专利名称：：抗hpv16和hpv18和至少一种另外的选自hpv31、45或52的hpv类型的疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗人乳头状瘤病毒疫苗发明背景乳头瘤病毒为小DNA肿瘤病毒，具有高度物种特异性。迄今为止，有记载的个体人乳头状瘤病毒(HPV)基因型已超过100种。HPV通常对皮肤(例如HPV-1和-2)或粘膜表面(例如HPV-6和-11)有特异性，一般会引起引起持续数月或数年良性肿瘤(疣)。这类良性肿瘤可能会引起患病苦恼，但是除了少数例外，不会对生命造成威胁。某些HPVs也与癌症有关，被称为致癌HPV类型。在HPV和人类癌症之间最有力肯定的联系是存在于HPV-16和HPV-18与子宫颈癌之间的联系。在发展中国家，子宫颈癌是最常见的恶性肿瘤，世界上每年新增大约500,000新病例。与癌症有特殊联系的其它HPV有类型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82、26、53和66。已经有人提出，HPV病毒样颗粒(VLP)有可能成为用于治疗HPV的疫苗。已经证实使用VLP的二价疫苗可有效地预防年轻女性感染HPV16和18。仍然需要抵抗多种(例如＞2)HPV类型的疫苗。本发明满足了这一需要。发明概述一方面，本发明涉及免疫原性组合物，包含来自HPV16和18和至少一种其它HPV癌症类型的VLP，其它癌症类型选自HPV类型31、45和52，其中至少一种其它癌症类型的VLP的剂量少于HPV16或18的剂量。另一方面，本发明涉及包含来自HPV16和至少一种其它HPV癌症类型的VLP的免疫原性组合物，其它的癌症类型选自HPV类型31和52，其中至少一种其它癌症类型的剂量少于HPV16的剂量。在相关的方面，本发明涉及包含来自HPV18和HPV45的VLP的免疫原性组合物，其中HPV45VLP的剂量少于HPV18的剂量。本发明进一步涉及如上定义的免疫原性组合物与助剂和/或载体的组合。本发明进一步涉及包含如上定义的免疫原性组合物与可药用赋性剂的疫苗。本发明进一步涉及预防HPV感染和/或疾病的方法，包括给药需要的个体如上定义的组合物或疫苗。本发明进一步涉及制备如上定义的免疫原性组合物的方法，包括混合来自HPV16和18与至少一种其它HPV癌症类型的VLP，所述其它癌症类型选自HPV类型31、45和52，其中至少一种其它癌症类型的VLP剂量少于HPV16或18的剂量。本发明的上述方面也可应用比VLP更优的HPV病毒壳微体。详细说明我们已经出人意外地发现HPV16和18VLP可提供抗某些其他HPV癌症类型即HPV31、HPV45和HPV52的感染和/或疾病的交叉保护作用。在本文实施例中提供数据。交叉保护作用可认为是由包含一种抗不同HPV类型引起的感染(偶然或持续)和/或疾病的HPV类型的疫苗提供的保护作用。偶然和持续感染的定义如Harper等人在LancetpaperVol364，issue9447，November2004，pages1757-1765中的描述。交叉保护作用可通过测定疫苗功效(V.E.)来评价，其中V.E.为与给定类型的安慰剂组相比，疫苗提供的抗感染保护作用的％增加。因此，包含HPV16和18VLP的HPV疫苗可与低于在不存在HPV16和18VLP下所需剂量的其它(非HPV16/18)癌症类型VLP(31、45或52)制剂，该剂量仍可以获得相同的抗那些其它类型的偶然和/或持续HPV感染的保护性应答。当抗原总量可能受到限制时例如物理、化学或调节限制，多价疫苗方案(scenario)中其它癌症类型VLP剂量的减少，在不显著影响由那些其它类型引起的保护作用下，可能是有利的。对于给定量的抗原而言，也允许制备更多剂量的疫苗，且有可能地降低总疫苗费用。本文中的VLP剂量为适宜VLP的总量，以重量测定。换言之，为了获得抗偶然和/或持续感染和/或疾病的相同保护性应答，与在不存在这种类型的16和/或18VLP下需要的水平相比，与HPV16和/或HPV18VLP联合使用需要的(非HPV16/HPV18)‘其它癌症类型‘VLP的剂量可减少。因此，本发明涉及包含来自HPV16和18和至少一种其它HPV癌症类型的VLP的免疫原性组合物，其它癌症类型选自HPV类型31、45和52，其中至少一种其它癌症类型VLP的剂量少于HPV16或18的剂量。在另一方面，本发明涉及包含来自HPV16和18和至少一种其它HPV癌症类型的免疫原性组合物，其它癌症类型选自HPV类型31、45和52，其中至少一种其它癌症类型VLP的剂量少于在不存在HPV16和18VLP下需要的剂量，该剂量可以产生相同的抗该其它类型的偶然和/或持续HPV感染的保护作用。在一个方面，(非HPV16、18)其它癌症类型VLP的剂量足够提供抗该类型的偶然和/或持续感染的保护作用，在本发明的一个方面，保护作用至少抗偶然感染。在本发明的一个方面，本发明的组合物适于保护人类患者免于感染和/或疾病。通过人类试验例如在本文实施例中描述的那些试验来确定适宜的剂量。抗给定HPV类型例如HPV16、18、31、45或52的偶然和/或持续感染的保护作用指，例如适宜地对50％的已接种人群提供抗那种类型感染的保护作用，在本发明的一个方面，提供60％保护作用，在另一方面，提供70％保护作用，在进一步地方面，提供80％保护作用，在进一步的方面，提供90％保护作用，在进一步的方面，提供95％保护作用，在进一步的方面，提供96％保护作用，在进一步的方面，提供97％保护作用，在进一步的方面，提供98％保护作用，在进一步的方面，提供99％保护作用，且在还进一步的方面，提供100％保护作用。适宜地，在至少6个月的时期内评价这种保护作用，例如至少9个月，至少1年，至少18个月，适宜地至少2年或超过2年。在本发明的一个方面，可看到抗由HPV16和/或HPV18引起的感染或疾病的保护作用，在本发明的另一个方面，可看到抗由HPV16和HPV18引起的感染和/或疾病的保护作用。可通过分析已接种个体中存在的HPV种类来评价对感染的预防作用，例如通过PCR分析和/或杂交技术，例如在W003014402和W09914377中描述的那些，将其引入本文作为参考。当本发明的免疫原性组合物包含HPV16和18VLP时，非HPV16/18癌症类型为类型31或45或52或其组合。在一个方面，本发明的免疫原性组合物包含来自HPV16、18、31和45的VLP。在一个方面，本发明的免疫原性组合物包含来自HPV16、18、31和52的VLP。在一个方面，本发明的免疫原性组合物包含来自HPV16、18、45和52的VLP。在一个方面，本发明的免疫原性组合物包含来自HPV16、18、31、52和45的VLP。当存在两种或多种其它癌症类型VLP(例如31和45、31和52、45和52)时，这些其它类型的至少一种的剂量少于HPV16或HPV18的剂量。在一个方面，HPV31的剂量少于HPV16的剂量。在一个方面，HPV52的剂量少于HPV16的剂量。在一个方面，HPV45的剂量少于HPV18的剂量。适宜地，如上定义的免疫原性组合物提供抗HPV16、HPV18和一种或多种上述所列的其它HPV类型(31、45或52)引起的偶然感染和/或持续感染和/或疾病的保护作用，例如抗偶然感染的保护作用。当本发明的免疫原性组合物包含HPV16VLP，而不包含HPV18VLP时，适宜的非HPV16/18VLP癌症类型为类型31和/或类型52。当本发明的免疫原性组合物包含HPV18VLP时，而不包含HPV16VLP时，适宜的非HPV16/18VLP癌症类型为类型45。在本发明的一个方面，所述组合物包含HPV16和18VLP与HPV31和HPV45VLP中一种或两种的组合。在本发明的一个方面，组合物至少包含HPV16VLP与HPV31VLP的组合。本发明的组合物除了包含减少剂量的VLP，还可包含任意适宜剂量的其它HPVVLP。例如，本发明的组合物可包含另外的″高危″癌症类型，例如HPV33、35、39、51、56、58、59、66或68中的一种或多种。在一个方面，组合物可包含另外的称为″生殖器疣″类型，例如HPV6和/或11，或称为″皮肤″型，例如HPV5和/或8。在一个方面，另外的VLP以与HPV16和/或HPV18相同剂量或高于其剂量存在。在本发明的一个方面，所述组合物包含HPV39和/或HPV51VLP，且这些中至少一种的剂量少于HPV16和/或HPV18的剂量。在一个方面，选择任意其它的VLP的用量，以提供相同程度的抗另外类型的感染或疾病的保护作用。本发明的某些组合物，个别如下，包含下述剂量的VLP适宜地，在本发明的组合物中的HPVVLP之间没有显著地生物学相关影响(interference)，如此，本发明组合的VLP疫苗能够提供有效地抗疫苗中描述的每种HPVVLP类型感染的保护作用。适宜地，当单独测定时，组合物抗给定的VLP类型的免疫应答为对相同VLP类型免疫应答的50％，优选100％或基本上100％。对HPV16和HPV18VLP组分的应答而言，本发明的组合疫苗优先刺激免疫应答，其为由组合的HPV16/HPV18VLP疫苗提供的应答的至少50％。适宜地，本发明的疫苗产生的免疫应答为其中每种VLP类型的保护效果仍能看见的程度。适宜地，所述免疫应答可通过使用标准技术例如ELISA的抗体应答和本文描述的临床试验来测定。在一个方面，本发明的组合物不包含热激蛋白或其片段。在一个方面，本发明的组合物不包含HPVL2蛋白或多肽。在另一个方面，本发明的组合物包含HPVL2蛋白或多肽。HPVVLP和制备VLP的方法是本领域众所周知的。典型地，VLP由病毒的L1和任选地L2结构蛋白构成，参见例如W09420137、W09629413和W09405792。任意适宜的HPVVLP都可用于本发明，例如L1或L1+L2VLP。VLP形成可通过标准的技术例如电(子显微)镜技术和动态激光散射来评价。在本发明的一个方面，VLP为仅含L1的VLP。VLP可包含全长Ll蛋白。在本发明的一个方面，用于形成VLP的L1蛋白为截短的L1蛋白。截短的HPVL1蛋白公开于，例如US6361778，将其引入本文作为参考。在一个方面，截短除去细胞核定位信号。在进一步的方面，截短为C末端截短。在进一步的方面，C末端截短除去少于50个氨基酸，适宜地优选少于40个氨基酸。适宜地，HPV16L1序列开始于第二个甲硫氨酸密码子，例如在下述序列中显示的，或在其它HPV类型的类似的位置。在一个方面，当VLP为HPV16VLP时，C末端截短从HPV16L1序列中除去34个氨基酸。在一个方面，当VLP为HPV18VLP时，C末端截短从HPV18L1序列中除去35个氨基酸。在一个方面，HPV16序列为下述序列MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKI60LVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGH120PLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAV180NPGDCPPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSE240PYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMV300TSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTNF360KEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRF420VTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQ471HPV16序列也可以为公开于W09405792或US6649167中的那些，例如，适宜地被截短。适宜的截短为在上述显示序列的等同位置截短，如通过序列比较来评价。在一个方面，HPV18序列为下述序列MALWRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQ60DIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDNSIYNPETQRLVWACVGVEIGRGQPLGVGLSGH120PFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPL180SQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSAD240PYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPPSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIV300TSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATK360FKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYR420FVQSVAITCQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQ472另一种HPV18序列在W09629413中公开，其可适宜地被截短。适宜的截短为在上述显示序列的等同位置截短，如通过序列比较来评价。其它的HPV16和HPV18序列是本领域已知的，可适用于本发明。也可进行HPV31、HPV45和HPV52的适宜截短，适宜的除去上述那些的L1蛋白等同的C末端部分，如通过序列对比来评价。截短的L1蛋白公开于例如W09611272和US6066324中，本文将其引入作为参考。在一个方面，截短的L1蛋白适宜地为功能性L1蛋白衍生物，其能产生免疫应答(如果需要，适当加入助剂)，所述免疫应答能够识别由全长L1蛋白和/或从L1蛋白获得的HPV型组成的VLP。本发明的VLP也可含有其它类型的功能性蛋白衍生物，包括全长突变体或者截短的HPVL1蛋白，例如缺失、置换或插入突变体。L1蛋白或衍生物也可以是融合蛋白，例如L1蛋白与L2蛋白或早期蛋白的融合蛋白。L1蛋白或功能性蛋白衍生物能够形成VLP，而且VLP的形成可通过例如电子显微镜术和动态激光散射等标准技术进行评价。VLP可用任何合适的细胞底物例如酵母细胞或昆虫细胞例如杆状病毒细胞制备，而且VLP的制备技术已为本领域所熟知，例如为WO9913056和US6245568及其中引用的参考文献中的技术，本文将其全部内容引入作为参考。在一个方面，VLP通过解组装和重新组装技术来制备，其可提供更稳定和/或更均质的乳头瘤病毒VLP。例如McCarthy等人，1998″QuantitativeDisassemblyandReassemblyofHumanPapillomavirusType11ViruslikeParticlesinVitro″J.Virology72(1)33-41，其中描述了从昆虫细胞纯化的重组L1HPV11VLP的解组装和重新组装以获得VLP的均质制剂。WO9913056和US6245568也描述了制备HPVVLP的解组装和重新组装方法。在一个方面，本发明的HPVVLP可如W09913056或US6245568中的描述制备。本发明的VLP可以与助剂或免疫刺激剂混合，所述免疫刺激剂例如，但不限于任何来源的解毒脂质A和脂质A的无毒衍生物，皂角苷和其它能够刺激TH1型应答的试剂。长期以来，已知肠细菌脂多糖(LPS)是免疫系统的一种有效的刺激物，虽然其在助剂中的应用由于其毒性效应而一直被减少。Ribi等人(1986，ImmunologyandImmunopharmacologyofbacterialendotoxins，PlenumPubl.Corp.，NY，第407-419页)已经描述了通过从还原末端葡糖胺除去核心糖基团和除去磷酸酯而产生的LPS的一种无毒衍生物单磷酰脂质A(MPL)，其具有以下结构一种进一步解毒形式的MPL通过从二糖主链的3位除去酰基链而产生，称之为3-O-去酰化单磷酸类脂A(3D-MPL)。它可以用GB2122204B中教导的方法来纯化和制备，其也公开了二磷酰基脂质A及其3-O-去酰化变体的制备。在一个方面，3D-MPL为直径小于0.2μm的小粒径的乳剂形式，其生产方法在WO94/21292中公开。在WO9843670A2中描述了包含单磷酰脂质A和表面活性剂的水性制剂。在本发明组合物中制备的细菌脂多糖衍生的助剂可以从细菌来源纯化和加工，或者它们可以是合成的。例如，在Ribi等1986(参见上文)中描述了纯化单磷酸类脂A，而在GB2220211和US4912094中描述了来源于沙门氏菌(Salmonellasp.)的3-O-去酰化单磷酰脂质A或二磷酰基脂质A。其它纯化的和合成的脂多糖已有描述(Hilgers等人，1986.Int.Arch.Allergy.Immunol.，79(4)392-6；Hilgers等人，1987，Immunology，60(1)141-6；和EP0549074B1)。在一个方面，细菌脂多糖助剂为3D-MPL。因此，可以用于本发明的LPS衍生物是在结构上与LPS或MPL或3D-MPL类似的那些免疫刺激剂。在本发明的另一方面，LPS衍生物可以是酰化单糖，它是MPL上述结构的亚部分。皂角苷在文献Lacaille-Dubois，M和WagnerH.(1996，Areviewofthebiologicalandpharmacologicalactivitiesofsaponins.Phytomedicine第2卷，第363-386页)中有教导。皂角苷是在植物界和海洋动物界中广泛分布的类固醇或三萜类糖苷。皂角苷以在水中形成胶体溶液以及沉淀胆固醇而著称，所述胶体溶液振摇时可产生泡沫。当皂角苷接近细胞膜时，其可在膜上形成导致细胞膜破裂的孔状结构。例如，红细胞的溶解就是这种现象的一个实例，这是皂角苷的一个确定的特性，但并不是其全部的特性。已知皂角苷为用于系统给药的疫苗中的助剂。本领域已经对各种皂角苷的助剂和溶血活性进行了广泛深入的研究(Lacaille-Dubois和Wagner，参见上文)。在US5,057,540和“Saponinsasvaccineadjuvants”，Kensil，C.R.，CritRevTherDrugCarrierSyst，1996，12(1-2)1-55；和EP0362279B1中描述了QuilA(来源于南美皂树QuillajaSaponariaMolina的树皮)及其级分。包含QuilA级分的称为免疫刺激复合物(ImmuneStimulatingComplexes)(ISCOMS)的颗粒性结构具有溶血作用，并且已经用于疫苗的制备(Morein，B.，EP0109942B1、WO96/11711、WO96/33739)。溶血性皂角苷QS21和QS17(QuilA的HPLC纯化级分)被描述为有效的系统助剂，其制备方法在美国专利第5,057,540号和EP0362279B1中公开。已经用于系统疫苗接种研究的其它皂角苷包括来源于其它各种植物例如丝石竹属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)的皂角苷(Bomford等，Vaccine，10(9)572-577，1992)。一种增强性系统包括无毒脂质A衍生物和皂角苷衍生物的组合，特别是WO94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或者QS21被胆固醇猝灭的较低反应原性组合物，如在WO96/33739中所公开的。在一个方面，助剂为在WO95/17210中描述的含有QS21和3D-MPL水包油型乳剂的特别有效的助剂制剂。因此，在本发明的一个实施方案中，可提供以解毒脂质A或脂质A的无毒衍生物为助剂的组合物，更优选以单磷酸类脂A或其衍生物为助剂的组合物。在一个方面，组合物还包含皂角苷，更优选为QS21。在一个方面，助剂制剂还包含水包油型乳剂。本发明还提供制备疫苗制剂的方法，所述方法包括将本发明的VLP和可药用赋形剂例如3D-MPL一起混合。根据本发明，优选存在于加入助剂的组合物中的另外的组分包括非离子去垢剂，例如如本文描述的辛苯聚醇和聚氧乙烯酯，特别是叔辛基酚聚氧乙醇(TritonX-100)和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温80)；和在本文描述的胆盐或胆酸衍生物，特别是脱氧胆酸钠或牛磺脱氧胆酸钠。在一个方面，加入助剂的组合物包括3D-MPL、TritonX-100、吐温80和脱氧胆酸钠，其可与L2抗原制剂联用来提供适宜的疫苗。在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含含有胆固醇、皂角苷和LPS衍生物的泡状助剂制剂。在这一点上，优选的助剂制剂可包括含有胆固醇、具有适宜地包含二油酰磷脂酰胆碱的脂质双分子层的单层脂质体，其中皂角苷和LPS衍生物与脂质双分子层结合或嵌入其内。更优选地，这些助剂制剂包含作为皂苷的QS21和作为LPS衍生物的3D-MPL，其中，QS21∶胆固醇的比例为1∶1至1∶100重量/重量，最优选为1∶5重量/重量。在EP0822831B中描述了这类助剂制剂，将其公开的内容引入本文作为参考。在一个方面，本发明的组合物与铝联合使用，并且适合吸附或部分吸附在铝助剂上。在一个方面，适宜地，助剂为铝盐，其与3DMPL联合，例如磷酸铝和3DMPL。在另一个方面，所述助剂是氢氧化铝，任选地与3DMPL联合。在另一个方面，组合物是VLP与铝盐或铝盐+3DMPL的联合。在本发明的一个方面，所述铝盐为氢氧化铝。本发明的组合物还可包含作为稳定剂的铝或铝化合物。本发明通常涉及VLP的组合。然而，可以理解VLP的主要组分是L1蛋白。L1蛋白联合形成五聚物(病毒壳微体)，然后其(组装)形成VLP。如此，本发明也涉及如上描述的包含L1蛋白或含有L1蛋白的病毒壳微体的免疫原性组合物，L1蛋白或含有L1蛋白的病毒壳微体代替了本文描述的VLP。适宜地，L1蛋白能够刺激蛋白保护性免疫应答。适宜地，L1蛋白是构象正确。为避免疑惑，本发明因而也涉及如上描述的功能性L1衍生物的用途，例如L1截短物、缺失、置换或插入突变体和融合蛋白、适宜地能提供可识别HPV病毒免疫应答的那些。包含例如这些蛋白的病毒壳微体也包括在本发明中。作为免疫原性药剂的病毒壳微体已公开于例如W00204007中。W09901557也公开了包含HPV病毒壳微体的组合物。L1蛋白，衍生物和病毒壳微体以与上述用于VLP相同的方式使用。因此，本发明涉及包含来自HPV16和18和至少一种其它HPV癌症类型的L1蛋白或其功能性衍生物的免疫原性组合物，其它癌症类型选自HPV类型31、45和52，其中至少一种其它癌症类型的L1蛋白或其衍生物的剂量少于HPV16或18的剂量。因此，本发明涉及包含来自HPV16和18和至少一种其它HPV癌症类型的HPV病毒壳微体的免疫原性组合物，其它癌症类型选自包含HPV类型31、45和52，其中至少一种其它癌症类型的剂量少于HPV16或18的剂量。在一个方面，本发明涉及如上讨论的免疫原性组合物与可药用赋形剂的组合。适宜的赋形剂是本领域众所周知的，例如，包括缓冲液和水。本发明的组合物和疫苗可通过以下任意途径供给或递送例如口服、局部、皮下、粘膜(特别是阴道内)、静脉内、肌内、鼻内、舌下、真皮内及通过栓剂。在本发明的一个方面，组合物或疫苗可以与HPV早期抗原制剂或共同给药，所述早期抗原例如选自下列的抗原HPVE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7和E8。在另一个方面，疫苗可不含HPV早期抗原，例如选自下列的抗原HPVE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7和E8。任选地，组合物或疫苗也可与非HPV抗原制剂或者共同给药。适宜地，这些非-HPV抗原可提供抗其它疾病的保护作用，所述其它疾病最优选性传播疾病，例如单纯疱疹病毒、EBV、衣原体和HIV。我们特别优选的是，所述组合物或疫苗包含gD或其HSV的截短物，适宜地，称为来自HSV-2的C末端截短物。如此，该组合物或疫苗提供抗HPV和HSV两者的保护作用。组合物或疫苗组分的剂量根据个体的病症、性别、年龄和体重、给药途径以及疫苗的HPV的情况而变化。用量也可根据VLP类型的数目而变化。适宜地，递药量为适于产生免疫性保护应答的疫苗量。适宜地，每剂疫苗剂量包含每种VLP1-100μg，在一个方面为5-80μg，在进一步的方面为每种VLP5-30μg，在进一步的方面为每种VLP5-20μg，在进一步的方面，每种VLP特定地为5μg、6μg、10μg、15μg或者20μg。典型地，适宜用于人类的剂量为包含20-40μg的HPV16和HPV18VLP，和如本文描述的减少的剂量的其它HPV癌症类型(31、45、52)，适宜地为每种VLP少于20μg的水平，适宜地为能够在至少某些已接种个体中引起保护性免疫应答的水平。适于在人类中使用的其它剂量可包含较低地量的HPV16和/或18，这种剂量在人类中提供的保护作用如可使用本文列出的试验来测定。当本发明的VLP与例如强助剂联合时，这种剂量可能是适宜的。在一个方面，本发明的组合物包含20μg的HPV16、20μg的HPV18和5-18μg，例如5-15μg的来自其它癌症类型(31、45或52)每种VLP，且在进一步的方面，特别地为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15μg的来自每种非HPV16/18癌症类型的VLP。在一个方面，本发明的组合物包含10-15μg的HPV16、10-15μg的HPV18和5-9μg的来自其它癌症类型(31、45或52)的每种VLP，且在一个方面，特别地为5、6、7、8或9μg的来自每种非HPV16/18癌症类型的VLP。在一个方面，HPV16VLP与其它癌症类型(31、45或52)VLP的重量比例为1∶0.9-1∶0.1(HPV16其它类型)，适宜地1∶0.9-1∶0.3，适宜地1∶0.8-1∶0.4。在一个方面，HPV18VLP与其它癌症类型(31、45或者52)VLP的重量比例为1∶0.9-1∶0.1，(HPV18其它类型)，适宜地为1∶0.-1∶0.3，适宜地为1∶0.8-1∶0.4。换言之，减少的剂量适宜地为HPV16或HPV18VLP剂量的10-90％，且在一个方面为HPV16或HPV18VLP剂量的20-80％，在进一步的方面，为30-70％，在进一步的方面为30-60％，且特别地为HPV16或HPV18剂量的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一个方面，组合物适宜地用于预防一种或多种HPV-16和/或HPV-18感染，持续HPV-16和/或HPV-18感染和HPV-16和/或HPV-18相关的子宫颈瘤形成。适宜地，本发明的免疫原性组合物的用途为用于预防与其它(非HPV16、18)致癌类型相关的子宫颈瘤形成和/或偶然感染和/或持续感染。适宜地，本发明的免疫原性组合物用于成年人或10岁以上青春期少女的自动免疫接种。对本发明的所有组合物和疫苗而言，所述组合物或疫苗适宜用于年龄为10-15岁，优选10-13岁的青春期少女接种。所述组合物或疫苗也可给药给异常巴氏涂片或切除由HPV引起的病变的手术后，或者对HPV癌症类型血清反应阴性的和DNA阴性的成年女性。10-55岁的女性是另一类适宜的靶向组。在另一个方面，疫苗可以用于大于婴儿的所有年龄的少女和女性，且在进一步的方面，可以给予男孩或男人。在进一步的方面，疫苗可以用于治疗对HPV病毒血清反应阳性的女性。在一个方面，本发明的组合物用于预防或治疗由HPV感染引起的子宫颈癌或者CIN1、CINII或CINIII疾病状态。在一个方面，所述疫苗按2或3剂量方案递送，例如分别分别按0、1个月方案或0、2个月方案、或者0、2、6个月方案或0、1和6个月方案递送。适宜地，该疫苗接种方案可在3至10年后，或5至10年，例如优选3、4、5、6、7、8、9或10年后进行一次加强注射。在一个方面，本发明的组合物或疫苗为液体疫苗制剂，尽管疫苗可以冷冻干燥并在给药前重构。也可使用，例如局部制剂，例如阴道内乳膏剂。本文将本申请所有参考文献包括专利申请和授权专利的教导引入本文作为参考。本发明的组合物和疫苗包含上述列出的某些HPV组分。在本发明进一步的方面，所述疫苗基本上包含所述组分或者由所述组分组成。据此，本发明将参照下述非限定性的实施例加以阐述，这些实施例涉及HPV16和HPV18VLP的交叉保护作用，并且显示了HPVVLP的制备实施例1使用HPV16L1VLP和HPV18L1VLP的混合物对年龄为15-25岁的健康女性进行免疫。受试女性为1)对HPV-16和HPV-18呈血清反应阴性的；2)对高危HPV子宫颈感染呈阴性(通过HPVPCR检测)的；3)一生中有6个或更少性伴侣的；4)PAP涂片正常的。所述混合物每0.5ml剂量中包含20μgHPV-16L1VLP、20μgHPV-18L1VLP，和500μg氢氧化铝及50μg3DMPL的助剂。安慰剂组仅注射500μg的氢氧化铝。对高危癌症HPV类型的疫苗功效(V.E.)进行评价，其中V.E.表示疫苗组与安慰剂组相比，抗感染的保护作用％增加。在接种疫苗组和对照组中，可以通过检测各种致癌类型特异性核酸的存在，对交叉保护作用进行评价。例如可以使用WO03014402及其中的参考文献中描述的技术进行检测，特别是使用WO99/14377和Kleter等[JournalofClinicalMicrobiology(1999)，37(8)2508-2517]中描述的LiPA系统，对HPVDNA进行非特异性扩增和其后对DNA类型进行检测，将上述文献的全部内容引入本文作为参考。然而，任何适宜的方法都可以用于检测样品中的HPVDNA，例如用使用对每种目标HPV类型有特异性的引物的类型特异性PCR。适宜的引物为技术人员熟知的，或者如果已知致癌HPV型的序列则可以容易地构建。对所有12种高危癌症类型、HPV-16种系相关型(各组；31、35和58；和31、33、35、52和58)和HPV-18种系相关型(45和59)的感染进行疫苗功效的评价。对“ITT”(计划治疗(IntentionToTreat)人群，代表所有接受至少一种剂型疫苗的个体)进行初步分析。这一数据显示在表1中。表2和表3给出的结果涉及“ATP”(AccordingToProtocol)组，即符合该项试验所有标准的那些患者。表2为中点分析，其数据采自至少有50％的人群处于首次疫苗接种后18个月时间点的所有患者。表3给出了最终结果，所有数据采自首次疫苗接种(0月)后18个月的受试者。在ATP组中，所有患者均在0、1月和6个月接受了3次剂量的疫苗，并且在6个月时血清反应呈阴性。如表1中给出的数据所证实的，用HPV16VLP和HPV18VLP混合物进行免疫，提供了明显的抗其它HPV类型的交叉保护作用。在这一点上，因样品数量太少而无法提供精确的统计学分析，然而，所得数据却证明了积极的趋势，并建议用HPV16VLP和HPV18VLP进行免疫，可有效地抗其它HPV类型的感染。当研究深入时，这一点得到了证实。试验设计的详细内容在实施例3中作进一步描述。表2证实了HPV16和HPV18对一组高危癌症类型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68提供统计学显著性交叉保护作用。表3证实了除HPV-18相关型(其显示非常强的趋势)之外，对以下组别有统计学显著性交叉保护作用HPV31、35、58；HPV31、33、35、52、58；和所评价的12种高危HPV型(非HPV-16/18型)。后来的试验数据分析已经表明在实施例1中使用的联合的HPV16和18疫苗提供了抗HPV31的统计学偶然感染的统计学显著性交叉保护作用(疫苗功效，75.1％，p＝0.007)。虽然样本量仍然不足以对其它类型得出统计学显著性结论，但是对其它类型例如39、45、51和52的数据证实了积极的趋势，并建议用HPV16和HPV18VLP免疫将有效地抗其它HPV类型的感染。实施例3中列出的数据进一步提供了在相同研究中达到的数据，将提供的交叉保护作用聚焦在抗某些特定类型上。表1在第9、12、15和18个月时从患者中采集样品，对上述特类型的HPV感染进行试验。表2-在预防偶然异源性感染中三次剂量后的疫苗功效表2抗HPV-16种系相关类型、HPV-18种系相关类型、HPV-16和/或HPV-18种系相关类型以及不包括HPV-16和HPV-18在内的所有高危类型感染的疫苗功效-ATP群体(6-18个月)N＝特定人群的受试者人数；N＝偶然HPV感染的受试者人数；AR＝发病率＝n/N95％CI＝95％置信区间下限＝1-exp(log(arv/arp)+1.96*sqrt(1/nv-1/Nv+1/np-1/Np))上限＝1-exp(log(arv/arp)-1.96*sqrt(1/nv-1/Nv+1/np-1/Np))当疫苗组病例＝0时；下限*＝1-exp(log(arv*/arp*)+1.96*sqrt(1/(nv+0.5)-1/(Nv+0.5)+1/(np+0.5)-1/(Np+0.5)))上限*＝1-exp(log(arv*/arp*)-1.96*sqrt(1/(nv+0.5)-1/(Nv+0.5)+1/(np+0.5)-1/(Np+0.5)))其中arv＝疫苗接受者的发病率arp＝安慰剂接受者的发病率nv＝疫苗接受者的病例数Nv＝疫苗接受者的病例数或非病例数np＝安慰剂接受者的病例数Np＝安慰剂接受者的病例数和非病例数HPV-16相关类型HPV-16种系相关类型35、31、58，而不考虑其它HPV类型HPV-16相关类型*HPV-16种系相关类型35、31、58、33、52，而不考虑其它HPV类型HPV-18相关类型HPV-18种系相关类型45、59，而不考虑其它HPV类型HPV-16和/或HPV-18相关类型HPV-16和/或HPV-18种系相关类型35、31、58、45、59，而不考虑其它HPV类型HPV-16和/或HPV-18相关类型*HPV-16和/或HPV-18种系相关类型35、31、58、33、52、45、59，而不考虑其它HPV类型**＝不包括HPV-16和HPV-18在内的高危类型表3在第18个月时从患者中采集样品，并且对上述特定类型的HPV感染进行试验。实施例2HPV16和HPV18VLP可根据下列方法制备实例1本文详细描述了HPV16和HPV18L1VLP的组合。来自其它HPV基因型的L1蛋白可很容易地按照本领域已知的类似方法制备。AHPV16/18L1VLP的制备使用标准试验设计，例如参见W09913056，来进行HPV16和HPV18VLP的制备。HPV16/18蛋白在感染编码感兴趣的HPV16或18L1基因重组体Baculovirus(MOI为0.3)的Trichoplusiani(HighFiveTM)细胞(密度为～350000cells/ml)中表达。感染72小时后采集细胞。4.1B细胞采集/抗原提取抗原(L1-16/18)为从Hi5细胞中分三步方法浓缩、提取、净化来提取的。浓缩步骤除去大于90％的培养介质，其通过切向流体过滤进行。提取步骤用低渗缓冲液(Tris20mM，pH8.5)进行。使用与培养体积相等的体积进行提取。在稳定的搅拌(moothagitation)下，所用接触时间最少为半小时。通过切向流体过滤进行净化。C纯化在室温下进行纯化步骤。将β-巯基乙醇(4％w/w)加入到提取液中以便于将VLP解组装成两个抗原LI-16/18的病毒壳微体。在加入β-巯基乙醇前，加入甘油至浓度为w/w10％。使用的所有缓冲液都经过0.22μm过滤器过滤，贮存在2℃-8℃。在进行每次纯化前，对凝胶基质消毒，并且在装载样品前，用适宜的缓冲液平衡。给出用于从HPV16和18两者中分离纯化L1的纯化方案。这些方案普遍类似，包括步骤阴离子交换色谱(二甲氨基乙基-DMAE)，阴离子交换色谱(三甲氨基乙基-TMAE)，羟磷灰石层析，纳米过滤(Planova)，超滤，对HPV18用疏水作用层析(使用OctylSepharose)或者对HPV16用阴离子交换色谱(DEAE)；和过滤除菌。4.1.1特别地4.1.2C1L1-18抗原的纯化4.1.2.1阴离子交换色谱DMAE将净化的提取物(浓度为～1g/ml的蛋白，含有～150mg/ml的L1蛋白)应用于阴离子交换柱(二甲氨基乙基)。用(Tris20mM|NaCl200mM|4％β-(3-巯基乙醇BME)缓冲液，pH7.9±0.2进行洗脱。用约5个柱体积缓冲液洗脱抗原，在280nm检测洗脱特性。4.1.2.2阴离子交换色谱TMAE用1体积的H2O/BME4％稀释第一步骤得到的洗脱液。然后将稀释的洗脱液应用于第二个阴离子交换柱(TriMethylAminoEthyl)。用(Tris20mM|NaCl200mM|4％BME)缓冲液，pH7.9±0.2进行洗脱。用约4个柱体积缓冲液洗脱抗原，在280nm检测洗脱特性。4.1.2.3羟磷灰石层析将TMAE步骤所得到的洗脱液应用于羟磷灰石(HA)柱。在应用样品后，用约2.5个柱体积的(NaH2PO4100mM|NaCl30mM|4％BME)缓冲液，pH6.0±0.2洗脱凝胶。4.1.2.4纳米过滤(Planova)稀释HA洗脱液以达到下述条件(NaH2PO425mM|NaCl10mM|4％BME)缓冲液，pH7.5±0.2。然后，连续用0.2μm预滤器和0.12m2的Planova15N过滤器过滤。过滤在恒压200mbar±20mba进行。4.1.2.5超滤用装有聚醚砜膜的全流过滤超滤系统(Centramatecassette0.1m2，100kD)进行超滤。处理Planova洗脱液以达到下述条件(NaH2PO4100mMINaCl30Mm|4％BME)，pH6.0±0.2；然后，将其装入系统，浓缩5倍，且连续注射～10倍起始体积的(NaH2PO4，20mMINaCl500mM)缓冲液，pH6.0±0.2来透析过滤。4.1.2.6疏水作用层析(OctylSepharose)将超滤渗透物应用于OctylSepharose柱。该层析步骤在含有约5体积的(Na3PO420mMINaCl500mM)缓冲液，pH6.0±0.2的阴性模式中进行。4.1.2.7无菌过滤纯化的L1-18抗原溶液通过用0.22μm膜过滤灭菌。4.1.34.1.4C2L1-16抗原的纯化4.1.4.1阴离子交换色谱DMAE将澄清的提取物应用于阴离子交换柱(二甲氨基乙基)。用(Tris20mM|NaCl180mM|4％BME)缓冲液，pH7.9±0.2来进行洗脱。用约4个柱体积缓冲液洗脱抗原，在280nm检测洗脱特性。4.1.4.2阴离子交换色谱TMAE用1体积的H2O/BME4％稀释第一步骤得到的洗脱液。然后将稀释的洗脱液应用于第二个阴离子交换柱(TriMethylAminoEthyl)。用(20mMTris|NaCl180mM|4％BME)缓冲液，pH7.9±0.2进行洗脱。用约5个柱体积缓冲液洗脱抗原，在280nm检测洗脱特性。4.1.4.3羟磷灰石层析(HA)将TMAE步骤所得到的洗脱液应用于HA柱。在应用样品后，用约3个柱体积的(NaH2PO4100mM|NaCl30mM|4％BME)缓冲液，pH6.0±0.2洗脱凝胶。4.1.4.4纳米过滤(Planova)稀释HA洗脱液以达到下述条件(NaH2PO425mM|NaCl10mM|4％BME)缓冲液，pH7.5±0.2。然后，连续用0.2μm预滤器和0.12m2的Planova15N过滤器过滤。过滤在恒压200mbar±20mba进行。4.1.4.5超滤用装有聚醚砜膜的全流过滤超滤系统(Centramatecassette0.1m2，100kD)进行超滤。处理Planova洗脱液以达到下述条件(NaH2PO4100mMINaCl30mM|4％BME)，pH6.0±0.2；然后，将其装入系统，浓缩5倍，且连续注射～10倍起始体积的(NaH2PO4，20mMINaCl500mM)缓冲液，pH6.0±0.2，透析过滤。4.1.4.6阴离子交换色谱DEAE调节超滤洗脱液达到平衡缓冲液(Na3PO420mMINaCl250mM)，pH6.0±0.2的导电率，将其应用于阴离子交换柱(DiEthylAminoEthyl)。用(NaH2PO420mMINaCl500mM)缓冲液，pH6.0±0.2进行洗脱。用约3个柱体积缓冲液洗脱抗原，在280nm检测洗脱特性。4.1.4.7无菌过滤纯化的L1-16抗原溶液通过用0.22μm膜过滤灭菌。C3独立地吸附每种VLP类型以制备集中吸附的单一抗菌物(concentratedadsorbedmonovalent)。VLP16集中吸附的单一抗菌物的制备在pH为6.0±0.2和室温下，在150μg来自Al(OH)3的Al3+上吸附60μg来自HPV16的纯化的VLP一小时，伴有轻微搅拌。这一集中吸附的单一抗菌物在+4℃保存。通过离心制剂和定量化浮于上层的VLP来检验吸附。VLP8集中吸附的单一抗菌物的制备在pH为6.0±0.2和室温下，在150μg来自Al(OH)3的Al3+上吸附60μg来自HPV18的纯化的VLP一小时，伴有轻微搅拌。这一集中吸附的单一抗菌物在+4℃保存。通过离心制剂和定量化浮于上层的VLP来检验吸附。D最终的疫苗制剂可混合通过上述方法制备的集中吸附的单一抗菌物以形成包含20μg每种VLP每剂量的混悬液。最终的疫苗保存在+4℃。根据本发明，当适宜时，可加入适宜浓度的来自其它癌症类型的VLP附加物。这种类型的序列是本领域已知的，且包含这种蛋白的VLP可由本领域技术人员容易地表达。所述组合吸附的原料(bulks)或者独立吸附的原料可进一步与助剂例如3D-MPL混合。实施例3进行试验的精确详细内容在Harper等人，theLancet.2004Nov13；364(9447)1757-65中提供。总之，使用HPV16L1VLP和HPV18L1VLP的混合物对年龄为15至25岁的健康女性进行免疫。受试女性为1)对HPV-16和HPV-18呈血清反应阴性的；2)对高危HPV子宫颈感染呈阴性(通过HPVPCR检测)的；3)一生中有6个或更少性伴侣的；4)PAP涂片正常的。所述混合物每0.5ml剂量中包含20μgHPV-16L1VLP、20μgHPV-18L1VLP，和500μg氢氧化铝及50μg3DMPL的助剂。安慰剂组仅注射500μg的氢氧化铝。HPV16VLP由471个氨基酸、C末端截短的、有34个氨基酸缺失的HPVL1蛋白组成。HPV18VLP由C末端截短的、有35个氨基酸缺失的、472个氨基酸的HPVL1蛋白。对高危癌症HPV类型的疫苗功效(V.E.)进行评价，其中V.E.表示疫苗组与安慰剂组相比，抗感染的保护作用％增加。在接种疫苗组和对照组中，可以通过检测各种致癌类型特异性核酸的存在，对交叉保护作用进行评价。例如可以使用WO03014402及其中的参考文献中描述的技术进行检测，特别是使用WO99/14377和Kleter等[JournalofClinicalMicrobiology(1999)，37(8)2508-2517]中描述的LiPA系统，对HPVDNA进行非特异性扩增和其后对DNA类型进行检测，将上述文献的全部内容引入本文作为参考。然而，任何适宜的方法都可以用于检测样品中的HPVDNA，例如用使用对每种目标HPV类型有特异性的引物的类型特异性PCR。适宜的引物为技术人员熟知的，或者如果已知致癌HPV型的序列则可以容易地构建。详细地，下面完全再现了Lancetpaper的试验部分Harper等人，theLancet.2004Nov13；364(9447)1757-65-试验的详细内容该试验的主要目的是评价第6个月至第18个月间，在预防受试者感染HPV-16、HPV-18或者两者(HPV-16/18)中的疫苗功效，所述受试者最初通过ELISA显示对HPV-16/18呈血清反应阴性，且通过PCR显示对HPV-16/18DNA呈阴性。第二个目的包括评价在预防持续感染HPV-16/18中的疫苗功效，和评价第6月至第18月间，第6月至第27月间，在预防细胞学证实的低度恶性鳞状上皮内损伤(LSIL)、高度恶性鳞状上皮内损伤(HSIL)和组织学证实的LSIL(CIN1)、HSIL(CIN2或3)鳞状上皮细胞癌或与HPV-16/18感染相关的乳腺癌中的疫苗功效。由此，与HPV-16/18感染相关的意义未确定的非典型鳞状细胞(ASCUS)细胞学的预防也加入到分析结果中。我们也通过PCR检测做了受损伤组织中与HPV-16/18DNA感染相关的组织病理学说终末点(histopathologicalendpoints)CIN1和2的探测分析。其它目的包括疫苗免疫原性、安全性和耐受性的评价。北美(加拿大和美国)和巴西的研究者通过广告或联系以前参与2000年7月和12月HPV横断层面流行病学研究的参与者召集了这次功效研究的女性。对于32个研究点的每个而言，公共检查委员会(institutionalreviewboard)批准了试验设计、同意方案(consentforms)和修正书(amendments)。这些女性分别签署了参与研究和阴道镜检查的书面同意书。对于那些不到18岁的女性而言，必须由其亲属同意和赞成参与研究。分两个研究期初期，接种疫苗和随访，在第18个月得出结论；和盲目随访延长期，在第27个月得出结论。适宜用于初期(0-18个月)研究的女性包括年龄为15-25岁的健康女性，不超过6个性伴侣，没有异常Pap试验史或没有烧蚀(ablative)或切除治疗子宫颈，且一直没有治疗外部湿疣；和在进入研究前不超过90天，细胞学阴性、ELISA检测对HPV-16和HPV-18抗体呈血清反应阴性，且PCR检测对14种高危类型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)呈HPV-DNA-阴性的那些女性。完成最早研究的初期的女性，和没有烧蚀或切除治疗子宫颈的女性，或在登记后切除子宫的女性，适合参与研究的延长期(18-27个月)。方法每种剂量的二价HPV-16/18病毒样颗粒疫苗(GlaxoSmithKlineBiologicals，Rixensart，Belgium)包含20μg的HPV-16L1病毒样颗粒和20μg的HPV-18L1病毒样颗粒。在含有AS04助剂的SpodopterafrugiperdaSf-9和TrichoplusianiHi-5细胞底物中制备每种类型的病毒样颗粒，其以单剂量小瓶提供，所述AS04助剂包含500μg氢氧化铝和50μg3-脱酰化单磷酸类脂A(MPL，Corixa，Montana，USA)。安慰剂包含每剂量500μg的氢氧化铝，外观与HPV-16/18疫苗完全相同。每位研究参与者在0月、1月和6月，接受0-5mL剂量的疫苗或安慰剂。保健提供者在筛选检查和第6、12和18个月，用子宫颈刷和子宫颈刮板(在PreservCyt中洗过的，CytycCorporation，Boxborough，MA，USA)得到子宫颈样本，用于细胞学和HPVDNA试验。在第0和6个月，及随后每3个月，女性用两把连续拭子(sequentialswabs)(放置在PreservCyt中)自取子宫颈阴道样本，用于HPVDNA试验。[DMHarper，WWNoll，DRBelloni和BF.Cole，RandomizedclinicaltrialofPCR-determinedhumanpapillomavirusdetectionmethodsself-samplingversusclinician-directed-biologicconcordance和women′spreferences.AmJObstetGynecol186(2002)，pp.365-373]。一个中心试验室(QuestDiagnostics，Teterboro，NJ，USA)报道了使用1991Bethesda分类系统的细胞学结果(ThinPrep，CytycCorporation)。试验设计指南推荐在两次报道ASCUS后，或在一次报道未确定显著性非典型腺细胞(atypicalglandularcellsofundeterminedsignficance)、LSIL或HSIL、鳞状细胞癌、原位腺癌或腺癌后，进行阴道镜检查。这些指南也推荐对任意可疑损害的活组织检查。中心组织试验室对用于临床处理的福尔马林固定组织样品进行了初次诊断。随后，一组三个病理学家得出了一致的诊断结果HPV-16和HPV-18与CIN系统损伤有关。该一致的诊断结果也包括观察纤维解剖时采集的切片，其用于受损害HPVDNA的PCR测定。从组织样本(MagNaPureTotalNucleicAcidsystem，RocheDiagnostics，Almere，Netherlands)和从子宫颈活组织样本(proteiBaseKextraction)中分离的HPVDNA为从纯化的所有DNA等分试样中扩增的，其扩增了L1基因的65bp区域，所述纯化的所有DNA具有SPF10广谱引物。[Kleter，LJvanDoom，JterSchegget等人.，Novelshort-fragmentPCRassayforhighlysensitivebroad-spectrumdetectionofanogenitalhumanpapillomaviruse.AmJPathol153(1998)，pp.1731-1739LJvanDoom，WQuint，BKleter等人.，GenotypingofhumanpapillomaviruseinliquidcytologycervicalspecimensbythePGMYlineblotassayandtheSPF(10)lineprobeassay.JClinMicrobiol40(2002)，pp.979-983和WGQuint，GScholte，LJvanDoom，BKleter，PHSmits和J.Lindeman，ComparativeanalysisofhumanpapillomaviruseinfectionsincervicalscrapesandbiopsyspecimensbygeneralSPF(I0)PCRandHPVgenotyping.JPathol194(2001)，pp.51-58]。通过DNA酶免疫测定检测扩增产物。用一列探针试验(LiPAKitHPVINNOLiPAHPVgenotypingassay，SPF-10systemversion1，Innogenetics，Gent，Belgium，manufacturedbyLaboBio-medicalProducts，Rijswijk，Netherlands)检测25HPV基因型(6、11、16、18、31、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70和74)。[BKleter，LJvanDoom，LSchrauwen等人.，Development和clinicalevaluationofahighlysensitivePCR-reversehybridizationlineprobeassayfordetectionandidentificationofanogenitalhumanpapillomavirus.JClinMicrobiol37(1999)，pp.2508-2517]用类型特异性HPV-16和HPV-18PCR测定对DNA酶免疫测定呈阳性的任意样品。HPV-16类型特异性PCR引物扩增了E6/E7基因的92bp片段，HPV-18类型特异性PCR引物扩增了L1基因的126bp片段。[MFBaay，WGQuint，JKoudstaal等人.，Comprehensivestudyofseveralgeneral和type-specificprimerpairsfordetectionofhumanpapillomavirusDNAbyPCRinparaffin-embeddedcervicalcarcinomas.JClinMicrobiol34(1996)，pp.745-747]我们定义偶然子宫颈感染HPV-16/18为在试验期间对HPV-16或HPV-18的PCR结果至少一种为阳性，定义持续感染HPV-16/18为在至少6个月对相同的病毒基因型分离的HPV-DNAPCR试验至少两种为阳性。[HRichardson，GKelsall，PTellier等人.，Thenaturalhistoryoftype-specifichumanpapillomavirusinfectionsinfemaleuniversitystudents.CancerEpidemiolBiomarkersPrev12(2003)，pp.485-490和ABMoscicki，JHEllenberg，SFarhat和J.Xu，PersistenceofhumanpapillomavirusinfectioninHIV-infectedanduninfectedadolescentgirlsriskfactorsanddifferences，byphylogenetictype.JInfectDis190(2004)，pp.37-45]在试验期间，对研究者隐瞒HPV-DNA试验结果，仅透漏为临床治疗目的的细胞学和组织学诊断。分析包括子宫颈样本和自取的子宫颈阴道样品的HPV-16/18DNA结果。我们在0、1、6、7、12和18个月收集研究参与者的血清用于评价免疫原性。通过ELISA进行抗体对HPV-16和HPV-18病毒样颗粒的血清样试验。使用重组体HPV-16或HPV-18病毒样颗粒作为用于抗体检测的固定抗原(参见webappendixhttp://image.thelancet.com/extras/04art10103webappendix.pdf)。血清阳性被定义为试验终止时确定的滴定度大于或等于对于HPV-16而言8ELISAunits/mL，和对HPV-18而言7ELISAunits/mL。典型的天然滴定度是通过使用下述血样来确定得自在前述传染病学研究中通过ELISA发现对HPV-16或HPV-18呈血清反应阳性的女性。在女性接种疫苗后7天期间，在日记卡上用三种不同的症状强度等级记录症状。另外，他们报道研究了在接种疫苗后第一个30天内工作人员采访了所有不利事件。收集研究期间严重的不利事件和妊娠情况。统计学方法假定在12个月内，HPV-16和HPV-18类型感染的累积发病率为6％，我们估计每个处理组将有500名女性提供80％有效性(power)用于判断高于零的疫苗功效95％CI的下限。我们假定在18个月内保留率为80％。进行功效、安全性和免疫原性的中值分析(interimanalyses)仅用于未来研究计划目的；在进行中值分析后，使用O′Brien和Fleming方法调节最终分析结果(全部的，α＝0.05；双向检验)。[O′Brien和TR.Fleming，Amultipletestingprocedureforclinicaltrials.Biometrics35(1979)，PP.549-556]使用国际随机取样系统集中符合验证的算法的分层、分段随机抽样(Stratified，blockrandomization)。分层是根据年龄(15-17、18-21，和22-25岁)和区域(北美和巴西)进行的。由研究人员将具体参与者的信息输入计算机随机系统，随机选取参与者数量分配每种疫苗。对研究者和参与长期随访研究的女性隐瞒治疗配置情况(Treatmentallocation)。在图中显示了想要治疗(intention-to-treat)和符合试验设计的人群，其中从分析中排除的理由按等级次序列出；根据最高等级标准，符合超过一种排除指标的女性仅计数一次。我们将加入想要治疗和符合试验设计分析的参与者的组合称为群体(cohorts)，尽管用于限制目的包含在符合试验设计中的信息仅在随访后才能获知。我们进行了符合试验设计和想要治疗的功效分析。在符合试验设计18个月分析中疫苗功效的结果以疫苗组对安慰剂组中有HPV-16/18感染的参与者比例为基础。疫苗功效被定义为1减去这两者比例；95％CIs判断功效评价的精确度。用双向Fisher′s精密试验计算P值。相应的比例表示有结果的病例数量除以有危险的参与者。符合试验设计的18个月群体包括接受三次列表剂量疫苗和符合如图中描述的试验设计的女性。在想要治疗和符合试验设计27个月分析中疫苗功效的计算以疫苗组对安慰剂组中使用有HPV-16/18感染病例的时间对发生率(time-to-occurrence)的Cox比例风险模型为基础。这允许控制每组中产生的人次-时间数据。疫苗功效为使用1减去危害比来计算，p值为使用指数系列检验来计算。相应的比例表示病例数量除以所有的人次-时间。在0个月，所有接受至少一种剂量的疫苗或安慰剂、高危HPV-DNA为阴性的和对检测结果有有效数据的女性包括在想要治疗群体中。符合试验设计27个月群体包括得自符合试验设计18个月群体和在延长期(18个月至27个月)存在的女性。使用Fisher′s精确试验对照进行用于安全性分析的p值计算。用于安全性分析的人群包括所有加入的接受至少一种剂量的疫苗或安慰剂，且符合特定的、最低试验设计要求的女性(参见下图)。在一组符合试验设计安全性人群中评价免疫原性，其包括在试验期间在0、7和18个月有血清学结果的女性，其按照时间表接受了所在一组符合试验设计安全性人群中评价免疫原性，其包括在试验期间在0、7和18个月有血清学结果的女性，其按照时间表接受了所有三次剂量的研究疫苗或安慰剂，按采血时间表采血，且没有对HPV-16/18-DNA表现出阳性。用Fisher′s精确试验比较疫苗组和安慰剂组之间的血清阳性率(p＜0.001judgedsignificant)。用ANOVA和Kruskal-Wallis试验比较几何平均滴定度。用SASversion8.2(SASInstitute，Cary，NorthCarolina)进行Block随机抽样和统计分析。结果在专利申请W02004/056389中列出了对交叉保护作用最初分析的结果，本文将其全部内容引入作为参考。进一步地分析对″ATP″(根据试验设计)组那些符合所有试验条件的患者进行分析。在ATP组中，所有患者在0、1和6个月接受3次剂量，在第6个月血清反应阴性。如表4中数据证实的，与对照组相比，HPV16和HPV18VLP混合物免疫接种提供了抗HPV类型31、52和45偶然感染的统计学显著的交叉保护作用。在抗所有HPV16有关类型(HPV-31、33、35、52和58)组和所有高危类型组中，不包括16和18(HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)，也观察到抗偶然感染的统计学显著的交叉保护作用。在抗类型31和52(参见表5)和抗所有HPV16有关类型组(参见表5)中也观察到抗持续感染的统计学显著的交叉保护作用。在抗与HPV52相关的细胞学异常中也观察到统计学显著的交叉保护作用，参见表6。在抗与所有HPV16相关类型(HPV-31、33、35、52和58)的组相关的，和所有高危类型的组相关的细胞学异常中也观察到统计学显著保护作用，其中不包括16和18(HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)。表4抗16/18相关类型*的偶然感染的功效*子宫颈样品；ATP群体表5抗16/18相关类型*的持续感染的功效*所有样品；ATP群体表6抗与16/18有关类型*相关的细胞学异常的功效*ATP群体在表4、5和6中，N＝特定人群患者的数量AR＝发病率＝n(偶然感染、持续感染或细胞学异常的HPV患者数量，与表中的相适宜(asappropriateforthetable))/N％疫苗功效为1-(A/B)×100，根据疫苗和安慰剂组的相对数量调节，其中A＝疫苗组中患有偶然感染、持续感染或细胞学异常的女性％，与表中的相适宜B＝安慰剂组中患有偶然感染、持续感染或细胞学异常的女性％，与表中的相适宜。权利要求1.免疫原性组合物，包含来自HPV16和18和至少一种其它HPV癌症类型的VLP或病毒壳微体，其它癌症类型选自HPV类型31、45和52，其中至少一种其它癌症类型的VLP或病毒壳微体的剂量少于HPV16或18的剂量。2.根据权利要求1的组合物，其中其它癌症类型为HPV31。3.根据权利要求1的组合物，其中其它癌症类型为HPV45。4.根据权利要求1的组合物，其中其它癌症类型为HPV52。5.根据权利要求1的组合物，其中其它癌症类型为HPV31和HPV45。6.根据权利要求1的组合物，其中其它癌症类型为HPV31和HPV52。7.根据权利要求1的组合物，其中其它癌症类型为HPV52和HPV45。8.根据权利要求1的组合物，其中其它癌症类型为HPV31、HPV45和HPV52。9.根据任一项前述权利要求的免疫原性组合物，其中所述组合物包含10μg或者更多的HPV16和/或HPV18VLP或病毒壳微体和2-9μg的来自其它癌症类型的VLP或病毒壳微体。10.根据权利要求1-8中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含20μg或者更多的HPV16和/或HPV18VLP或病毒壳微体和5-15μg的来自其它癌症类型的VLP或病毒壳微体。11.根据权利要求10的免疫原性组合物，其中所述组合物包含10μg的来自其它癌症类型的VLP或病毒壳微体。12.根据权利要求1-11中任一项的免疫原性组合物与助剂的组合。13.根据权利要求12的组合物，其中所述助剂为铝盐。14.根据权利要求13的组合物，其中所述助剂为氢氧化铝。15.根据权利要求12的组合物，其中所述助剂为脂质A衍生物。16.根据权利要求15的组合物，其中所述助剂为3DMPL。17.根据权利要求16的组合物，其中所述助剂为3DMPL和氢氧化铝。18.疫苗，包含根据任一项前述权利要求的免疫原性组合物和可药用赋形剂。19.预防HPV感染和/或疾病的方法，包含给药需要的个体如上定义的组合物或疫苗。20.制备如上定义的免疫原性组合物的方法，包含混合来自HPV16和18与至少一种其它HPV癌症类型的VLP或病毒壳微体，其它癌症类型选自HPV类型31、45和52，其中至少一种其它癌症类型的VLP或病毒壳微体的剂量少于HPV16或18的剂量。21.预防或治疗HPV感染和/或疾病的方法，包括递送给个体包含来自HPV16和18和至少一种其它癌症类型的VLP或病毒壳微体的免疫原性组合物，其它癌症类型选自HPV类型31、45和52，其中至少一种其它癌症类型的VLP或病毒壳微体的剂量少于HPV16或18的剂量。全文摘要免疫原性组合物和制备所述组合物的方法，所述组合物包含来自HPV16和18和至少一种其它HPV癌症类型的VLP或病毒壳微体，其它癌症类型选自HPV类型31、45和52，其中至少一种其它癌症类型的VLP或病毒壳微体的剂量少于HPV16或18的剂量。文档编号A61K39/12GK1976718SQ200580019515公开日2007年6月6日申请日期2005年6月14日优先权日2004年6月16日发明者S·德布鲁斯,M·-T·马丁,R·J·斯蒂芬,J·斯蒂芬尼,M·A·C·维滕多夫申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司