一种中药复方制剂的质量控制方法

专利名称：一种中药复方制剂的质量控制方法
技术领域：
本发明是一种中药复方制剂的质量控制方法，属于中药的技术领域。
背景技术：
心脑血管疾病如冠心病、脑血栓、老年性痴呆等均是当今世界最常见和危害最大的疾病之一，在许多国家已成为人口死亡的主要原因之一；据调查，近年来的发病率有逐年增高趋势，而且中、青年患者不断增加，心脑缺血性疾病已成为危害我国人民健康的常见病、多发病；为了达到防治目的，许多发明人及药品企业对其做了大量的研究工作。药物制剂必须要在保证产品质量稳定可控安全的基础之上，才能不断的更新发展，为了更好的控制该制剂的质量，保证用药的安全性，更好的指导生产，使工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质地，需要研究、控制该中药复方制剂质量的方法；目前，在相关药物制剂中，一般仅以野黄芩苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1为检测指标，但是它根本不能全面反应产品的质量，仅以此用来控制中药复方制剂的质量不是十分合理；如果用别的指标进行控制，由于没有现成的检测方案、检测条件等等，所以比较难于实施。

发明内容
本发明的目的在于提供一种新的中药复方制剂的质量控制方法。这种方法向相关的生产、检测机构提供了检测的指标、检测的手段、技术方法等等，以便更好的控制该制剂的质量，保证用药的安全性，能够更好的指导生产，使生产工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质地。
该中药复方制剂的药味组成及配比如下(按重量份)方案一三七 1～99重量份 灯盏细辛 99～1重量份方案二三七 1～99重量份 灯盏细辛提取物 30～0.1重量份方案三三七提取物 0.1～30重量份 灯盏细辛 99～1重量份方案四三七提取物 0.1～30重量份 灯盏细辛提取物 30～0.1重量份方案五三七总皂苷 0.1～30重量份 灯盏细辛总黄酮 30～0.1重量份上述中药复方制剂的剂型为注射剂或口服制剂；其中注射剂包括直接用于注射给药的注射液、直接供静脉滴注的静脉输液、需稀释后用于静脉滴注的注射用浓溶液和用冷冻干燥法或喷雾干燥法制备的注射用无菌粉末或无菌块状物；口服制剂包括片剂、分散片剂、胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、颗粒剂、丸剂、微丸剂、散剂、滴丸剂、缓释制剂、控释制剂、口服液体制剂、凝胶剂、煎膏剂、浸膏剂和膜剂。临床上用于治疗冠心病、心绞痛、心律失常、脑血栓、老年性痴呆、肝肾综合症、心肺病、糖尿病及其并发症等疾病。
本发明是这样构成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于该方法包括以下全部或部分内容(1)指纹图谱测试，包括以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱和以三七成分特征为主的指纹图谱中的一种或两种；(2)灯盏细辛对照药材、三七对照药材、野黄芩苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1中全部或部分成分的鉴别测试方法；(3)野黄芩苷、总黄酮、总皂苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1中全部或部分成分的含量测试方法。
所述的以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于该方法采用液相色谱法测试以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱和以三七成分特征为主的指纹图谱中的一种或两种a、采用液相色谱法测试以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备取待测中药复方制剂适量，加水或甲醇或乙醇溶解或稀释，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备取野黄芩苷，用甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为0.5％～100％乙腈溶液或甲醇0.005mol/L～5mol/L磷酸二氢钠溶液或0.005mol/L～5mol/L磷酸二氢钾溶液或0.1％～5％冰醋酸或0.1％～5％甲酸或0.005％～5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min、检测波长为190-400nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～30个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测中药复方制剂中以灯盏细辛、白芍或赤芍成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测中药复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算待测中药复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00；II.待测中药复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％；III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间的相对偏差不得超过±20％。
b、采用液相色谱法测试以三七成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备取待测中药复方制剂适量，加甲醇或乙醇或水稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备取适量三七药材中的主要活性成分对照品，包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种，用水或甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈或甲醇∶水或0.1％～5％冰醋酸或0.1％～5％甲酸或0.005％～5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min、检测波长为190-400nm范围内的一个或几个或蒸发光散射检测器检测，柱温在20～60℃范围内；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以三七成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～30个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测中药复方制剂中以三七成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测中药复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算待测中药复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00；II.待测中药复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％；III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间的相对偏差不得超过±20％。
所述的以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于该方法采用液相色谱法测试以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱和以三七成分特征为主的指纹图谱中的一种或两种a、采用液相色谱法测定以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备精密称取待测中药复方制剂适量，加水制成每1ml含1mg的溶液，摇匀，即得；(2)参照物溶液的制备精密称取野黄芩苷适量，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为80％乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，梯度洗脱，溶剂比例从0分钟至80分钟，流动相A的比例由15％升至70％，流动相B的比例由85％升至30％；流速为1.0ml/min，检测波长为230±2nm，柱温为40℃；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以灯盏细辛成分特征为主的标准指纹图谱的测试手段；分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～20个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测中药复方制剂中以灯盏细辛特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测中药复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算待测中药复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；II.待测中药复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间的相对偏差不得超过±10％。
b、采用液相色谱法测试以三七成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备取待测中药复方制剂适量，加甲醇或乙醇或水稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1适量，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈∶水，梯度洗脱，，溶剂比例为从0分钟至12分钟，乙腈的比例为15％，从14分钟至45分钟，乙腈的比例为从15％升至30％，从45分钟至60分钟，乙腈的比例为从30％升至80％，流速为1ml/min、检测波长203±2nm，柱温30℃；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以三成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～20个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测中药复方制剂中以三七成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测中药复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算待测中药复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；II.待测中药复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间的相对偏差不得超过±10％。
所述的以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂的鉴别方法包括以下中的一种或几种a、中药复方制剂中灯盏细辛药材、野黄芩苷中一种或几种的薄层色谱鉴别方法取待测中药复方制剂适量，加醋酸乙酯或乙醇或甲醇或正丁醇提取，滤过或离心，取滤液或上清液作为供试品溶液；另取灯盏细辛对照药材、野黄芩苷对照品中的一种或两种制备对照溶液；灯盏细辛对照药材溶液的制备取灯盏细辛对照药材，加醋酸乙酯或乙醇或甲醇或正丁醇提取，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇或乙醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取野黄芩苷对照品，加甲醇或乙醇制成每1ml含1mg的溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液和灯盏细辛对照药材溶液、野黄芩苷对照品溶液的一种或两种各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板或聚酰胺薄膜上，以醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲酸或乙酸-水或甲醇0.2～60∶0.2～10∶0.3～20或苯或甲苯-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲酸或乙酸-水1～30∶0.5～15∶0.05～5∶0.01～3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.3％～10％三氯化铝乙醇或0.3～10％三氯化铝甲醇溶液或0.3～10％三氯化铁乙醇溶液，置日光下或紫外光灯365nm或254nm下检视或105℃烘1～15分钟后置日光下或紫外光灯365nm或254nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色斑点；b、中药复方制剂中野黄芩苷的液相色谱鉴别方法取待测中药复方制剂适量，加甲醇或乙醇或流动相或水溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液5％～95％∶95％～5％或甲醇或乙腈-四氢呋喃-0.01％～5％磷酸水溶液或乙腈-0.005moL/L～0.3moL/L磷酸二氢钠(1～99％磷酸调pH＝2.0～5.0)梯度洗脱系统为流动相，检测波长为200～410nm；供试品色谱中，应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰；c、中药复方制剂中三七、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的薄层色谱鉴别方法取待测中药复方制剂适量，用正丁醇或乙醇或甲醇或醋酸乙酯或三氯甲烷提取，滤过，滤液作为供试品溶液；另取三七对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种，制备对照溶液；三七对照药材溶液的制备取三七对照药材适量，加三氯甲烷或二氯甲烷或乙醚回流提取，弃去三氯甲烷或二氯甲烷或乙醚液，残渣加水饱和正丁醇或醋酸乙酯提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇或乙醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品，分别加甲醇或乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲醇-水5～40∶10～100∶5～50∶0.2～3010℃以下放置的下层溶液或正丁醇-醋酸乙酯或甲酸乙酯-水1～10∶0.2～2∶1～15的上层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5～50％硫酸乙醇试剂或50％硫酸试剂，80℃～160℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点，阴性无干扰；d、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的液相色谱鉴别取待测中药复方制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或流动相或乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇或乙腈-水或0.5％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.5％～5％甲酸溶液5％～40％∶95％～60％为流动相，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个或蒸发光检测器检测，柱温在20～60℃范围内；供试品色谱中，应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰，阴性无干扰。
所述的以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂的鉴别方法包括以下中的一种或几种a、中药复方制剂中灯盏细辛药材、野黄芩苷中一种或几种的薄层色谱鉴别方法取待测中药复方制剂适量，加甲醇提取，离心，取上清液作为供试品溶液；另取灯盏细辛对照药材、野黄芩苷中的一种或几种制备对照溶液；灯盏细辛对照药材溶液的制备取灯盏细辛对照药材，加醋酸乙酯提取，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取野黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各3μl，分别以条状带点于同一聚酰胺膜上，以甲醇-醋酸乙酯-甲酸7∶2∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的条斑；b、中药复方制剂中野黄芩苷的液相色谱鉴别方法取待测中药复方制剂适量，加甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-0.1％磷酸水溶液50％∶50％为流动相，检测波长为335nm；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰；c、中药复方制剂中三七、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的薄层色谱鉴别方法取待测中药复方制剂适量，用正丁醇提取，滤过，滤液作为供试品溶液；另取红参或人参对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种，制备对照药材溶液；三七对照药材溶液的制备取三七对照药材适量，加三氯甲烷回流提取，弃去三氯甲烷液，残渣加水饱和正丁醇提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品，分别加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-水15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试剂，105℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰；d、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的液相色谱鉴别取待测中药复方制剂适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰，阴性无干扰。
所述的以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂含量的测试方法应包括以下中的一种或几种a、中药复方制剂中野黄芩苷的含量测定取待测中药复方制剂适量，加甲醇或乙醇或流动相或水溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液5％～95％∶95％～5％或甲醇或乙腈-四氢呋喃-0.01％～5％磷酸水溶液或乙腈-0.005moL/L～0.3moL/L磷酸二氢钠(1～99％磷酸调pH＝2.0～5.0)梯度洗脱系统为流动相，检测波长为200～410nm；以外标一点法或标准曲线法进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含野黄芩苷的限度不得少于2mg；b、中药复方制剂中总黄酮的含量测定取待测中药复方制剂适量，用甲醇或水溶解并稀释至合适浓度，摇匀，作为供试品溶液；以野黄芩苷作为对照品，同法制得对照品溶液；以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在335±10nm的波长处测定吸收度，以外标一点法或标准曲线法进行计算；或取待测中药复方制剂适量，加水溶解并稀释至合适浓度，摇匀，精密量取适量，置量瓶中，加50％甲醇或水1～25ml，加5％亚硝酸钠溶液0.3～1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.3～1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液4～10ml，再加50％甲醇或水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以芦丁或野黄芩苷作为对照品，同法制得对照品溶液；以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在500±10nm处测定吸收度，以外标一点法或标准曲线法进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总黄酮的限度以芦丁或野黄芩苷计，不得少于5mg；c、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的含量测定取待测中药复方制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或流动相或乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇或乙腈-水或0.5％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.5％～5％甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个或蒸发光检测器检测，柱温在20～60℃范围内；以外标法或标准曲线法进行计算，待测中药复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项(1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于2.5mg；(2)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于3.5mg；(3)每单位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.25mg；每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的总和的限度不得少于6mg；d、中药复方制剂中总皂苷的含量测定取待测中药复方制剂适量，置量瓶中，加蒸馏水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取适量，置量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加1％～50％香草醛-冰醋酸溶液0.1～10ml，高氯酸0.1～15ml，摇匀，30～80℃水浴上加热3～50分钟，取出，立即以冰水浴或流水冷却，精密加冰醋酸至刻度，摇匀，作为供试品溶液，以人参皂苷Rg1或人参皂苷Rb1或三七皂苷R1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在547±10nm的波长处测定吸收度，以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测中药复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以人参皂苷Rg1或人参皂苷Rb1或三七皂苷R1计，不得少于10mg。
所述的以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂含量的测试方法是以下一种或几种方法a、中药复方制剂中野黄芩苷的含量测定取待测中药复方制剂适量，加甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-0.1％磷酸水溶液50％∶50％为流动相，检测波长为335nm；以外标一点进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含野黄芩苷的限度不得少于4mg；b、中药复方制剂中总黄酮的含量测定取待测中药复方制剂适量，置量瓶中，加甲醇适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取1ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以野黄芩苷作为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，照分光光度法，在335nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总黄酮的限度以野黄芩苷计，不得少于10mg；c、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的含量测定取待测中药复方制剂适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温为30℃；以外标法或标准曲线法进行计算，待测中药复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项(1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于5mg；(2)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于7mg；(3)每单位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.5mg；(4)每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的总和的限度不得少于12mg；d、中药复方制剂中总皂苷的含量测定取待测药物适量，置10ml量瓶中，加蒸馏水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取0.6，置25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液0.5ml，高氯酸2.0ml，摇匀，60℃水浴上加热15分钟，取出，立即以冰水浴或流水冷却，精密加冰醋酸至刻度，摇匀，作为供试品溶液，以人参皂苷Rg1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在547nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测中药复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以人参皂苷Rg1计，不得少于20mg。
所述的以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂的含量测定结果，按照重量百分比计算，野黄芩苷、总黄酮、总皂苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1中的全部或部分物质的总含量占制剂中扣除辅料和水分外的总固体量的25％以上。
与现有技术相比，本发明能更加完善的控制以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量。中药成分复杂，如果只用其中一、两种成分来说明其内在质量，具有一定的片面性，更无法判断其药效的指标成分。因此本申请人制定了以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱和以三七成分特征为主的指纹图谱、鉴别和含量测定来全面控制中药复方制剂的质量。但是由于中药复方制剂中的各药材之间所含的化学成分复杂，对指纹图谱的制定、鉴别和含量测定造成干扰，导致鉴别、含量测定和各部分指纹图谱特征不稳定，所以必须控制流动相、展开剂等色谱条件，才能得到良好的薄层色谱、含测条件和指纹图谱。也就是说，由于处方中各成分相互之间的干扰影响，导致中药复方制剂中灯盏细辛、三七部分的指纹图谱特征峰发生改变，而只有采用本发明的条件，才能得到理想的薄层色谱、含测条件和指纹图谱。
通过实验证明，本发明质量控制方法对以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂产品的质量控制更为有效，方法精密度、稳定性均较高。
实验例1以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱的制备a、实验仪器、试剂及样品对照品野黄芩苷中国药品生物制品检定所b、色谱条件与系统适应性实验1.色谱柱的选择研究过程中，选用了常规的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，分别试用了Inertsil ODS-3(250mm×4.6mm，5μm)Kromasil C18(200mm×4.6mm，5μm)、Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)三种牌号的色谱柱，结果显示三种牌号的色谱柱均可达到较好的分离效果，其中Diamonsil C18色谱柱分离效果最好，柱效最高，可以达到70000(以参照物野黄芩苷计算)。故最终选用Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)为实验研究柱。
2.流动相的选择研究过程中分别考察了(1)甲醇-水(20∶80)，(2)乙腈-水(10∶90)，(3)乙腈-水(梯度洗脱)(4)流动相A为80％乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，梯度洗脱，溶剂比例从0分钟至80分钟，流动相A的比例由15％升至70％，流动相B的比例由85％升至30％四种流动相系统。结果显示流动相(1)条件下，峰形较差，1小时内出峰较少，仍有不少组分滞留在后出峰；流动相(2)流动相条件下，峰形较差，分离不好；(3)条件下，峰拖尾严重，出峰不完全；流动相(4)条件下，峰形较好，出峰完全且分布均匀，故而最终被选用。
3.检测波长的确定研究中在流动相A为80％乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，梯度洗脱流动相条件下，分别考察了在不同波段典型波长230、254、270、300下的色谱峰情况，结果表明，230nm检测时能兼顾各成分色谱峰的峰度、分离度和基线，故选择230nm为本品指纹图谱检测波长。
4.仪器、色谱柱及积分参数4.1仪器参数选用了液相色谱分析领域主流配置和性能良好的LC-10Avp高效液相色谱仪，WML-2010色谱工作站。色谱柱为Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温40℃，流速1.0ml/min。
4.2积分参数峰宽10；斜率100；最小峰面积50000。如此设定可以避免一些很小面积的色谱峰(单峰面积占总峰面积小于0.5％)的计算，同时保证与参照物的相关性。
5.供试品溶液的制备精密称取本品适量，加水制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
6.参照物溶液的制备精密称取野黄芩苷适量，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，作为参照物溶液。
7.指纹图谱及技术参数根据10批样品制定标准指纹图谱，将供试品指纹图谱与标准指纹图谱比较，相似度均在0.90～1.00之间。
实验例2以三七成分特征为主的指纹图谱a、实验仪器、试剂及样品对照品人参皂苷Rg1中国药品生物制品检定所b、色谱条件与系统适应性实验
1.色谱柱的选择研究过程中，选用了常规的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，分别试用了Zorbax、Inertsil ODS-3、Diamonsil ODS(均为C18，4.6mm×200mm，5μm)三种牌号的色谱柱，结果显示三种牌号的色谱柱均可达到较好的分离效果，其中Diamonsil ODS色谱柱分离效果最好，柱效最高，可以达到5400(以参照物人参皂苷Rg1计算)。故最终选用Diamonsil ODS色谱柱(4.6mm×200mm，5μm)为实验研究柱。
2.流动相的选择研究过程中分别考察了(1)甲醇-水(20∶80)，(2)乙腈-水(10∶90)，(3)乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(梯度洗脱)(4)乙腈-水(梯度洗脱)(梯度洗脱体积配比为从0分钟至12分钟，乙腈的比例为15％，从14分钟至45分钟，乙腈的比例为从15％升至30％，从45分钟至60分钟，乙腈的比例为从30％升至80％)四种流动相系统。结果显示流动相(1)条件下，峰形较差，1小时内出峰较少，仍有不少组分滞留在后出峰；流动相(2)流动相条件下，峰形较差，分离不好；(3)条件下，峰拖尾严重，出峰不完全；流动相(4)条件下，峰形较好，出峰完全且分布均匀，故而最终被选用。
3.检测波长的确定研究中在乙腈-水(梯度洗脱)流动相条件下，分别考察了在不同波段典型波长203、210、230、254下的色谱峰情况，结果显示，在203nm下色谱峰较多，峰形较好，故最终选用203nm±2作为检测波长。
4.仪器、色谱柱及积分参数4.1仪器参数选用了液相色谱分析领域主流配置和性能良好的Agilent1100系列高效液相色谱仪，Chemstation色谱工作站。色谱柱为Diamonsil ODS(4.6mm×200mm，5μm)；柱温40℃，流速1.0ml/min。
4.2积分参数Slope Sensitivity1，peak width0.05，最小峰面积为参照物(S)峰峰面积的5％，最小峰高为S峰峰高的5％。如此设定可以避免一些很小面积的色谱峰(单峰面积占总峰面积小于0.5％)的计算，同时保证与参照物的相关性。
5.供试品溶液的制备精密称取本品适量，加水制成每1ml含50mg的溶液，即得。
6.参照物溶液的制备人参皂苷Rg1为三七主要活性成分之一，其积分面积在指纹图谱中所占比例较大且较稳定，同时兼顾中间体和药材的研究，因此选定人参皂苷Rg1作为参照物。
7.指纹图谱及技术参数根据10批样品制定标准指纹图谱，将供试品指纹图谱与标准指纹图谱比较，相似度均在0.90～1.00之间。
实验例3中药复方制剂中灯盏细辛药材、野黄芩苷中一种或几种的薄层色谱鉴别方法为了突出灯盏细辛的特征，选择了灯盏细辛对照药材、野黄芩苷作为其特征，但是由于药材中存在较多与野黄芩苷结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下薄层板和展开条件对野黄芩苷进行了展开

经过筛选，确定了以聚酰胺膜为固定相，以甲醇-醋酸乙酯-甲酸(7-2-1)为展开剂，在此条件下，野黄芩苷的Rf值适中，和其它斑点分离清晰，阴性无干扰。
实验例4中药复方制剂中野黄芩苷的液相色谱鉴别方法为了突出灯盏细辛的特征，除了薄层鉴别方法以外，选择了野黄芩苷作为其特征成分，但是由于药材中存在较多与野黄芩苷结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下色谱柱和流动相对野黄芩苷进行了分离

经过筛选，确定了以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，甲醇-0.1％磷酸水溶液(50∶50)为流动相，在此条件下，野黄芩苷保留时间适中，峰行尖锐，对称，阴性无干扰。
实验例5中药复方制剂人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的薄层色谱鉴别方法为了突出三七的特征，选择了人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1作为其特征斑点，但是由于药材中存在较多与人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下薄层板和展开条件对麦冬进行了展开

经过筛选，确定了以硅胶G薄层板为固定相，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，在此条件下，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的Rf值适中，和其它斑点分离清晰，阴性无干扰。
实验例6中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的液相色谱鉴别方法为了突出三七的特征，选择了人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1作为其特征成分，但是由于药材中存在较多与人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下色谱柱和流动相对人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1进行了分离

经过筛选，确定了以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％，在此条件下，人人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1保留时间适中，峰行尖锐，对称，阴性无干扰。
实验例7中药复方制剂中野黄芩苷含量测定1仪器与试药1.1主要仪器高效液相色谱仪 LC-2010AHT SHIMADZU紫外/可见分光光度仪 TU-1810SPC 北京普析通用仪器有限公司电子分析天平BP211D SARTORIUS超声波清洗机KQ250DB 昆山市超声仪器有限公司1.2试药野黄芩苷 中国药品生物制品检定所甲醇 分析纯 北京化工厂乙腈 色谱纯 迪马公司磷酸分析纯 北京化学试剂公司2野黄芩苷 由中国药品生物制品检定所提供野黄芩苷，经高效液相色谱法(归一化法)测定纯度为96.40％，符合含量测定用对照品要求(在测定中，按照96.40％的纯度进行折算)。
3检测波长的选择 取野黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.0463mg的溶液，在190～400nm波长范围内扫描。结果表明，野黄芩苷在284nm及335nm处有最大吸收，根据《卫生部药品标准中药成方制剂》相关品种并结合文献报道，选择335nm作为野黄芩苷含量测定的检测波长。
4色谱条件色谱仪SHIMADZU LC-2010AHT；色谱柱Diamonsil ODS 250mm×4.6mm 5μm；流动相甲醇-0.1％磷酸水溶液(50∶50)；流速1.0ml/min；柱温30℃；进样量10μl；检测波长335nm。
对照品溶液的制备 精密称取野黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中取约0.25g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)5min，取出，放至室温，加甲醇定至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
根据上述色谱条件得到野黄芩苷对照品、供试品色谱图，其理论板数n均大于2000，野黄芩苷色谱峰与相近峰分离清晰完全，分离度均大于1.5，溶剂无干扰。
5提取时间的选择 取装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中取约0.25g(共3份)，精密称定，分置25ml量瓶中，加甲醇适量，分别超声处理(功率250W，频率33KHz)5、10、20min，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
提取时间考察

结果表明，超声处理5min即可提取完全。
6线性关系考察 精密量取野黄芩苷对照品溶液(C＝0.978mg/ml)0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别从中精密吸取10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定。以峰面积为纵坐标，野黄芩苷的量(μg)为横坐标作图，绘制标准曲线。
野黄芩苷标准曲线测定结果

回归方程Y＝3259091.50x-1830.06相关系数γ＝0.9999结果表明野黄芩苷在0.1886μg～0.9428μg范围内线性良好。
经计算，野黄芩苷的标准曲线过原点，因此选用外标一点法测定野黄芩苷的含量。
7精密度实验 精密吸取野黄芩苷对照品溶液(0.0489mg/ml)10μl，注入液相色谱仪，测定5次，考察对照品溶液精密度，测定结果见下表。
精密度试验

结果表明，对照品溶液精密度良好。
8稳定性实验8.1对照品溶液的稳定性实验 精密吸取野黄芩苷对照品溶液(0.0489mg/ml)10μl，注入液相色谱仪，注入液相色谱仪，分别在0、2、4、8、24小时进样测定。
对照品溶液稳定性试验

结果表明，对照品溶液24小时内稳定性良好。
8.2供试品溶液的稳定性实验精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，分别在0、2、4、8、24小时进样测定。
供试品溶液稳定性实验

结果表明，供试品溶液24小时内稳定性良好。
9重复性实验 取本品，按正文供试品溶液的制备和测定法项下进行操作。
重复性实验

10加样回收率实验 采用加样回收法，取装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中取约0.13g(共6份)，精密称定，分置25ml量瓶中，分别精密加入野黄芩苷对照品溶液(C＝0.6782mg/ml)1.0ml，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)5min，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
中药复方制剂中野黄芩苷的含量为4.958mg/g。
加样回收率实验

平均回收率＝97.96％，RSD＝0.88％11样品含量测定 取本品三批样品，按照正文供试品溶液的制备和测定法项下的操作。
野黄芩苷含量测定

实验例8中药复方制剂中总黄酮含量测定1仪器与试药(1)主要仪器紫外分光光度计 TU-1810SPC北京普析通用仪器有限责任公司电子分析天平BP211DSARTORIUS超声波清洗机KQ250DB 昆山市超声仪器有限公司(2)试药芦丁中国药品生物制品检定所(批号0080-9705)乙醇分析纯阿托兹精细化工有限公司硝酸铝 分析纯天津市化学试剂三厂亚硝酸钠分析纯天津市化学试剂三厂氢氧化钠分析纯天津市北方化玻购销中心2检测波长的选择 取芦丁对照品，按正文对照品溶液的制备方法进行操作，获得对照品溶液。取中药复方制剂，按正文测定法中供试品溶液的制备方法进行操作，获得供试品溶液。吸取芦丁对照品溶液，供试品溶液，按正文总黄酮测定项下拟定的方法，在400～800nm波长范围内进行扫描，结果表明，对照品溶液与供试品溶液均在510nm有最大吸收，溶剂无干扰，因此选择510nm作为分光光度法测定中药复方制剂中总黄酮含量的检测波长。
3对照品溶液的制备 精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品20mg，置100ml量瓶中，加60％乙醇溶液适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加60％乙醇溶液至刻度，摇匀，精密量取25ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含无水芦丁0.1mg)。
4供试品溶液的制备 取装量差异项下本品，取内容物，混匀，取约0.25g，置25ml量瓶中，加60％乙醇溶液适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加60％乙醇溶液至刻度，摇匀，即得。
5测定法 精密量取对照品溶液与供试品溶液各3.0ml，分置10ml量瓶中，各加30％乙醇溶液使成5.0ml，精密加亚硝酸钠溶液(1→20)0.3ml摇匀，放置6分钟，再加硝酸铝溶液(1→10)0.3ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液4.0ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以随行溶剂为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)，在510nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。
6标准曲线的制备 精密量取芦丁对照品溶液(C＝0.1064mg/ml)0.0ml，1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，分置10ml量瓶中，分别加30％乙醇溶液使成5.0ml，精密加亚硝酸钠溶液(1→20)0.3ml，摇匀，放置6分钟，再加硝酸铝溶液(1→10)0.3ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液4.0ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以随行溶剂为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)，在510nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度(mg/ml)为横坐标做图，绘制标准曲线。
总黄酮标准曲线测定结果

回归方程Y＝10.818x-0.0005；相关系数γ＝0.9999；结果表明芦丁在0.0110～0.0530mg/ml范围内线性良好。
经计算，芦丁的标准曲线过原点，因此选用外标一点法测定总黄酮的含量。
7精密度试验 精密吸取芦丁对照品溶液(浓度0.1064mg/ml)3.0ml，置10ml量瓶中，按正文测定法项下的方法，自“加30％乙醇溶液使成5.0ml”起，依法操作，在510nm的波长处测定吸收度，测定5次。
精密度试验

结果表明，对照品溶液精密度良好。
8稳定性试验8.1对照品溶液稳定性试验 精密吸取芦丁对照品溶液(浓度0.1064mg/ml)3.0ml，置10ml量瓶中，按正文测定法项下的方法，自“加30％乙醇溶液使成5.0ml”起，依法操作，在510nm的波长处测定吸收度，分别在0、5、10、15、30分钟重复测定一次。
对照品溶液稳定性试验

结果表明，对照品溶液稳定性良好。
8.2供试品溶液稳定性试验 精密吸取供试品溶液1.0ml，置10ml量瓶中，按正文测定法项下的方法，自“加30％乙醇溶液使成5.0ml”起，依法操作，在510nm的波长处测定吸收度，分别在0、5、10、15、30min测定吸收度。
供试品溶液稳定性试验

结果表明，供试品溶液在30min内稳定性良好。
9重复性试验 取本品，按正文供试品溶液的制备和测定法项下进行操作。
重复性试验

结果表明，重复性良好。
10加样回收率试验 采用加样回收法，取装量差异项下本品，取内容物，混匀，取0.13g(共6份)，精密称定，分置25ml量瓶中，精密称取经120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品26.34mg，置25ml量瓶中，加60％乙醇适量超声处理使溶解，取出，放至室温，用60％乙醇定至刻度，摇匀，精密量取1.5ml(共6份)，分置上述25ml量瓶中，加60％乙醇溶液适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，用60％乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液3.0ml，分置10ml量瓶中，照正文测定法项下的方法，自“加30％乙醇溶液使成5.0ml”起，依法操作，在510nm的波长处测定吸收度，计算，即得。
中药复方制剂中总黄酮的含量为12.18mg/g。
加样回收率试验

平均回收率＝97.95％，RSD＝0.93％。
11样品的含量测定 取本品三批样品，按照正文供试品溶液的制备和测定法项下的操作，测定样品含量。
总黄酮的含量测定

实验例9 中药复方制剂中总皂苷含量测定1仪器、试药1.1仪器普析通 TU-1810SPC 紫外/可见分光光度仪SARTORIUS BP211D 电子分析天平1.2试药香草醛 分析纯 天津市光复精细化工研究所甲醇色谱纯 J.T.Baker冰醋酸 分析纯 上海试剂一厂高氯酸 分析纯 天津市鑫源化工厂纯净水 娃哈哈2方法与结果2.1检测波长的选择 精密称取人参皂苷Rg15.14mg，置100ml量瓶中，加适量甲醇超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取1.2ml，置10ml具塞试管中，水浴蒸干溶剂，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，立即在冰水浴中冷却2分钟，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，在700～400nm波长范围内进行扫描，结果表明，黄芪甲苷在547nm处有最大吸收，空白无干扰，因此选择547nm为分光光度法测定中药复方制剂中总皂苷的检测波长。
2.2对照品溶液的制备 人参皂苷Rg15mg，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得。
2.3供试品溶液的制备 取装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中取约50mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHZ)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置10ml具塞试管中，水浴蒸干溶剂，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，立即在冰水浴中冷却2分钟，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，以随行溶剂为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VA)，在547nm的波长处测定吸收度。以外标一点法计算，即得。
3线性关系的考察 精密称取人参皂苷Rg1对照品5.03mg，置100ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHZ)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml，分置10ml具塞试管中，水浴蒸干溶剂，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，立即在冰水浴中冷却2分钟，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，以随行溶剂为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VA)，在547nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，黄芪甲苷的量(μg)为横坐标，绘制标准曲线。
回归方程Y＝0.0062X+0.0047；r＝0.9999人参皂苷Rg1在20.12～100.6μg范围线性良好。
人参皂苷Rg1标准曲线测定数据

3精密度试验 精密量取对照品溶液(0.0503mg/ml)1.2ml，置10ml具塞试管中，水浴蒸干溶剂，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，立即在冰水浴中冷却2分钟，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，以随行溶剂为空白，按正文测定法项下操作，连续测定5次。
精密度实验

5稳定性试验5.1对照品溶液的稳定性试验精密量取对照品溶液(0.0503mg/ml)1.2ml，置10ml具塞试管中，水浴蒸干溶剂，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，立即在冰水浴中冷却2分钟，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，以随行溶剂为空白，按正文测定法项下操作，分别在0、10、20、40、60分钟时测定。
对照品溶液稳定性实验

5.2供试品溶液的稳定性实验 取本品装量差异项下本品，取内容物，研细，从中取约50mg，按正文测定法项下进行操作，分别在0、10、20、40、60分钟时测定。
供试品溶液稳定性实验

6重复性试验 取本品装量差异项下本品，取内容物，研细，从中取约50mg(共5份)，按正文测定法项下进行操作。
重复性实验

7回收率试验 采用加样回收法，取装量差异项下本品，取内容物，研细，从中取约25mg(共5份)，精密称定，分置25ml量瓶中；精密量取人参皂苷Rg1对照品溶液(0.642mg/ml)1ml(共5份)，精密称定，分置上述25ml量瓶中，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml具塞试管中，按正文测定法项下进行操作，以随行溶剂为空白，依法测定吸收度，按外标一点法计算，即得。
中药复方制剂中总皂苷的含量24.41mg/g
加样回收率实验

平均回收率＝97.18％ RSD＝1.10％8三批中试样品含量测定取本品样品三批，按正文所述方法处理。
三批样品含量测定结果

实验例10 中药复方制剂中三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1含量测定1仪器与试药1.1仪器Alltech UVIS-201高效液相色谱仪，Alltech HPLC system工作站(美国)KQ250B超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)ZK-30ABX电热真空干燥箱(北京中兴伟业仪器公司)Mettler AE240电子天平(上海梅特勒公司)1.2试药三七皂苷R1中国药品生物制品检定所人参皂苷Rg1中国药品生物制品检定所人参皂苷Rb1中国药品生物制品检定所所用甲醇、乙腈均为色谱纯，均购于德国Merck公司水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。
2色谱条件色谱柱Diamonsil(TM)C18，5μm；250×4.6mm；流动相乙腈-水为流动相，梯度洗脱；
梯度洗脱系统

流速1ml/min，两次进样间隔平衡时间3min；检测波长203nm；柱温30℃；进样量10μl理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于3000。
检测波长的选择 三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，均在203nm波长处有最大吸收，因此选用203nm作为本品的检测波长。
3对照品溶液的制备 取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每ml含三七皂苷R10.62mg、人参皂苷Rg11.42mg和人参皂苷Rb12.14mg的溶液，作为贮备液；再分别吸取上述溶液各1ml，置同一5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得每ml含三七皂苷R10.124mg、人参皂苷Rg10.284mg和人参皂苷Rb10.428mg的对照品溶液。
4供试品溶液的制备 取装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中精密称取2.5g，置50ml量瓶中，加甲醇40ml，超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。
5阴性供试品溶液的制备 照本品处方称取除三七外的其它成分，按本品制备工艺制成阴性供试品。精密称取2.40572g，照供试品溶液的制备项下方法制备，作为阴性供试品溶液。
6系统适用性试验 根据上述色谱条件得到三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、混合对照品、样品、阴性色谱图，理论板数n大于3000，样品中各对照品峰与相近峰分离清晰完全，分离度大于1.5，阴性无干扰。
7线性关系的考察 取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每ml含三七皂苷R10.62mg、人参皂苷Rg11.42mg和人参皂苷Rb12.14mg的溶液，作为贮备液；精密量取前述对照品贮备液各0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml，分置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别从中精密吸取10μl，依次注入液相色谱仪，以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标做图，绘制标准曲线。
回归方程为三七皂苷R1Y＝208361.76X-1972.29 r＝0.9995；人参皂苷Rg1Y＝293933.01X-13982.75 r＝0.9994；人参皂苷Rb1Y＝192503.18X-9202.56 r＝0.9993。
结果表明三七皂苷R1在0.248-2.480μg范围内线性关系良好；人参皂苷Rg1在0.568-5.680μg范围内线性关系良好；人参皂苷Rb1在0.856-8.560μg范围内线性关系良好。
线性关系试验测定结果

8精密度试验 取对照品混合溶液(三七皂苷R10.124mg/ml、人参皂苷Rg10.284mg/ml和人参皂苷Rb10.428mg/ml)，连续测定5次，考察对照品溶液精密度。
精密度试验

9稳定性试验9.1对照品溶液稳定性试验 取对照品混合溶液(三七皂苷R10.124mg/ml、人参皂苷Rg10.284mg/ml和人参皂苷Rb10.428mg/ml)，分别在0、2、6、10、24小时进样测定，考察对照品溶液稳定性。
对照品溶液的稳定性试验

9.2供试品溶液的稳定性试验 取装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中精密称取2.48425g，，按正文供试品溶液制备下进行操作，分别在0、2、6、10、24小时进样测定。
稳定性试验

结果表明供试品溶液在24小时内基本稳定。
10重复性试验 取装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中取约2.5g(共5份)，按正文测定法供试品溶液制备和测定项下进行操作。
重复性试验

结果表明，本法重复性较好。
11、加样回收率试验 采用加样回收法，取装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中取约1.25g(共5份)，分别置50ml量瓶中，另精密量取混合对照品溶液4ml(其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1的浓度为0.385mg/ml、1.694mg/ml、2.403mg/ml)，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
经测定已知中药复方制剂中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1的含量分别是1.242、6.711、8.434mg/g。
三七皂苷R1加样回收率试验

平均回收率＝97.65％；RSD＝0.53％。
人参苷Rg1加样回收率试验

平均回收率＝97.95％；RSD＝0.87％。
人参苷Rb1加样回收率试验

平均回收率＝97.92％；RSD＝1.01％。
12三批中试样品含量测定取本品样品三批，按正文所述方法处理。
三批样品含量测定结果

实验例1采用液相色谱法测定以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备精密称取本发明组方粉针制剂适量，加水制成每1ml含1mg的溶液，摇匀，即得；(2)参照物溶液的制备精密称取野黄芩苷适量，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为80％乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，梯度洗脱，溶剂比例从0分钟至80分钟，流动相A的比例由15％升至70％，流动相B的比例由85％升至30％；流速为1.0ml/min，检测波长为230±2nm，柱温为40℃；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以灯盏细辛成分特征为主的标准指纹图谱的测试手段；分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～20个；(5)以(1)～(3)所述方法作为本发明组方粉针制剂中以灯盏细辛特征为主的指纹图谱的测试手段，制备本发明组方粉针制剂的指纹图谱；(6)将本发明组方粉针制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算本发明组方粉针制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；II.本发明组方粉针制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱相比，相对偏差不得超过±10％。
实验例2采用液相色谱法测试以三七成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备精密称取本发明组方粉针制剂适量，加水制成每1ml含50mg的溶液，摇匀，即得；(2)参照物溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1适量，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈∶水，梯度洗脱，，溶剂比例为从0分钟至12分钟，乙腈的比例为15％，从14分钟至45分钟，乙腈的比例为从15％升至30％，从45分钟至60分钟，乙腈的比例为从30％升至80％，流速为1ml/min、检测波长203±2nm，柱温30℃；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以三七成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～20个；(5)以(1)～(3)所述方法作为本发明组方粉针制剂中以三七成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将本发明组方粉针制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算本发明组方粉针制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；II.本发明组方粉针制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱相比，相对偏差不得超过±10％。
实验例3本发明组方粉针制剂中灯盏细辛药材、野黄芩苷中一种或几种的薄层色谱鉴别方法取本发明组方粉针制剂2g，加甲醇10ml提取，离心，取上清液作为供试品溶液；另取灯盏细辛对照药材、野黄芩苷中的一种或几种制备对照溶液；灯盏细辛对照药材溶液的制备取灯盏细辛对照药材，加醋酸乙酯提取，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取野黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各3μl，分别以条状带点于同一聚酰胺膜上，以甲醇-醋酸乙酯-甲酸7∶2∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的条斑。
实验例4本发明组方粉针制剂野黄芩苷的液相色谱鉴别方法取本发明组方粉针制剂0.25g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)5min，取出，放至室温，加甲醇定至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-0.1％磷酸水溶液50％∶50％为流动相，检测波长为335nm；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实验例5本发明组方粉针制剂中三七、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的薄层色谱鉴别方法取本发明组方粉针制剂3g，用正丁醇10ml提取，滤过，滤液作为供试品溶液；另取红参或人参对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种，制备对照药材溶液；三七对照药材溶液的制备取三七对照药材适量，加三氯甲烷回流提取，弃去三氯甲烷液，残渣加水饱和正丁醇提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇2ml溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品，分别加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-水15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试剂，105℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。
实验例6本发明组方粉针制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的液相色谱鉴别取本发明组方粉针制剂2.5g，置50ml量瓶中，加甲醇40ml，超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰，阴性无干扰。
实验例7本发明组方粉针制剂野黄芩苷的含量测定取本发明组方粉针制剂0.25g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)5min，取出，放至室温，加甲醇定至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-0.1％磷酸水溶液50％∶50％为流动相，检测波长为335nm；以外标一点进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含野黄芩苷的限度不得少于4mg。
实验例8本发明组方粉针制剂中总黄酮的含量测定本发明组方粉针制剂0.25g，置25ml量瓶中，加60％乙醇溶液适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加60％乙醇溶液至刻度，摇匀作为供试品溶液；以野黄芩苷作为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，照分光光度法，在335nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总黄酮的限度以野黄芩苷计，不得少于10mg。
实验例9本发明组方粉针制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的含量测定取本发明组方粉针制剂2.5g，置50ml量瓶中，加甲醇40ml，超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温为30℃；以外标法或标准曲线法进行计算，待测中药复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项(1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于5mg；(2)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于7mg；(3)每单位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.5mg；(4)每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的总和的限度不得少于12mg。
实验例10本发明组方粉针制剂中总皂苷的含量测定取本发明组方粉针制剂50mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHZ)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取2.5ml，置25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液1.25ml，高氯酸5ml，摇匀，60℃水浴上加热15分钟，取出，立即以冰水浴或流水冷却，精密加冰醋酸至刻度，摇匀，作为供试品溶液，以人参皂苷Rg1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在547nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测中药复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以人参皂苷Rg1计，不得少于20mg。
实验例11采用液相色谱法测定以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备取本发明组方小水针制剂作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备精密称取野黄芩苷适量，加乙制成每1ml含0.15mg的溶液，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为80％甲醇，流动相B为1％冰醋酸溶液，梯度洗脱，溶剂比例从0分钟至80分钟，流动相A的比例由15％升至70％，流动相B的比例由85％升至30％；流速为1.0ml/min，检测波长为230±2nm，柱温为40℃；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以灯盏细辛成分特征为主的标准指纹图谱的测试手段；分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～20个；(5)以(1)～(3)所述方法作为本发明组方小水针制剂中以灯盏细辛特征为主的指纹图谱的测试手段，制备本发明组方小水针制剂的指纹图谱；(6)将本发明组方小水针制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算本发明组方小水针制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；II.本发明组方小水针制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱相比，相对偏差不得超过±10％。
实验例12采用液相色谱法测试以三七成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备取本发明组方小水针制剂作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1适量，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈∶1％冰醋酸溶液，梯度洗脱，，溶剂比例为从0分钟至12分钟，乙腈的比例为15％，从14分钟至45分钟，乙腈的比例为从15％升至30％，从45分钟至60分钟，乙腈的比例为从30％升至80％，流速为1ml/min、检测波长203±2nm，柱温30℃；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以三七成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～20个；(5)以(1)～(3)所述方法作为本发明组方小水针制剂中以三七成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将本发明组方小水针制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部
I.计算本发明组方小水针制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；II.本发明组方小水针制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱相比，相对偏差不得超过±10％。
实验例13本发明组方小水针制剂中灯盏细辛药材、野黄芩苷中一种或几种的薄层色谱鉴别方法取本发明组方小水针制剂10ml，水浴蒸干，残渣加乙醇10ml提取，离心，取上清液作为供试品溶液；另取灯盏细辛对照药材、野黄芩苷中的一种或几种制备对照溶液；灯盏细辛对照药材溶液的制备取灯盏细辛对照药材，加三氯甲烷提取，滤过，滤液挥干，残渣用乙醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取野黄芩苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各3μl，分别以条状带点于同一聚酰胺膜上，以乙醇-甲酸乙酯-醋酸8∶2∶2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的条斑。
实验例14本发明组方小水针制剂野黄芩苷的液相色谱鉴别方法取本发明组方小水针制剂10ml，置25ml量瓶中，加乙醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)5min，取出，放至室温，加乙醇定至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸水溶液45％∶55％为流动相，检测波长为335nm；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实验例15本发明组方小水针制剂中三七、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的薄层色谱鉴别方法取本发明组方小水针制剂30ml，用正丁醇10ml提取，滤过，滤液作为供试品溶液；另取红参或人参对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种，制备对照药材溶液；三七对照药材溶液的制备取三七对照药材适量，加二氯甲烷回流提取，弃去二氯甲烷液，残渣加醋酸乙酯提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇2ml溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品，分别加乙制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-加酸乙酯-甲醇-水22∶45∶10∶15在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试剂，105℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。
实验例16本发明组方小水针制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的液相色谱鉴别取本发明组方小水针制剂25ml，置50ml量瓶中，加乙醇至刻度，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰，阴性无干扰。
实验例17本发明组方小水针制剂野黄芩苷的含量测定取本发明组方小水针制剂作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-1％冰醋酸水溶液55％∶45％为流动相，检测波长为335nm；以外标一点进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含野黄芩苷的限度不得少于4mg。
实验例18本发明组方小水针制剂中总黄酮的含量测定本取本发明组方小水针制剂作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇溶液作为对照品溶液。以随行溶剂为空白，照分光光度法，在335nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总黄酮的限度以野黄芩苷计，不得少于10mg。
实验例19本发明组方小水针制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的含量测定取本发明组方小水针制剂25ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温为30℃；以外标法或标准曲线法进行计算，待测中药复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项(1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于5mg；(2)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于7mg；(3)每单位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.5mg；(4)每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的总和的限度不得少于12mg。
实验例20本发明组方小水针制剂中总皂苷的含量测定取本发明组方小水针制剂50ml，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解并定量转移置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取2.5ml，置25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液1.25ml，高氯酸5ml，摇匀，60℃水浴上加热15分钟，取出，立即以冰水浴或流水冷却，精密加冰醋酸至刻度，摇匀，作为供试品溶液，以人参皂苷Rg1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在547nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测中药复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以人参皂苷Rg1计，不得少于20mg。
实验例21本发明组方胶囊制剂中灯盏细辛药材、野黄芩苷中一种或几种的薄层色谱鉴别方法取本发明组方胶囊制剂2g，加甲醇10ml提取，离心，取上清液作为供试品溶液；另取灯盏细辛对照药材、野黄芩苷中的一种或几种制备对照溶液；灯盏细辛对照药材溶液的制备取灯盏细辛对照药材，加甲酸乙酯提取，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取野黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各3μl，分别以条状带点于同一聚酰胺膜上，以甲醇-醋酸乙酯-甲酸6∶4∶2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的条斑。
实验例22本发明组方胶囊制剂野黄芩苷的液相色谱鉴别方法取本发明组方胶囊制剂0.25g，精密称定，置25ml量瓶中，加乙醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)5min，取出，放至室温，加甲醇定至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％甲酸水溶液48％∶52％为流动相，检测波长为335nm；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实验例23本发明组方胶囊制剂中三七、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的薄层色谱鉴别方法取本发明组方胶囊制剂3g，用醋酸乙酯10ml提取，滤过，滤液作为供试品溶液；另取红参或人参对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种，制备对照药材溶液；三七对照药材溶液的制备取三七对照药材适量，加三氯甲烷回流提取，弃去三氯甲烷液，残渣加水饱和正丁醇提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇2ml溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品，分别加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-醋酸乙酯-乙醇-水14∶30∶10∶15在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试剂，105℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。
实验例24本发明组方胶囊制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的液相色谱鉴别取本发明组方胶囊制剂2.5g，置50ml量瓶中，加甲醇40ml，超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.2％磷酸为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为30％，从15分钟至30分钟，乙腈的比例由30％上升至40％，从30分钟至50分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰，阴性无干扰。
实验例25本发明组方胶囊制剂野黄芩苷的含量测定取本发明组方胶囊制剂0.25g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)5min，取出，放至室温，加甲醇定至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.4％磷酸水溶液46％∶54％为流动相，检测波长为335nm；以外标一点进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含野黄芩苷的限度不得少于4mg。
实验例26本发明组方胶囊制剂中总黄酮的含量测定本发明组方胶囊制剂0.25g，置25ml量瓶中，加80％乙醇溶液适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加80％乙醇溶液至刻度，摇匀作为供试品溶液；以野黄芩苷作为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，照分光光度法，在335nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总黄酮的限度以野黄芩苷计，不得少于10mg。
实验例27本发明组方胶囊制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的含量测定取本发明组方胶囊制剂2.5g，置50ml量瓶中，加乙醇40ml，超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，甲醇的比例为25％，从15分钟至30分钟，甲醇的比例由25％上升至38％，从30分钟至35分钟，甲醇的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温为30℃；以外标法或标准曲线法进行计算，待测中药复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项(1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于5mg；(2)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于7mg；(3)每单位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.5mg；(4)每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的总和的限度不得少于12mg。
权利要求
1.一种以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于该方法包括以下全部或部分内容(1)指纹图谱测试，包括以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱和以三七成分特征为主的指纹图谱中的一种或两种；(2)灯盏细辛对照药材、三七对照药材、野黄芩苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1中全部或部分成分的鉴别测试方法；(3)野黄芩苷、总黄酮、总皂苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1中全部或部分成分的含量测试方法。
2.按照权利要求1所述的以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于该方法采用液相色谱法测试以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱和以三七成分特征为主的指纹图谱中的一种或两种a、采用液相色谱法测试以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备取待测中药复方制剂适量，加水或甲醇或乙醇溶解或稀释，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备取野黄芩苷，用甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为0.5％～100％乙腈溶液或甲醇0.005mol/L～5mol/L磷酸二氢钠溶液或0.005mol/L～5mol/L磷酸二氢钾溶液或0.1％～5％冰醋酸或0.1％～5％甲酸或0.005％～5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min、检测波长为190-400nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～30个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测中药复方制剂中以灯盏细辛、白芍或赤芍成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测中药复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算待测中药复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00；II.待测中药复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％；III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱相比，相对偏差不得超过±20％。b、采用液相色谱法测试以三七成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备取待测中药复方制剂适量，加甲醇或乙醇或水稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备取适量三七药材中的主要活性成分对照品，包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种，用水或甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈或甲醇∶水或0.1％～5％冰醋酸或0.1％～5％甲酸或0.005％～5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min、检测波长为190-400nm范围内的一个或几个或蒸发光散射检测器检测，柱温在20～60℃范围内；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以三七成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～30个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测中药复方制剂中以三七成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测中药复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算待测中药复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00；II.待测中药复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％；III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱相比，相对偏差不得超过±20％。
3.按照权利要求2所述的以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于该方法采用液相色谱法测试以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱和以三七成分特征为主的指纹图谱中的一种或两种a、采用液相色谱法测定以灯盏细辛成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备精密称取待测中药复方制剂适量，加水制成每1ml含1mg的溶液，摇匀，即得；(2)参照物溶液的制备精密称取野黄芩苷适量，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为80％乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，梯度洗脱，溶剂比例从0分钟至80分钟，流动相A的比例由15％升至70％，流动相B的比例由85％升至30％；流速为1.0ml/min，检测波长为230±2nm，柱温为40℃；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以灯盏细辛成分特征为主的标准指纹图谱的测试手段；分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～20个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测中药复方制剂中以灯盏细辛特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测中药复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算待测中药复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；II.待测中药复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱相比，相对偏差不得超过±10％。b、采用液相色谱法测试以三七成分特征为主的指纹图谱(1)供试品溶液的制备取待测中药复方制剂适量，加水稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；(2)参照物溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1适量，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作为参照物溶液；(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈∶水，梯度洗脱，，溶剂比例为从0分钟至12分钟，乙腈的比例为15％，从14分钟至45分钟，乙腈的比例为从15％升至30％，从45分钟至60分钟，乙腈的比例为从30％升至80％，流速为1ml/min、检测波长203±2nm，柱温30℃；(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以三成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～20个；(5)以(1)～(3)所述方法作为待测中药复方制剂中以三七成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；(6)将待测中药复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部I.计算待测中药复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；II.待测中药复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱相比，相对偏差不得超过±10％。
4.按照权利要求1所述的以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂的鉴别方法包括以下中的一种或几种a、中药复方制剂中灯盏细辛药材、野黄芩苷中一种或几种的薄层色谱鉴别方法取待测中药复方制剂适量，加醋酸乙酯或乙醇或甲醇或正丁醇提取，滤过或离心，取滤液或上清液作为供试品溶液；另取灯盏细辛对照药材、野黄芩苷对照品中的一种或两种制备对照溶液；灯盏细辛对照药材溶液的制备取灯盏细辛对照药材，加醋酸乙酯或乙醇或甲醇或正丁醇提取，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇或乙醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取野黄芩苷对照品，加甲醇或乙醇制成每1ml含1mg的溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液和灯盏细辛对照药材溶液、野黄芩苷对照品溶液的一种或两种各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板或聚酰胺薄膜上，以醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲酸或乙酸-水或甲醇0.2～60∶0.2～10∶0.3～20或苯或甲苯-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲酸或乙酸-水1～30∶0.5～15∶0.05～5∶0.01～3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.3％～10％三氯化铝乙醇或0.3～10％三氯化铝甲醇溶液或0.3～10％三氯化铁乙醇溶液，置日光下或紫外光灯365nm或254nm下检视或105℃烘1～15分钟后置日光下或紫外光灯365nm或254nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色斑点；b、中药复方制剂中野黄芩苷的液相色谱鉴别方法取待测中药复方制剂适量，加甲醇或乙醇或流动相或水溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液5％～95％∶95％～5％或甲醇或乙腈-四氢呋喃-0.01％～5％磷酸水溶液或乙腈-0.005moL/L～0.3moL/L磷酸二氢钠(1～99％磷酸调pH＝2.0～5.0)梯度洗脱系统为流动相，检测波长为200～410nm；供试品色谱中，应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰；c、中药复方制剂中三七、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的薄层色谱鉴别方法取待测中药复方制剂适量，用正丁醇或乙醇或甲醇或醋酸乙酯或三氯甲烷提取，滤过，滤液作为供试品溶液；另取三七对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种，制备对照溶液；三七对照药材溶液的制备取三七对照药材适量，加三氯甲烷或二氯甲烷或乙醚回流提取，弃去三氯甲烷或二氯甲烷或乙醚液，残渣加水饱和正丁醇或醋酸乙酯提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇或乙醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品，分别加甲醇或乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲醇-水5～40∶10～100∶5～50∶0.2～3010℃以下放置的下层溶液或正丁醇-醋酸乙酯或甲酸乙酯-水1～10∶0.2～2∶1～15的上层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5～50％硫酸乙醇试剂或50％硫酸试剂，80℃～160℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点，阴性无干扰；d、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的液相色谱鉴别取待测中药复方制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或流动相或乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇或乙腈-水或0.5％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.5％～5％甲酸溶液5％～40％∶95％～60％为流动相，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个或蒸发光检测器检测，柱温在20～60℃范围内；供试品色谱中，应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰，阴性无干扰。
5.按照权利要求4所述的以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂的鉴别方法包括以下中的一种或几种a、中药复方制剂中灯盏细辛药材、野黄芩苷中一种或几种的薄层色谱鉴别方法取待测中药复方制剂适量，加甲醇提取，离心，取上清液作为供试品溶液；另取灯盏细辛对照药材、野黄芩苷中的一种或几种制备对照溶液；灯盏细辛对照药材溶液的制备取灯盏细辛对照药材，加醋酸乙酯提取，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取野黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各3μl，分别以条状带点于同一聚酰胺膜上，以甲醇-醋酸乙酯-甲酸7∶2∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的条斑；b、中药复方制剂中野黄芩苷的液相色谱鉴别方法取待测中药复方制剂适量，加甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-0.1％磷酸水溶液50％∶50％为流动相，检测波长为335nm；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰；c、中药复方制剂中三七、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的薄层色谱鉴别方法取待测中药复方制剂适量，用正丁醇提取，滤过，滤液作为供试品溶液；另取红参或人参对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种，制备对照药材溶液；三七对照药材溶液的制备取三七对照药材适量，加三氯甲烷回流提取，弃去三氯甲烷液，残渣加水饱和正丁醇提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品，分别加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-水15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试剂，105℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰；d、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的液相色谱鉴别取待测中药复方制剂适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰，阴性无干扰。
6.按照权利要求1所述的以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂含量的测试方法应包括以下中的一种或几种a、中药复方制剂中野黄芩苷的含量测定取待测中药复方制剂适量，加甲醇或乙醇或流动相或水溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液5％～95％∶95％～5％或甲醇或乙腈-四氢呋喃-0.01％～5％磷酸水溶液或乙腈-0.005moL/L～0.3moL/L磷酸二氢钠(1～99％磷酸调pH＝2.0～5.0)梯度洗脱系统为流动相，检测波长为200～410nm；以外标一点法或标准曲线法进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含野黄芩苷的限度不得少于2mg；b、中药复方制剂中总黄酮的含量测定取待测中药复方制剂适量，用甲醇或水溶解并稀释至合适浓度，摇匀，作为供试品溶液；以野黄芩苷作为对照品，同法制得对照品溶液；以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在335±10nm的波长处测定吸收度，以外标一点法或标准曲线法进行计算；或取待测中药复方制剂适量，加水溶解并稀释至合适浓度，摇匀，精密量取适量，置量瓶中，加50％甲醇或水1～25ml，加5％亚硝酸钠溶液0.3～1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.3～1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液4～10ml，再加50％甲醇或水至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以芦丁或野黄芩苷作为对照品，同法制得对照品溶液；以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在500±10nm处测定吸收度，以外标一点法或标准曲线法进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总黄酮的限度以芦丁或野黄芩苷计，不得少于5mg；c、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的含量测定取待测中药复方制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或流动相或乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇或乙腈-水或0.5％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.5％～5％甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个或蒸发光检测器检测，柱温在20～60℃范围内；以外标法或标准曲线法进行计算，待测中药复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项(1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于2.5mg；(2)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于3.5mg；(3)每单位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.25mg；每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的总和的限度不得少于6mg；d、中药复方制剂中总皂苷的含量测定取待测中药复方制剂适量，置量瓶中，加蒸馏水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取适量，置量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加1％～50％香草醛-冰醋酸溶液0.1～10ml，高氯酸0.1～15ml，摇匀，30～80℃水浴上加热3～50分钟，取出，立即以冰水浴或流水冷却，精密加冰醋酸至刻度，摇匀，作为供试品溶液，以人参皂苷Rg1或人参皂苷Rb1或三七皂苷R1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在547±10nm的波长处测定吸收度，以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测中药复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以人参皂苷Rg1或人参皂苷Rb1或三七皂苷R1计，不得少于10mg。
7.按照权利要求6所述的以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂含量的测试方法是以下一种或几种方法a、中药复方制剂中野黄芩苷的含量测定取待测中药复方制剂适量，加甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以野黄芩苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-0.1％磷酸水溶液50％∶50％为流动相，检测波长为335nm；以外标一点进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含野黄芩苷的限度不得少于4mg；b、中药复方制剂中总黄酮的含量测定取待测中药复方制剂适量，置量瓶中，加甲醇适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取1ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以野黄芩苷作为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，照分光光度法，在335nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总黄酮的限度以野黄芩苷计，不得少于10mg；c、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的含量测定取待测中药复方制剂适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温为30℃；以外标法或标准曲线法进行计算，待测中药复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项(1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于5mg；(2)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于7mg；(3)每单位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.5mg；(4)每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的总和的限度不得少于12mg；d、中药复方制剂中总皂苷的含量测定取待测药物适量，置10ml量瓶中，加蒸馏水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取0.6，置25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液0.5ml，高氯酸2.0ml，摇匀，60℃水浴上加热15分钟，取出，立即以冰水浴或流水冷却，精密加冰醋酸至刻度，摇匀，作为供试品溶液，以人参皂苷Rg1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在547nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测中药复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以人参皂苷Rg1计，不得少于20mg。
8.按照权利要求6或7所述的以灯盏细辛、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂的含量测定结果，按照重量百分比计算，野黄芩苷、总黄酮、总皂苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1中的全部或部分物质的总含量占制剂中扣除辅料和水分外的总固体量的25％以上。
全文摘要
本发明涉及一种由灯盏细辛和三七或其提取物、有效部位制成的中药复方制剂的质量控制方法，该质量控制方法包括灯盏细辛和三七的指纹图谱测试方法和/或鉴别测试方法和/或含量测定方法，本发明为该组方制剂的质量控制提供了一种可靠、稳定、全新的方法，使该制剂的工艺控制更加严格合理，质量更加稳定，同时为大生产提供了可靠稳定的检测方法，为确保患者用药的有效性、安全性提供了数字化的说明。
文档编号A61P7/02GK1939368SQ20051010781
公开日2007年4月4日 申请日期2005年9月30日 优先权日2005年9月30日
发明者于文风 申请人:北京奇源益德药物研究所