用于癌症免疫疗法的基于mage－3和ny－eso－1的多价疫苗的制作方法

专利名称：用于癌症免疫疗法的基于mage－3和ny－eso－1的多价疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型疫苗制剂，其含有(a)抗原成分，其含有修饰的MAGE-3抗原和NY-ESO-1抗原的组合，或其衍生物，和(b)佐剂。
尽管投入了大量的财力和人力资源，但癌症仍然是主要的死亡原因之一。
在本领域，描述癌症免疫疗法已经很多年了，包括那些给患者主动接种肿瘤相关抗原的疗法，其旨在提高这些个体中的免疫反应，该免疫反应识别和消灭癌细胞。针对该目的已描述了许多癌症抗原，包括MAGE家族抗原和NY-ESO-1抗原。
尽管这些疗法已经研究了很长时间，但实际上仍然需要改进策略以增强对抗原的免疫反应。这类策略包括将肿瘤抗原与有效的疫苗佐剂组合。
睾丸癌(CT)抗原是在多种癌症中优势表达的免疫原性蛋白，但其在除了配子形成组织(睾丸)之外的正常组织中并不表达(Kirkin，A等人，Cancer Investigation，2002，20(2)，222-236)。MAGE-3和NY-ESO-1被称为是原型CT抗原。CT抗原的家族也包括NY-ESO-1的成员、PRAME、GAGE家族、PAGE家族、BAGE、XAGE家族、LAGE、SSX家族的成员(其中SSX-1、-2也称为HOM-MEL-40、-4、-5)、SCP-1(也称为HOM-TES-14)、SART-1和SART-3、HOM-TES-85、精子蛋白Sp17、CTp11、TSP50、CT9/BRDT、TRAG-3(紫杉醇抗性相关基因-3)、OY-MS-4MAGE(参见Kirkin A.等人，CancerInvestigation，2002，20(2)，222-236中的表1)。
发明概述本发明涉及新型疫苗制剂，其含有(a)抗原成分，其含有修饰的MAGE-3抗原和NY-ESO-1抗原的组合，或其衍生物，和(b)免疫刺激佐剂，其含有以下成分的一种或多种明矾盐、胆固醇、水包油(oil-in-water)乳剂(O/W乳剂)、水包油乳剂低剂量型(low dose)、免疫刺激寡核苷酸、生育酚、脂质体、皂苷和脂多糖。
也提供了通过施用本发明的疫苗治疗个体的方法，并且在具体的实施方案中，该疫苗用于治疗黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)或膀胱癌。
本发明的一个方面提供了疫苗组合物，其含有(a)抗原成分，其含有SEQ ID NO1(如本文及WO 99/40188中所述)的MAGE3与截短的蛋白D载体蛋白的融合蛋白(MAGE3-蛋白D 1/3)，NY-ESO-1蛋白抗原，和(b)佐剂组合物，其含有包含胆固醇和QS21的脂质体结构，所述结构结合了包含至少一个未甲基化的寡核苷酸的免疫刺激寡核苷酸。
与仅包含一种由肿瘤细胞表达的抗原的疫苗相比，本发明的疫苗可以增强癌症疫苗的抗肿瘤作用。该增强的疫苗不但必然具有更大的患者覆盖范围(即，使得可用一种疫苗靶定更多的癌症)，而且使针对靶定的肿瘤发生的免疫反应更好。另外，本发明的疫苗可减少肿瘤逃避(evasion)或逃脱(escape)的机会，即使在接种后其中一种抗原的表达减弱了。
发明详述本发明涉及以下成分的具体组合(i)修饰的MAGE蛋白(MAGE3-蛋白D1/3)，如SEQ ID NO1中所示(ii)NY-ESO1基因产物的“免疫原性区域”，例如NY-ESO1蛋白；由包含NY-ESO1的I类(Class I)和/或II类(Class II)表位的蛋白C-末端部分组成或包含所述部分的蛋白、多肽或肽；含有该区域的重叠长肽；和/或特异的CD8肽。
(iii)免疫刺激佐剂，其含有以下成分的一种或多种明矾盐、胆固醇、水包油乳剂(O/W乳剂)、水包油乳剂低剂量型、免疫刺激寡核苷酸(如CpG)、生育酚、脂质体、皂苷(如QS21)和脂多糖(如MPL)。适于本发明用途的佐剂实例包括含有或由以下成分组成的那些a.CpG；O/W乳剂/3D-MPL/QS21(高剂量)；b.CpG/O/W乳剂低剂量型/3D-MPL/QS21；c.CpG/脂质体/QS21；和
d.CpG/3D-MPL/QS21/脂质体；e.包含QS21的ISCOMS；f.含有QS21和QS7的ISCOMS在一个实施方案中，佐剂为CpG/MPL/QS21/脂质体。
成分(i)和(ii)可与成分(iii)共同配制以便伴随施用，或每一种单独与成分(iii)一起配制以便伴随施用或顺序施用。
在本发明的一个实施方案中，成分(i)与含有CpG/MPL/QS21/脂质体的佐剂成分(iii)一起配制，且成分(ii)与含有ISCOMS(如包含QS21的ISCOMS或含有QS21和QS7的ISCOMS)的佐剂成分(iii)一起配制。因此，成分(i)和(ii)提供用于伴随施用或顺序施用。
成分(i)和(ii)可表达为单独的成分，或表达为融合蛋白。还可以考虑DNA/病毒载体的疫苗，其中疫苗含有编码成分(i)和(ii)的核酸，而成分(iii)为DNA疫苗的合适佐剂。
疫苗组合物包括MAGE-3衍生抗原。在本发明的一个实施方案中，衍生物是包含了连接到异源配偶体上的MAGE-3抗原的融合蛋白。蛋白可被化学缀合，或表达为重组的融合蛋白，从而相比于非融合蛋白允许在表达系统中产生增加的水平。因此融合配偶体有助于提供T辅助表位(免疫融合配偶体)，例如由人识别的T辅助表位，或有助于表达比天然重组蛋白更高产量的蛋白(表达增强子)。在一个实施方案中，融合配偶体既是免疫融合配偶体又是表达增强配偶体。
在本发明的一种形式中，MAGE-3免疫融合配偶体源自蛋白D，蛋白D为革兰氏阴性杆菌B型流感嗜血菌(Haemophilus influenza)(WO 91/18926)的表面蛋白。在一个实施方案中，蛋白D衍生物含有大约前1/3的蛋白，具体而言为大约N-末端前100-110个氨基酸。在一个实施方案中，蛋白D衍生物是脂质化的(lipidated)。在一个实施方案中，脂蛋白D融合配偶体的前109个残基包括在N-末端上，以提供具有附加的外源T细胞表位的疫苗候选抗原，并增强在大肠杆菌(E.coli)中的表达水平(因此也可作为表达增强子)。脂质尾巴确保了抗原向抗原呈递细胞的最佳呈递。
其他的MAGE-3融合配偶体包括流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。一般可利用N末端81个氨基酸，然而可利用不同的片段，前提是它们包括T-辅助表位。
在另一个实施方案中，MAGE-3免疫融合配偶体为称做LYTA的蛋白。在一个实施方案中，利用了分子的C末端部分。Lyta源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，后者合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，即酰胺酶LYTA，(其由lytA基因编码{Gene，43(1986)第265-272页}，是一种能特异地降解肽聚糖主链上某些键的自溶素。LYTA蛋白的C-末端结构域负责对胆碱或一些胆碱类似物如DEAE的亲和力。已经利用该特性来开发用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。已经描述了在其氨基酸末端包含C-LYTA片段的杂交蛋白的纯化{Biotechnology10，(1992)第795-798页}。如本文所用，本发明的一个实施方案利用了Lyta分子从残基178开始在C末端的重复部分。一种可利用的形式并入了残基188-305。
在本发明的一个实施方案中，修饰后的MAGE-3组合物包括WO99/40188中所公开的抗原，或免疫原性片段，如保留了引发识别MAGE蛋白的免疫反应能力的肽。本疫苗的一个特异抗原是MAGE-3多肽，其具有在Gaugler B.等人，J.Exp.Med.，1994，179，921(MAGE-3)中或SEQ ID NO1(蛋白D1/3-MAGE-3)(本文和WO99/40188中都有)中所列的氨基酸序列。所述免疫原性组合物可依照WO99/40188中公开的方法制备，或用本领域技术人员已知的任何常规技术制备。
NY-ESO-1是WO98/14464中所述的肿瘤相关抗原，WO98/14464的内容被全文引用到此公开内容中。在Chen YT等人，Proc Natl AcadSci USA 1997，941914-18；Scanlan等人，2004，Cancer Immunity，4，1.中也描述了NY-ESO-1。NY-ESO-1的蛋白和多核苷酸的序列由Genbank ACCESSION No.U87459，Version U87459.1(SEQ ID Nos 2和3)提供。
构成本发明一部分的疫苗佐剂包括含有以下成分的一种或多种的免疫刺激佐剂明矾盐、胆固醇、水包油乳剂(O/W乳剂)、水包油乳剂低剂量型、免疫刺激寡核苷酸、生育酚、脂质体、皂苷和脂多糖。在一个实施方案中，佐剂包含免疫刺激寡核苷酸、皂苷和任选脂多糖(LPS)的衍生物。任选地，本发明的疫苗还包含载体。
免疫刺激寡核苷酸包含未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)，并且在本领域被认为在经全身途径和粘膜途径施用时作为佐剂(WO96/02555，EP468520，Davis等人，J.Immunol.，1998，160(2)870-876；McCluskie和Davis，J.Immunol.，1998，161(9)4463-6)。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基元的缩写。在历史观察到BCG的DNA级分能发挥抗肿瘤作用。在进一步的研究中，源于BCG基因序列的合成寡核苷酸表现出能诱导免疫刺激作用(体外和体内均可)。这些研究的作者得出结论某些回文序列，包括中央CG基元，具有该活性。CG基元在免疫刺激中的中心作用在后面阐述于Krieg发表的文章Nature 374，P546，1995中。详细的分析已表明CG基元必须是在一特定序列背景中，并且这种序列是细菌DNA中常见的，但在脊椎动物DNA中罕见。该免疫刺激序列经常是嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中该二核苷酸CG基元是未甲基化的，但其他未甲基化的CpG序列已知是免疫刺激的并且可用于本发明中。在这六种核苷酸的某些组合中，存在一个回文序列。几个这些基元，或者是作为一个基元的重复，或者是不同基元的组合，可存在于相同寡核苷酸中。一个或多个这些含有寡核苷酸的免疫刺激序列的存在可激活各种免疫亚群，包括天然杀伤细胞(其产生干扰素γ并具有细胞溶解活性)和巨噬细胞(Wooldrige等人，Vol 89(no.8)，1977)。当制成疫苗时，CpG一般与游离抗原一起在游离溶液中施用(WO96/02555；McCluskie和Davis，见上文)，或与抗原共价缀合(PCT公开No.WO98/16247)，或与载体如氢氧化铝一起配制((肝炎表面抗原)Davis等人，见上文；Brazolot-Millan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1998，95(26)，15553-8)。
在本发明的一方面，用于本发明疫苗的寡核苷酸包含至少一个由至少三个或至少六个或更多核苷酸隔开的未甲基化的CpG基元。本发明的寡核苷酸一般为脱氧核苷酸。在一个实施方案中，寡核苷酸内核苷酸间为二硫代磷酸酯。在另一个实施方案中，核苷酸间为硫代磷酸酯键。可是，磷酸二酯和其他核苷酸间键在本发明的范围内，包括含有混合核苷酸间键合的寡核苷酸。在US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204中描述了生产硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法。
可用的寡核苷酸实例具有以下序列。该序列可包含硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键合。
OLIGO 1(SEQ ID NO4)TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)OLIGO 2(SEQ ID NO5)TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)OLIGO 3(SEQ ID NO6)ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACGOLIGO 4(SEQ ID NO7)TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)OLIGO 5(SEQ ID NO8)TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)备选的CpG寡核苷酸可包含上述序列，因为它们存在序列上无关紧要的缺失或添加。
本发明所用的CpG寡核苷酸可通过任何本领域公知的方法合成(如EP468520)。为方便起见，该寡核苷酸可使用自动合成仪合成。其长度通常为10到50个碱基。
本发明所用的寡核苷酸一般为脱氧核苷酸。在一个实施方案中，寡核苷酸内的核苷酸间键是二硫代磷酸酯，或更多的是例如硫代磷酸酯键，而磷酸二酯在本发明的范围内。预期含有不同核苷酸间键合的寡核苷酸，如混合的硫代磷酸酯磷酸二酯。能稳定寡核苷酸的其他核苷酸间键也可利用。
可用于本发明疫苗组合的皂苷包括源自皂皮树(QuillajaSaponaria Molina)的树皮的那些皂苷(称为Quil A)，和其级分，它们在US5,057,540和“Saponins as vaccine adjuvant”，Kensil，C.R.，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)1-55；和EP0362279B1中阐述。合适的Quil A级分的实例为QS21、QS7和QS17。溶血皂苷QS21和QS17(Quil A的HPLC纯化级分)被称为强效的全身性佐剂，且它们的生产方法在U.S.Pat.No.5,057,540和EP0362279B1中公开。在这些参考文献中也阐述了QS7(Quil A的非溶血性级分)的用途，QS7作为全身性疫苗的强效佐剂。QS21的用途在Kensil等人，(1991，J.Immunology vol 146，431-437)中进一步加以阐述。QS21和聚山梨醇酯或环糊精的组合也是为人熟知的(WO99/10008)。
包含Quil A级分的被称为免疫刺激复合物(ISCOMS)的颗粒结构是溶血性的，并且已被用于疫苗生产(Morein，B.，EP0109942B1)。已经报道这些结构具有佐剂活性(EP0109942B1；WO96/11711)。QS21和聚山梨醇酯或环糊精的组合也是为人熟知的(WO99/10008)。在WO96/33739和WO96/11711中阐述了含有Quil A级分如QS21和QS7的颗粒佐剂系统。
在本发明的一个实施方案中，佐剂成分包括包含QS21的ISCOM。在另一个实施方案中，佐剂成分包括含有QS21和QS7的ISCOMS。
本发明的佐剂组合还可包括载体，所述载体可与佐剂简单地混合在一起，或者佐剂与颗粒载体实体结合以增强组合的佐剂活性。例如，全身性疫苗可含有载体分子。示例性的载体包括无机盐(例如，但不限于铝盐或钙盐)、脂质体、ISCOMs、乳剂(水包油、油包水、水包油包水)、聚合物(例如，但不限于聚乳酸、聚乙醇酸、聚磷腈(polyphosphazine)、聚氨基酸、藻酸盐、脱乙酰壳多糖)或微粒。本发明的疫苗还包含抗原，所述抗原可与CpG-载体复合物结合，或不与CpG-载体复合物结合。在这种情况下，抗原可以是游离悬浮液或与单独的载体结合。
构成本发明部分的皂苷可以以微团的形式分离，或者是大的有序结构如ISCOMs(EP0109942B1)或当用胆固醇和脂质制备时脂质体的形式(“DQ”，阐述于WO96/33739)，或者是水包油乳剂(WO95/17210)的形式。皂苷可以与金属盐结合，如氢氧化铝或磷酸铝(WO98/15287)。可选择地是，皂苷可与颗粒载体如脱乙酰壳多糖结合。皂苷也可以是干燥状态的，如粉末。处于施用于疫苗接种者粘膜表面的形式的最终制剂实际上是溶血性的。皂苷可以通过直接连接或和相同颗粒载体分子互作与或不与抗原物理结合(GB9822712.7；WO98/16247)。
可用于本发明的佐剂或疫苗中的CpG和皂苷本身是分开的或结合的。例如，CpG和皂苷可以是游离悬浮液，或经载体(例如，颗粒载体如氢氧化铝)或通过阳离子脂质体或ISCOM结合在一起。
根据本发明的佐剂组合的一个实例是由在两个邻近的CG基元之间包含至少3个或至少6个核苷酸的一个或多个CpG寡核苷酸以及QS21和选自水包油乳剂或DQ的颗粒载体组成的。脂多糖可能是二或一磷酰脂质衍生物。脂多糖可能是3脱O-酰基(de-O-acylated)的，具体来说为3脱O-酰基一磷酰脂质A。在一个实施方案中，佐剂组合包含与QS21和选自水包油乳剂或DQ的颗粒载体混合的CpG2006(SEQ ID NO4)或CpG1758(SEQ ID NO2)或CPG1826(SEQID NO1)。因此，本发明的疫苗可以，例如，包含这样的佐剂组合和抗原。本发明的疫苗在以全身途径方式施用于个体后可用于产生全身性免疫反应。
在WO00/62800中阐述了可构成本发明疫苗部分的示例性佐剂组合物。
本发明的佐剂组合可包括基于油的乳剂。油性乳剂佐剂已被认识很多年了，包括关于弗氏完全和不完全矿物油性乳剂佐剂方面的工作。从那时起就进行许多工作来设计这些强效但反应原性的佐剂制剂的稳定和良好耐受性的替代品。
已经阐述了许多单一的或多相的乳剂系统。提示水包油乳剂佐剂本身可用作佐剂组合物(EP0399843B)，而且水包油乳剂与其他活性试剂的组合也被描述为疫苗佐剂(WO95/171210；WO98/56414；WO99/12565；WO99/11241)。还阐述了其他油性乳剂佐剂，诸如油包水乳剂(US5,422,109；EP0480982B2)和水包油包水乳剂(US5,424,067；EP0480981B)。
用于本发明的油性乳剂佐剂可以是天然的或合成的，且可以是无机的或有机的。无机油和有机油的实例对本领域的技术人员来说是显而易见的。
为了使任一种水包油组合物都适于人类施用，乳剂系统的油相可含有可代谢油。术语可代谢油的意思在本领域是公知的。可代谢的被定义为“能被代谢作用转化的”(Dorland’s Illustrated MedicalDictionary，W.B.Sanders Company，25thedition(1974))。该油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油，这些油对受体是无毒的并且能被代谢作用转化。坚果(如花生油)、种子和谷物是植物油的常用来源。合成油也是本发明的一部分，并且可包括商品油如NEOBEE等。角鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是被发现在鲨鱼肝油中大量存在而在橄榄油、麦胚油、米糠油和酵母中量较少的不饱和油，并且是适用于本发明的一种油。角鲨烯是可代谢油，这依据了角鲨烯是胆固醇生物合成过程中的中间体的事实(Merck index，10thEdition，entry no.8619)。
用于本发明的油性乳剂的实例是水包油乳剂，且具体而言是水包角鲨烯乳剂。
另外，本发明的油性乳剂佐剂含有抗氧化剂，其可能是油性α-生育酚(维生素E，EP0382271B1)。
WO95/17210和WO99/11241公开了基于角鲨烯、α-生育酚和TWEEN 80的乳剂佐剂，其任选地与免疫刺激剂QS21和/或3D-MPL一起配制。WO99/12565公开了通过将固醇加入到油相中而改进这些角鲨烯乳剂。另外，可将甘油三酯如甘油三辛酸酯(C27H50O6)加入互油相以稳定乳剂(WO98/56414)。
在稳定的水包油乳剂中发现的油滴大小可小于1微米，可在基本上30-600纳米范围内，例如直径基本上约30-500纳米，和例如直径基本上150-500纳米，和具体地直径为约150纳米，如按光子相关光谱学所测量的。在这点上，数目上80％的油滴应该在这些示例的范围内，或例如数目上90％以上或95％以上的油滴应该在限定的尺寸范围内。按照常规，本发明的油性乳剂中存在的成分的量为2-10％的油如角鲨烯，且如果有α生育酚，则为2-10％，以及0.3-3％的表面活性剂如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。油α生育酚的比率可等于或小于1，因为这样提供了更稳定的乳剂。Span 85也可以以约1％的水平存在。在某些情况下，本发明的疫苗还包含有稳定剂可能是有利的。
生产水包油乳剂的方法是本领域技术人员熟知的。一般来说，该方法包括将油相与表面活性剂如PSB/TWEEN 80TM溶液混合，然后用匀浆器进行匀浆，本领域技术人员很清楚，包括将混合物两次通过注射器针头的方法将会适于将小体积液体匀浆。同样地，本领域技术人员可修改在微流化床装置(microfluidiser)(M110S微流体机器，最多为50个通道，在6巴的最大压力输入下2分钟的时间段(输出压力为约850巴))中的乳化方法以产生更小体积或更大体积的乳剂。这种修改可通过常规实验完成，所述实验包括测量所得乳剂，直到得到具有所需直径的油滴的制剂。
本发明的疫苗可通过全身或肠胃外途径施用，如肌内、皮内、经皮、皮下、腹膜内或静脉内施用。
本发明的全身性疫苗制剂以经肌内、腹膜内、皮内、经皮、静脉内或皮下施用所述疫苗的方式可用以保护或治疗易患或患有癌症的哺乳动物。本发明的疫苗可用来治疗患有非小细胞肺癌(NSCLC)、黑素瘤或膀胱癌的个体。
因此，提供了一种用于在个体中诱导针对MAGE-3和NY-ESO-1的免疫反应的方法，包括给个体施用依据本发明的疫苗。
用于本发明佐剂的皂苷的量可以为每剂1-1000微克，例如每剂1-500微克，或例如每剂1-250微克，或例如每剂1-100微克。所以，CpG∶皂苷的比率(w/w)在1∶1000至1000∶1的范围内，且一般在1∶100至100∶1的范围内，或例如在1∶10至1∶1或1∶1至10∶1的范围内。在一个实施方案中，比率为1∶1、4∶1或10∶1。
本发明佐剂或疫苗中的CpG或免疫刺激寡核苷酸的量一般很小，但取决于疫苗制剂，可为每剂1-1000微克，例如每剂1-500微克，或例如每剂1-100微克。
在New Trends and Developments in Vaccines，Voller等人编，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978中全面地阐述了疫苗制剂。
因此，本发明提供了预防个体感染选自NSCLC、黑素瘤和膀胱癌的疾病的方法，该方法包括通过所述个体的全身途径施用基本上按本文所述的组合物。
用于本发明组合的合适的药学可接受的赋形剂的实例包括水、磷酸缓冲盐水、等渗缓冲溶液。
任选地，疫苗佐剂成分还可包括LPS衍生物，如3D-MPL。此类佐剂实例包括CpG、3D-MPL和QS21的组合(EP0671948B1)，含有CpG、3D-MPL和QS21的水包油乳剂(WO95/17210，WO98/56414)，或与如本文所述的CpG寡核苷酸组合的与其他载体一起配制的3D-MPL(EP0689454B1)。
本发明的佐剂组合可包括至少一个肠杆菌脂多糖来源的佐剂。
早就知道肠杆菌脂多糖(LPS)是免疫系统的强效刺激物，然而它在佐剂中的用途已经被其毒性作用所限制。通过去除还原末端的葡糖胺上的核心糖基和磷酸盐得到的LPS的非毒性衍生物----一磷酰脂质A(MPL)已由Ribi等人阐述(1986，Immunology andImmunopharmacology of bacterial endotoxins，Plenum Publ.Corp.，NY，p407-419)，并具有如下结构
其他的解毒的MPL由去除二糖主链3位上的酰基链生成，并称为3-O-脱酰基一磷酰脂质A(3D-MPL)。通过GB 2122204B中所教导的方法能纯化和制备3D-MPL，该参考文献也公开了二磷酰脂质A及其3-O-脱酰基变体的制备。3D-MPL的一种形式的实例是具有直径小于0.2μm的小颗粒大小的乳剂形式，其生产方法在WO94/21292中公开。含有一磷酰脂质A和表面活性剂的水性制剂在WO98/43670A2中阐述。
可在本发明的佐剂组合中配制的细菌脂多糖来源的佐剂可从细菌来源纯化和加工，或另一种选择是对其进行合成。例如，纯化的一磷酰脂质A在Ribi等人1986中(见上文)阐述，而来源于沙氏门菌属物种(Salmonella sp.)的3-O-脱酰基一磷酰或二磷酰脂质A在GB2220211和US4912094中阐述。其他纯化和合成的脂多糖已都得以阐述(WO98/01139；US6,005,099和EP0729473B1；Hilgers等人，1986，Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4)392-6；Hilgers等人，1987，Immunology，60(1)141-6；和EP0549074B1)。细菌脂多糖佐剂可能是US6,005,099和EP0729473B1中所阐述的3D-MPL和β(1-6)葡糖胺二糖。
因此，可用于本发明的LPS衍生物是结构上与LPS或MPL或3D-MPL类似的那些免疫刺激剂。在本发明的另一方面，LPS衍生物可为酰基化单糖，其是上述MPL结构的亚部分。
二糖佐剂的一个实例为如下式的纯化的或合成的脂质A 其中R2可以是H或PO3H2；R3可以是酰基链或β-羟基肉豆蔻酰基(β-hydroxymyristoyl)或具有如下式的3-酰氧基酰基(3-acyloxyacyl)残基 其中 并且其中X和Y的值为0至最大约20一种示例性的疫苗制剂含有0.5ml佐剂组合物，该佐剂组合物包括水包油乳剂，其包含，油相中约12mgα-生育酚、约11mg角鲨烯和约5mg tween 80；且在水相中50μg 3D-MPL和50μg QS21和500μgCpG。另一个示例性的疫苗制剂含有水包油乳剂，其包含，油相中约2mgα-生育酚、约2mg角鲨烯和约1mg tween 80；且在水相中50μg 3D-MPL和50μg QS21。
在另一个实施方案中提供了一种疫苗组合物，其含有修饰的MAGE蛋白，如WO9940188中所述；NY-ESO1基因产物的“免疫原性区域”，如NY-ESO1蛋白；由包含NY-ESO1的I类和/或II类表位的蛋白C末端部分组成或包含所述部分的蛋白、多肽或肽；含有该区域的重叠长肽；和/或特异的CD8肽；含有明矾盐、水包油乳剂(O/W乳剂)的一种或多种的免疫刺激佐剂。
序列表SEQID NO 1MAGE3/蛋白D 1/3多肽序列Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu1 5 10 15Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys20 25 30Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro35 40 45Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala phe Ala Gln Gln Ala Asp50 55 60Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val65 70 75 80Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe85 90 95Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr100 105 110Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met115 120 125Asp Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu Glu130 135 140Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala Thr145 150 155 160Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val Thr165 170 175Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser Pro180 185 190Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp Ser195 200 205Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr210 215 220Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys Val225 230 235 240Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro245 250 255Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln Tyr260 265 270Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu Val275 280 285Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr Ile290 295 300Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn305 310 315 320Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile325 330 335Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu Leu340 345 350Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly Asp355 360 365Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu370 375 380Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp385 390 395 400Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His His405 410 415Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu His420 425 430Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Thr Ser Gly Gly His His His435 440 445His His His450
SEQID NO 2，NY-ESo-1多肽序列MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR″SEQ ID NO 3NY-ESO-1多核苷酸序列1 atcctcgtgg gccctgacct tctctctgag agccgggcag aggctccgga gccatgcagg61 ccgaaggccg gggcacaggg ggttcgacgg gcgatgctga tggcccagga ggccctggca121 ttcctgatgg cccagggggc aatgctggcg gcccaggaga ggcgggtgcc acgggcggca181 gaggtccccg gggcgcaggg gcagcaaggg cctcggggcc gggaggaggc gccccgcggg241 gtccgcatgg cggcgcggct tcagggctga atggatgctg cagatgcggg gccagggggc301 cggagagccg cctgcttgag ttctacctcg ccatgccttt cgcgacaccc atggaagcag361 agctggcccg caggagcctg gcccaggatg ccccaccgct tcccgtgcca ggggtgcttc421 tgaaggagtt cactgtgtcc ggcaacatac tgactatccg actgactgct gcagaccacc481 gccaactgca gctctccatc agctcctgtc tccagcagct ttccctgttg atgtggatca541 cgcagtgctt tctgcccgtg tttttggctc agcctccctc agggcagagg cgctaagccc601 agcctggcgc cccttcctag gtcatgcctc ctcccctagg gaatggtccc agcacgagtg661 gccagttcat tgtgggggcc tgattgtttg tcgctggagg aggacggctt acatgtttgt721 ttctgtagaa aataaaactg agctacgaaa aa
权利要求
1.一种疫苗组合物，其包括(a)抗原成分，其含有修饰的MAGE-3抗原和NY-ESO-1抗原的组合，或其衍生物，和(b)佐剂成分，其包括含有以下成分中的一种或多种的免疫刺激佐剂明矾盐、胆固醇、水包油乳剂(O/W乳剂)、水包油乳剂低剂量型、免疫刺激寡核苷酸、生育酚、脂质体、皂苷、ISCOMS和脂多糖。
2.一种如权利要求1所请求保护的疫苗，其中所述佐剂成分包括免疫刺激寡核苷酸和皂苷的组合。
3.一种如权利要求1或2所请求保护的疫苗，其中所述修饰的MAGE-3抗原具有如SEQ ID NO 1中所述的多肽序列。
4.一种如前述任一项权利要求所请求保护的疫苗，其中所述NY-ESO-1抗原具有如SEQ ID NO 2中所述的多肽序列。
5.一种如前述任一项权利要求所请求保护的疫苗，其中所述皂苷是在包含胆固醇的脂质体中制备的QS21。
6.一种如前述任一项权利要求所请求保护的疫苗，其中所述免疫刺激寡核苷酸为CpG。
7.一种如前述任一项权利要求所请求保护的疫苗组合物，其还含有3-脱O-酰基一磷酰脂质A。
全文摘要
本发明提供了用于治疗癌症抗原的新型疫苗制剂。该疫苗含有修饰的MAGE－3抗原、NY－ESO－1抗原和佐剂，该佐剂包含皂苷和免疫刺激寡核苷酸。
文档编号A61K39/39GK1980691SQ200580013797
公开日2007年6月13日 申请日期2005年5月2日 优先权日2004年5月4日
发明者C·E·M·布鲁克, V·布里查德, R·M·帕尔曼捷, M·米德尔斯 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司