干燥得水蛭提取物；2)将郁金、川芎打粗粉，用75％乙醇提取三次，合并提取液浓缩后加水水沉，冷库中冷藏24小时，过滤后上大孔吸附树脂，洗脱液浓缩烘干得郁金川芎提取物；3)将水蛭提取物和郁金川芎提取物合并，按各种制剂常规技术做成相应制剂。
水蛭提取物和郁金川芎提取物制备后，第三步操作可以将水蛭提取物和郁金川芎提取物合并后，溶于注射用水中，冷藏过夜，过滤后加入一定量的亚硫酸氢钠，加入0.05-0.15％的活性炭煮沸20分钟脱碳，过滤，精滤后分装，灭菌，制成针剂或输液。
水蛭提取物和郁金川芎提取物制备后，第三步将水蛭提取物和郁金川芎提取物合并后，按该领域内常规工艺制成胶囊或软胶囊。
水蛭提取物和郁金川芎提取物制备后，第三步将水蛭提取物和郁金川芎提取物合并后，按该领域内常规工艺制成片剂。
一种注射用血栓解药物组合物的制备方法，其特征是按以下步骤完成的1)取1.5份量的水蛭粉碎成粗粉，用70-90％的乙醇提取两次，每次5-8倍量，合并两次提取液过滤，滤液用层析柱或分子筛树脂层析，用75乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，用超滤柱超滤，截取分子量3000-20000之间的溶液，超滤液减压浓缩低温干燥得水蛭提取物；2)取2份量的郁金和3份量的川芎打粗粉，用75％乙醇提取三次，合并提取液浓缩后加水水沉，冷库中冷藏24小时，过滤后上大孔吸附树脂，洗脱液浓缩烘干得郁金川芎提取物；a)将水蛭提取物和郁金川芎提取物合并充分溶解于注射用水中，加入注射用冻干辅料，经过脱碳，过滤，精滤，分装，加塞，冻干，压盖，加铝盖即得注射用血栓解冻干粉。
水蛭提取物制备过程中优选截留5000-20000分子量的物质。
郁金川芎提取物的制备过程中可以是但不限于ADS-5、AB-8或ADS-7大孔吸附树脂。
冻干辅料可以是但不限选用甘露醇为骨架支撑剂。
郁金川芎提取物的制备过程中更优选ADS-5大孔吸附树脂。
本发明所得药物组合物可以用于制备治疗和预防血栓症的药物。
本发明所制备的血栓解药物组合物工艺可行，疗效确切，毒副作用小，能够进一步开发为新型治疗和预防血栓症的药物。
具体实施例实施例1水蛭提取物的制备取15kg水蛭粉碎成粗粉，加入70％的药用乙醇50L，60℃温浸提取1.5h后，过滤，药渣再加入70％的药用乙醇50L，60℃温浸提取1.5h，过滤，合并两次滤液。滤液上预处理好的大孔吸附树脂，用75％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，用超滤柱超滤，截取分子量3000-20000之间的溶液，超滤液减压浓缩低温干燥得水蛭提取物，称重得37.3g。批号040201实施例2水蛭提取物的制备取15kg水蛭粉碎成粗粉，加入90％的药用乙醇50L，60℃温浸提取1.5h后，过滤，药渣再加入90％的药用乙醇50L，60℃温浸提取1.5h，过滤，合并两次滤液。滤液上预处理好的层析柱，用75％乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，用超滤柱超滤，截取分子量5000-20000之间的溶液，超滤液减压浓缩低温干燥得水蛭提取物，称重得35.2g。批号040211水蛭素的含量测定取纤维蛋白原0.25g，溶于50mL的Tris2HCl缓冲液(pH＝8)中，得0.5％的纤维蛋白原溶液″稀释凝血酶到5NIH/mL″取0.2mL纤维蛋白原溶液，分别加入20μL水蛭提取物溶解液(分别取040201和040211各2mg溶解并定溶于10ml容量瓶中)，并加入凝血酶至凝固，得水蛭素含量＝凝血酶浓度*凝血酶用量/水蛭提取物溶液体积，结果见表1表1水蛭素含量测定
实施例3郁金川芎提取物的制备取20kg的郁金和30kg的川芎打粗粉，用75％乙醇提取三次，每次300L，合并提取液浓缩至相对密度1.18(50℃)，加6倍量水充分搅拌，冷库中冷藏24小时，过滤后上ADS-5大孔吸附树脂(天津欧瑞生物科技有限公司)，洗脱液浓缩烘干得郁金川芎提取物，称重得88.7g。批号040220
实施例4郁金川芎提取物的制备取20kg的郁金和30kg的川芎打粗粉，用75％乙醇提取三次，每次500L，合并提取液浓缩至相对密度1.18(50℃)，加6倍量水充分搅拌，冷库中冷藏24小时，过滤后上AB-8大孔吸附树脂(天津欧瑞生物科技有限公司)，洗脱液浓缩烘干得郁金川芎提取物，称重得96.8g。批号040225实施例5注射用血栓解冻干粉的制备将040201水蛭提取物0.37g、040220郁金川芎提取物0.89g，均匀混合充分溶解于80ml注射用水中，冷藏24小时过滤，滤液加入8g甘露醇，过0.45微米的微孔滤膜，加注射用水定容至100ml，溶液加热至80℃左右，加入0.05g活性炭，保持温度15分钟，过滤，精滤，分装于7ml西林瓶中每支2ml，加塞，冻干，压盖，加铝盖即得注射用血栓解冻干粉。批号冻干粉040301实施例6血栓解注射液的制备将040201水蛭提取物0.37g、040220郁金川芎提取物0.89g，均匀混合充分溶解于800ml注射用水中，冷藏24小时过滤，滤液加入0.5g的亚硫酸氢钠，充分溶解，补加注射用水至1000ml后煮沸后，加入0.5g的活性炭煮沸20分钟脱碳，过滤，0.22微米微孔滤器过滤后分装于100ml瓶中，115℃灭菌20分钟，制成输液。批号输液40310实施例7血栓解软胶囊的制备将040211水蛭提取物0.35g、040225郁金川芎提取物0.97g，均匀混合后，加入大豆油15g，蜂蜡0.3g，混匀，制成软胶囊50粒，即得。
实施例8血栓解胶囊的制备将040211水蛭提取物0.35g、040225郁金川芎提取物0.97g，均匀混合后，加10％的糊精，制粒，制成胶囊50粒，即得实施例9血栓解片的制备将040211水蛭提取物0.35g、040225郁金川芎提取物0.97g，均匀混合后加入7.5g微晶纤维素，0.5g交联聚乙烯吡咯烷酮，粉碎，乙醇软化，过60目筛后制粒，50℃干燥，过60目筛整粒，加入0.5g羧甲基淀粉钠，0.1g阿斯帕坦，1.5g硬脂酸镁均匀混合，压制成50片，即得。
实施例10、体外兔血栓溶解实验实验药物本发明冻干粉针，本发明冻干粉针溶液配制分别取冻干粉(040301)1只和5只，各加入生理盐水100ml制备成两种不同浓度的溶液。
生理盐水0.9％氯化钠溶液丹参注射液取10ml，加入生理盐水40ml制备成丹参注射溶液。
实验动物1.0-1.5kg新西兰兔2只实验方法于兔颈静脉取血，取兔静脉血30ml于聚氯乙烯管中(自径0.34cm)，室温下让其凝固，60min后用注射器推出凝块，切成0.15cm3大小备用，共制备12块，制得全血凝块。取兔静脉血30ml，用柠檬酸钠抗凝，以800r/min离心10min，收集上层血浆及中层血小板，然后加入凝血酶，按每毫升血浆加0.1ml(10μ/ml)凝血酶的剂量，混匀后在平皿中形成凝块，切成0.15cm3的小块备用，共制备12块，制得多血小板血浆凝块。取浓度为20mg/ml(不含纤溶酶和纤溶酶原)的纯纤维蛋原溶液2ml，加2ml(10μ/ml)的凝血酶，在自径为0.5cm的小试管中形成凝块，将凝块轻轻摇出，切成0.15cm3的小块备用，共制备12块，制得纯纤维蛋白凝块。将制好的兔全血凝块、兔多血小板血浆凝块和纯纤维蛋白凝块分别投入高、低浓度的本发明冻干粉针溶液、丹参注射液溶液阳性对照液和生理盐水阴性对照液中(均为600μl溶液)，置37℃恒温水溶液中保温并观察其溶解情况，记录其完全溶解时间，各实验重复做3次。
实验结果见表2表2各组血栓完全溶解的时间比较(x±s)
注本发明注射液血栓凝块溶解时间与丹参对照组比较**P＜0.01实施例11、利用血栓法测定对大白鼠血栓形成的影响实验药物本发明冻干粉针，本发明冻干粉针溶液配制取冻干粉(040301)1只和5只，各加入生理盐水100ml制备成两种不同浓度的溶液生理盐水0.9％氯化钠溶液丹参注射液取2ml，加入生理盐水50ml制备成丹参注射溶液。
实验动物体重300-400克的SD大白鼠40只，雌雄各半。随机分为空白对照、丹参注射液对照组、本发明注射液低剂量、本发明注射液高剂量四组份，每组10只。
实验方法将大鼠给药，给药剂量，本发明冻干粉针溶液低剂量组，本发明冻干粉针溶液高剂量组，丹参注射液对照组灌胃。空白对照组等容量生理盐水，灌胃溶积均为6ml/kg，每天一次，共5天。大鼠给药第5天，末次给药后1小时后，动物称重，iv 3％戊巴比妥纳1ml/kg麻醉。仰卧位固定，取颈正中切口，分离气管，分离双侧颈总A，V，在聚乙烯管中穿6cm5个0丝线，以肝素生理盐水溶液充满聚乙烯管，当聚乙烯管的一端插入左侧颈外静脉后，由聚乙烯管准确的注入肝素抗凝，再将聚乙烯管另一端插入右侧颈动脉，打开动脉夹，造成A-V旁路，开放血流15min，取出硅胶管，抽出丝线(含血栓)，按号置于已称重的小培养皿中，分析天平称取血栓湿重，总重量减去丝线重量即得血栓重量。
结果见表3表3各给药组的血栓重量比较(x±s)
注与生理盐水对照组比较**P＜0.01与丹参注射液对照组比较△△P＜0.01实施例12、对大白鼠凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)及血液流变学影响实验药物本发明冻干粉针，本发明冻干粉针溶液配制取冻干粉(040301)1只和5只，各加入生理盐水100ml制备成两种不同浓度的溶液生理盐水0.9％氯化钠溶液丹参注射液取2ml，加入生理盐水50ml制备成丹参注射溶液。实验动物体重300-400克的SD大白鼠40只，雌雄各半。随机分为空白对照、丹参注射液对照组、本发明注射液低剂量、本发明注射液高剂量四组分，每组10只。
实验方法将大鼠给药，给药剂量，本发明冻干粉针溶液低剂量组按，本发明冻干粉针溶液高剂量组，丹参注射溶液组，灌胃。空白对照组等容量生理盐水，灌胃溶积均为6ml/kg，每天一次，共5天。大鼠给药第5天，末次给药后半小时后眼后动脉取血，取血2ml加入含有3.8％的构椽酸钠水溶液0.2ml的试管中，颠倒试管混匀，再由ACL-200(美国贝克曼)型智能血液凝集仪检测测量PT，APTT。另取血2ml，加入事先己经制备好的内壁附有肝素的干燥试管中，颠倒混匀，加样使用可调加样器，调至800μl，将试杯及切血板装入测试系统，加样器吸头底接触样品杯内侧表面，让血液沿内器缓慢滑入，预温3分钟由血液流变分析仪器LG-R-80(北京世帝科学仪器有限公司)行全血粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数、红细胞变形能力检测。
结果见表4、5表4各给药组的对大鼠PT和APTT影响(x±s)
注与生理盐水对照组比较**P＜0.01与丹参注射液对照组比较△P＜0.05表4各给药组对大鼠血液流变学指标影响(x±s)
注与生理盐水对照组比较料**P＜0.01*P＜0.05实施例13、对大白鼠血小板聚集性的影响(比浊法)实验药物本发明冻干粉针，本发明冻干粉针溶液配制分别取冻干粉(040301)1只和5只，各加入生理盐水100ml制备成两种不同浓度的溶液生理盐水0.9％丹参注射液取4ml，加入生理盐水50ml制备成丹参注射溶液。
实验动物体重300-400克的SD大白鼠40只，雌雄各半。随机分为空白对照、丹参注射液对照组、本发明注射液低剂量、本发明注射液高剂量四组分，每组10只。
实验方法将大鼠给药，给药剂量，本发明冻干粉针溶液低剂量组，本发明冻干粉针溶液高剂量组，丹参注射液组，灌胃。空白对照组等容量生理盐水，灌胃溶积均为6ml/kg，每天一次，共7天。大鼠给药第7天，末次给药后半小时后行大鼠眼后动脉取血，0.13％构缘酸钠抗凝(血液与抗凝剂容积比9∶1)，将血液注入硅化试管内，用塑料薄膜覆盖离心管口，将离心管倒转3-4次使血液与抗凝剂充分混匀，用清洁的滤纸吸去附着在管壁残留的血液，并加紧盖盖紧离心管。以1000r/min离心10分钟，小心取出上层血浆(PRP)，将剩余血浆以3000r/min离心20分钟，下层透明液体为PPP。计数PRP中的血小板数，用PPP将PRP中的血小板调至200×109/L。硅化处理的移液管取PPP和PRP450ul分别置入比浊管内，测定时先以PPP标本将记录仪的透光度调节到100，然后将PRP标本放入测定孔，调节透光度为10，并加搅拌磁棒，在37℃预热3分钟，打开记录仪，在PRP中加入ADP诱导血小板聚集剂，CHROND-Log血小板聚集仪(美国)，通过聚集曲线算出血小板最大聚集率(％)，(Amax)＝h1/h0×100％；血小板聚集抑制率，抑制率＝[(生理盐水Amax-用药Amax)/生理盐水Amax]×100％。
结果见表6表6各给药组的对大鼠血小板聚集性影响(x±s)
注与生理盐水对照组比较**P＜0.01与丹参注射液给对照比较△△P＜0.01
实施例14对小鼠ADP诱导的血栓性死亡的影响实验药物本发明冻干粉针，本发明冻干粉针溶液配制取冻干粉(040301)1只和5只，各加入生理盐水100ml制备成两种不同浓度的溶液生理盐水0.9％氯化钠溶液丹参注射液取5ml，加入生理盐水50ml制备成丹参注射溶液。
实验动物BALB/c小鼠80只，雌雄各半。随机分为空白对照、丹参注射液对照组、本发明冻干粉针溶液低剂量、本发明冻干粉针溶液高剂量四组分，每组20只。
实验方法将小鼠给药，给药剂量，本发明冻干粉针溶液低剂量组，本发明冻干粉针溶液高剂量组，丹参注射液组，灌胃。空白对照组等容量生理盐水，灌胃溶积均为6ml/kg，每天一次，连续7天，于末次给药后1h尾静脉注射ADP48.0ml/kg，记录动物死亡情况。
结果见表7表7各给药组的对小鼠ADP诱导的血栓性死亡的影响比较
权利要求
1.一种治疗和预防血栓症的血栓解药物组合物，是由质量比1-3份水蛭，1-3份郁金，2-4份川芎制成的提取物和相应剂型的药用辅料组成。
2.如权力要求1所述的血栓解药物组合物，其特征是由质量比1.5份水蛭，2份郁金，3份川芎制成的提取物和相应剂型的药用辅料组成。
3.如权力要求2所述的血栓解药物组合物，其特征是由质量比1.5份水蛭，2份郁金，3份川芎制成的提取物和冻干辅料组成。
4.一种治疗和预防血栓症的血栓解药物组合物，是按以下步骤制成的1)水蛭粉碎成粗粉，用70-90％的乙醇提取两次，每次5-8倍量，合并两次提取液过滤，滤液用层析柱或分子筛树脂分离，洗脱液浓缩后，用超滤柱超滤，截取分子量3000-20000之间的溶液，超滤液减压浓缩低温干燥得水蛭提取物；2)将郁金、川芎打粗粉，用75％乙醇提取三次，合并提取液浓缩后加水分散，冷库中冷藏24小时，过滤后上大孔吸附树脂，洗脱液浓缩烘干得郁金川芎提取物；3)将水蛭提取物和郁金川芎提取物合并，按各种制剂常规技术做成相应制剂。
5.如权力要求4所述的血栓解药物组合物，其特征是按以下步骤制成的1)水蛭粉碎成粗粉，用70-90％的乙醇提取两次，每次5-8倍量，合并两次提取液过滤，滤液用层析柱或分子筛树脂层析，洗脱液浓缩后，用超滤柱超滤，截取分子量3000-20000之间的溶液，超滤液减压浓缩低温干燥得水蛭提取物；2)将郁金、川芎打粗粉，用75％乙醇提取三次，合并提取液浓缩后加水水沉，冷库中冷藏24小时，过滤后上大孔吸附树脂，洗脱液浓缩烘干得郁金川芎提取物；3)将水蛭提取物和郁金川芎提取物合并充分溶解于注射用水中，加入注射用冻干辅料，以该领域内常规技术制成注射用血栓解冻干粉。
6.如权力要求5所述的血栓解药物组合物，其特征是按以下步骤制成的1)水蛭粉碎成粗粉，用70-90％的乙醇提取两次，每次5-8倍量，合并两次提取液过滤，滤液用层析柱或分子筛树脂层析，洗脱液浓缩后，用超滤柱超滤，截取分子量3000-20000之间的溶液，超滤液减压浓缩低温干燥得水蛭提取物；2)郁金、川芎打粗粉，用75％乙醇提取三次，合并提取液浓缩后加水水沉，冷库中冷藏24小时，过滤后上大孔吸附树脂，洗脱液浓缩烘干得郁金川芎提取物；3)将水蛭提取物和郁金川芎提取物合并，溶于注射用水中，冷藏过夜，过滤后加入一定量的亚硫酸氢钠，加入0.05-0.15％的活性炭煮沸20分钟脱碳，按该领域内常规工艺制成针剂或输液。
7.一种注射用血栓解药物组合物的制备方法，其特征是按以下步骤完成的1)取1.5份量的水蛭粉碎成粗粉，用70-90％的乙醇提取两次，每次5-8倍量，合并两次提取液过滤，滤液用层析柱或分子筛树脂层析，洗脱液浓缩后，用超滤柱超滤，截取分子量3000-20000之间的溶液，超滤液减压浓缩低温干燥得水蛭提取物；2)取2份量的郁金和3份量的川芎打粗粉，用75％乙醇提取三次，合并提取液浓缩后加水水沉，冷库中冷藏24小时，过滤后上大孔吸附树脂，洗脱液浓缩烘干得郁金川芎提取物；3)将水蛭提取物和郁金川芎提取物合并充分溶解于注射用水中，加入注射用冻干辅料，经过脱碳，过滤，精滤，分装，加塞，冻干，压盖，加铝盖即得注射用血栓解冻干粉。
8.如权力要求10所述的注射用血栓解药物组合物的制备方法，其特征是水蛭提取物制备过程中截留的是5000-20000分子量的物质。
9.如权力要求7或8所述的注射用血栓解药物组合物的制备方法，其特征是郁金川芎提取物的制备过程中可以是但不限于ADS-5、AB-8或ADS-7大孔吸附树脂。
10.如权力要求5所述的注射用血栓解药物组合物在制备治疗和预防血栓症药物中的应用。
全文摘要
一种用于治疗和预防血栓症的血栓解药物组合物及其制备方法。主要是将水蛭经过提取、盐析和层析分离的方法制得水蛭提取物，将郁金川芎采用提取和大孔吸附树脂纯化的方法制得郁金川芎提取物，合并两个提取物按各种制剂常规手段制成冻干粉针、注射液、片剂、胶囊或软胶囊等制剂。本发明所制得的血栓解药物组合物有强的溶栓效果，对脑梗塞、心肌梗塞等疾病疗效确切，有较高的安全性。并且具有预防血栓形成的功效，疗效明确，质量可控，毒副作用小。
文档编号A61K35/64GK1788785SQ20051010101
公开日2006年6月21日 申请日期2005年11月11日 优先权日2005年11月11日
发明者王伟, 刘二伟 申请人:广东大光药业有限公司