专利名称：一种药物组合物、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物组合物、其制备方法及其用途，具体地说，涉及一种由除人以外的哺乳动物脑组织中提取的脑提取液、维脑路通及含有从除人以外的哺乳动物脑组织中提取的神经节苷脂组配而成的药物组合物、其制备方法及其在制备治疗急慢性脑血管疾病、老年性痴呆、颅脑外伤、脑血管意外创伤及创伤后的神经系统后遗症及脑血管疾病所引起脑功能障碍等后遗症药物的用途。
背景技术：
维脑路通(又名曲克芦丁)是芦丁经羟乙基化半合成而得到的水溶性黄酮类化合物，为以曲克芦丁(7，3’，4’-三羟乙基芦丁)为主的羟乙基芦丁的混合物，一般药用按无水物计算，含曲克芦丁(C33H42O19)不得少于80.0％(供注射用)和60.0％(供口服用)。维脑路通能抑制血小板的聚集，有防止血栓形成的作用。同时能对抗5-羟色胺、缓激肽引起的血管损伤，增加毛细血管的抵抗力，降低毛细血管的通透性，可防止血管通透性升高引起的水肿。
维脑路通的临床药用价值有适用于闭塞性脑血管病引起的偏瘫、失语、冠心病梗死前综合征、中心视网膜炎、血栓性静脉炎、血管通透性升高引起的水肿、淋巴水肿、烧伤及创伤水肿、动脉硬化等。
以维脑路通作为组分之一，构成复方，相关专利也有公开。比如，申请号93107252.2公开了一种复方天仙子动静脉注射液及其制备方法，每10ml这种注射液含有盐酸山茛菪硷30-80mg，氢溴酸东茛菪硷0.3-1.5mg，维脑路通0.1-0.4g，葡萄糖200-400mg。其制备方法是按维脑路通-盐酸山茛菪硷-氢溴酸东茛菪硷-葡萄糖的顺序依次混合、装瓶、封口、消毒、抽验合格后备用。
申请号95109431.9公开了一种复方混配脑脉通注射液水制剂，其特点是丹参100-300份、维脑路通5-15份、胞二磷胆碱5-10份、辅酶A1-2份、三磷酸腺甘0.4份、水240-770份，该药有抑制红细胞和血小板凝集的作用，能防治血栓形成，能防治脑水肿，促进新血管生成，能防治老年痴呆，可治疗脑脉血管疾病。
脑组织蛋白酶解可制成含特异性多肽、氨基酸的脑提取物，但神经节苷脂检测不出，上述脑组织特异性多肽、氨基酸广泛参与脑代谢各种生化过程，包括各种物质的合成、物质的转运、信息物质生成与传递，同时为脑代谢活动提供能量、营养，对脑组织非常重要。
神经节苷脂是一种含唾液酸的鞘糖脂类，其一个或多个末端糖基是N-乙酰基神经酸即唾液酸。脑灰质的膜脂中含神经节苷脂高达6％以上，在神经的传导中起着重要作用。
神经节苷脂的临床药用价值有用于各种原因引起的中枢神经系统结构损害的功能恢复；用于脑血管意外创伤及创伤后的中枢神经系统后遗症的治疗；用于缺血性和出血性脑病变的治疗。
目前上市的神经节苷脂类药物有阿根廷生产的施捷因，为单唾液酸四己糖神经节苷脂钠盐注射液，其由基因工程方法生产，为单一组分，不含活性多肽，不太利于吸收和利用。
意大利Fidia公司从牛脑组织中提取的单唾液酸四己糖基神经节苷脂(GM1)注射液(商品名Sygen)已于20世纪90年代正式在我国销售。
中国专利申请93112578公开了一种脑保健营养品、其制造方法和用途，该保健品为含有神经节苷脂的营养液，神经节苷脂含量至少每毫升含有0.5mg，其制造方法主要使用水、氯仿、酒精提取，其用途在于增强人脑的学习、记忆功能，促进人脑的正常发育和脑损伤后的恢复。
中国专利申请95111569公开了一种含神经节苷脂为主的糖脂类物质的生产方法，包括粉碎、溶剂提取、过滤和浓缩，其特征是将干净的动物脑经粉碎，加入40-100％含量的酒精和石油醚提取，或者在干净的动物脑中加入40～100％含量的酒精后粉碎，加入石油醚提取，上述提取物过滤，清液浓缩，所述的动物脑、酒精和石油醚的重量比是1∶1～20∶0.5～8。
中国专利申请00133077公开了一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的高纯度制备工艺。
从国内外文献报道的提取神经节苷脂的方法看，多采用不同比例有机溶剂抽提总脂，然后用分配萃取方法提取神经节苷脂混合物，再用离子交换层析、分子排阻及硅胶层析法分离神经节苷脂。
有报道，将组织匀浆用氯仿-甲醇溶液抽提、离心，上清液加水萃取、蒸干得粗脂。将粗脂溶于甲醇，过阴离子交换柱，收集神经节苷脂。
另有报道，将组织加入氯仿-甲醇溶液抽提，抽提液浓缩、旋转蒸干得总脂。将总脂加入异丙醚-正丁醇溶剂溶解后用氯化纳溶液萃取、离心，水相为酸性鞘糖脂提取物。冻干粗脂过Sepbadex G-50柱层析，收集混合神经节苷脂组分冻干。
专利申请01126465公开了一种治疗神经系统疾病的药物和保健品，含有神经节苷脂和银杏叶提取物，提供了神经节苷脂作为组合物组分，与其它组分协同发挥作用的药物组合物。
目前已公开的脑提取液中的神经节苷脂的含量均较低，而且虽然也有神经节苷脂作为组合物组分，与其它组分协同发挥作用的药物组合物的公开报道，但仍未涉及维脑路通与动物脑提取物(含有活性多肽、多种氨基酸)及神经节苷脂组配，制备新的药品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种药物组合物，该药物组合物由除人以外的哺乳动物脑组织中提取的脑提取液、维脑路通及含有从除人以外的哺乳动物脑组织中提取的神经节苷脂组配而成。
本发明的另一目的在于提供该药物组合物的制备方法。
本发明的再一目的是提供上述组合物在制备治疗急慢性脑血管疾病、老年性痴呆、颅脑外伤、脑血管意外创伤及创伤后的神经系统后遗症及脑血管疾病所引起脑功能障碍等后遗症药物的用途。
本发明还涉及药物组合物在制备治疗闭塞综合症、动脉硬化、血栓性静脉炎、毛细血管出血以及血管通透性升高引起的水肿等药物中的用途。
本发明所述的一种药物组合物，其中含有动物脑组织提取液，脑组织提取液中活性多肽、氨基酸由截留分子量5000-10000的超滤膜在超滤时控制。
本发明所述的药物组合物，含有芦丁经羟乙基化得到的维脑路通(7，3’，4’-三羟乙基芦丁)和由除人以外的哺乳动物脑组织中提取的脑提取液及含有从除人以外的哺乳动物脑组织中提取的神经节苷脂，药物组合物中含有维脑路通为1-1000重量份，所述的重量份可以是μg、mg、g等医药领域公知的含量，其中维脑路通与脑提取液中总氮含量的重量比为0.1～200，维脑路通与神经节苷脂中唾液酸的重量比为10～1600倍。
所述的药物组合物中维脑路通与脑提取液中总氮含量的重量比为10-100，该重量比更优选为70-90，最优选为80；药物组合物中维脑路通与与神经节苷脂中唾液酸的重量比40～1000倍，该重量比更优选为100-500，最优选为400。
本发明所述的除人以外的哺乳动物脑组织优选为猪、狗、牛、羊、鹿、马或兔的脑组织。
哺乳动物中枢神经系统中的神经节苷脂含量丰富，例如可从猪、狗、牛、羊、鹿、马、兔等新鲜脑组织中提取含有神经节苷脂的物质，从生产成本、生产工艺、产品质量稳定性、临床疗效等因素考虑，上述哺乳动物脑组织提取的神经节苷脂优选牛脑组织。牛脑主要是用来提取神经节苷脂，国外已经用牛脑外的其它动物组织提取制成了同类产品，但主要基于神经节苷脂的提取量考虑。
本发明同时优选牛脑，通过酶解，制成含有特异性多肽、氨基酸的脑提取物，其用量以总氮含量计。
本发明所述药物组合物的制备方法包括包括脑提取液的制备及神经节苷脂提取液的制备和脑提取液、维脑路通及神经节苷脂提取液按比例混配，其中维脑路通与脑提取液中总氮含量的重量比为0.1～200，维脑路通与神经节苷脂中唾液酸的重量比为10～1600倍，然后经后处理制得成品制剂。
其中脑提取液的制备过程为取新鲜健康的动物脑组织，加0.5-2.5倍重量注射用水匀浆，加热至80-95℃，保持15-30分钟，冷却至酶解温度，调节至酶解pH值，加入脑重量0.1-1.5％的蛋白水解酶，进行一次酶解或二次酶解，一次酶解液或二次酶解液在4-8℃放置8-24小时后，经离心过滤处理，滤液用截留分子量为5000-10000的超滤膜超滤，超滤液为脑提取液，其总氮含量为0.1～10mg/ml。
所述的一次酶解为在加入脑重量0.1-1.5％的蛋白水解酶后，在该蛋白水解酶酶解温度保持2-20小时，保持酶解pH值，然后加热至80-95℃并保持15-30分钟，得一次酶解液。
所述蛋白水解酶优选使用胰蛋白酶，酶解适合温度为35-50℃，酶解适合pH值为7.5-8.5，酶解pH值优选为7.8～8.2，酶解温度优选为37～42℃；为保持温度稳定，可采取夹层水浴保温的方法。
所述的所述的二次酶解过程为将一次酶解液降温至酶解温度，调节至酶解pH值，加入脑重量0.1-1.5％的蛋白水解酶，酶解2-20小时，保持酶解pH值，然后加热至80-95℃保持15-30分钟，得二次酶解液。
所述蛋白水解酶优选使用胃蛋白酶，酶解温度为35-50℃，酶解温度优选为37～42℃，酶解pH值为2.5-3.5，酶解pH值优选为2.5-3.2。
所述的酶解温度是上述使用的蛋白酶对应的具有生物活性的工作温度，在该温度下，使用的蛋白酶具有正常的生物活性。
所述的酶解pH值是适合所使用的蛋白酶的环境pH值，在该pH值下，使用的蛋白酶具有正常的生物活性。
所述的一次酶解后的离心过滤处理为离心后分离上清液，将上清液过滤，滤液调pH值为3.5-4.5，加热至80-95℃，保持15-30分钟，在4-8℃放置8-24小时，离心后分离上清液，将上清液过滤，滤液调pH值为6.5-7.5，加热至80-95℃，保持15-30分钟，在4-8℃放置8-24小时，然后离心，上清液经过滤得滤液。
所述的二次酶解后的离心过滤处理为离心后分离上清液，将上清液过滤，滤液调pH值为8.0-10.0，加热至80-95℃，保持15-30分钟，在4-8℃放置8-24小时，离心后分离上清液，将上清液过滤，滤液调pH值为6.5-7.5，加热至80-95℃，保持15-30分钟，在4-8℃放置8-24小时，然后离心，上清液经过滤得滤液。
所述的离心条件为4000转/分，离心时间为15-30分钟。
所述的过滤为现有技术中通用的纸浆过滤或澄清板过滤。
上述过程调pH值使用盐酸和/或氢氧化钠。
所述的蛋白水解酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶等现有技术中使用的蛋白水解酶，使用方式可以是单一使用，也可以是先后使用不同的酶；优选使用胰蛋白酶或胃蛋白酶。胃蛋白酶常用规格为1∶3000-10000，胰蛋白酶常用规格为1∶250，为使本发明生产工艺、产品质量稳定，使用的酶应尽可能由固定生产商提供。
上述超滤膜优选为截留分子量为6000-10000的超滤膜，更优选截留分子量为8000的超滤膜。使用的超滤膜为市售产品，其生产商应为行业认可的生产单位，使用的滤膜型号与尺寸可根据具体的生产量、选用的超滤器尺寸来确定。
其中神经节苷脂提取液的制备过程为A)将动物脑组织加溶剂匀浆后过滤，滤渣用溶剂抽提提取，提取液与滤液合并后蒸干，得干燥物；B)将干燥物溶于溶剂中，向其中加入盐的水溶液提取分液；C)分液的上、下层液相分别用至少两种溶剂的混合水溶液洗涤，合并洗涤后的上层液相部分，减压浓缩，然后用预冷丙酮沉淀，干燥后得干燥物；D)将干燥物溶于至少两种溶剂的混合水溶液，层析柱分离，洗脱液浓缩后用预冷丙酮沉淀、分离，得到的沉淀经后处理，得到神经节苷脂提取液；在神经节苷脂提取液的制备过程中，匀浆所用溶剂为丙酮，滤渣用氯仿-甲醇(1～20∶1～20，V/V)的混合液充分抽提，合并的滤液用旋转蒸发器蒸干，得干燥物。
溶解干燥物的溶剂为体积比为2～30∶1～20的卤代烃和醇的混合溶剂，盐的水溶液优选KCl水溶液。
分液的上、下层液相分别用卤代烃和醇的混合水溶液洗涤，减压浓缩至初始体积的1/8～1/2，然后用低于0℃预冷丙酮沉淀。
将干燥物溶于卤代烃和醇的混合水溶液，用卤代烃和醇的混合水溶液梯度洗脱柱层析分离。
更具体地说，神经节苷脂提取液的制备过程为A)将动物脑组织加3～4倍重量的丙酮匀浆后过滤，保留滤渣和滤液；滤渣用3～5倍重量的氯仿-甲醇(1～20∶1～20，V/V)混合液抽提三次，分别过滤；将上述滤液合并后在旋转蒸发器中37℃减压蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿-甲醇(2～30∶1～20，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/20～1/80体积的0.1mol/L的KCl溶液，室温下搅拌1小时，静置8～16小时后分液；C)分液后，上层液相用等体积的氯仿-甲醇-水(50～150∶5～40∶0.5～5，V/V/V)混合液洗涤，下层液相用等体积的氯仿-甲醇-水(1～10∶30～80∶35～85，V/V/V)混合液洗涤，合并两次洗涤后的上层液相部分，在37℃减压浓缩至初始体积的1/8～1/2，然后用-20℃预冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)将干燥物溶于的氯仿-甲醇-水(30～80∶10～50∶1～90，V/V/V)混合液，制成1～5％浓度的溶液，加入层析柱，调整流速5ml/分钟，用氯仿-甲醇-水(60～90∶15～40∶1～10，V/V/V)混合液10～30L洗脱，然后改用氯仿-甲醇-水(40～80∶20～50∶5～15，V/V/V)混合液8～15L洗脱，收集后洗脱液6～12L，减压浓缩后用3～5倍体积的-20℃预冷丙酮沉淀，-20℃静止2小时后倾去上层清液，余下部分在1000转/分下离心10分钟，得到的沉淀用适量丙酮洗2次，真空干燥，将干燥物溶于水得神经节苷脂提取液，该神经节苷脂提取液浓度为每1ml含唾液酸0.1～20mg；更为优选的，神经节苷脂提取液的制备过程为A)将动物脑组织加3～4倍重量的丙酮匀浆后过滤，保留滤渣和滤液；滤渣用3～5倍重量的氯仿-甲醇(1∶1，V/V)混合液抽提三次，分别过滤；将上述滤液合并后在旋转蒸发器中37℃减压蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿-甲醇(2∶1，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/80体积的0.1mol/L的KCl溶液，室温下搅拌1小时，静置8～16小时后分液；C)分液后，上层液相用等体积的氯仿-甲醇-水(86∶14∶1，V/V/V)混合液洗涤，下层液相用等体积的氯仿-甲醇-水(3∶48∶47，V/V/V)混合液洗涤，合并两次洗涤后的上层液相部分，在37℃减压浓缩至初始体积的1/4，然后用-20℃预冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；
D)将干燥物溶于的氯仿-甲醇-水(65∶25∶4，V/V/V)混合液，制成2.5％浓度的溶液，加入层析柱，调整流速5mL/分钟，用氯仿-甲醇-水(65∶25∶4，V/V/V)混合液20L洗脱，然后改用氯仿-甲醇-水(60∶35∶8，V/V/V)混合液12L洗脱，收集后洗脱液10L，减压浓缩后用4倍体积的-20℃预冷丙酮沉淀，-20℃静止2小时后倾去上层清液，余下部分在1000转/分下离心10分钟，得到的沉淀用适量丙酮洗2次，真空干燥，将干燥物溶于水得神经节苷脂提取液，该神经节苷脂提取液浓度为每1ml含唾液酸0.1～20mg；上述步骤B)中，氯仿-甲醇混合液加入量以完全溶解干燥物为准。
上述步骤中丙酮的加入量以不再有沉淀析出为准。
上述步骤D)中，所用的层析柱通过如下过程制备将硅胶颗粒过筛选60～80目的均匀颗粒，在110℃下干燥1小时，使其活化，然后用5倍柱体积的氯仿-甲醇(5～20∶0.5～3，V/V)混合液作为载体，将硅胶调成糊状，使其均匀分散后装入80×10cm的层析柱，即得。其中优选的氯仿-甲醇混合比为9∶1(V/V)。
本发明的减压蒸发的压力控制在0.04～0.08MPa左右。
上述制备方法制备的脑提取液、神经节苷脂提取液与维脑路通按比例混配，其中维脑路通与脑提取液中总氮含量的重量比为0.1～200，维脑路通与神经节苷脂中唾液酸的重量比为10～1600倍，然后经后处理制得成品制剂，成品制剂的剂型为药剂学上可接受的剂型，比如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、小容量注射剂、大容量注射剂或冻干粉针剂等，优选为小容量注射剂、大容量注射剂或冻干粉针剂，最优选为小容量注射剂。因此，所述的后处理可以是按照制备药剂学上可接受的剂型的常规方法进行。
本发明二次酶解后的脑提取液含有多肽和游离氨基酸，符合国家药品标准脑蛋白水解物质量标准。本发明二次酶解后的脑提取液浓缩干燥后脑蛋白水解物(口服用)每克含总氮应为80-100mg，符合脑蛋白水解物(口服用)国家药品标准；本发明二次酶解后的脑提取液(注射用，水溶液)稀释或浓缩后可用于制备脑蛋白水解物注射液，并符合国家药品标准。脑蛋白水解物为一种大脑所特有的肽能神经营养物，能以多种方式作用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害。可通过血脑屏障，促进脑内蛋白质的合成，影响呼吸链，具有抗缺氧的保护能力，改善脑内能量代谢，可激活腺苷酸环化酶和催化其他激素系统，提供神经递质，肽类激素及辅酶前体。可用于颅脑外伤，脑血管病后遗症伴有记忆减退及注意力集中障碍的症状改善。对脑功能不全有辅助改善作用，也用于蛋白质缺乏、神经衰弱病人以及对一般蛋白质消化吸收障碍的病例。
本发明的制备方法采用硅胶柱一步纯化得混合神经节苷脂，含有单唾液酸四己糖神经节苷脂(如GM1)、双唾液酸四己糖神经节苷脂(如GD1a、GD1b、GD3)及三唾液酸四己糖神经节苷脂(如GT1)等多种神经节苷脂，先减压浓缩后用预冷丙酮沉淀，真空干燥后溶于蒸馏水，作为神经节苷脂提取液备用，使制得的提取物有效成分收率较高，组分更合理，同时也节省了操作时间，降低了原辅料消耗。该复合神经节苷脂对神经组织具有高度特异亲和性，能够在神经细胞膜上高度浓集而发挥神经病变、神经损伤修复、再生作用。神经节苷脂具有感知、传递细胞内外信息的功能，参与细胞的识别、粘着、生长、分化以及细胞信息传递等过程。作为某些神经递质、激素、病毒和干扰素的受体，具有参与神经组织的分化、再生、修复，与神经冲动的传导、细胞间的识别作用，能加速病变、损伤的神经组织的再生修复，促进神经功能恢复和清除神经病变症状，减低兴奋性氨基酸的释放，从而减轻细胞毒性和血管水肿，是脑血管意外治疗的良药，用于治疗老年性痴呆及其它神经性疾病取得良好疗效。
本发明所述药物组合物可应用于制备治疗脑血栓、脑栓塞、脑痉挛等急慢性脑血管疾病，以及老年性痴呆、颅脑外伤、脑血管意外创伤及创伤后的神经系统后遗症及脑血管疾病(脑供血不全、脑梗塞)所引起脑功能障碍等后遗症；用于治疗闭塞综合症、动脉硬化、血栓性静脉炎、毛细血管出血以及血管通透性升高引起的水肿等药物中的应用。
本发明研究人员进行大量实验发现，当该药物组合物中维脑路通重量为脑提取液中总氮含量的80倍时及维脑路通重量为神经节苷脂中唾液酸含量的400倍时的三者协同作用最好，更利于人体的吸收和利用。
本发明最优选药物组合物注射液的规格为2ml∶80mg维脑路通∶1mg总氮∶200μg唾液液；5ml∶200mg维脑路通∶2.5mg总氮∶500μg唾液酸；10ml∶400mg维脑路通∶5mg总氮∶1000μg唾液酸；肌内注射一次2～4ml，一日2次静脉滴注一次10ml，一日一次，用250～500ml生理盐水或5％葡萄糖注射液稀释后使用。20日为一疗程，可用1～3个疗程，每疗程间隔3～7天。
本发明所述的药物组合物含有治疗脑血管疾病及其引起的脑功能障碍后遗症的脑提取液、多种神经节苷脂等活性物质，能调节和改善脑代谢，能加速病变、损伤的神经组织的再生修复，促进神经功能恢复和清除神经病变症状，采用维脑路通与脑提取液、多种神经节苷脂活性物质的协同作用，达到了最佳的临床效果。
本发明人在长期研究基础上，结合目前临床积累的经验，出人意料的发现，将神经节苷脂提取物与曲克芦丁、脑蛋白提取物组合，在治疗心脑血管疾病上有着更好的协调增效作用。
本药物组合物通过脑提取液、神经节苷脂与维脑路通的有机组合，发挥了三者的协同作用，更利于脑血管疾病的有效治疗及其由脑血管疾病引起的后遗症的改善。
本发明所述的药物组合物含有治疗脑血管疾病及其引起的脑功能障碍后遗症的活性物质，包括维脑路通、脑提取液中含有的大量活性多肽和多种氨基酸及多种神经节苷脂。维脑路通能抑制血小板的聚集，有防止血栓形成的作用。同时能对抗5-羟色胺、缓激肽引起的血管损伤，增加毛细血管的抵抗力，降低毛细血管的通透性，可防止血管通透性升高引起的水肿，可增加血中氧含量和氧饱和度，保护缺氧状态下酶的活性、改善微循环，促进新血管生成以增进侧枝循环，从而增加脑血流量，改善半暗带区域的供血，减轻周边区域的水肿，减小脑梗死面积。脑提取液所含的大量活性多肽、多种氨基酸等能透过血脑屏障，以多种形式作用于中枢神经，调整和改善神经元代谢，并影响其呼吸链，具有激活、改善脑内神经递质和酶的活性，保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害。能增加脑组织对葡萄糖的利用，改善脑细胞缺氧状态，对缺氧的脑组织具保护作用。
神经节苷脂对神经组织具有高度特异亲和性，能够在神经细胞膜上高度浓集而发挥神经病变、神经损伤修复、再生作用，能加速病变、损伤的神经组织的再生修复，促进神经功能恢复和清除神经病变症状。脑提取液所含的活性多肽、特定比例组成的氨基酸能够透过血脑屏障，能够激活和促进神经细胞蛋白质合成，提供和补充神经代谢所需的特异性营养物质，能够补充脑营养，促进脑神经新陈代谢，能够为生命活动及机体病变修复提供高效能量补充和营养支持。神经节苷脂和脑提取液所含多种活性营养因子及维脑路通之间的高效组合，相互能够起到促进、协同、增强作用。可应用于制备治疗脑血栓、脑栓塞、脑痉挛等急慢性脑血管疾病，以及老年性痴呆、颅脑外伤、脑血管意外创伤及创伤后的神经系统后遗症及脑血管疾病(脑供血不全、脑梗塞)所引起脑功能障碍等后遗症；用于治疗闭塞综合症、动脉硬化、血栓性静脉炎、毛细血管出血以及血管通透性升高引起的水肿等药物中的应用。
具体实施例方式
实施例1取新鲜健康牛脑10kg，除去筋膜等杂质，用注射用水洗涤，加10L注射用水，匀浆，加热80℃，保持15分钟，冷却至42℃，调节pH值7.5，加入45g胰蛋白酶(美国DIFCO公司，规格500g)在42℃酶解3小时，酶解过程中控制pH值8.5，取出，加热至80℃，保持20分钟，得一次酶解液；4℃放置24小时后离心，离心条件为4000转/分，离心时间为15分钟，纸浆过滤，上清液调pH值3.5，加热95℃，保持20分钟，4℃放置12小时后离心，离心条件为4000转/分，离心时间为20分钟，纸浆过滤，滤液调pH值6.5，加热至90℃，保持15分钟，8℃放置8小时后离心，离心条件为4000转/分，离心时间为20分钟，得滤液；滤液用截留分子量为6000的超滤膜(美国millipore公司，标准超滤系统)超滤，超滤液即为脑提取液，其中总氮含量为4mg/ml。
取10kg新鲜牛脑用40L丙酮匀浆，匀浆液用滤纸过滤，得滤渣2500g，滤渣用10L氯仿-甲醇(1∶1)混合液抽提三次，分别过滤后合并滤液，使用旋转蒸发器，在37℃减压蒸干，得干燥物1.25g。干燥物用20L氯仿-甲醇混合液(2∶1，V/V)溶解，加入250ml的0.1mol/LKCl溶液。室温搅拌1小时，转移到分液漏斗中静置8小时。分液后，上相用等体积的氯仿-甲醇-水(86∶14∶1，V/V/V)洗1次；下相用等体积的氯仿-甲醇-水(3∶48∶47，V/V/V)洗1次；合并2次上相于37℃减压浓缩至约5L，-20℃预冷丙酮沉淀，真空干燥。
层析柱通过如下过程制备将硅胶颗粒过筛选80目的均匀颗粒，在110℃下干燥1小时，使其活化，然后用5倍柱体积的氯仿-甲醇(9∶1，V/V)混合液作为载体，将硅胶调成糊状，使其均匀分散后装入80×10cm的层析柱，即可。
将前述真空干燥物1.2g溶于氯仿-甲醇-水(65∶25∶4，V/V/V)50ml加入层析柱，调整流速5ml/分钟，用氯仿-甲醇-水(65∶25∶4，V/V/V)20L溶液洗脱，然后改用氯仿-甲醇-水(60∶35∶8)12L洗脱，收集后洗脱液10L，减压浓缩后用40L的-20℃预冷丙酮沉淀，-20℃静止2小时，倾去上层清液，离心10分钟(1000rpm)，沉淀用适量丙酮洗2次，沉淀真空干燥过夜。
将1.2g干燥物溶于1200ml注射用水，作为神经节苷脂提取液备用，浓度为每1ml含神经节苷脂以唾液酸计1mg/ml。
称取注射用维脑路通纯品80g，与250ml脑提取液及200ml神经节苷脂提取液可配成2000ml药液，最终制成小溶量注射剂1000支(规格为2ml∶80mg维脑路通、1mg总氮与200μg唾液酸)。取配液量约40％的注射用水于浓配罐中，加入维脑路通充分搅拌至完全溶解，加入总配制体积0.05％的活性搅拌煮沸15分钟，将药液温度降至40～50℃，将药液脱炭过滤至稀配罐中，在稀配罐中投入脑提取液及神经节苷脂提取液，加水至配液量，调节PH值6.8～7.0，药液经过滤系统过滤后灌封于2ml安瓿中，灭菌，即得小容量注射剂。
实施例2取新鲜健康猪脑10kg，除去筋膜等杂质，用注射用水洗涤，加10L注射用水，匀浆，调节pH值8.2，加热80℃，保持15分钟，冷却至42℃，加入80g胰蛋白酶(美国DIFCO公司，规格500g)在42℃酶解10小时，酶解过程中控制pH值8.2，取出，加热至80℃，保持20分钟，得一次酶解液；将一次酶解液降温至44℃，调节pH值为2.5，加入50g胃蛋白酶(厦门星隆达化学试剂有限公司；1∶10000；规格100g)，酶解10小时，过程pH值控制为2.5，然后加热至90℃保持20分钟，得到二次酶解液；以4000转/分的速度离心30分钟，将上清液澄清板过滤，滤液调pH值为8.0，加热至95℃，保持15分钟，在6℃放置20小时，相同离心方式分离上清，过滤，滤液调pH值为7.3，加热至85℃，保持25分钟，然后在6℃放置15小时，相同方式离心、过滤得滤液；滤液用截留分子量为10000的超滤膜(美国millipore公司，标准超滤系统)超滤，超滤液即为脑提取液，其中总氮含量为6mg/ml。
取10kg新鲜牛脑用35L丙酮匀浆，匀浆液用滤纸过滤，得滤渣2500g，滤渣用7.5L氯仿-甲醇(5∶1)混合液抽提三次，分别过滤后合并滤液，使用旋转蒸发器，在37℃减压蒸干，得干燥物1.25g。干燥物用20L氯仿-甲醇混合液(10∶1，V/V)溶解，加入1000ml的0.1mol/LKCl溶液。室温搅拌1小时，转移到分液漏斗中静置10小时。分液后，上相用等体积的氯仿-甲醇-水(50∶10∶0.5，V/V/V)洗1次；下相用等体积的氯仿-甲醇-水(1∶30∶35，V/V/V)洗1次；合并2次上相于37℃减压浓缩至约2.5L，-20℃预冷丙酮沉淀，真空干燥。
层析柱通过如下过程制备将硅胶颗粒过筛选70目的均匀颗粒，在110℃下干燥1小时，使其活化，然后用5倍柱体积的氯仿-甲醇(20∶3，V/V)混合液作为载体，将硅胶调成糊状，使其均匀分散后装入80×10cm的层析柱，即可。
将前述真空干燥物1.2g溶于氯仿-甲醇-水(30∶50∶40，V/V/V)120ml加入层析柱，调整流速5ml/分钟，用氯仿-甲醇-水(90∶15∶6，V/V/V)30L溶液洗脱，然后改用氯仿-甲醇-水(80∶20∶5)8L洗脱，收集后洗脱液12L，减压浓缩后用35L的-20℃预冷丙酮沉淀，-20℃静止2小时，倾去上层清液，离心10分钟(1000rpm)，沉淀用适量丙酮洗2次，沉淀真空干燥过夜。
将1.16g干燥物溶于800ml注射用水，作为神经节苷脂提取液备用，浓度为每1ml含神经节苷脂以唾液酸计1.45mg/ml。
称取注射用维脑路通纯品60g，与250ml脑提取液及200ml神经节苷脂提取液可配成2000ml药液，最终制成小溶量注射剂1000支(规格为2ml∶60g维脑路通、1.5mg总氮与290μg唾液酸)。。取配液量约40％的注射用水于浓配罐中，加入维脑路通充分搅拌至完全溶解，加入总配制体积0.05％的活性搅拌煮沸15分钟，将药液温度降至40～50℃，将药液脱炭过滤至稀配罐中，在稀配罐中投入脑提取液及神经节苷脂提取液，加水至配液量，调节PH值7.1～7.3，药液经过滤系统过滤后灌封于2ml安瓿中，灭菌，即得小容量注射剂。
实施例3取新鲜健康牛脑10kg，除去筋膜等杂质，用注射用水洗涤，加25L注射用水，匀浆，调节pH值9.0，加热95℃，保持30分钟，冷却至38℃，加入150g胰蛋白酶，保温4小时，酶解过程中控制pH值8.0，然后加热至85℃，保持30分钟，得一次酶解液；8℃放置8小时，离心，离心条件为4000转/分，离心时间为20分钟，上清液纸浆过滤，滤液调pH值4.0，加热80℃，保持30分钟，5℃放置12小时，离心，离心条件为4000转/分，离心时间为30分钟，上清液过滤，滤液调pH值7.0，加热至95℃，保持30分钟，7℃放置18小时后离心，离心条件为4000转/分，离心时间为30分钟，上清液过滤，得滤液；滤液用截留分子量为8000的超滤膜超滤，超滤液即为脑提取液，其总氮含量为1.4mg/mL。
取10kg新鲜马脑用30L丙酮匀浆，匀浆液用滤纸过滤，得滤渣2500g，滤渣用12.5L氯仿-甲醇(20∶1)混合液抽提三次，分别过滤后合并滤液，使用旋转蒸发器，在37℃减压蒸干，得干燥物1.25g。干燥物用20L氯仿-甲醇混合液(30∶1，V/V)溶解，加入500ml的0.1mol/LKCl溶液。室温搅拌1小时，转移到分液漏斗中静置16小时。分液后，上相用等体积的氯仿-甲醇-水(120∶35∶5，V/V/V)洗1次；下相用等体积的氯仿-甲醇-水(10∶68∶77，V/V/V)洗1次；合并2次上相于37℃减压浓缩至约10L，-20℃预冷丙酮沉淀，真空干燥。
层析柱通过如下过程制备将硅胶颗粒过筛选80目的均匀颗粒，在110℃下干燥1小时，使其活化，然后用5倍柱体积的氯仿-甲醇(15∶2，V/V)混合液作为载体，将硅胶调成糊状，使其均匀分散后装入80×10cm的层析柱，即可。
将前述真空干燥物1.2g溶于氯仿-甲醇-水(80∶10∶20，V/V/V)24ml加入层析柱，调整流速5ml/分钟，用氯仿-甲醇-水(75∶15∶10，V/V/V)20L溶液洗脱，然后改用氯仿-甲醇-水(40∶50∶15)15L洗脱，收集后洗脱液8L，减压浓缩后用40L的-20℃预冷丙酮沉淀，-20℃静止2小时，倾去上层清液，离心10分钟(1000rpm)，沉淀用适量丙酮洗2次，沉淀真空干燥过夜。
将1.25g干燥物溶于500ml注射用水，作为神经节苷脂提取液备用，浓度为每1ml含神经节苷脂以唾液酸计2.5mg/ml。
称取注射用维脑路通纯品100g，与500ml脑提取液及200ml神经节苷脂提取液可配成2000ml药液，最终制成小溶量注射剂1000支(规格为2ml∶100mg维脑路通、0.7mg总氮与500μg唾液酸)。取配液量约40％的注射用水于浓配罐中，加入维脑路通充分搅拌至完全溶解，加入总配制体积0.05％的活性搅拌煮沸15分钟，将药液温度降至40～50℃，将药液脱炭过滤至稀配罐中，在稀配罐中投入脑提取液及神经节苷脂提取液，加水至配液量，调节PH值7.0～7.2，药液经过滤系统过滤后灌封于2ml安瓿中，灭菌，即得小容量注射剂。
实施例4按照实施例3的操作，得到一次酶解液。
将一次酶解液降温至45℃，调节pH值为3.5，加入100g胃蛋白酶(厦门星隆达化学试剂有限公司；1∶10000；规格100g)，酶解2小时，过程pH值控制为3.2，然后加热至95℃保持15分钟，得到二次酶解液；以4000转/分的速度离心30分钟，将上清液澄清板过滤，滤液调pH值为10.0，加热至g0℃，保持30分钟，在4℃放置8小时，相同离心方式分离上清，过滤，滤液调pH值为7.0，加热至90℃，保持30分钟，然后在6℃放置15小时，相同方式离心、过滤得滤液；滤液用截留分子量为8000的超滤膜(美国millipore公司，标准超滤系统)超滤，超滤液即为脑提取液，其中总氮含量为2.5mg/ml。
取10kg新鲜马脑用45L丙酮匀浆，参照实施例1步骤，制备神经节苷脂提取液备用，浓度为每1ml含1含神经节苷脂以唾液酸计10mg/ml。
按照实施例3的操作，制得注射液。
实施例5取新鲜健康鹿脑10kg，除去筋膜等杂质，用注射用水洗涤，加5L注射用水，匀浆，调节pH值至8.5，加热85℃，保持20分钟，冷却至45℃，加入40g胃蛋白酶(厦门星隆达化学试剂有限公司；1∶10000；规格100g)，在45℃酶解20小时，酶解过程中控制pH值2.5，然后加热至95℃，保持15分钟，得到一次酶解液；7℃放置10小时后离心，离心条件为4000转/分，离心时间为30分钟，上清液澄清板过滤，滤液调pH值3.5，加热至80℃，保持30分钟，8℃放置8小时后离心，相同方式离心、过滤，滤液调pH值7.3，加热至85℃，保持15分钟，4℃放置24小时后，相同方式离心、过滤，得滤液，滤液用截留分子量为8000的超滤膜(美国millipore公司，标准超滤系统)超滤，超滤液即为脑提取液，其中总氮含量为7mg/ml。
取10kg新鲜狗脑用40L丙酮匀浆，参照实施例1步骤，制备神经节苷脂提取液备用，浓度为每1ml含1含神经节苷脂以唾液酸计100μg/ml。
称取注射用维脑路通纯品100g，与500ml脑提取液及1000ml神经节苷脂提取液可配成2000ml药液，最终制成小溶量注射剂1000支(规格为2ml∶100mg维脑路通、3.5mg总氮与100μg唾液酸)。取配液量约20％的注射用水于浓配罐中，加入维脑路通充分搅拌至完全溶解，加入总配制体积0.05％的活性搅拌煮沸15分钟，将药液温度降至40～50℃，将药液脱炭过滤至稀配罐中，在稀配罐中投入脑提取液及神经节苷脂提取液，加水至配液量，调节PH值7.0～7.2，药液经过滤系统过滤后灌封于2ml安瓿中，灭菌，即得小容量注射剂。
实施例6按照实施例5的操作，得到一次酶解液。
将一次酶解液降温至50℃，调节pH值为7.8，加入80g胰蛋白酶(美国DIFCO公司，规格500g)，酶解10小时，过程pH值控制为7.8，然后加热至90℃保持20分钟，得到二次酶解液；以4000转/分的速度离心30分钟，将上清液澄清板过滤，滤液调pH值为9.0，加热至85℃，保持25分钟，在8℃放置10小时，相同离心方式分离上清，过滤，滤液调pH值为7.2，加热至80℃，保持20分钟，然后在6℃放置25小时，相同方式离心、过滤得滤液；滤液用截留分子量为6000的超滤膜(美国millipore公司，标准超滤系统)超滤，超滤液即为脑提取液，其中总氮含量为8.0mg/ml。
取10kg新鲜猪脑用35L丙酮匀浆，参照实施例1步骤，制备猪脑神经节苷脂提取液备用，浓度为每1ml含唾液酸400μg唾液酸。
按照实施例5的操作，制得注射液。
实施例7取新鲜健康猪脑10kg，加入15L注射用水匀浆，参照实施例1制备脑提取液备用，其中总氮含量为2.4mg/ml。
取10kg新鲜羊脑用35L丙酮匀浆，参照实施例1步骤，制备羊脑神经节苷脂提取液备用，浓度为每1ml含唾液酸400μg唾液酸。
称取注射用维脑路通纯品80g，与250ml脑提取液及500ml神经节苷脂提取液可配成2000ml药液，最终制成小容量注射剂400支(规格为5ml∶200mg维脑路通、1.5mg总氮与5mg唾液酸)。取配液量约40％的注射用水于浓配罐中，加入维脑路通充分搅拌至完全溶解，加入总配制体积0.05％的活性搅拌煮沸15分钟，将药液温度降至40～50℃，将药液脱炭过滤至稀配罐中，在稀配罐中投入脑提取液及神经节苷脂提取液，加水至配液量，调节PH值6.8～7.0，药液经过滤系统过滤后灌封于5ml安瓿中，灭菌，即得小容量注射剂。
实施例8按照实施例1中的操作，制备脑提取液及神经节苷脂提取液。
称取注射用维脑路通纯品80g，与1000ml脑提取液及神经节苷脂提取液200ml可配成2000ml药液，最终制成小溶量注射剂200支(规格为10ml∶400mg维脑路通、20mg总氮与10mg唾液酸)。取配液量约30％的注射用水于浓配罐中，加入维脑路通充分搅拌至完全溶解，加入总配制体积0.05％的活性搅拌煮沸15分钟，将药液温度降至40～50℃，将药液脱炭过滤至稀配罐中，在稀配罐中投入脑提取液及神经节苷脂提取液，加水至配液量，调节PH值6.8～7.0，药液经过滤系统过滤后灌封于5ml安瓿中，灭菌，即得小容量注射剂。
实施例9～14参照实施例1～6，脑提取液和维脑路通及神经节苷脂提取液进行配比，按公知的方法，制成颗粒，干燥后压片，得片剂。
实施例15～20参照实施例1～5，脑提取液和维脑路通及神经节苷脂提取液进行配比，加入适宜的赋型剂(如右旋糖酐40、甘露醇等)，进行除菌灌装，按公知的方法，冷冻干燥制成冻干粉针产品。
实施例21～26参照实施例1～5，将脑提取液及神经节苷脂提取液投入到稀配罐中；在浓配罐中投入维脑路通和0.85％最终配制总体积的氯化钠，加入0.4‰活性炭煮沸脱炭过滤，冷却后，将药液过滤至稀配罐中，在稀配罐中补加注射用水至配液量，调PH为6.8～7.0，过滤。灌封于输液瓶中，100℃流通蒸汽灭菌45分钟，即得输液产品。
实验例1本实验例为实施例1注射剂外观性状、pH值、蛋白质、热原、异常毒性及其它规定的注射剂检查项目的检测。
√本品为黄色或浅棕黄色澄明液体。
√按照中国药典2000年版二部附录VI H测定，本品pH值应为5.5-7.5。
√取本品2ml，加20％磺基水杨酸溶液2ml，溶液应澄清。
√热原检查取本品，用氯化钠注射液稀释成每ml中含维脑路通20mg的溶液，依法检查(中国药典2000年版二部附录XID)。剂量按家兔体重每kg注射本品2ml，应符合规定。
√异常毒性测定取本品，用氯化钠注射液稀释成每ml中含维脑路通20mg的溶液，依法检查(中国药典2000年版二部附录XIC)。按静脉注射给药，应符合规定。
√其他应符合注射剂项下有关各项规定(中国药典2000版二部附录IB)。
实验例2本实验例为实施例1注射剂中主要组分的定性测定。
√取本品0.5ml，加水稀释至20ml，加盐酸1ml和锌粉少量，置水浴上加热，显持续的红色。
√取本品0.5ml，加水稀释至20ml，加三氯化铝少量，溶液显亮黄色。
√取本品2ml，加茚三酮试液数滴，加热，应显蓝色。
√在维脑路通含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液的主峰保留时间应与维脑路通对照品峰的保留时间一致。
以上三种实验为本发明药物组合物所含组份的定性反应，说明本发明药物组合中含有确定的组份。
实验例3本实验例为实施例1注射剂中的维脑路通定量测定。
本实验例按高效液相色谱法(中国药典2000年版二部附录VD)测定。
√色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％枸橼酸溶液-乙睛-四氢呋喃(85∶9∶6)为流动相；检测波长为254nm。理论板数按维脑路通峰计算应不低于2000。维脑路通峰与其他物质峰之间的分离度应符合要求。
√测定法取本品适量，用流动相定量稀释成每1ml中含维脑路通0.20mg的溶液，作为供试品溶液，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密称取维脑路通对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中含维脑路通0.20mg的溶液，作为对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算。
√维脑路通含量应为标示量的90～110％。
√分为三组测定，结果见下表
实验例4本实验例为实施例1注射剂中总氮的定量测定。
取本品依法测定(中国药典2000年版二部附录VIID)。
分为三组测定，本品中总氮含量应为标示量的85～115％，结果见下表
实验例5本实验例为本发明最优选药物组合物小容量注射剂(每ml含40mg维脑路通、0.5mg总氮、200μg唾液液)中所含神经节苷脂(以唾液酸计)的定量测定。
参比溶液的制备 取唾液酸参比试剂适量，加0.9％氯化钠溶液制成每1ml中含50μg的溶液。
标准曲线的制备 精密量取参比溶液0.0ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml，分别置具塞试管中，各加水至2.0ml，再分别精密加入间苯二酚溶液(取2％间苯二酚溶液10ml、2.5％硫酸铜溶液0.25ml，盐酸80ml，加水至100ml)2ml，摇匀，置水浴中反应15分钟，取出置冷水中10分钟。分别精密加醋酸正丁酯-正丁醇(85∶15)5ml，剧烈振摇后放置15分钟。取上层液于585nm的波长处测定吸收度；以0管作为空白。以测得的吸收度与对应的浓度计算回归方程。
测定法 精密量取供试品溶液1ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“精密加入间苯二酚溶液”起，依法测定，从回归方程求得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，即为唾液酸含量。
√含神经节苷脂(以唾液酸计)应为标示量的80.0％～120.0％。
√分为三组测定，结果见下表
实验例6本例为对实施例2所制备的脑提取液按脑蛋白水解物注射液标准进行的主要项目检测。
√氨基酸含量测定取本品，用适宜的氨基酸分析仪或高效液相色谱仪进行分离测定；另取相应的氨基酸对照品制成的相应浓度的对照品溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算各氨基酸的含量。测定结果如下每1ml含游离氨基酸为34.70mg/ml，其中门冬氨酸 3.05mg/ml谷氨酸3.89mg/ml丝氨酸0.25mg/ml组氨酸1.22mg/ml甘氨酸1.49mg/ml苏氨酸0.24mg/ml丙氨酸2.99mg/ml精氨酸0.55mg/ml缬氨酸1.94mg/ml蛋氨酸0.43mg/ml异亮氨酸 1.90mg/ml苯丙氨酸 1.80mg/ml亮氨酸6.18mg/ml赖氨酸6.55mg/ml脯氨酸2.22mg/ml√总氮含量测定取本品，依法测定(中国药典2000年版二部附录VII D)，总氮为6.10mg/ml。
√鉴别(1)取本品2ml，加双缩腺试剂(取硫酸铜0.75g和酒石酸钾钠0.3g，加水250ml使溶解，在搅拌下加入10％氢氧化钠溶液150ml，加水至500ml)4ml，显紫红色，符合规定。
√鉴别(2)取本品，照高效液相色谱法(中国药典2000年版二部附录V D)试验。
色谱条件用凝胶色谱柱以磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾10.63g与磷酸二氢钾5.31g，加异丙醇50ml，加水至1000ml，用磷酸调节PH值至7.0)为流动相；流速为每分钟1ml。
测定法取对照溶液及供试品溶液各10υl注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的色谱图应与对照溶液的色谱图基本一致，符合规定。
√折光率本品的折光率(中国药典2000年版二部附录VIH)为1.342，符合规定。
√PH值PH值为7.2(中国药典2000年版二部附录VIH)，符合规定。
√蛋白质取本品5ml，加20％磺基水杨酸2ml，溶液应澄清，符合规定。
实验例7本实验例为本发明药物组合物对大鼠局灶脑缺血后的神经修复功能的药理药效试验，说明了各组分之间的协同增效作用。
方法采用Longa氏法制备SD大鼠大脑中动脉脑缺血模型，分组如下A、假手术组(8只)；B、持续缺血组(无药物干预)根据取样时间点的不同分为1、3、7及14d共4组(每组8只)；C、药物干预组实施例1注射剂、施普善(Cerebrolysin，原名脑活素)和维脑路通注射液干预组。
各时相点取材，免疫组化观察巢蛋白(Nestin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达变化，并使用多媒体彩色病理图像分析系统进行定量分析；利用草酸-焦锑酸钾电镜细胞化学技术观察缺血脑组织的超微结构改变。
结果药物干预组其病理改变轻于持续缺血组；实施例1注射剂组病理改变轻于施普善、维脑路通注射液组。药物干预组其Nestin、NSE表达明显高于持续缺血组。
结论本发明药物组合物注射剂可通过使缺血后Nestin、NSE的表达上调，而起到减轻缺血性脑损伤的作用，同时因兼有神经节苷脂，其效果上有协同增效作用。
比较例1本例为实施例1注射剂与对照组在治疗脑血栓的临床对比，说明本发明组合物的良好疗效，即脑提取液、神经节苷脂与维脑路通的协同疗效优于脑提取液与维脑路通的组合。
目标病例数受试对象及基本情况，各项指标经过统计学检验后，无差异。根据总体试验设计，共有115例(既治疗组55例及对照组60例)两组分布一致。
试验对象1、入选标准急性中度(NIH 7-22分)颈内动脉首发的脑梗死，发病在72小时内；发病年龄35-70岁；无意识障碍、查体合作；经头颅CT证实为脑梗死，排出脑出血。
2、排除标准既往有致残性中风者；心、肺、肝、肾等脏器功能衰竭者；怀孕或哺乳期的妇女；试验开始前一个月及试验期间参加其他任何药物的试验者；有精神病史或严重精神症状者；有活动性出血或出血倾向者。
试验方法1、本试验为随机对照试验。
2、实施例1产品作为治疗组应用，对照组按照实施例1的制备方法制备，不同在于，其中没有神经节苷脂组分。
3、观察指标1)NIH2)病残程度评分3)实验室检查a.分别与给药前、给药后7天、21天化验血、尿常规、肝、肾功能b.于给药前及试验结束后检查心电图、血压。
4、不良反应详细记录治疗中出现的不良反应，包括头痛、头晕、皮肤过敏反应等。记录不良反应出现的时间、程度、和持续时间。并按与本药治疗肯定有关、很可能有关、可能有关、不能判定及无关五级标准判定。
5、疗效判定基本痊愈NIH减少91-100％，病残程度为0级；显著进步NIH减少46-90％，病残程度在1-3级；进步NIH减少18-45％；无变化NIH减少或增加在17％；恶化NIH增加18％以上。
总有效率＝基本痊愈+显著进步+进步统计分析所有数据均用SPSS统计软件进行分析；其中两组间各指标均数间比较采用t检验；计数资料采用x2检验。
结果1、入选病例及治疗前病人的基本特征两组分别为55例和60例，病例均包括在意向处理分析中；两组病人治疗前在性别、年龄、病程、NIH等无明显差异。
2、临床疗效分级疗效评定如下表
3、终止治疗及不良反应事件治疗前、治疗后，实验室检查肝肾功能、血尿常规及心电图均无异常变化，未见明显不良反应。
结论本发明治疗组有效率83.6％，对照组有效率65％，尤其在显著进步和基本痊愈上有了显著的提高。因此，本发明药物组合物具有多途径、多机制的协同药理作用，无明显的不良反应，是治疗急性脑血管病的有效药物。
比较例2本例为实施例1注射剂与施捷因[神经节苷脂(GM1)注射液]，在治疗血管性痴呆(VaD)的临床对比，说明本发明注射液的良好疗效，即脑提取液、神经节苷脂与维脑路通的协同疗效优于神经节苷脂注射液。
研究对象VaD患者共52例，年龄55～75岁，所有入选病例均符合DSM-IV及NINCDS-ADRDA标准(1)满足DSM-IV可能性VaD标准；(2)HIS评分超过7分；(3)CT或MRI有额叶和顶叶脑室旁融合性白质病变及基底节和额叶腔隙性梗死灶(≥2)。
腔隙灶定义为低密度，与脑脊液等密度，2mm＜直径＜15mm。
52例患者随机分为本发明药物组和普洛迪组对照组，失访2例，实际入选50例。
本发明组(实施例1注射剂组)27例，男20例，女7例，平均年龄65±3.5岁，病程3～3.5年，合并高血压15例，糖尿病12例，血脂异常14例；对照组23例，男18例，女6例，平均年龄66±7.0岁，病程3～3.5年，合并高血压11例，糖尿病9例，血脂异常10例；两组的性别、年龄、文化程度、婚姻、基本病情无显著差异(p＞0.05)。
治疗方法均采用药品说明书方法给药，每天1次，28d为1个疗程。
疗效评定所有患者治疗前及治疗后28d、3个月接受简易智力状态检查表(MMSE)、日常生活能力表(ADL)、脑卒中患者临床神经功能缺损表(DND)评估。
统计学方法数据采用SPSS10.0软件包处理。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，行方差分析和t检验。
结果治疗前两组各量表评分无显著性差异(p＞0.05)。治疗28d后本发明组的MMSE总分比治疗前提高3.12分，对照组提高1.30分，本发明组优于施捷因组，两组比较有显著性差异(p＜0.05)。3个月后本发明组MMSE总分比治疗前提高了0.91分，施捷因组下降1.78分，两组比较差异有显著性(p＜0.05)。本发明组ADL和DND在治疗后28d和3个月后均下降，与施捷因组比较差异有显著性意义(p＜0.01或p＜0.05)。
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物由除人以外的哺乳动物脑组织中提取的脑提取液、维脑路通及神经节苷脂组配而成，所述的神经节苷脂由除人以外的哺乳动物脑组织中提取得到，其中维脑路通与脑提取液中总氮含量的重量比为0.1～200，维脑路通与神经节苷脂中唾液酸的重量比为10～1600倍。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的药物组合物中维脑路通与脑提取液中总氮含量的重量比为10-100，该重量比更优选为70-90，最优选为80；药物组合物中维脑路通与与神经节苷脂中唾液酸的重量比40～1000倍，该重量比更优选为100-500，最优选为400。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述的除人以外的哺乳动物脑组织为猪、狗、牛、羊、鹿、马或兔的脑组织，优选牛脑组织。
4.权利要求1-3所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括脑提取液的制备，神经节苷脂提取液的制备，脑提取液、维脑路通和神经节苷脂混配，以及经后处理制得成品制剂的步骤。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的脑提取液的制备过程为取新鲜健康的动物脑组织，加0.5-2.5倍重量注射用水匀浆，加热至80-95℃，保持15-30分钟，冷却至酶解温度，调节至酶解pH值，加入脑重量0.1-1.5％的蛋白水解酶，进行一次酶解或二次酶解，一次酶解液或二次酶解液在4-8℃放置8-24小时后，经离心过滤处理，滤液用截留分子量为5000-10000的超滤膜超滤，超滤液为脑提取液，其总氮含量为0.1～10mg/ml；进一步的，上述脑提取液制备所述的一次酶解为在加入脑重量0.1-1.5％的蛋白水解酶后，在该蛋白水解酶酶解温度保持2-20小时，保持酶解pH值，然后加热至80-95℃并保持15-30分钟，得一次酶解液；所述蛋白水解酶优选使用胰蛋白酶，酶解温度为35-50℃，酶解温度优选为37～42℃，酶解pH值为7.5-8.5，酶解pH值优选为7.8～8.2；所述的一次酶解后的离心过滤处理为离心后分离上清液，将上清液过滤，滤液调pH值为3.5-4.5，加热至80-95℃，保持15-30分钟，在4-8℃放置8-24小时，离心后分离上清液，将上清液过滤，滤液调pH值为6.5-7.5，加热至80-95℃，保持15-30分钟，在4-8℃放置8-24小时，然后离心，上清液经过滤得滤液；所述的二次酶解过程为将一次酶解液降温至酶解温度，调节至酶解pH值，加入脑重量0.1-1.5％的蛋白水解酶，酶解2-20小时，保持酶解pH值，然后加热至80-95℃保持15-30分钟，得二次酶解液；所述蛋白水解酶优选使用胃蛋白酶，酶解适合温度为35-50℃，酶解温度优选为37～42℃，酶解适合pH值为2.5-3.5，酶解pH值优选为2.5-3.2；所述的二次酶解后的离心过滤处理为离心后分离上清液，将上清液过滤，滤液调pH值为8.0-10.0，加热至80-95℃，保持15-30分钟，在4-8℃放置8-24小时，离心后分离上清液，将上清液过滤，滤液调pH值为6.5-7.5，加热至80-95℃，保持15-30分钟，在4-8℃放置8-24小时，然后离心，上清液经过滤得滤液；所述的离心条件为4000转/分，离心时间为15-30分钟；所述的过滤为现有技术中通用的纸浆过滤或澄清板过滤；所述的蛋白水解酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶等现有技术中使用的蛋白水解酶；上述超滤膜优选为截留分子量为6000-10000的超滤膜，更优选截留分子量为8000的超滤膜。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的神经节苷脂提取液的制备过程为A)将动物脑组织加溶剂匀浆后过滤，滤渣用溶剂抽提提取，提取液与滤液合并后蒸干，得干燥物；B)将干燥物溶于溶剂中，向其中加入盐的水溶液提取分液；C)分液的上、下层液相分别用至少两种溶剂的混合水溶液洗涤，合并洗涤后的上层液相部分，减压浓缩，然后用预冷丙酮沉淀，干燥后得干燥物；D)将干燥物溶于至少两种溶剂的混合水溶液，层析柱分离，洗脱液浓缩后用预冷丙酮沉淀、分离，得到的沉淀经后处理，得到神经节苷脂提取液；所述的神经节苷脂提取液的制备过程进一步优选为A)将动物脑组织加3～4倍重量的丙酮匀浆后过滤，保留滤渣和滤液；滤渣用3～5倍重量的氯仿-甲醇(1～20∶1～20，V/V)混合液抽提三次，分别过滤；将上述滤液合并后在旋转蒸发器中37℃减压蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿-甲醇(2～30∶1～20，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/20～1/80体积的0.1mol/L的KCl溶液，室温下搅拌1小时，静置8～16小时后分液；C)分液后，上层液相用等体积的氯仿-甲醇-水(50～150∶5～40∶0.5～5，V/V/V)混合液洗涤，下层液相用等体积的氯仿-甲醇-水(1～10∶30～80∶35～85，V/V/V)混合液洗涤，合并两次洗涤后的上层液相部分，在37℃减压浓缩至初始体积的1/8～1/2，然后用-20℃预冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)将干燥物溶于的氯仿-甲醇-水(30～80∶10～50∶1～90，V/V/V)混合液，制成1～5％浓度的溶液，加入层析柱，调整流速5ml/分钟，用氯仿-甲醇-水(60～90∶15～40∶1～10，V/V/V)混合液10～30L洗脱，然后改用氯仿-甲醇-水(40～80∶20～50∶5～15，V/V/V)混合液8～15L洗脱，收集后洗脱液6～12L，减压浓缩后用3～5倍体积的-20℃预冷丙酮沉淀，-20℃静止2小时后倾去上层清液，余下部分在1000转/分下离心10分钟，得到的沉淀用适量丙酮洗2次，真空干燥，将干燥物溶于水得神经节苷脂提取液，该神经节苷脂提取液浓度为每1ml含唾液酸0.1～20mg；所述的神经节苷脂提取液的制备过程更进一步优选为A)将动物脑组织加3～4倍重量的丙酮匀浆后过滤，保留滤渣和滤液；滤渣用3～5倍重量的氯仿-甲醇(1∶1，V/V)混合液抽提三次，分别过滤；将上述滤液合并后在旋转蒸发器中37℃减压蒸干，得干燥物；B)干燥物溶于氯仿-甲醇(2∶1，V/V)混合液，然后向混合液中加入1/80体积的0.1mol/L的KCl溶液，室温下搅拌1小时，静置8～16小时后分液；C)分液后，上层液相用等体积的氯仿-甲醇-水(86∶14∶1，V/V/V)混合液洗涤，下层液相用等体积的氯仿-甲醇-水(3∶48∶47，V/V/V)混合液洗涤，合并两次洗涤后的上层液相部分，在37℃减压浓缩至初始体积的1/4，然后用-20℃预冷丙酮沉淀，真空干燥，得干燥物；D)将干燥物溶于的氯仿-甲醇-水(65∶25∶4，V/V/V)混合液，制成2.5％浓度的溶液，加入层析柱，调整流速5mL/分钟，用氯仿-甲醇-水(65∶25∶4，V/V/V)混合液20L洗脱，然后改用氯仿-甲醇-水(60∶35∶8，V/V/V)混合液12L洗脱，收集后洗脱液10L，减压浓缩后用4倍体积的-20℃预冷丙酮沉淀，-20℃静止2小时后倾去上层清液，余下部分在1000转/分下离心10分钟，得到的沉淀用适量丙酮洗2次，真空干燥，将干燥物溶于水得神经节苷脂提取液，该神经节苷脂提取液浓度为每1ml含唾液酸0.1～20mg。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤D)中所用的层析柱通过如下过程制备将硅胶颗粒过筛选60～80目的均匀颗粒，在110℃下干燥1小时，使其活化，然后用5倍柱体积的氯仿-甲醇(5～20∶0.5～3，V/V)混合液作为载体，将硅胶调成糊状，使其均匀分散后装入80×10cm的层析柱，即得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述氯仿-甲醇混合比为9∶1(V/V)。
9.根据权利要求4-8任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述的成品制剂的剂型为药剂学上可接受的剂型，比如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、小容量注射剂、大容量注射剂或冻干粉针剂等，优选为小容量注射剂、大容量注射剂或冻干粉针剂，最优选为小容量注射剂；所述的后处理是按照制备药剂学上可接受的剂型的常规方法进行。
10.权利要求1-3所述的药物组合物在制备治疗脑血栓、脑栓塞、脑痉挛等急慢性脑血管疾病，以及老年性痴呆、颅脑外伤、脑血管意外创伤及创伤后的神经系统后遗症及脑血管疾病所引起脑功能障碍等后遗症，治疗闭塞综合症、动脉硬化、血栓性静脉炎、毛细血管出血以及血管通透性升高引起的水肿等药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种药物组合物，含有芦丁经羟乙基化得到的维脑路通和从除人以外的哺乳动物脑组织中提取的脑提取液及含有从除人以外的哺乳动物脑组织中提取的神经节苷脂，药物组合物中含有维脑路通1－1000重量份，药物组合物中维脑路通重量为脑提取液中总氮含量的0.1～200倍，药物组合物中维脑路通重量为神经节苷脂中唾液酸的10～1600倍，还公开了药物组合物的制备方法及其用途，本药物组合物能抑制血小板的聚集，有防止血栓形成的作用，能调整和改善脑代谢，能促进神经病变、神经损伤修复、再生，有神经功能恢复和清除神经病变症状作用，用于治疗急慢性脑血管疾病，以及老年性痴呆、颅脑外伤、脑血管意外创伤及创伤后的神经系统后遗症及脑血管疾病所引起脑功能障碍等后遗症；用于治疗闭塞综合症、动脉硬化、血栓性静脉炎、毛细血管出血以及血管通透性升高引起的水肿。
文档编号A61P25/00GK1813797SQ200510130540
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月14日 优先权日2004年12月15日
发明者彭瑞平 申请人:阿尔贝拉医药控股(通化)有限公司