专利名称：栀子提取物在治疗慢性乙型肝炎中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及栀子提取物的新用途，尤其涉及栀子提取物在治疗慢性乙型肝炎和保护肝损伤中的用途，属于中药领域。
背景技术：
病毒性肝炎是一种世界性的常见病，我国属流行的“重灾区”，各种类型病毒性肝炎严重威胁着国人的健康。西方国家以丙型肝炎为最多，而在我国主要流行的却是乙型肝炎。据统计，目前全世界有3.5亿慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者，我国感染者约1.2亿，由乙型肝炎引起的肝功能不正常患者约有3000万人，国内慢性丙型肝炎的感染率也有约3.2％。此外，慢性病毒性肝炎还与原发性肝癌的发生有密切关系，绝大部分肝癌病人有慢性肝炎病史，因此慢性肝炎的治疗已成为一个迫切需要解决的重大问题。
目前慢性乙肝的治疗，西医主要采用抗病毒、免疫调节、改善肝功能和抗肝纤维化等综合疗法。其中，抗病毒是最主要的措施。主要用于抗病毒的药物有干扰素和几种核苷类似物。干扰素对乙型和丙型肝炎的治疗有效率约为30％～50％，停药后约6个月至1年内大部分病人会复发。干扰素治疗药费相当昂贵，一个病人用进口干扰素需人民币数万元，用国产干扰素亦在1万元以上。干扰素需要肌肉注射，部分病人用药后有流感样症状的副反应。某些核苷类似物如拉米夫定(lamivudin)、法昔洛韦(famciclovir)对肝炎病毒有一定的治疗效果，但亦存在停药后很快反跳即复发现象，药品价格亦较昂贵。可以说至今世界上尚没有一种特效的药物能肯定有效地清除乙肝病毒。在改善肝功能药物又称保肝药或抗肝细胞损伤药物方面，市场上销售的有联苯双酯、肝细胞生长因子、五味子制剂及其他中草药复方制剂等，甘草甜素已由日本研制成功，水飞蓟素为德国产品，在世界市场上销售。这类药物对降低血清转氨酶、退黄疸有一定效果。这类药物费用较低，副反应少，但停止使用后，大多数病人病情亦会复发，且对肝炎病毒阳性指标转阴似乎没有什么疗效。免疫调节药有转移因子、白细胞介素-2、胸腺肽、皮质激素等，这类药物治疗慢性肝炎的病例不多，疗效尚待肯定，药费较昂贵，且有副反应。由此可见，目前尚无满意的治疗慢性病毒性肝炎的药物。
栀子是茜草科植物山栀Gardeniajasm inoides Ellis.的果实，性苦寒，无毒，入心、肝、肺、胃经，能清热泻火、凉血解毒，是一味多年来应用于中医临床的常用药，现代医药学研究结果证明，栀子具有多方面的药理作用，如保肝利胆、解热镇痛、镇静、抗菌消炎、降低血压、防治动脉粥样硬化及血栓等多方面作用，其中以保肝利胆作用最为显著。
研究表明，栀子提取物中含有众多的化学成分，如黄酮类(栀子素类)、环烯醚萜甙类(包括栀子苷、羟异栀子苷、栀子苷酸、京尼平、山栀子苷、车叶草苷等)、三萜类(栀子花酸类)、有机酸酯类(绿原酸、藏红花酸类等)，另外还含有D-甘露醇、甾醇类、三萜皂甙类、长链烷烃、醇、色素，挥发油、多糖等成分。迄今为止，尚未分离得到治疗慢性乙型肝炎的栀子有效部位提取物。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种治疗慢性乙型肝炎并对肝损伤具有保护作用的栀子有效部位提取物，以重量份计，该栀子提取物中含总环烯醚萜苷40％以上，含栀子苷25％以上。
优选的，以重量份计，该栀子提取物含总环烯醚萜苷70％以上，含栀子苷50％以上。
栀子提取物中化学成分复杂，主要含有黄酮类、环烯醚萜甙类、三萜类、有机酸酯类等成分，其中环烯醚萜苷类主要包括栀子苷(geniposide)、羟异栀子苷(gardenoside)、京尼平酸(geniposidic acid)、京尼平(genipin)等成分。为了从如此众多的成分中分离得到有效的抑制乙型肝炎病毒DNA复制和对肝损伤具有保护作用的有效部位，本发明人进行了大量的试验，最终发现栀子提取物中的总环烯醚萜苷，尤其是栀子苷是抑制乙型肝炎病毒DNA复制和对肝损伤具有保护作用的有效成分，进一步发现，当栀子提取物中含总环烯醚萜苷40％以上，含栀子苷25％以上，尤其是含总环烯醚萜苷70％以上，含栀子苷50％以上的栀子提取物具有显著的抑制乙型肝炎病毒DNA复制和保护肝损伤的作用。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备上述栀子提取物的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术途径来实现的一种制备栀子提取物的方法，包括以下步骤1).将栀子粉碎，用30-70％乙醇40-60℃浸泡，得浸提液；2).浸提液离心除渣，取上清液减压浓缩回收乙醇后，加95％乙醇至含醇量达60-80％，沉淀，静置，过滤除沉后回收乙醇至无醇味；3).用水稀释，过弱极性大孔吸附树脂柱，待全部通过树脂柱后，再用上样体积0.5-2倍量水冲柱，至流出液无色，继续用20-50％乙醇冲柱，收集洗脱液，减压浓缩回收乙醇即得栀子提取物。
上述制备方法中，步骤1)中将栀子粉碎后优选用50％乙醇50℃浸泡两次，每次3小时以上；步骤2)中上清液减压浓缩回收乙醇后，加95％乙醇优选至含醇量达70％；步骤3)中所述的弱极性大孔吸附树脂柱优选为AB-8大孔吸附树脂、X-5大孔吸附树脂或D101大孔吸附树脂；用水冲柱时，优选用上样体积1倍量水冲柱；至流出液无色，继续用30％乙醇冲柱。为了得到总环烯醚萜苷或栀子苷含量更高的栀子提取物，步骤3)中优选将所制备的栀子提取物进行精制，即将所得到的栀子提取物进一步通过硅胶柱层析，用体积比为6-9∶1-4的氯仿与甲醇为洗脱液，进行洗脱，收集洗脱液即得总环烯醚萜苷或栀子苷含量更高的栀子提取物。
本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种药物组合物，该药物组合物由治疗上有效剂量的上述栀子提取物和药学上可接受的载体或辅料组成。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有10％-99％重量，优选10-60％重量的栀子提取物。
本发明药物组合物可按照本领域的常规方法制备成临床上适宜的口服制剂或非肠道给药的剂型，例如可以是颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、口服液；或注射剂、栓剂、气雾剂等。
本发明栀子提取物经药效学试验证实，能够有效抑制乙型肝炎病毒进行DNA复制以及对肝损伤有明显的保护作用。
以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
具体实施例方式
实施例1将栀子粉碎，用30％乙醇40℃温度下浸泡，得浸提液，浸提液离心除渣，上清液减压浓缩回收乙醇后，加95％乙醇至含醇量达60％，沉淀，静置过夜。过滤除沉后回收乙醇几无醇味，按1克生药10ml比例用水稀释，得上柱液。
取AB-8大孔吸附树脂，装柱，按生药树脂比1∶2的比例，将上述提取液通过AB-8大孔吸附树脂柱，待全部通过树脂柱后，再用上样体积0.5倍量水冲柱，至流出液基本无色。继用20％乙醇冲柱，洗脱液减压回收乙醇的提取物。
经紫外分光光度法测定，此总提取物含总环烯醚萜苷40％以上，经高效液相色谱法测定此总提取物含栀子苷26％以上。
实施例2将栀子粉碎，取70％乙醇60℃浸泡两次，每次3小时以上，合并浸提液，浸提液离心除渣，上清液减压浓缩回收乙醇后，加95％乙醇至含醇量达80％沉淀，静置过夜。过滤除沉后回收乙醇几无醇味，按1克生药10ml比例用水稀释，得上柱液。
取X-5大孔吸附树脂，装柱，按生药树脂比1∶2的比例，将上述提取液通过AB-8大孔吸附树脂柱，待全部通过树脂柱后，再用上样体积2倍量水冲柱，至流出液基本无色。继用50％乙醇冲柱，洗脱液减压回收乙醇的提取物。经紫外分光光度法测定，此总提取物含总环烯醚萜苷60％以上，经高效液相色谱法测定此总提取物含栀子苷40％。
实施例3粉碎，取50％乙醇50℃浸泡两次，每次3小时以上，和并浸提液，浸提液离心除渣，上清液减压浓缩回收乙醇后，加95％乙醇至含醇量达70％沉淀，静置过夜。过滤除沉后回收乙醇几无醇味，按1克生药10ml比例用水稀释，得上柱液。
取D101大孔吸附树脂，装柱，按生药树脂比1∶2的比例，将上述提取液通过AB-8大孔吸附树脂柱，待全部通过树脂柱后，再用上样体积一倍量水冲柱(约5倍柱体积)，至流出液基本无色。继用30％乙醇冲柱，洗脱液减压回收乙醇的提取物。将此提取物通过硅胶柱层析，用氯仿∶甲醇按比例(8∶2)洗脱，得提取物，此总提取物经紫外分光光度法测定，含总环烯醚萜苷70％以上，经高效液相色谱法测定，此总提取物含栀子苷90％以上。
试验例1 本发明栀子提取物抗乙型肝炎病毒活性试验一、试验材料1、细胞株2.2.15细胞，由中国医学科学院协和医药生物技术研究所病毒所保存2、供试样品本发明实施例1、2和3所制备的栀子提取物，分别编号为供试样品1、2和3；临用前溶于DMSO(二甲基亚砜)配成1000mg/ml，检测时用培养液作3倍稀释，共8个稀释度。
3、阳性对照药拉米夫定(3TC)，由葛兰素威康公司生产。
4、主要试剂乙肝病毒e抗原及s抗原放免检测试剂盒，北京北方生物技术研究所提供；α32PdCTP，中国福瑞生物工程有限公司提供；二、试验方法2.2.15细胞种96孔培养板，36小时后按以上稀释度分别加入供试样品及阳性对照药，同时设细胞对照孔，加药后96小时后分别更换含不同稀释浓度样品的培养液，于加药后第8天分别收集细胞上清及2.2.15细胞，点杂交的方法检测细胞中HBV DNA复制程度，分别计算IC50及SI。试验结果见表1
表1本发明栀子提取物抗乙型肝炎病毒活性试验结果
注TC50对细胞半数有毒浓度；IC50对病毒半数抑制浓度；SI选择指数，SI＝TC50/IC50。
试验结果表明，本发明栀子提取物能够有效的抑制乙型肝炎病毒DNA的复制。
试验例2本发明栀子提取物保护肝损伤作用试验一、试验材料1、试验动物昆明种小鼠，雄性，体重20±2g，二级健康动物，由中国医学科学院实验动物研究所提供。
2、供试样品本发明实施例1、2和3所制备的栀子提取物，分别编号为供试样品1、2和3。
二、试验方法及结果取50只试验动物，按体重随机分成五组，每组10只。不锈钢笼笼养，每笼5只，自由取食2天后，于每天下午1:00灌胃给受试物，第1、2、3组每只分别灌胃0.1ml供试样品1、2和3，第4组和第5组每组每只分别灌胃0.4ml生理盐水，连续给药5天，于末次给药后2小时，第1、2、3和4组分别灌胃0.10％CCl4花生油0.4ml/只，第5组灌胃等体积的花生油，禁食不禁水，18h后摘除眼球采血制备血清，测定血清谷丙转氨酶(SGPT)、谷草转氨酶(SGOT)、乳酸脱氢酶(LDH)活性。
全部数据结果均采用x±s表示，采用t检验进行统计分析。
试验结果如表2所示。小鼠灌胃CCl4后血清转氨酶和LDH活性极显著地升高(P＜0.01)，表明肝细胞已受到破坏，胞内酶大量溶出，而预先灌胃本发明栀子提取物则可极显著地抑制CCl4所致的SGPT、SGOT、LDH的升高，并且随着有效成分含量的加大，栀子提取物的抑制作用越强。
表2本发明栀子提取物保护肝损伤作用试验结果
试验结果表明，本发明栀子提取物对于肝损伤有显著的保护作用。
权利要求
1.栀子提取物在制备治疗慢性乙型肝炎药物中的用途，其中，以重量份计，所述的栀子提取物含总环烯醚萜苷40％以上，含栀子苷25％以上。
2.栀子提取物在制备治疗肝损伤药物中的用途，其中，以重量份计，所述的栀子提取物含总环烯醚萜苷40％以上，含栀子苷25％以上。
3.根据权利要求1的用途，其特征是在制备抑制乙型肝炎病毒DNA复制药物中的用途。
4.根据权利要求1或2的用途，其特征是以重量份计，所述的栀子提取物含总环烯醚萜苷70％以上，含栀子苷50％以上。
5.一种制备权利要求1或2栀子提取物的方法，包括以下步骤1).将栀子粉碎，用30-70％乙醇40-60℃浸泡，得浸提液；2).浸提液离心除渣，取上清液减压浓缩回收乙醇后，加95％乙醇至含醇量达60-80％，沉淀，静置，过滤除沉后回收乙醇至无醇味；3).用水稀释，过弱极性大孔吸附树脂柱，待全部通过树脂柱后，再用上样体积0.5-2倍量水冲柱，至流出液无色，继续用20-50％乙醇冲柱，收集洗脱液，减压浓缩回收乙醇即得栀子提取物。
6.按照权利要求5的方法，其特征是步骤1)中将栀子粉碎后用50％乙醇50℃浸泡两次，每次3小时以上。
7.按照权利要求5的方法，其特征是步骤2)中上清液减压浓缩回收乙醇后，加95％乙醇至含醇量达70％。
8.按照权利要求5的方法，其特征是步骤3)中所述的弱极性大孔吸附树脂柱选自AB-8大孔吸附树脂、X-5大孔吸附树脂或D101大孔吸附树脂。
9.按照权利要求5的方法，其特征是步骤3)中用水冲柱时，用上样体积1倍量水冲柱；至流出液无色，继续用30％乙醇冲柱。
10.按照权利要求5的方法，其特征是步骤3)中将所得到的栀子提取物进一步通过硅胶柱层析，用体积比为6-9∶1-4的氯仿与甲醇进行洗脱，收集洗脱液，即得。
全文摘要
本发明公开了一种治疗慢性乙型肝炎并具有保护肝损伤作用的栀子提取物，该栀子提取物中含总环烯醚萜苷40％以上，含栀子苷25％以上。药效学试验证实，该栀子提取物能够有效的抑制乙型肝炎病毒DNA的复制，对于肝损伤也有显著的保护作用。
文档编号A61P31/00GK1981832SQ200510130550
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月14日 优先权日2005年12月14日
发明者赵世萍, 付桂香, 张德权, 丛笑, 潘琳, 张岚, 董晞, 张韫, 张远春 申请人:中日友好医院