专利名称：靶向氧化治疗剂在治疗糖尿病和肥胖症中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有过氧化物或氧化产物的组合物及其制备方法和应用。本发明特别涉及一种药物组合物或制剂，含有使用含氧氧化剂(如臭氧)氧化烯烃族化合物(液体形式或者在溶液中)所得到的过氧化物或反应产物；渗透溶剂；含有螯合金属的染料；和芳香族氧化还原化合物。本发明还涉及所述药物制剂的制备及它在治疗糖尿病和肥胖中的应用。
背景技术：
臭氧是一种三原子气体分子，也是氧气的一种同素异形体。它可以通过纯氧放电或强烈紫外线穿过纯氧而获得。普遍的错误观点认为臭氧是严重的污染物，疾病的“自由基”理论和抗氧化剂添加物市场使医疗理论对臭氧作为治疗的应用存有偏见。然而，臭氧疗法是一个错误的叫法。臭氧是非常活跃而不稳定的气体，与副产物直接有关的作用机制是臭氧与血浆和细胞膜中有机化合物的选择性相互作用。臭氧与不饱和烯烃的选择性反应发生在碳-碳双键，从而生成臭氧化物。臭氧本身是有毒性的，它的反应产物-臭氧化物不稳定，不能单独作为治疗剂。
过氧化氢(H202)，1818年被发现，痕量存在于自然界。过氧化氢不稳定，当与有机的膜和颗粒物质直接接触时剧烈分解(或发泡)。光、搅拌、加热和铁都能加速溶液中过氧化氢的分解速度。过氧化氢通过体外直接接触而杀灭微生物，所述微生物具有低水平的过氧化物分解酶，如过氧化氢酶。然而，当过氧化氢被注入兔血液中时(该兔感染了对过氧化物敏感的大肠杆菌)，没有杀菌作用。而且，在体外，兔或人血液中(含有大肠杆菌)过氧化物浓度的增加没有表现出直接的杀菌活性。高浓度过氧化氢作用的缺乏与宿主动物血液中过氧化物分解酶-过氧化氢酶的存在直接相关。为了产生作用，高浓度的过氧化氢必须与细菌接触有效的时间周期。普遍存在于血液中的大量过氧化氢分解酶(如过氧化氢酶)使过氧化物在血液中不能多存在几秒钟。因此，通过注射或输注而被引入血液中的过氧化氢在血液或细胞外液中没有像细胞外杀菌剂那样直接起作用。
但是，过氧化氢确实参与了活化的巨噬细胞的杀菌过程。活化的巨噬细胞被引入感染部位，吸附于传染生物体并将之吞噬。生物体杀伤作用发生在巨噬细胞内部，由过氧化氢产生。过氧化氢将细胞的氯化物氧化成二氧化氯自由基，使微生物细胞膜不稳定，如果作用持久，将引起细胞凋亡或细胞自杀。对于细胞内过氧化作用关键的治疗条件是过氧化物载体分子的选择性传递、吸收和激活，只进入患病巨噬细胞中，这些巨噬细胞被认为没有提高的过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶活性。注入的过氧化氢无显著特点的毒物，而定向的细胞内氧化作用是一种选择性的治疗手段。
巨噬细胞在免疫、骨钙化、视力、神经隔离(髓鞘化)、解毒、泵强度和毒素从机体清除等方面起关键作用，取决于它们的位置分布。巨噬细胞对能量的需求由细胞内结构-线粒体提供。线粒体在结构上通常具有微丝内部细胞结构。线粒体的折叠内层产生高能量分子ATP，而外层含有细胞色素和电子循环分子，产生过氧化物。线粒体的外层对内毒素、真菌毒素、药物、重金属和杀虫剂引起的毒性阻断或损伤是敏感的。当线粒体的过氧化作用功能被阻断时，细胞的丝状结构易于交联，产生错误信号、机能不全、不适当复制或早熟细胞死亡。
当负责血糖调节的组织产生对胰岛素的抵抗时，形成2型糖尿病(Ivy等人，1999)。当正常的胰岛素浓度产生的生物反应低于正常水平时，证明有胰岛素抵抗。骨骼肌是负责控制食后血糖的主要组织，食后状态下的胰岛素浓度是升高的。
实验研究和临床研究中不断增加的证据表明，氧化-还原失衡在两种类型糖尿病的发病机理中都起着主要作用(Maritim等人，2003)。糖尿病患者在葡萄糖氧化、非酶的蛋白质糖基化及糖化蛋白随后的氧化降解反应过程中可能经历这样的失衡，它能导致细胞器和酶的损伤、脂质过氧化的增加和胰岛素抵抗的发生。氧化还原失衡的这些后果能够加速糖尿病并发症的发展。
胰岛素抵抗也是大部分人类和动物肥胖症的普遍特征。当缺乏胰岛素刺激的肌肉葡萄糖吸收时，骨骼肌不能清除循环中的葡萄糖。血液中过量葡萄糖被转化为脂肪，长期则导致肥胖。因此，减少全身胰岛素抵抗将有效治疗肥胖，通过提高骨骼肌葡萄糖吸收而减少循环中的过量葡萄糖。
美国专利4,451,480(De Villez)公开了一种治疗痤疮的组合物和方法。该方法包括使用臭氧化物质来局部处理感染区域，所述臭氧化物质是通过氧化各种不挥发性油和不饱和酯、醇、醚和脂肪酸而获得的。
美国专利4,591,602(De Villez)公开了一种Jojoba(加州希蒙得木)的臭氧化物，用于控制微生物感染。
美国专利4,983,637(Herman)公开了一种非经肠处理局部或全身病毒感染的方法，通过药物可接受的载体来给入萜烯的过氧化物。
美国专利5,086,076(Herman)公开了一种含有载体和萜烯的抗病毒组合物。该组合物适合于全身用药或局部用药。
美国专利5,126,376(Herman)公开了一种使用载体中萜烯过氧化物来局部治疗哺乳动物体内病毒感染的方法。
美国专利5,190,977(Herman)公开了一种含有非水载体和萜烯过氧化物的抗病毒组合物，适于全身注射。
美国专利5,190,979(Herman)公开了一种使用载体中萜烯过氧化物来非经肠治疗哺乳动物体内疾病状况的方法。
美国专利5,260,342(Herman)公开了一种使用载体中萜烯过氧化物来非经肠治疗哺乳动物体内病毒感染的方法。
美国专利5,270,344(Herman)公开了一种治疗哺乳动物体内全身性疾病的方法，通过肠道应用三甲沙林或不饱和烃的过氧化物衍生物，其衍生物是通过对溶解于非极性溶剂中的不饱和烃进行过氧化而制备的。
美国专利5,364,879(Herman)公开了一种用于治疗哺乳动物体内疾病状况的组合物，该组合物含有非萜烯不饱和烃的双氧化物或三甲沙林衍生物，其衍生物是通过在低于35℃条件下氧化载体中的不饱和烃。
尽管有关于萜烯用于不同的医疗适应症，但是萜烯过氧化物表现了多种缺陷。例如，单萜的过氧化物(如月桂烯和柠檬烯)在实验室中燃烧。因此，它们在作成制剂或贮存时是非常危险的。
另外，水或二甲基亚砜(″DMSO″)中的香叶醇过氧化物(一种线性单萜醇)在3例病毒水痘带状疱疹和2例单纯性疱疹皮炎的病例中没有显示出任何临床效力。
因此，需要一种安全有效的药物制剂或组合物，利用烯烃化合物的氧化反应产物。同时，需要一种方法刺激对抗自由基形成的线粒体防御并减少糖尿病和肥胖患者的胰岛素抵抗。
发明内容
本发明涉及一种药物制剂，含有使用含氧氧化剂(如臭氧)氧化不饱和有机化合物(液体形式或在溶液中)所得到的过氧化物或反应产物；渗透溶剂；含有螯合金属的染料；和芳香族氧化还原化合物。所述药物制剂的一个实施方式中，必要组分包括通过不饱和醇臭氧分解而形成的过氧化产物；稳定剂；金属卟啉；和醌。本发明还涉及上述药物制剂在治疗糖尿病和肥胖中的应用。
优选的，过氧化物或反应产物是通过烯烃与臭氧反应而形成的。普遍认为烯烃和臭氧之间的反应是按照Criegee机理进行。根据该机理，如下图解1所示，该反应的起始步骤为臭氧与烯烃的1，3-双极环加成作用而生成初级过氧化物(1，2，3-trioxalane)。该初级过氧化物不稳定，经1，3-开环成为一个羰基化合物和一个羰基氧化物。在不存在其他试剂或亲核溶剂的条件下，该新的1，3-偶极子进入第二次1，3-双极环加成作用而生成“正常的”过氧化物-1，2，4-三环氧乙烷(trioxalane)。
图解1在一个副反应中，羰基氧化物能够进行二聚作用而生成过氧化物二聚体，1，2，4，5-四环氧乙烷(tetraoxane)。
图解2
羰基氧化物是较强的亲电物质，在亲核物质(如乙醇或水)存在下，它经过温和的亲核加成反应而生成1-alkoxyhydroperoxide，如下图解3所示。在一定条件下，1-alkoxyhydroperoxide能够经过进一步的反应而生成羧酸衍生物。
图解3不想受理论束缚，在本发明含有乙醇的烯烃的臭氧分解过程中，预期出现下述三个主要类型的过氧化物产物是合理的正常的臭氧化物、羰基四环氧乙烷二聚物和1-alkoxyhydroperoxide。当有水存在时，这些过氧化物产物还可以导致粗品混合物中出现有机过酸。
本发明还涉及使用渗透溶剂(如二甲基亚砜(″DMSO″))来“稳定”臭氧分解的初始产物。同样，不想受任何理论束缚，稳定作用大部分类似于简单的溶剂化现象。但是，已知DMSO正常情况下是一种亲核试剂。它也可能是作为亲核配偶体而参与稳定反应物(例如，作为二甲基硫代氧鎓盐)。本发明药物制剂的稳定的过氧化分子和渗透溶剂是从公认为安全的(″GRAS″)成分所制得。
药物制剂的另外一个组分是螯合染料，如卟啉。金属卟啉使氧在光化激活下感光的特性是公知的，如同与含氧系统相结合的亚铁卟啉和铜卟啉的特性。
药物制剂的另一个组分是芳香族氧化还原化合物，如醌。
尽管不想受任何理论的束缚，但依然提出优选的药物制剂是生化剂的组合，所述生化剂引发了在受感染或异常的巨噬细胞中重复的、自身催化的氧化作用。药物制剂通过非对抗的过氧化作用刺激了靶向细胞凋亡(细胞自杀)。因此，该药物制剂在许多看似不同的线粒体巨噬细胞性疾病中产生治疗作用。特别是，该药物制剂在减少全身胰岛素抵抗、降低血糖反应和提高肌肉葡萄糖吸收方面是有效的，这表明了它在治疗糖尿病和肥胖中的有效性。
图1显示了两组肥胖Zucker鼠的平均体重。一组接受3次药物制剂的注射(实验组)，一组只用生理盐水进行治疗(对照组)。
图2显示了两组肥胖Zucker鼠的血糖浓度，通过口服葡萄糖耐量试验(″OGTT″)检测。一组接受1次药物制剂注射(实验组)，一组只采用生理盐水治疗(对照组)。
图3显示了两组肥胖Zucker鼠的血糖浓度，通过口服葡萄糖耐量试验(″OGTT″)检测。一组接受2次药物制剂注射(实验组)，一组只采用生理盐水治疗(对照组)。
图4显示了两组肥胖Zucker鼠的血糖浓度，通过口服葡萄糖耐量试验(″OGTT″)检测。一组接受3次药物制剂注射(实验组)，一组只采用生理盐水治疗(对照组)。
图5显示了两组肥胖Zucker鼠的葡萄糖吸收，通过后肢灌注法检测。一组接受3次药物制剂注射(实验组)，一组只采用生理盐水治疗(对照组)。
具体实施例方式
本发明涉及药物制剂，含有使用含氧氧化剂，如臭氧，氧化不饱和有机化合物(液体形式或在溶液中)所得到的过氧化物或反应产物；渗透溶剂；含有螯合金属的染料；和芳香族氧化还原化合物。该药物制剂可以用来治疗糖尿病和肥胖症。本发明的一个具体实施方式
中，所述药物制剂的必要组分包括不饱和醇臭氧分解而形成过氧化产物、稳定溶剂、金属卟啉和醌。
药物制剂的不饱和有机化合物(也可以是不饱和烯烃)可以是不含羟基的烯烃或者是含有羟基的烯烃。优选的，所述烯烃的碳原子数小于35。不含羟基的烯烃可以是开链不饱和醇、单环不饱和醇或二环不饱和醇。所述烯烃也可以包含在非挥发油、酯、脂肪酸或醚中。
可用的不饱和烯烃可以是未取代的、取代的、环状的或复合的烯烃、肼、类异戊二烯、类固醇、喹啉、类胡萝卜素、生育酚、异戊烯化或不饱和脂肪。本发明优选的不饱和烃是烯烃和类异戊二烯。
作为精油的组分，类异戊二烯主要存在于植物中。而许多类异戊二烯是烃，含氧类异戊二烯也可以是醇、醛和酮。形式上，类异戊二烯烃类的组成结构可以被视为异戊二烯CH2＝C(CH3)-CH＝CH2，尽管已知异戊二烯本身是类异戊二烯生物合成的终产物而非中间体。类异戊二烯烃类的分类是根据它们所含有的异戊二烯单元(C5H8)数目。因此，单萜类具有2个异戊二烯单元、倍半萜具有3个异戊二烯单元、二萜类具有4个异戊二烯单元、二倍半萜具有5个异戊二烯单元、三萜类具有6个异戊二烯单元、四萜类具有8个异戊二烯单元。四萜更普遍的已知为类胡萝卜素。
柠檬烯和蒎烯是单萜的例子。法尼醇和橙花叔醇是倍半萜醇的例子。维生素A1和叶绿醇是双萜醇的例子，鲨烯是三萜的例子。维生素原A1，已知为胡萝卜素，是四萜的例子。香叶醇，一种单萜醇，其氧结合状态和正常状态都是液体形式并对活细胞是安全的。
用于本发明药物制剂的优选的不饱和烃包括烯烃类异戊二烯，如myricene、citrillene、柠檬醛、蒎烯或柠檬烯。优选的不饱和烃还包括在线性链上具有2-4个重复的异戊二烯基团的线性类异戊二烯醇，如α-萜品醇、香茅醇、橙花醇、叶绿醇、薄荷醇、香叶醇、尨牛儿基尨牛儿醇、芳樟醇或法尼醇。
不饱和有机化合物可以是线性的、分支的、环状的、螺旋形的或者在构型上与其他分子复合的。不饱和有机化合物在与氧化剂结合前可以气态液体或固体状态天然存在。
开链不饱和烃可以是CnH2n，1个双健，n＝2-20；CnH2n-2，2个双健，n＝4-20；CnH2n-4，3个双健，n＝6-20；CnH2n-6，4个双健，n＝8-20；C25H40，二倍半萜烯烃；或C30H48，三萜烯烃。
单环不饱和烃可以是CnH2n-2，1个双健，n＝3-20；CnH2n-4，2个双健和1个环，n＝5-20；CnH2n-6，3个双健和1个环，n＝7-20；C25H40，二倍半萜烯烃；或C30H48，三萜烯烃。
二环不饱和烃可以是CnH2n-4，1个双健和2个环，n＝4-20；CnH2n-6，2个双健和2个环，n＝6-20；C25H40，二倍半萜烯烃；或C30H48，三萜烯烃。
开环不饱和醇可以是CnH2nOm,1个双健，n＝3-20，m＝1-4；CnH2n-2Om，2个双健，n＝5-20，m＝1-4；CnH2n-4Om，3个双健，n＝7-20，m＝1-4；CnH2n-6Om，4个双健，n＝9-20，m＝1-4；C25H40Om，m＝1-4，二倍半萜烯醇；或C30H48Om，m＝1-4，三萜烯醇。
单环不饱和醇可以是CnH2n-2Om，1个双健和1个环，n＝3-20，m＝1-4；CnH2n-4Om，2个双健和1个环，n＝5-20，m＝1-4；CnH2n-6Om，3个双健和1个环，n＝7-20，m＝1-4；C25H40Om，m＝1-4，二倍半萜烯醇；或C30H48Om，m＝1-4，三萜烯醇。
二环不饱和醇可以是CnH2n-4Om，1个双健和2个环，n＝5-20，m＝1-4；CnH2n-6Om，2个双健和2个环，n＝7-20，m＝1-4；C25H40Om，m＝1-4，二倍半萜烯醇；或C30H48Om，m＝1-4，三萜烯醇。
基于药物制剂的总重量，烯烃可以为约0.001％-30％，优选为约0.1％-5.0％，更优选为约0.5-3.0％。
本发明药物制剂的含氧氧化剂(氧化不饱和烃)可以是单态氧、三重态的氧、超氧负离子、臭氧、高碘酸、羟基、过氧化氢、过氧化烃、过氧化氨基酰、过氧化苯甲酰、过渡元素(如钼)结合氧(如MoO5)。
将“活化的氧”与完整的类异戊二烯醇(如香叶醇)相结合的优选方法是通过臭氧化作用，条件为温度0-20℃、黑暗中、不含水或极性溶剂。然后，黑暗条件下将香叶醇“臭氧化物”溶解并稳定于100％DMSO中，来防止产物过早分解。虽然不想受任何理论束缚，但相信香叶醇臭氧化的副产物过氧化四环氧乙烷二聚体(不是一种臭氧化物)在细胞中超氧负离子存在时发生催化分解。最终释放的活性治疗剂是过氧化氢和乙酸。
药物制剂还使用了渗透溶剂。稳定氧合不饱和烃的渗透溶剂可以是软化剂、液体、胶束薄膜或吸入剂。可用的渗透溶剂包括水溶液、脂肪、醇、卵磷脂、磷脂、乙醇、丙二醇、甲硫酰甲烷、聚乙烯吡咯烷酮、pH缓冲盐和二甲基亚砜(″DMSO″)。优选的渗透溶剂包括DMSO、聚乙烯吡咯烷酮和pH缓冲盐。最优选的渗透溶剂是DMSO。
基于药物制剂的总重量，渗透溶剂可以约为50％-99％，优选为90％-98％，更优选为约95％-98％。
“稳定的”过氧化分子及其渗透溶剂从目前受食品药品监督管理局(FDA)管理的生产中所使用的组分而制得。这些成分是药物主文件的(DMF)、药物专论的主题，记载于USP/NF，或者被公认为是安全的(GRAS)。
药物制剂的另一组分是螯合染料。该染料优选为含有螯合的二价或三价金属，如铁、铜、锰锡、镁或锶。优选的螯合金属是铁。发现螯合染料(如金属卟啉)在光化激活条件下有对氧敏感的倾向，如亚铁卟啉和铜卟啉倾向于结合有氧系统。可用的染料包括天然或合成染料。这些染料的例子包括卟啉、玫瑰红、叶绿酸、氯化高铁血红素、卟吩、咕啉、texaphrins、亚甲篮、苏木精、曙红、藻红、黄酮、核黄素、蒽染料、金丝桃素、甲基胆蒽、中性红、荧光素、酞菁、真黑素和嗜黑色素。优选的染料可以是任何天然或合成的卟啉、血卟啉、叶绿酸、玫瑰红、它们各自的同源物、或者上述物质的混合物。最优选的染料是天然生成的卟啉，如血卟啉和玫瑰红。染料可以快速响应光子、激光、电离辐射、声子、电穿孔、磁或等离子脉冲或恒流刺激。
基于药物制剂或组合物的总重量，染料约为0.1％-30％，优选为约0.5％-5％，更优选为0.8％-1.5％。
药物制剂的其他组分为芳香族氧化-还原化合物，如醌。芳香族氧化还原化合物可以是任何取代或非取代的苯醌、萘醌或蒽醌。优选的芳香族氧化还原化合物包括苯醌、甲基苯醌、萘醌和甲基萘醌。最优选的芳香族氧化还原化合物为甲基萘醌。
基于药物制剂的总重量，芳香族氧化还原化合物可以约为0.01％-20.0％，优选的约为0.1％-10％，和更优选为约0.1％-0.5％。
药物制剂优选的被能量或电子给体所激活。有用的电子给体包括等离子体、电流、维生素C或抗坏血酸、三氧化二锗。优选的电子给体包括维生素C和三氧化二锗。最优选的电子给体是任何盐形式的抗坏血酸。
基于药物制剂的总重量，电子给体约为0.01％-20％，优选为1％-10％，更优选为1％-5％。
为获得体内生物学作用，优选的，被注入的药物制剂为不饱和烃经臭氧分解而生成的过氧化产物(不是臭氧化物)与生成螯合染料和芳香醌的超氧化物的交联物。不饱和烃产物或过氧化二聚体分子应该在非水稳定溶剂中被稳定，并且应该能够穿透类脂膜。
高能活性染料疗法的研究者们早已知道生成染料的超氧化物和芳香族氧化还原化合物优选的吸收入被感染和异常的细胞中，所述细胞一般还缺乏过氧化氢酶。不想受理论束缚，但过氧化氢酶诱导的过氧化物分解将在靶细胞中受到抑制，这种抑制的发生是自然地或者由药物制剂引起。过氧化二聚体还可以被超氧化物生成染料所激活，引发对二聚体的电子供给并导致过氧化氢和乙酸的细胞内释放。染料的电子激活作用不总是需要光，它的产生更可能是通过小电脉冲，例如由心脏脉冲提供的小电脉冲。然后，受感染的巨噬细胞中的过氧化反应易于破坏细胞内微管的异戊烯化蛋白键，易于破坏传染毒素，或者易于诱导宿主巨噬细胞的细胞凋亡。
药物制剂是稳定成分的组合。这些成分可以优选的作为干燥固体成分和液体成分而保存在分开的容器中，然后在使用场所混合。干燥固体成分优选的含有螯合染料和芳香族氧化还原化合物。液体成分优选的含有过氧化物或含氧活性剂氧化不饱和烃所得到的反应产物以及渗透溶剂。给药途径优选为静脉注入。重新溶解的产品优选的可以生理盐水浓缩剂静脉给入。牙髓和腹内也是可能的给药途径。肌肉内注射不是优选的方式，因为它易于产生局部刺激。
药物制剂的体内使用能有效减少全身胰岛素抵抗、降低血糖反应、提高肌肉葡萄糖吸收，表明了它在治疗糖尿病和肥胖中的有效性。
实施例1不饱和烃的臭氧分解烯烃的臭氧分解在溶剂或neat中进行。在两种情况下，反应混合物的冷却在避免反应的过氧化产物爆炸性分解中都是关键的。
下述一般程序是液体烯烃臭氧分解的典型程序。
装有磁力搅拌器的1升烧瓶中装入烯烃(2摩尔)，该装置被称重。烧瓶至于冷却浴中(冰-水或冰-盐)。当内容物冷却至5℃以下时，开始搅拌，并将含有臭氧的干燥氧气(一般含3％臭氧)通过混合物。通过玻璃釉料排出含有臭氧的氧气是方便的，但这对于搅拌中的溶液不是必需的。定期中断气体流，进行反应瓶称重或反应混合物取样，之后继续通入气体流。
当反应瓶重量有足够增加时，或者当反应混合物的核磁共振(H1NMR)谱显示烯族质子共振强度的减少达到预期时(一般约减少50％)，停止气体流。
臭氧分解可以如上进行，在对臭氧无反应性的溶剂(如饱和烃或氯化烃)中代替烯烃溶液。臭氧分解也可以如上进行，使用或不使用溶剂，用烯醇代替烯烃，而对反应没有实质影响。
之后，反应混合物被缓缓倒入冷却的渗透溶剂中。
实施例2药物制剂的制备本发明优选的药物制剂制备如下(1)将臭氧/纯氧气体混合物120mg/L鼓泡通过二烯醇，3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇(香叶醇)，1升/小时；(2)反应温度保持在约5℃；(3)每1小时取出小部分反应产物并通过H1NMR检测过氧化物或反应产物的形成；(4)当有50％以上的可用不饱和键反应后，停止反应；(5)用二甲基亚砜稀释产品混合物(1∶10)而形成溶液或分散液；(6)在应用于靶生物系统之前，向所述溶液或分散液中加入足量的血卟啉、玫瑰红和甲基萘醌干燥粉末混合物，在通过盐水静脉注入靶生物系统时，散布在其中的每种组分的浓度为20微摩尔。任选的，可以在使用前将维生素C加入制剂。
实施例3药物制剂的举例两种优选的制剂如下
A.
*通过质谱检测B.
*通过质谱检测实施例4实验操作为检测药物制剂在减少胰岛素抵抗中的有效性，使用3种不同浓度的药物制剂A来治疗肥胖Zucker鼠。
肥胖Zucker鼠(fa/fa)是用来研究胰岛素抵抗的完善的动物模型(Czech等人，1980；Sherman，et al.，1988；Zucker，et al.，1972)。尽管成年早期的基本葡萄糖在胖的和瘦的Zucker鼠之间是相似的，但是胖鼠表现出严重的高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良以及针对葡萄糖刺激产生的血浆胰岛素反应的提高(Cortez等人，1991；Zucker等人，1972)。肌肉胰岛素抵抗在肥胖鼠中也是显著的，正如胰岛素刺激的肌肉葡萄糖吸收和转运的减少所表明的。
通过口服葡萄糖耐量试验(OGTT)来检测经治疗的Zucker鼠的葡萄糖耐受和对葡萄糖刺激的胰岛素反应。该试验之后，通过后肢灌注技术来评价肌肉胰岛素抵抗。注射生理盐水的3只肥胖Zucker鼠作为对照。小鼠被自由喂养，市内保持12小时灯光/黑暗循环，温度69±1℃。
药物制剂通过腹膜注射给药。使用剂量基于药物制剂中的醌的形式(porpho-quinone)。首次剂量为0.04μg/g体重，在3天内连续注射，在最后一次注射后七天，进行OGTT。第二次剂量为0.06μg/g体重，在OGTT之后6天进行注射，注射三天后进行第二次口服胰岛素耐量试验。最后一次经过测试的剂量为0.04μg/g体重，在第二次OGTT之后13天注射。药物制剂的体积保持在大约200μL，通过生理盐水稀释。3次OGTT和后肢灌注在小鼠禁食12小时后进行。
OGTT包括为小鼠灌注500mg葡萄糖/kg体重。葡萄糖在蒸馏水中稀释并调整浓度，以使灌注体积在500μL到900μL之间。在OGTT过程中，从鼠的尾部静脉取样0.5mL血液。抽血时间为葡萄糖灌注之前以及在灌注之后15、45、90和120分钟。两滴血液立即用来检测血糖，使用血糖测试仪(One Touch.RTM.Basic，Lifescan，Inc.，Milpitas，Calif.)。血糖测试仪在应用于本研究之前，通过血糖测试仪和YSI23A血糖分析仪(Yellow Springs Instruments，YellowSprings，Ohio)所获得数据之间的比较而验证了血糖测试仪的效度和信度。根据生产商提供的标准对血糖测试仪进行校准。血糖一经检测，0.5mL血液即被转入含有EDTA(24mg/mL，pH7.4)的试管中。离心血液，使用放射免疫分析试剂盒(Linco，St.Louis，Mo.)来分析血浆中的胰岛素。
用于后肢灌注的外科技术与前述方案相符合(Ivy等人，1986；Sherman等人，1988)。腹主动脉和腔静脉分支的主要血管都被结扎，除了髂动脉和髂静脉。肝素(100U)被注入刚好位于膈膜下方的下腔静脉。注入肝素之后，降主动脉和下腔静脉被插入套管(Ivy等人，1986)。导管与非循环的后肢灌注装置相连，所述装置提供37℃、连续通气(95％O25％CO2)的灌注流(6.0mL/min)。两个后肢在平衡期(5分钟)被灌注，然后将左髂动脉结扎，以使灌注液只流经右后肢。在平衡期之后，有一个25分钟的跟踪期来检测葡萄糖吸收。灌注液包括含有6％牛血清白蛋白(BSA)和0.2mM丙酮酸盐的Krebs-Henseleit缓冲液(″KHB″，pH7.4)。在跟踪期内，灌注液含有6mM葡萄糖、[1，2-3H]2-脱氧葡萄糖(0.05μCi/mL；ICNBiochemicals，Costa Mesa，Calif.)和0.2mU/mL胰岛素(Humulin.RTM.R-100，Eli Lilly，Indianapo1is，Ind.)。在灌注期之后，立即使用35mL KHB导洗后肢，切下右腓肠肌的红白部分和比目鱼肌用Wollenberg tongs冷冻，液氮中冷却并冷冻保藏(-80℃)，待进一步分析。
后肢葡萄糖吸收的测定是通过动脉-静脉葡萄糖差额乘以灌注液流速，再除以被灌注的肌肉重量(μg/(g*h))。为测定个体肌肉中2-脱氧葡萄糖的吸收，60-100mg肌肉溶解于1mL 1N KOH中，65℃保温15分钟，搅拌，然后再65℃保温5分钟。上述水解样品中加入等体积1N HCl，混合，取小份中和后的样品计算[3H]DPM(BeckmanLS 6000SC，Fullerton，Calif.)。根据原始灌注液的特异活性来计算肌肉对2-脱氧葡萄糖的吸收。
实施例5体重和食物消耗每日记录鼠的体重，在给入最高药物剂量后测定小鼠的食物消耗，持续3天。
试验开始时，治疗鼠体重平均为267.7g，对照鼠体重平均为266.7g。在研究结束时，治疗鼠体重为534.3g，对照鼠体重为557.7g。因此，使用药物制剂治疗的鼠对照鼠的体重增加缓慢。图1显示了在第3次注射药物制剂后，治疗鼠和对照鼠的平均体重。
成年肥胖Zucker鼠一般每天吃大约25g的食物。对照鼠的食物消耗未受影响，它们每天消耗21-25g食物。但是，在最后一次药物制剂治疗后的3天内，每天的食物消耗为12g-19g。因此，经药物制剂治疗的鼠还表现出食欲抑制。治疗鼠在注射后每天的食物消耗都在增加，表明上述食欲抑制作用不是持久的。
实施例6口服耐量试验3次OGTT在鼠禁食12小时后进行。
图2显示了治疗鼠和对照鼠在第一次OGTT中的血糖水平。在第1次OGTT过程中，治疗鼠和对照鼠的空腹血糖浓度相似。灌注葡萄糖之后，对照鼠中血糖浓度的增加比治疗鼠中血糖浓度的增加更高。最短在葡萄糖灌注后45分钟内，这种增加是明显的。在禁食过夜后，治疗鼠和小鼠的血浆胰岛素水平相似。在葡萄糖灌注后，两组鼠的血浆胰岛素立即显著增加。但是，治疗鼠中的胰岛素反应回复到基线水平，而对照鼠中胰岛素反应保持增高的状态。因此，尽管在治疗鼠中有较低的血糖反应，它们的血浆胰岛素水平在第一次OGTT过程中都是较低的，这表明胰岛素敏感度的增加。
图3显示了治疗鼠和对照鼠在第2次OGTT中的血糖水平。在第2次OGTT过程中，两组鼠的空腹血糖浓度相似。灌注葡萄糖之后，对照鼠中血糖浓度的增加比治疗鼠中血糖浓度的增加更高。而且，在OGTT后最初的45分钟内，治疗鼠的血糖反应较低。尽管治疗鼠的空腹血浆胰岛素浓度比对照鼠稍微高一些，但是治疗鼠在葡萄糖灌注后胰岛素的升高较低，并且在2小时的OGTT过程中保持较低水平。治疗鼠在OGTT中没有比第一次治疗产生的效果有显著提高。
图4显示了治疗鼠和对照鼠在第3次OGTT中的血糖水平。在第3次OGTT过程中，对照鼠的空腹血糖浓度升高，而治疗鼠的空腹血糖浓度与之前测定结果相似。葡萄糖灌注之后，治疗鼠的葡萄糖反应再次较低，但只是在葡萄糖灌注后45分钟的时候。两组鼠的空腹血浆胰岛素水平相似。但是，治疗鼠的胰岛素反应比对照鼠高。
因此，结果表明，使用剂量为0.04μg/g体重的药物制剂治疗3天，降低了对口服葡萄糖刺激的血糖反应。剂量升高50％或10倍没有表现出具有附加效果。尽管药物制剂治疗组中胰岛素反应较低，依然发生了血糖反应的下降。这表明肥胖Zucker鼠的全身胰岛素抵抗得到了改善。数据还表明极高浓度的药物制剂没有毒性。
实施例7后肢灌注和肌肉葡萄糖吸收图5和表7-1显示了治疗鼠和对照鼠的葡萄糖吸收，通过后肢灌注技术测定。胰岛素刺激的葡萄糖吸收在治疗鼠中比对照鼠中高44％。对2-脱氧葡萄糖吸收的评价表明，鼠的快速颤搐型红白肌具有更高的胰岛素敏感性。两组鼠的比目鱼肌中的2-脱氧葡萄糖吸收没有表现出差别。
表7-1
参考文献下述美国专利文献和出版物以引用方式并入本文。
美国专利美国专利号4,451,480(DeVillez)美国专利号4,591,602(DeVillez)美国专利号4,983,637(Herman)美国专利号5,086,076(Herman)美国专利号5,126,376(Herman)美国专利号5,190,977(Herman)美国专利号5,190,979(Herman)美国专利号5,260,342(Herman)美国专利号5,270,344(Herman)美国专利号5,364,879(Herman)其他出版物Cortez，M.，C.Torgan，J.J.Brozinick，and J.Ivy.Insulinresistance of obese Zucker rats exercise trained at twodifferent intensities.Am.J.Physiol 261E613-619，1991。
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Zucker，L.M.and H.N.Antoniades.Insulin and obesityin the Zucker genetically obese Rat″fatty.″Endocrinology901320-1330，1972。
权利要求
1.一种治疗糖尿病患者的方法，包括为所述患者给入有效量的药物制剂，所述药物制剂包括使用含氧氧化剂氧化薄荷醇或烯烃所得到的过氧化物或反应产物，其中所述烯烃包括α-萜品醇、香茅醇、橙花醇、芳樟醇、叶绿醇、香叶醇、紫苏醇、薄荷醇、尨牛儿基尨牛儿醇或法尼醇，其中所述过氧化物或反应产物占所述药物制剂总重量的0.001-30％；渗透溶剂，包括二甲基亚砜、甾醇、卵磷脂、丙二醇或甲硫酰甲烷，占所述药物制剂总重量的50-99％；含有螯合二价或三价金属的染料，所述染料包括卟啉、玫瑰红、叶绿酸、氯化高铁血红素、咕啉、texaphrin、亚甲篮、苏木精、曙红、藻红、核黄素、蒽染料、金丝桃素、甲基胆蒽、中性红、荧光素、酞菁、真黑素或嗜黑色素，占所述药物制剂总重量的0.1-30％；和芳香族氧化还原化合物，包括取代或非取代的苯醌、萘醌或蒽醌，占所述药物制剂总重量的0.01-20％。
2.权利要求1所述的方法，其中所述烯烃是液体形式、在溶液中或者在分散液中。
3.权利要求1所述的方法，其中所述烯烃包含在非挥发油、酯、脂肪酸或醚中。
4.权利要求1所述的方法，其中所述含氧氧化剂包括单态氧、三重态的氧、超氧负离子、高碘酸、羟基、过氧化氢、过氧化烃、过氧化氨基酰、过氧化苯甲酰、与过渡元素结合的氧。
5.权利要求1所述的方法，其中所述含氧氧化剂包括臭氧。
6.权利要求1所述的方法，其中所述渗透溶剂是液体、胶束薄膜、软化剂或吸入剂。
7.权利要求1所述的方法，其中所述渗透溶剂是二甲基亚砜。
8.权利要求1所述的方法，其中所述染料包括卟啉、玫瑰红、叶绿酸或它们的混合物。
9.权利要求1所述的方法，其中所述金属包括铁。
10.权利要求1所述的方法，其中所述金属包括铜、锰、锡、镁或锶。
11.权利要求1所述的方法，进一步包括电子给体。
12.权利要求11所述的方法，其中所述电子给体包括抗坏血酸或其药用盐。
13.一种治疗糖尿病患者的方法，包括为所述患者给入有效量的药物制剂，所述药物制剂包括使用臭氧和氧气的混合物氧化香叶醇所得到的过氧化物或反应产物；二甲基亚枫；含有螯合二价或三价金属的染料，其中所述染料含有血卟啉和玫瑰红的混合物或者血卟啉和叶绿酸的混合物；和甲萘醌。
14.一种治疗肥胖症患者的方法，包括为所述患者给入有效量的药物制剂，所述药物制剂包括使用含氧氧化剂氧化薄荷醇或烯烃所得到的过氧化物或反应产物，其中所述烯烃包括α-萜品醇、香茅醇、橙花醇、芳樟醇、叶绿醇、香叶醇、紫苏醇、薄荷醇、尨牛儿基尨牛儿醇或法尼醇，其中所述过氧化物或反应产物占所述药物制剂总重量的0.001-30％；渗透溶剂，包括二甲基亚砜、甾醇、卵磷脂、丙二醇或甲硫酰甲烷，占所述药物制剂总重量的50-99％；含有螯合二价或三价金属的染料，所述染料包括卟啉、玫瑰红、叶绿酸、氯化高铁血红素、咕啉、texaphrin、亚甲篮、苏木精、曙红、藻红、核黄素、蒽染料、金丝桃素、甲基胆蒽、中性红、荧光素、酞菁、真黑素或嗜黑色素，占所述药物制剂总重量的0.1-30％；和芳香族氧化还原化合物，包括取代或非取代的苯醌、萘醌或蒽醌，占所述药物制剂总重量的0.01-20％。
15.权利要求14所述的方法，其中所述烯烃是液体形式、在溶液中或者在分散液中。
16.权利要求14所述的方法，其中所述烯烃包含在非挥发油、酯、脂肪酸或醚中。
17.权利要求14所述的方法，其中所述含氧氧化剂包括单态氧、三重态的氧、超氧负离子、高碘酸、羟基、过氧化氢、过氧化烃、过氧化氨基酰、过氧化苯甲酰、与过渡元素结合的氧。
18.权利要求14所述的方法，其中所述含氧氧化剂包括臭氧。
19.权利要求14所述的方法，其中所述渗透溶剂是液体、胶束薄膜、软化剂或吸入剂。
20.权利要求14所述的方法，其中所述渗透溶剂是二甲基亚砜。
21.权利要求14所述的方法，其中所述染料包括卟啉、玫瑰红或它们的混合物。
22.权利要求14所述的方法，其中所述金属包括铁。
23.权利要求14所述的方法，其中所述金属包括铜、锰、锡、镁或锶。
24.权利要求14所述的方法，进一步包括电子给体。
25.权利要求24所述的方法，其中所述电子给体包括抗坏血酸或其药用盐。
26.一种治疗肥胖症患者的方法，包括为所述患者给入有效量的药物制剂，所述药物制剂包括使用臭氧和氧气的混合物氧化香叶醇所得到的过氧化物或反应产物；二甲基亚枫；含有螯合二价或三价金属的染料，其中所述染料含有血卟啉和玫瑰红的混合物或者血卟啉和叶绿酸的混合物；和甲萘醌。
全文摘要
本发明公开了一种药物制剂及其应用。该药物制剂含有使用含氧氧化剂，如臭氧，氧化烯烃所得到的过氧化物或反应产物，如香叶醇；渗透溶剂，如二甲基亚枫；含有螯合金属的染料，如血卟啉；和芳香族氧化还原化合物，如苯醌。该药物制剂用于有效治疗糖尿病和肥胖患者。
文档编号A61K31/555GK101027087SQ200580022437
公开日2007年8月29日 申请日期2005年5月5日 优先权日2004年5月6日
发明者罗伯特·F·霍夫曼 申请人:罗伯特·F·霍夫曼