专利名称：肥胖症遗传检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体肥胖症遗传易感性的试剂盒， 通过同时检测与肥胖症密切相关的载脂蛋白B基因(AP0B)、瘦素基因(LEP)、脂迮白脂酶基因(LPL)、 解偶联蛋0 2基因(UCP2)上的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体肥胖症遗传易感性。
背景技术：
肥胖是指体内脂肪堆积过多和/或分布异常，体重增加，是一种多因素的慢性代谢性疾病。遗传因素、 高热量、高脂饮食、体力活动少是肥胖的主要原因。世界卫生组织(WHO)己将肥胖定为一种疾病，它与高 血压、高脂血症、2型糖尿病、动脉粥样硬化等疾病有非常密切的关系，肥胖导致这些疾病的患病率和死 亡率急剧上升。
肥胖是一种与遗传因素及生活方式密切相关的慢性疾病。不同个体由于遗传体质及生活环境各异，导 致其肥胖的高危因子也不同，并且进行体重控制的有效形式也存在差异。因此，了解自身遗传状况，不仅 可以通过饮食结构和生活方式的调整避免肥胖和超重的发生，还能通过针对性的措施，有效地控制体重， 维护身心健康。
APOB基因编码的载脂蛋白B(ApoB)是乳糜微粒和低密度脂蛋白(LDL)最主要的转运蛋白。该蛋白可 以形成低密度脂蛋白胆固醇，通过肝脏细胞表面的低密度脂蛋白受体(LDLR)介导的细胞内吞作用将脂质代 谢的残余物进行清除。已有的研究发现APOB基因上的多个多态位点的改变而引超的基因结构变化可能导 致编码的载脂蛋白B(ApoB)和胆固醇结合后的脂蛋白复合物与肝脏细胞上的低密度脂蛋白受体结合能力下 降，导致低密度脂蛋白胆固醇类在血桨中淤积，发生高脂血症及肥胖。当携带风险基因型时，低密度脂蛋 白与肝细胞上受体结合能力偏低，血液内甘油三脂和胆固醇清除速度减慢，造成甘油三脂和胆固醇在体内 的积累，无法正常排出体外，影响机体脂质代谢平衡，增加肥胖的发生风险。
LEP基因编码瘦素蛋白，主要由脂肪组织产生，在食欲控制、脂肪代谢和体重调节中发挥重要作用。 瘦素主要作用在中枢神经系统，尤其是下丘脑来影响食物摄取。瘦素的生物学作用是通过其受体来实现的， 它的受体主要表达在下丘脑。瘦素的水平与体重指数(BMI)和脂肪含量百分比有关。瘦素具有双重作用， 它在降低食欲的同时也能增加能量消耗，导致更多的脂肪燃烧。LEP基因的突变会导致瘦素缺乏，从而引 起肥胖。当携带风险基因型时，低密度脂蛋白与肝细胞上受体结合能力偏低，血液内甘油三脂和胆固醇清 除速度减慢，造成甘油三脂和胆固醇在体内的积累，无法正常排出体外，影响机体脂质代谢平衡，增加肥 胖的发生风险。
LEP基因编码瘦素蛋白，主要由脂肪组织产生，在食欲控制、脂肪代谢和体重调节中发挥重要作用。 瘦素主要作用在中枢神经系统，尤其是下丘脑来影响食物摄取。瘦素的生物学作用是通过其受体来实现的， 它的受体主要表达在下丘脑。瘦素的水平与体重指数(BMI)和脂肪含量百分比有关''。瘦素具有双重作用， 它在降低食欲的同时也能增加能量消耗，导致更多的脂肪燃烧。LEP基因的突变会导致瘦素缺乏，从而引 起肥胖。当携带风险基因型时，瘦素活性下降，不能正常激活抑食神经元POMC/CART并抑制促食神经元 NPY/AGRP，食欲增强，能量摄取过量，脂肪合成增加，最终导致肥胖发生风险增加.。
LPL基因编码的脂蛋白脂酶是脂蛋白降解过程中的关键酶，主要在脂肪组织、心肌、骨胳肌中表达和 合成，白色脂肪组织中的LPL蛋白活性增高有助于机体脂质的贮存，骨胳肌LPL蛋白活性升高则有利于 机体氧化产能，两者的平衡失调是机体肥胖或体重减轻的重要原因。脂蛋白脂酶主要分解乳糜微粒和极低 密度脂蛋白(VLDL)中的TG。LPL基因HindIII位点的多态性可能通过影响LPL活性使富含TG的脂蛋白分 解代谢异常，表现为TG水平的增高。脂蛋白脂酶介导的脂解作用还可促进脂蛋白间的脂质交换，将乳糜 微粒和VLDL中的磷脂和载脂蛋白转移至HDL,使HDL体积增大。当携带风险基因型时，基因上出现 HindIII酶切位点，将促进脂肪的向心性聚积，发生肥胖风险增加。
在正常情况下线粒体内膜有一定程度的质子泄漏，使线粒体内膜的跨膜电化学梯度(A u H+)减低，致使 剌激线粒体呼吸的质子驱动力降低，OXPHOS解偶联,使ADP磷酸化为ATP减少,能量以热的形式释放。 UCP2被发现对成人体重相关的一些调节因子有影响作用。成人静息能量消耗(rating energy expenditure,简写REE)，体重增长，并且连身体中的脂肪比例都被发现与UCP2的基因位点有关。当携带风险基因型 时，线粒体解偶联蛋白浓度偏低，在使ADP磷酸化为ATP的过程中，能量释放减少，脂质代谢紊乱和能 量代谢失衡，最终导致肥胖发生。
发明内容
基于载脂蛋白B基因(AP0B)、瘦素基因(LEP)、脂蛋白脂酶基因(LPL)、解偶联蛋白2基因(UCP2) 上的4个SNP位点多态性可用来评估个体肥胖症遗传易感性的基础上，本发明提供'一种检测个体肥胖症遗 传易感性的试剂盒。
该试剂盒包括
检测AP0B基因上Xbal SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对 检测LEP基因上G132A SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测LPL基因上HindIII SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测UCP2基因上Ala55Val SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、反应缓冲液、去离子水等)。 本试剂盒中所述的引物对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，并可用常规的合成技术进行合成。 .本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对可用 常规的探针合成技术进行合成。
本发明试剂盒的组分和含量包括
10 X荧光定量PCR反应缓冲液4^1,
25rnM dNTP混合液0.4^1，
25mM MgC12溶液2. 4^1，
5units/Vl Taq DNA聚合酶0. Ol(il,
20MM特异性引物对每条引物各0.225nl，
l(Ml特异性荧光探针对每条探针各0.25nl，
去离子水21.3nl。 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，分别进行4次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为 总体积10nl，包含浓度为20ng/nl的DNA模板2^1、 lpl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0. 1^1 25mM dNTP 混合液、0.6^1 25mM MgCl2溶液、0.025" (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20pM的有义引物和反义引物 各0.225nl、 KHiM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25^1，去离子水5.325nl。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为5(TC、 2分钟，95。C、 IO分钟，进行60个循环的95°C、 30秒， 60°C、 l分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
.步骤4:基因型分析 根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.应用检测试剂盒进行个体肥胖症遗传易感性检测的服务 步骤l: DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DNA抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的AP0B基因上Xbal SNP位点、LEP基因上G132ASNP 位点、LPL基因上HindIII SNP位点和UCP2基因上Ala55ValSNP位点进行荧光定量PCR检测，确定这4个 SNP位点的基因型。
步骤3:个体肥胖症遗传易感性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具个体肥胖症遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了被 检测者肥胖症遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体肥胖症遗传易感性分析报告单。'
权利要求
1.一种检测个体肥胖症遗传易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测载脂蛋白B基因(APOB)上XbaI SNP位点、瘦素基因(LEP)上G132A SNP位点、脂蛋白脂酶基因(LPL)上HindIII SNP位点、解偶联蛋白2基因(UCP2)上Ala55Val SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括IOX荧光定量PCR反应 缓冲液糾，25raMdNTP混合液0.糾，25mMMgC12溶液2.糾，5units/W Taq DNA聚合酶20PM 特异性引物对每条引物各0.225W, IO幽特异性荧光探针对每条探针各0.25ri，去离子水21.3W。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
全文摘要
本发明公开了一种检测肥胖症遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测载脂蛋白B基因(APOB)、瘦素基因(LEP)、脂蛋白脂酶基因(LPL)、解偶联蛋白2基因(UCP2)上的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与肥胖症遗传风险密切相关的基因上的多态性位点基因型来评估个体肥胖症遗传风险。
文档编号G01N21/64GK101608223SQ20081003926
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司