专利名称：嘌呤和嘧啶cdk抑制剂及其用于治疗自身免疫性疾病的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗与抗核抗体有关的疾病的方法。更明确地但非排它地，本发明涉及治疗自身免疫性风湿疾病，例如人类系统性红斑狼疮(SLE)，的方法，以及药物组合物及其组合。
背景技术：
免疫系统的目的是保护机体免受潜在有害物质(抗原)，例如微生物、毒素、癌细胞和来自另外一个人或物种的外来血液或组织的危害。通过免疫反应将抗原摧毁，其中免疫反应包括抗体(与抗原结合并使之更容易被破坏的分子)的产生和淋巴细胞(识别和破坏特殊抗原的特异白细胞)的激活。
当免疫反应不恰当、过多或缺乏时，便会出现免疫系统疾病。自身免疫性疾病是指任何以免疫系统功能失常为特征的疾病，其导致免疫系统产生抗自身组织的抗体。这是由超敏反应造成的，其中免疫系统对通常可以忽略的物质，也就是正常的“自身”机体组织，发生反应。
正常情况下，免疫系统能够区分“自身”与“非自身”组织。一些免疫系统细胞(淋巴细胞)会变得对“自身的”组织细胞敏感，但是这些错误的淋巴细胞通常受其它淋巴细胞的控制(抑制)。当这种正常的控制过程被打乱，或者如果正常的机体组织发生改变使得它不再被视为“自身的”时，便会发生自身免疫疾病。
自身免疫疾病典型地会导致一种或多种类型的机体组织被破坏，器官异常生长，或者器官功能改变。该疾病可以只影响一个器官或组织类型，或者可以影响多个器官或组织。受自身免疫疾病影响的常见器官和组织包括血液成分(如红细胞)，血管、结缔组织、内分泌腺(如甲状腺或胰腺)，器官(如肾或肝)，肌肉、关节和皮肤。
自身免疫或与自身免疫相关的疾病的实例包括桥本甲状腺炎、恶性贫血、阿狄森氏病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、斯耶格伦综合征、药物诱发红斑狼疮、多种硬化症、重症肌无力、赖特综合征和格雷氏疾病。
自身免疫性疾病的症状根据疾病类型有很大不同。然而，自身免疫性疾病常常伴随有非特异性症状，例如疲劳、头昏眼花、身体不适(非特异性的不适感觉)、发烧和低热(low-grade temperature elevations)。
特异的自身免疫性疾病会导致某个器官或组织被破坏，造成器官或组织的功能降低(例如在糖尿病中，胰腺的胰岛细胞被破坏)，和/或器官或组织的尺寸增大(例如在格雷夫病中，甲状腺增大)。症状随着特定的疾病和受影响的器官或组织而有很大不同。
自身免疫可以通过对免疫系统进行平衡抑制而加以控制。其目的是减少对正常机体组织的免疫反应，而保留完整的对微生物和异常组织的免疫反应。临床治疗自身免疫性疾病典型地包括使用降低免疫反应的皮质甾类和免疫抑制剂(包括环磷酰胺或硫唑嘌呤)。然而，目前可以获得的许多治疗都伴有严重的副作用。
本发明试图提供用于治疗自身免疫性疾病的替代疗法，其理想地能够减轻症状和控制自身免疫过程，同时保留对抗疾病的能力。更特别地，本发明涉及治疗与抗核抗体有关的疾病，特别是自身免疫性疾病，例如人类系统性红斑狼疮。本发明还试图提供适合于治疗这些疾病的药物组合和组合物。
发明内容
本发明的第一方面涉及使用CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂或其药物可接受的盐制备药物，用于治疗与抗核抗体有关的疾病，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐的给药量足以下调抗核抗体的水平。
本发明的第二方面涉及治疗与抗核抗体有关的疾病的方法，所述方法包括向对象给药一定剂量的CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐，其用量足以下调抗核抗体的水平。
本发明的第三方面涉及通过下调对象体内抗核抗体的水平治疗与抗核抗体有关的疾病的方法，所述方法包括向所述对象给药一定剂量的CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐，其用量足以下调抗核抗体的水平。
本发明的第四方面涉及通过下调对象体内抗核抗体的水平治疗与抗核抗体有关的疾病的方法，所述方法包括给药CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐，从而治疗所述疾病。
本发明的第五方面涉及下调对象体内抗核抗体水平的方法，所述方法包括向所述对象给药一定剂量的CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐，其用量足以下调抗核抗体的水平。
本发明的第六方面涉及下调细胞内抗核抗体水平的方法，所述方法包括使所述细胞与一定剂量的CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐相接触，其用量足以下调所述细胞内抗核抗体的水平。
本发明的第七方面涉及用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物组合物，所述组合物包括CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂，其用量足以下调抗核抗体的水平，并与药物可接受的稀释剂、赋形剂或载体混合。
本发明的第八方面涉及包括CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐与甲强龙(methylprednisolone)的组合。
本发明的第九方面涉及一种药物组合物，其包括根据本发明的组合和药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的第十方面涉及一种药物产品，其包括组合制备的CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐和甲强龙，它们在治疗中同时、顺次或分开使用。
本发明的第十一方面涉及一种药物组合物，其包括CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐；和甲强龙；与药物可接受的稀释剂、赋形剂或载体进行混合。
本发明的第十二方面涉及一种根据本发明的组合，用于制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物。
本发明的第十三方面涉及使用CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物，其中该药物用于和甲强龙组合使用。
本发明的第十四方面涉及使用甲强龙制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物，其中该药物用于和CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐组合使用。
本发明的第十五方面涉及使用CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐和甲强龙制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物。
本发明的第十六方面涉及使用CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物，其中所述治疗包括同时、顺次或分开地向对象给药CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐和甲强龙。
本发明的第十七方面涉及治疗对象中与抗核抗体有关的疾病的方法，所述方法包括向对象给药治疗可以接受剂量的CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐；和甲强龙。
为了容易参考，现在将以合适的部分标题讨论本发明的这些和进一步的方面。然而，每个部分的讲授内容不必仅限于每个具体的部分。
发明详述CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂本发明涉及使用一种或多种CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂。为了避免出现疑问，该抑制剂可以是CDK2、CDK7或CDK9中任一项的抑制剂，或其任意组合的抑制剂。
在一个优选实施方案中，该抑制剂是CDK2的抑制剂。
在另一个优选实施方案中，该抑制剂是CDK7的抑制剂。
在另一个优选实施方案中，该抑制剂是CDK9的抑制剂。
在另一个优选实施方案中，该抑制剂是CDK7和CDK9的抑制剂。
用于检测CDK活力的方法对于本领域技术人员而言是熟知的。进一步的细节在附加实施例部分中列出。
优选地，抑制剂对于一种或多种CDK2、CDK7或CDK9的IC50值小于1mM，更优选的小于100μM，再优选地小于50μM，更加优选的小于25μM，更加优选的小于10μM，再更加优选的小于1μM或0.5或0.1μM。
CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的合适实例包括嘌呤衍生物，例如在EP 0874847B(CNRS)，WO 03/002565(Cyclacel Limited)，WO04/016613(Cyclacel Limited)和WO 04/016612(Cyclacel Limited)中公开的；和嘧啶衍生物，例如在WO 01/72745，WO02/079193，WO 03/029248，WO04/043953(均以Cyclacel Limited的名义)公开的。
在本发明的一个优选实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂从如下物质及其药物可接受的盐中选择
在一个特别优选的实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂从化合物[1]-[2]，[5]-[8]，[11]和[12]中选择。
在另一个特别优选的实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂从化合物[4]，[9]和[10]中选择。
在另一个特别优选的实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂是化合物[7]。
目前为止，尚没有暗示表明CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂能够有效地降低抗核抗体的水平。在技术上也没有任何指导或暗示表明这些抑制剂能够与甲强龙组合治疗使用，用于治疗自身免疫疾病。
在一个优选实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂选自roscovitine、奥罗莫星和purvalanol A。
在本发明更加优选的实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂是roscovitine。
Roscovitine或2-[(1-乙基-2羟乙基)氨基]-6-苄氨基-9-异丙基嘌呤也被称作2-(1-D，L-羟甲丙氨基)-6-苄氨基-9-异丙基嘌呤。正如这里使用的，术语“roscovitine”包括溶解的R和S对映体、其混合物及其外消旋物。
正如这里使用的，术语“CYC202”是指roscovitine的R对映体，即2-(1-R-羟甲丙氨基)-6-苄氨基-9-异丙基嘌呤，结构如下所示。
roscovitine的体外活性如下
尽管在本领域中已有使用roscovitine治疗自身免疫疾病的证明，但是迄今为止，尚没有称其能够有效地降低抗核抗体水平的提议。在技术上也没有任何指导或暗示表明roscovitine能够与甲强龙在组合治疗中使用，来治疗自身免疫性疾病。
对于本发明的所有实施方案，roscovitine的优选形式为R对映体，即2-(1-R-羟甲丙氨基)-6-苄氨基-9-异丙基嘌呤，下文称作“CYC202”。
治疗活性如上所述，本发明涉及使用CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐制备药物，用于治疗与抗核抗体有关的疾病，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐的给药量足以下调抗核抗体的水平。
抗核抗体(ANA)是不常见的抗体，在血液中可以检测到，具有与细胞核内的某些结构结合的能力。ANA能够在免疫系统容易对自身机体组织造成炎症的患者体内发现。可引导抗自身组织的抗体被称作自身抗体。免疫系统对抗自身机体的倾向被称作自身免疫。
抗核抗体的存在是自身免疫疾病的标志。抗核抗体包括多种抗体，它们通常定向于含有蛋白质和核酸成分的大细胞复合物。最经常发生的是，抗核抗体与DNA-蛋白或RNA-蛋白复合物的成分发生反应[Van Venrooij W.J.等；Von Mulen C.A.等]。研究表明，这些自身抗体通常是高滴定度、高亲和性的IgG抗体，它们的产生依赖于T-细胞，并受宿主抗原驱动[Reichlin M.等]。
对于一种被定义为自身免疫的疾病，组织破坏必须显示是由于对自身抗原的适应性免疫反应造成的。自身免疫疾病能够受到自身抗体和/或自身反应性T细胞的介导，并且组织破坏的原因可以是对具有抗原的细胞的直接攻击、免疫复合物的形成或局部发炎。T细胞可与炎症或细胞破坏直接相关，它们还是维持自身抗体反应所必需的。类似地，B细胞可能是保持自身抗原特异性T细胞反应的重要抗原呈递细胞。
CD4T细胞选择性激活与抗原决定基结合的B细胞，其中该抗原决定基和被T细胞识别的肽物理连接。因此，自身反应性B细胞和自身反应性T细胞都是自身免疫相关疾病所必需的。
抗核抗体的产生只能在体内进行研究，因为这些抗体的产生需要功能失常的免疫系统，包括B和T细胞，和不能选择和破坏识别自身的免疫细胞。
T细胞功能的体外检验是鉴定具有在自身免疫性疾病的复杂情况下调节免疫反应的能力的化合物的适当筛选工具。其中的一种检验是T细胞增殖检验，其进一步的细节在附加实施例中给出。在涉及抗核抗体产生的自身免疫性疾病中，需要正常的T细胞功能，以便通过B细胞刺激自身抗体的产生。因此，影响T细胞功能的化合物(T细胞功能的一个测量是响应免疫刺激物进行增殖的能力)会通过控制T细胞与B细胞通讯的能力，并通过阻止T细胞迁移到自身免疫破坏的位置，而防止自身抗体的形成。
在本文中，术语“抗核抗体”同时包括抗DNA抗体、抗RNA抗体和直接定向于抗蛋白核成分的抗体。与抗核抗体有关的疾病包括自身免疫性风湿病和器官特异性自身免疫。
优选地，自身免疫性风湿病选自药物诱发的狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)和风湿性关节炎。
风湿性关节炎是一种慢性疾病，其包括关节和/或其它内部器官的膜发炎。风湿性关节炎是一种系统性疾病，其影响整个肌体，是关节炎最常见的形式之一。其特征在于，关节滑膜发炎，造成疼痛、僵硬、发热、发红和肿胀。发炎的关节膜滑膜会侵入并破坏骨骼和软骨。发炎细胞释放能够消化骨骼和软骨的酶。所涉及关节的形状和对准(alignment)会松弛，导致疼痛和运动丧失。症状典型地包括关节发炎、肿胀、运动困难和疼痛。其它的症状包括食欲下降、发烧、精力下降和贫血。
迄今为止，治疗方法集中于减轻疼痛、减少发炎、停止或减慢关节损伤、和提高患者机能和舒适度。药物可以分成两类(i)对症药(例如NSAIDS、阿司匹林、镇痛药和皮质甾类)，其有助于减少关节疼痛、僵硬和肿胀；和(ii)缓解疾病的抗风湿药，例如低剂量的氨甲蝶呤、来氟米特、D-青霉胺、柳氮磺吡啶、金疗法、二甲胺四环素、咪唑硫嘌呤、羟化氯喹(和其它抗疟药)、环孢霉素和生物剂。
更优选地，自身免疫性风湿病是系统性红斑狼疮(SLE)。
系统性红斑狼疮在一个优选实施方案中，本发明涉及治疗系统性红斑狼疮(也称作播散性红斑狼疮；SLE；狼疮；红斑狼疮)，它是一种慢性炎性自身免疫疾病，影响许多器官系统，包括皮肤、关节和内脏。尽管患有该疾病的人可以有多种不同的症状，但是最常见的一些症状包括极度疲劳、关节疼痛或肿胀(关节炎)、无法解释的发烧、皮疹和肾脏问题。目前尚没有治疗SLE的方法。
该疾病对女士的影响是男人的9倍，并且似乎在非洲裔人群中更加普遍。它可以在任何年龄发生，但经常在10-50年龄段的人群中出现。SLE还可以由某些药物导致。当由药物诱发时，称作药物导致的红斑狼疮，通常它在药物停止之后是可逆的。
该病的进程可从轻微偶发性疾病到严重的致命性疾病。在一个特定个体中，随着时间，其症状也有很大不同，其特征为有好转期和恶化期。狼疮最常见的一些症状包括关节疼痛或肿胀(关节炎)、无法解释的发烧和极度疲劳。狼疮的其它症状包括乳房疼痛、脱发、贫血(红细胞降低)、口腔溃疡和在寒冷和应激情况下手指和脚趾变灰或变紫。一些人还会经历头痛、头昏眼花、抑郁、精神错乱或癫痫。在初始诊断之后多年可能会继续出现新的症状，并且在不同的时间会出现不同的症状。在开始时，只有一个器官被波及。之后其他的器官也会被波及。
狼疮的特点是存在许多疾病周期，称作突发期，和良好期，或缓解期。典型地，一旦诊断有SLE，医生将根据患者的年龄、性别、健康状况、症状和生活方式制定一个治疗计划。在制定治疗计划中，医生有多个目的防止突发，在发生时进行治疗，和使器官破坏和并发症最小化。
迄今为止，有大量不同的用于SLE患者的治疗方法。对于具有关节或乳房疼痛或发烧的人，经常使用被称作非甾体抗炎药(NSAID)的药物减轻炎症。NSAID的常见副作用可包括肠胃不适、胃灼热、腹泻和体液潴留。一些患者还产生肝、肾、或者甚至神经并发症。
抗疟药是另一种常用于治疗狼疮的药物。尽管它们一般用于治疗疲劳、关节疼痛、皮疹和肺炎，但是临床研究发现，持续用抗疟药治疗可以防止突发的再发生。抗疟药的副作用可包括胃部不适和极少见的眼视网膜损伤。
狼疮的主要治疗方法包括使用皮质甾类激素。通过迅速抑制炎症起效的皮质甾类能够经口、应用于皮肤的乳膏、或通过注射给药。皮质甾类的短期副作用包括肿胀、食欲增加和体重增加。这些副作用一般在停药之后消失。然而，这样会经常存在突然停止使用皮质甾类的危险，因此在较长时间之后需要让患者断绝使用它们。皮质甾类的长期副作用包括皮肤白纹(stretchmark)、骨骼脆弱或破坏(骨质疏松和骨坏死)、高血压、动脉损伤、高血糖(糖尿病)、感染和白内障。典型地，服用的剂量越高、时间越长，副作用的危险和严重程度越大。
对于肾脏或中枢神经系统受到狼疮影响的患者，可以使用免疫抑制剂。免疫抑制剂通过阻断免疫细胞的产生抑制过度活跃的免疫系统。副作用可以包括恶心、呕吐、脱发、膀胱疾病、生育力下降和癌症和感染的危险增加。副作用的危险随着治疗的长度而增加。与其它用于治疗狼疮的方法药物相同，在停用免疫抑制剂之后存在复发的危险。
本发明提供了一种用于SLE和其他自身免疫性风湿病的替代疗法。特别地，本发明的目的在于提供免疫抑制剂和类固醇的替代治疗，其至少在疾病的急性期具有优异的治疗效果，同时主要的长期副作用较小。
体内研究在小鼠体内进行研究，考察CYC202和CYC202/甲强龙组合的疗效。
NZB/W F1杂交小鼠会自发产生表明人类系统性红斑狼疮的严重自身免疫性疾病。该疾病的形成证据是形成早期抗核抗体，出现伴有蛋白尿的免疫复合物肾小球性肾炎，和经过一段时间之后发展成为肾功能不全，这还会导致小鼠夭折。最突出的疾病可能是T和B细胞功能失常，并伴有抗核和内源抗原(包括核小体、DNA与组蛋白复合物)的自身抗体的产生。
在体内，核小体通过凋亡产生，而在狼疮患者体内，凋亡过程似乎受到干扰。在凋亡细胞清除不充分的情况下，核小体起到自身抗原的作用，驱动T细胞依赖的免疫反应，该反应的关键成分是核小体特异的抗体和核小体/IgG复合物。这些物质与肾小球基底膜的固有成分结合，并促进发炎。肾脏固有的和渗入的细胞会产生过多的细胞因子和化学引诱物，放大并使免疫复合物介导的伤害永久持续下去。
组织学上，NZB/W小鼠体内肾小球的改变包括与病灶性(focal)毛细血管外增生有关的毛细血管内细胞过多症；在肾小球膜内和在肾小球基底膜(GBM)的内皮下侧上可检测到免疫型沉淀物。肾小管损伤、间质性炎和纤维化都较严重。
更多的证据显示，正(细胞周期素和细胞周期素依赖的激酶)和负(细胞周期素依赖的激酶抑制剂)细胞周期调节蛋白在调节细胞对免疫和非免疫形式伤害的反应中，包括细胞增殖和凋亡，具有至关重要的作用。固有肾小球细胞(例如肾小球膜细胞)的增殖是对免疫介导的肾小球损伤，例如IgA肾病、狼疮和膜增殖性肾小球肾炎的特征性反应。在以肾小球膜细胞增殖为特征的实验性膜增生性肾小球肾炎(Thy肾炎)中，正细胞周期蛋白(细胞周期素D、E、A)的表达以及CDK2蛋白水平和活性增加。在该模型中，抑制CDK2可降低肾小球膜细胞的增殖和基质蛋白的积累以及提高肾脏机能。
本申请人的体内研究显示，从2月龄开始用200和100mg/kg剂量的CYC202处理的NZB/W F1小鼠的存活时间显著长于用载体处理的小鼠(P＜0.05)。在研究结束时(8个月)，用载体处理的NZB/W小鼠只有4/13(31％)存活，而用200和100mg/kg CYC202处理的小鼠则分别有10/13(77％)和10/14(71％)存活。在从5月龄开始用CYC202(100mg/kg)处理的小鼠组中，存活率与载体处理的小鼠没有差异。
在本发明的一个优选实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的用量足以延迟蛋白尿和肾功能损伤的发生时间。
在所有实验组中，在疾病的不同阶段评估具有重度蛋白尿(＞4mg/天)的小鼠的累积百分比。在载体组中，具有蛋白尿的小鼠的百分比随着时间逐渐增加。在研究结束时，蛋白尿小鼠的百分比为85％。与载体相比，在2月龄开始预防给药CYC202能够以剂量依赖的方式显著延迟蛋白尿的发生(％蛋白尿小鼠，8个月200mg/kg，23％，与载体相比P＜0.01；100mg/kg，43％，与载体相比P＜0.05)。当从5月龄开始向狼疮小鼠给药CYC202时，可以看到与载体相比具有降低蛋白尿小鼠百分比的趋势，但是没有达到统计学显著的程度。
在5个月和8个月，通过血清血液尿素氮(BUN)评价肾脏功能。在5个月时，所有实验组的血清BUN水平处于正常范围(＜29mg/dl)。在载体组中，肾脏功能随着时间而退化，在8个月时，50％的存活小鼠的BUN水平≥30mg/dl。从2月龄开始预防给药CYC202可使狼疮小鼠的肾功能更好，但是当从5月龄开始给药时，则没有效果。
在本发明的一个优选实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的用量足以下调抗核抗体，特别地抗DNA抗体的水平。
抗DNA抗体水平的增加是NZB/W F1小鼠的特征。给予载体的小鼠的抗DNA抗体水平显示随着时间的延长而增加。从2月龄开始用CYC202处理的小鼠，在两个剂量下，在5个或8个月龄时，其抗DNA抗体的水平显著低于载体。在从5月龄开始接受CYC202的小鼠组中，在8个月时，抗DNA抗体的浓度在数值上低于载体组，但不显著。
在一个优选实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的用量足以减少肾小球和肾小管间质性(tubointerstitial)的改变。
在研究结束时，给予载体的NZB/W小鼠显示有肾小球改变，并伴有与病灶性毛细血管外增生有关的毛细血管内细胞过多症。在肾小球膜内和肾小球基底膜内皮下侧上可检测到免疫沉淀物。还可以观察到肾小管损伤和间质性炎。从2月龄开始用CYC202处理可以显著限制肾小球细胞过多症、免疫沉淀物和肾小管间质性损伤。当以200mg/kg的剂量给药CYC202时，这些效果更加明显。在从5月龄开始试给药CYC202的小鼠中仅观察到对肾形态有轻微的效果。
在一个优选实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的用量足以抑制由PMA和ConA诱发的T细胞增殖。
在一个优选实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的用量足以下调Mcl-1的表达。
在一个优选实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的用量足以减少单核细胞的间质性积累。
通过免疫组化技术对肾的F4/80阳性单核细胞/巨噬细胞进行分析。在给予载体的NZB/W小鼠的肾间质中存在明显的F4/80阳性细胞积累。从2月龄开始用200mg/kg CYC202进行预防处理与载体处理相比，能够显著降低F4/80阳性单核细胞/巨噬细胞的数目。100mg/kg剂量的CYC202能够限制单核细胞在间质性积累，但没有达到统计学显著程度。在治疗研究中(从5月龄开始处理)，可以观察到F4/80阳性细胞在数量上有所降低。
总而言之，本研究的结果清楚地表明，从2月龄开始用CYC202(200和100mg/kg)进行预防治疗，与给予载体的动物相比，能够阻止NZB/W小鼠狼疮的肾脏表现，并显著延长寿命。具体地，CYC202可延迟蛋白尿和肾脏功能损伤的发生，限制肾小球和肾小管间质性改变，包括单核细胞的间质性积累、肾小管细胞过多症和免疫沉淀。该效果在200mg/kg的剂量下更加显著。本研究的一个显著发现是，CYC202降低了抗DNA抗体的水平，这可能归功于CYC202影响T细胞，其进而影响B细胞。通过体外实验，在用CYC202处理之后，可观察到对由PMA和ConA诱导的T细胞增生以及混合淋巴细胞反应呈浓度依赖性抑制。而且，有证据显示在SLE中激活的对组蛋白和核小体特异的自身免疫T辅助细胞可以为B细胞分化成抗DNA生成浆细胞提供帮助(见综述Rekvig，Arthritis & Rheumatism 48300-312，2003)。
CYC202还已知对转录有影响，包括下调抗凋亡蛋白mcl-1，因此能够改变细胞生存信号的平衡。缺乏免疫反应性的T细胞可能对这种激动机制特别敏感。
与载体小鼠相比，从5月龄开始给药CYC202(100mg/kg)可使蛋白尿小鼠的百分率和肾脏损伤百分率有轻微的降低。生存率没有改善。该适度效果可能是由于剂量较低。
组合在一个特别优选的实施方案中，本药物用于和甲强龙进行组合治疗。
在本文中，术语“组合治疗”是指甲强龙与CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂一起给药，它们如果不是同时给药的话，则是在相同的时间范围内，在两者都可以发挥治疗作用的时候顺次给药。
本发明的另一方面涉及包含CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐与甲强龙的组合。
优选地，该组合具有协同作用，也就是，该组合是互相促进的。
甲强龙是一种合成(人工)的皮质甾类。化学名是11，17，21-三羟基-6-甲基-(6a，11b)-孕甾烷-1，4-二烯-3，20-二酮。皮质甾类是天然产生的化学剂，由与肾相邻的肾上腺产生。皮质甾类阻断发炎，并且广泛地应用于各种炎症疾病。已经有大量的皮质甾类制剂，包括口服药片、胶囊、液体、局部软膏和凝胶、吸入剂、滴眼剂、和可注射及静脉注射液。甲强龙典型地被处方作为口服药片或液体。
甲强龙用于促进对炎症的抑制。可使用甲强龙的炎症条件的实例包括风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、急性痛风性关节炎、银屑病关节炎、溃疡性结肠炎和克罗恩病。常规治疗无效的严重过敏症状也可以使用甲强龙。实例包括支气管哮喘、过敏性鼻炎、药物诱发的皮炎和接触性与异位性皮炎。可用甲强龙治疗的慢性皮肤病包括疱疹样皮炎、天疱疮、重度银屑病和重度脂溢性皮炎。眼睛葡萄膜、虹膜、结膜和视神经的慢性过敏和炎症也可以用甲强龙进行治疗。
另一方面涉及一种药物组合物，其包括根据本发明的组合和药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的另一方面涉及一种药物产品，其包括CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐与甲强龙，它们作为组合制剂用于在治疗中同时、顺次或分开使用。
CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂和甲强龙可以同时、组合地、顺次或分开(作为给药方案的一部分)给药。
在本文中，“同时”的意思是，两种药剂同时给药，而术语“组合地”的意思是指如果不是同时给药，则在相同的时间范围内当两者均可以发挥疗效时“顺次”给药。因此，“顺次”给药可以允许一种药剂在另一种药剂给药之后5分钟、10分钟或几小时内给药，条件是第一个给药的药剂的循环半衰期使得两种药剂能够同时处于有效治疗剂量上。各成分给药之间的时间延迟可以根据成分的确切性质、它们之间的相互作用和它们各自的半衰期而不同。
与“组合地”或“顺次地”不同，本文中“分开地”的意思是指，一种药剂与另一种药剂的给药间隔是显著的，也就是说，在施用第二种药剂时，第一个给药的药剂在血流中的存在量不再处于治疗上有效的剂量范围。
本发明的另外一方面涉及一种药物组合物，其包括(i)CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐；和(ii)甲强龙；与药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂进行混合。
进一步的方面涉及根据本发明的组合，其制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物。
本发明进一步的方面涉及使用CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物，其中该药物与甲强龙组合使用。
本发明另一方面涉及使用甲强龙制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物，其中该药物用于和CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐组合使用。
本发明进一步的方面涉及使用CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐及甲强龙，制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物。
本发明的另一方面涉及使用CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物，其中所述治疗包括同时地、顺次地或分开地向对象给药CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐及甲强龙。
本发明进一步的方面涉及治疗与抗核抗体有关的疾病的方法，所述方法包括向对象给药治疗可以接受剂量的(i)CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐；和(ii)甲强龙。
对于所有上述实施方案，优选地，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂和甲强龙同时地或顺次地给药。
在一个优选实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂和甲强龙同时给药。
在一个特别优选的实施方案中，首先向对象给药CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂，之后向所述对象顺次地或分开地给药甲强龙。
本发明的另一方面涉及治疗增生疾病的方法，其包括顺次给药有效治疗剂量的CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂，之后给药有效治疗剂量的甲强龙。
本发明的另一方面涉及使用CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂制造用于治疗增生疾病的药物，其包括顺次给药有效治疗剂量的CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂，随后给药有效治疗剂量的甲强龙。
在一个可选择的优选实施方案中，首先向对象给药甲强龙，随后顺次或分开地向所述对象给药CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂。
在一个特别优选的实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂和甲强龙顺次给药。
在本发明的一个优选实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂和甲强龙根据各自的成分以有效治疗剂量给药。
在本发明的一个优选实施方案中，CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂和甲强龙根据各自的成分以亚治疗剂量给药。
优选地，CDK2、CDK7或CDK9抑制剂与上文本发明第一方面中描述的相同。
药物组合物如上所述，本发明的各个方面均涉及药物组合物。
即使本发明的化合物(包括其药物可接受的盐、酯和药物可接受的溶剂化物)能够单独给药，但是一般地都是与药物载体、赋形剂或稀释剂混合给药，特别地在用于人类治疗时。药物组合物在人类和兽类药物中可以是人或兽的用量。
用于本文中说明的各种不同形式药物组合物的适当赋形剂的例子可以在Wade和PJ Weller编著的《药物赋形剂手册》第二版(1994)中找到。
治疗可以接受的载体或稀释剂在药学领域是众所周知的，并且在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack出版公司，(A.R.Gennaro编著，1985)中有说明。
合适的载体实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。
药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期给药途径和标准药学实践选定。药物组合物可以是，或者包括，载体、赋形剂或稀释剂、任何合适的结合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、助溶剂。
适当结合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖、无水乳糖、自由流动(free-flow)乳糖、β-乳糖、谷物增甜剂、天然和合成树胶，例如阿拉伯胶、黄芪胶或藻酸钠，羧甲基纤维素和聚乙二醇。
适当润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。
在药物组合物中可以提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至增香剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。还可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
盐/酯本发明使用的化合物可以盐或酯的形式，特别是药物可接受的盐或酯的形式存在。
本发明化合物的药物可接受的盐包括其加酸或碱的盐。关于适当药用盐的综述可以在Berge等，J Pharm Sci，66，1-19(1977)中查到。盐的形成可以使用例如强无机酸，例如矿物酸，如硫酸、磷酸或盐酸；使用强有机羧酸，例如具有1-4个非取代或取代(例如卤代)碳原子的烃基羧酸，如乙酸；使用饱和或非饱和二羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、反丁烯二酸、苯二甲酸、四苯酸(tetraphthalic)；使用羟基羧酸，例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；使用氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；使用苯甲酸；或使用有机磺基酸，例如非取代或取代(例如被卤素)的(C1-C4)-羟基-或芳基-磺酸，如甲基-或p-甲苯基磺酸。
酯的形成可以通过有机酸或醇/氢氧化物，取决于被酯化的功能基团。有机酸包括羧酸，例如具有取代或非取代(例如被卤素)的1-12个碳原子的链烷羧酸，如乙酸；饱和或非饱和二羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、反丁烯二酸、苯二甲酸、四苯二甲酸(tetraphthalic)；羟基羧酸，例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，例如非取代或取代(例如被卤素)的(C1-C4)-烷基-磺酸或芳基-磺酸，如甲磺酸或对甲苯基磺酸。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括具有非取代或取代(例如被卤素)的1-12个碳原子的链烷醇。
对映体/异构体在前面讨论的本发明的所有方面中，本发明包括使用，如果合适的话，所涉及化合物的全部对映体和异构体。本领域的技术人员能够识别出具有光学性质(一个或多个手性碳原子)或异构体特征的化合物。相应的对映体和/或异构体可以通过本领域已知的方法加以分离/制备。
立体和几何异构体本发明所用的化合物可以存在立体异构体和/或几何异构体，例如它们可以具有一个或多个不对称和/或几何中心，因此可以存在两种或多种立体和/或几何形式。本发明预期使用这些药剂的所有单独的立体异构体和几何异构体，及其混合物。权利要求中使用的术语包含这些形式，前提是所述形式保留合适的功能活性(尽管不必具有相同的程度)。
本发明还包括使用药剂所有合适的同位素类型或其药物可接受的盐。本发明药剂的一种同位素类型或其药物可接受的盐被定义为，至少有一个原子被具有相同原子数、但原子量与通常在自然中发现的原子量不同的原子代替。能够引入药剂和其药物可接受的盐的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别如2H，3H，13C，14C，15N，17O，18O，31P，32P，35S，18F和36Cl。药剂及其药物可接受的盐的某些同位素类型，例如包含具有放射性同位素如3H或14C的类型，在药物和/或底物组织分布研究中有用。氚，也就是3H，和碳-14，也就是14C，同位素是特别优选的，因为它们容易制备和检测。进一步，用同位素如氘(即2H)取代可以提供某些治疗优势，因为它们有更大的代谢稳定性，例如增加体内半衰期或减少需要剂量，因此在某些情况下是优选的。本发明药剂的同位素类型及其药物可接受的盐一般能够用合适试剂的恰当同位素类型通过常规的程序加以制备。
溶剂合物本发明还包括使用本发明化合物的溶剂合物形式。权利要求中使用的术语包括这些形式。
多晶形本发明进一步涉及使用本发明化合物的各种晶体形式、多晶形形式和含水(不含水)形式。在药物工业中已经较好地确认，通过轻微改变纯化方法可以分离出化合物的任何形式，或者从在合成制备该化合物时使用的溶剂中分离出其任何形式。
前药本发明进一步包括使用本发明化合物的前药形式。该前药一般是其中一个或多个合适的基团被修饰的化合物，这种修饰在向人或哺乳动物给药时可以逆转。该逆转通常是由对象体内天然存在的酶实现的，尽管也有可能与这种前药一起给药第二种药物以便在体内进行该逆转。这种修饰的实例包括酯(例如前面说明的任何一种)，其中逆转可以通过酯酶等加以执行。其它类似的系统对于本领域的技术人员而言是众所周知的。
给药本发明的药物成分可适用于经口、经直肠、经阴道、经肠道外、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、支气管内、皮下、真皮内、静脉内、经鼻、经口腔或舌下途径给药。
对于口服给药，特别使用扁平药片、药丸、药片、gellules、液滴和胶囊。优选地，这些组合物每剂量含有1mg-5000mg，更优选地，含有10mg-3000mg活性成分。
其它的给药形式包括可以在静脉内、动脉内、鞘内、皮下、真皮内、腹膜内或肌内注射的并用无菌或可杀菌溶液制备的溶液或乳剂。本发明的药物组合物可以是栓剂、阴道栓剂、悬浮液、乳剂、洗液、软膏、膏状物、凝胶、喷雾剂、溶液或粉末的形式。
经皮给药的另一种途径是使用皮肤贴。例如，活性成分可以掺入到一种由聚乙二醇水乳液或液态石蜡组成的膏状物中。活性成分还可以1-10％的重量百分比与必要的稳定剂和防腐剂一起掺入到一种由白蜡或白软石蜡基组成的软膏中。
可注射的形式每剂量可以含有10-3000mg，优选地10-1000mg活性成分。
组合物可以规划成单位剂量形式，也就是含有单位剂量或者多单位或亚单位剂量的离散形式。
剂量本领域的普通技术人员能够在不经试验的情况下容易地确定向对象给药当前组合物之一的合适剂量。典型地，医师将根据各种因素，包括所用具体化合物的活性、代谢稳定性和化合物作用时间的长度、年龄、体重、一般健康程度、性别、饮食、给药模式和时间、排泄速度、药物组合、特殊情况的严重程度和个人治疗经历，确定最适合于某位患者的实际剂量。本文公布的剂量是平均案例的实例。单独的案例也当然能够给予更高或更低的剂量，这也在本发明的范围之内。
根据需要，给药剂量可以是0.01-30mg/kg体重，例如0.1-10mg/kg体重，更优选地0.1-1mg/kg体重。
在示例性实施方案中，向患者施用10-3500mg/天的一剂或多剂药物。
下面将参考附图用实施例对本发明进行进一步的说明，其中
图1显示了从2月龄或5月龄开始以100和200mg/kg的剂量用CYC202对NZB/W F1小鼠进行处理的存活百分率随处理持续时间(月)的变化。
图2显示了以100mg/kg和200mg/kg的剂量用CYC202对NZB/W F1小鼠进行处理的蛋白尿小鼠百分比随处理持续时间(月)的变化情况。
图3显示了以100和200mg/kg的剂量用CYC202进行处理的NZB/W F1小鼠血清中的抗DNA抗体(U/ml)(与对照载体组比较)。
图4显示了用和不用DMSO载体处理，未刺激和受刺激PBMC和对照细胞的BrdU掺入(上)和生存能力(下)。
图5显示了在用PHA或PMA/I刺激48小时之后，再用DMSO(左上)或化合物以4×IC50，3×IC50，2×IC50和IC50的浓度处理PBMC细胞，其在刺激之前2小时(-2h)、刺激中(0h)和刺激之后2小时(+2h)的BrdU掺入的差异。
图6显示了在用PHA或PMA/I刺激48小时之后，再用DMSO(左上)或化合物以4×IC50，3×IC50，2×IC50和IC50的浓度处理PBMC细胞，其在刺激之前2小时(-2h)、刺激中(0h)和刺激之后2小时(+2h)的生存能力之差。
图7显示了伴刀豆球蛋白A的滴定，显示最大刺激为10μg/ml(左上)，在更高浓度下生存能力下降(右上)，与用PHA和PMA/I刺激(左下)相比，BrdU掺入增加。
图8显示了用和不用DMSO处理48和72小时，用和不用PHA和ConA刺激的PBMC细胞的BradU掺入(上)和生存能力(下)。
图9显示了用4×IC50，3×IC50，2×IC50，IC50，0.5×IC50和0.25×IC50的化合物及DMSO对照处理48和72小时后，受PHA(左)和ConA(右)刺激的PBMC内BrdU的掺入。
图10显示了用4×IC50，3×IC50，2×IC50，IC50，0.5×IC50和0.25×IC50的化合物及DMSO对照处理48和72小时后，受PHA(左)和ConA(右)刺激的PBMC的生存能力。
实施例CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂各种抑制剂化合物的制备是根据在EP 0874847B(CNRS)；和WO03/002565，WO 04/016613，WO 04/016612，WO 01/72745，WO 02/079193，WO 03/029248，WO 04/043953(均以Cyclacel Limited的名义)中说明的方法。
激酶检验激酶活性的检验是通过测量放射性磷从ATP进入合适多肽底物的量。重组蛋白激酶和激酶复合物是制备的或商业获得的。使用96孔板和合适的试验缓冲液(典型地25mM β-甘油磷酸，20mM MOPS，5mM EGTA，1mM DTT，1mM Na3VO3，pH7.4)进行检验，其中向缓冲液中添加2-4μg活性酶和适当底物。通过添加Mg/ATP混合物(15mM MgCl2+100μM ATP及30-50kBq/孔[γ-32P]-ATP)起始反应，并按要求在30℃培养该混合物。在冰上终止反应，随后通过p81滤板或GF/C滤板(Whatman Polyfiltronics，Kent，UK)过滤。用75mM水溶正磷酸冲洗3次后，对板进行干燥，添加闪烁剂，并在闪烁计数器(TopCount，Packard Instruments，Pangbourne，Berks，UK)中测量掺入的放射性。将用于激酶检验的化合物制备成10mM在DMSO中的储剂，在检验缓冲液中稀释成10％DMSO。数据分析使用曲线拟合软件(GraphPad Prismversion 3.00 for windows，GraphPad Software，San Diego California USA)确定IC50值(抑制酶活性达50％的试验化合物的浓度)。
CDK7和9检验在不同量的试验化合物存在下，在96孔微滴定板中的总体积为25μl的20mM MOPS pH 7.2、25mMβ-甘油磷酸、5mM EGTA、1mM DTT、1mM矾酸钠、15mM MgCl2和100μM ATP(含有痕量的32PγATP)中，CTD肽底物(生物素基-Ahx-(Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser)4-NH2；1-2mg/ml)和重组人CDK7/细胞周期素H、CDK9/细胞周期素T1或CDK9/细胞周期素K(0.5-2μg)在30℃培养45分钟。将板放置在冰上2分钟终止反应。向每个孔中添加亲和素(50μg)，将板在室温下培养30分钟。将样品转移到96孔P81过滤板中，用75mM磷酸冲洗(4×200μl/孔)。向每个孔添加Microscint 40闪烁液(50μl)，用Packard Topcount微板闪烁计数器测量每个样品的32P掺入量。
CYC202进行研究，以评估给药CDK2抑制剂CYC202是否能够有效减缓NZB/WF1易患狼疮小鼠的肾病发展。
使用在实验开始时为2月龄的NZBxNZW F1母鼠(Harlan Italy s.r.l.，Milano，Italy)。动物管理和处理根据指导手册进行，该指导手册符合国家(Decreto Legislativo n.116，Gazzetta Ufficiale suppl 40，18 febbraio 1992，Circolare n.8，Gazzetta Ufficiale 14 luglio 1994)和国际法规和政策(EECCouncil Directive 86/609，OJL358-1，1987年12月；实验动物管理和使用指导，U.S.National Research Council，1996)。动物饲养在恒温室内，12小时黑暗/12小时光照循环，给予标准饮食。
实施例1NZBxNZW F1小鼠随机分成如下的组组1(n＝18)每天管饲载体的小鼠(HCl 50mM)；组2(n＝17)每天管饲CYC202的小鼠(200mg/kg)；组3(n＝19)每天管饲CYC202的小鼠(100mg/kg)；处理在2月龄时开始(预防研究)，持续到8月龄；在5月龄时，每组处死4-5只动物，以评估血清BUN和循环抗DNA抗体的水平。
另外一个组，组4(n＝14只小鼠)从5月龄开始每天管饲CYC202(100mg/kg)，并持续到8月龄，其中在5月龄时已经实际发生免疫复合物沉淀(治疗研究)。5只正常CD-1小鼠(Charles River Italia，Calco，Italy)作为对照。
对如下参数进行评估尿蛋白排泄每月测量一次，直至5月龄，然后每2周测量一次。
处死时
血清中抗DNA抗体；血清BUN；血清转氨酶(AST，ALT)；肾组织学；单核细胞/巨噬细胞在肾间质内的积累。
实施例2将狼疮小鼠随机分成如下各组组1(n＝10)每天管饲载体的小鼠(HCl 50mM)；组2(n＝15)每天管饲CYC202的小鼠，剂量为200mg/kg；组3(n＝12)每天腹膜内注射甲强龙(MPS，Urbason，Hoechst s.p.a，Milano，Italy)的小鼠，剂量为1.5mg/kg；组4(n＝16)每天给药CYC202(200mg/kg)与MPS(1.5mg/kg)组合的小鼠。
处理在5月龄时开始，此时免疫复合物沉淀已经实际发生，持续至12月龄，此时接受载体处理的最后一只动物死亡。5只正常CD-1小鼠(CharlesRiver Italia，Calco，Italy)作为对照。
对如下参数进行评估存活率；尿蛋白排泄每月测量一次，直至5月龄，然后每2周测量一次。
血清BUN在5月龄时测量(处理之前)，并每月测量一次，直至研究结束；肾组织学在病危小鼠和存活至12月龄小鼠的活组织检查中进行评估；F4/80阳性单核细胞/巨噬细胞在肾间质内的积累(在与上面相同的活组织检查中评估)。
实施例1和2材料和方法蛋白尿和肾功能蛋白尿浓度的确定是通过考马斯亮兰G染料结合实验，以牛血清白蛋白为标准。肾功能是通过Reflotron试验(Roche Diagnostics corporation，Indianapolis，USA)评定肝素化血中的BUN。超过30mg/dl的BUN水平认为是不正常的(本实验室认为小鼠的正常范围是14-29mg/dl)。
抗DNA抗体血清中抗dsDNA的自身抗体的水平通过以前描述的酶免疫测定法(Kidney Int，53726-734，1998)(Diastat抗dsDNA试剂盒，Bouty Laboratory，Milano，Italy)进行评估。
血清转氨酶AST和ALT的血清水平用自动分析仪(CX5，Beckman Instruments Inc.，Fullerton，CA)加以测量。
肾形态学光学显微镜肾皮质片段在Dubosq-Brazil中固定，在乙醇中脱水，并包埋在石蜡内。切片(3μm)用苏木精和曙红、Masson三色染剂和过碘酸-希夫氏染色试剂(PAS染色)加以染色。肾小球毛细血管内细胞过多症的评估以半定量的方式进行，使用0至3+的评分系统(0＝没有细胞过多症；1+＝轻微；2+＝中等；3+＝严重)。还根据所牵涉的全部受损伤肾小球的百分比对其他的改变打一个单一的分数。毛细血管外增生的分级为0至3+(0＝没有细胞过多；1+＝少于25％的肾小球被牵涉；2+＝25％-50％的肾小球被牵涉；3+＝大于50％的肾小球被牵涉)。肾小球沉积物的分级为0至3+(0＝没有沉积物；1+＝少于25％的肾小球被牵涉；2+＝25％-50％的肾小球被牵涉；3+＝大于50％的肾小球被牵涉)。肾小管(萎缩、弯曲和扩张)和间质性改变(纤维化和发炎)分级为0至3+(0＝没有变化；1+＝变化影响小于样品的25％；2+＝变化影响为样品的25％-50％；3+＝变化影响大于样品的50％)。每次活组织检查至少检查100个肾小球。每个样品在低倍(10×)下至少检查10个视场，用于给间质组织学评分。全部肾活组织检查由同一个病理学家以单盲的方式进行分析。
免疫组织化学分析使用抗存在于小鼠单核细胞和巨噬细胞内的胞质抗原的大鼠单克隆抗体(F4/80，4μg/ml，Caltag Laboratories，Burlingame，CA)，通过免疫过氧化物酶法技术检测浸润细胞。切片用甲醇中的0.3％H2O2孵育30分钟，使内源的过氧化物酶失活。然后组织在溶于0.01mol/L PBS(pH7.2)的0.1％Triton X-100中渗透30分钟，然后用正常的山羊血清(Vector Laboratories)孵育30分钟。第一抗体在4℃孵育过夜，之后用第二抗体(生物素化山羊抗大鼠IgG，VectorLaboratories)和亲和素-生物素过氧化物酶复合物(ABC)溶液孵育，最后用DAB显影。切片用Harris苏木精反染。阴性对照通过省略第一抗体而获得。为每个动物至少在10个随机选择的高倍显微镜视场(400×)中计数F40/80标记的细胞。
统计分析数据用平均值±标准偏差(SE)表示。生存曲线通过时序检验进行分析。蛋白尿数据用Fisher精确检验进行分析。所有其他的参数用Kruskall Wallis检验进行分析。统计显著定义为P＜0.05。
实施例1结果体重和饮食和饮水如表1所示，狼疮小鼠在研究期间体重增加。实验各组之间的体重没有观察到差异。从2-5月，每两周测量食物(表2)和水(表3)的摄取量，并在载体和CYC202处理的小鼠之间进行比较。
狼疮小鼠生存率从2月龄开始用200和100mg/kg剂量的CYC202处理的NZB/W F1小鼠，其存活时间显著(P＜0.05)长于载体小鼠(见表4和图1)。实际上，在研究结束时(8月龄)，用载体处理的NZB/W小鼠十三只仅有四只(31％)存活，而用200和100mg/kg CYC202处理的小鼠分别十三只有十只(77％)和十四只有十只(71％)存活。在从5月龄开始给药CYC202(100mg/kg)的小鼠组中(治疗给药)，生存率与载体处理小鼠没有差异。
蛋白尿和肾功能在疾病的不同阶段对所有实验组评估患有严重蛋白尿(＞4mg/天)的小鼠的累积百分比。如表5所示，载体组中有蛋白尿的小鼠的百分比随时间逐渐增加(图2)。在研究结束时，蛋白尿小鼠的百分比为85％。与载体相比，预防治疗给药CYC202能够以剂量依赖的方式显著推迟蛋白尿的发生(％蛋白尿小鼠，8月龄200mg/kg，与载体相比P＜0.01；100mg/kg，与载体相比P＜0.05)。当从5月龄开始向狼疮小鼠给药CYC202时，与载体相比，可以观察到蛋白尿小鼠百分比降低的趋势，但没有达到统计学显著。
在5和8月龄通过血清BUN评估肾功能。在5月龄时，所有实验组的血清BUN水平均在正常范围内(＜29mg/dl)。在载体组中，肾功能随着时间延长而恶化，在8月龄时，50％存活小鼠的BUN水平≥30mg/dl(表6)。预防治疗给药CYC202可使狼疮小鼠的肾功能更好，而若后来给药则没有效果。
抗DNA抗体抗DNA抗体水平增加是NZB/W F1小鼠的特征。如表7所示，给予载体的小鼠抗DNA抗体的水平随着时间而增加。从2月龄开始用CYC202处理的小鼠，在两个剂量下5或8月龄均显示抗DNA抗体水平显著低于载体。在从5月龄开始接受CYC202的小鼠组在8月龄时，抗DNA抗体浓度在数值上低于载体，但不显著(图3)。
血清转氨酶水平测量从2月龄开始给药200mg/kg CYC202或从5月龄开始给药100mg/kgCYC202的NZB/W F1小鼠体内的血清ALT和AST水平。血清转氨酶水平未受处理而改变，数值与对照组小鼠相似(表8)。
肾形态学如表9所示，在研究结束时，给予载体的NZB/W小鼠显示肾小球毛细血管内细胞过多的改变，并伴有病灶性毛细血管外增生。在肾小球膜和肾小球基底膜的内皮下侧可以检测到免疫型沉淀物。还可以观察到肾小管损伤和间质性炎。从2月龄开始用CYC202进行处理能够显著限制肾小球细胞过多症、免疫沉淀和肾小管间质性损伤。当CYC202的给药剂量为200mg/kg时，这些效果更加显著。在从5月龄开始给予CYC202的小鼠中，可观察到对肾形态只有轻微的影响。
单核/巨噬细胞的间质性积累通过免疫组织化学技术分析了肾脏的F4/80阳性单核/巨噬细胞。在给予载体的NZB/W小鼠的肾间质内F4/80阳性细胞显著积累(表10)。用200mg/kgCYC202预防给药处理与载体相比能够显著降低F4/80阳性单核/巨噬细胞的数目。在100mg/kg的CYC202剂量下，尽管统计学上不显著，但能够限制单核细胞的间质性积累。在治疗研究中，可以观察到F4/80阳性细胞在数量上有所降低。
本课题的结果表明，从2月龄开始预防给药CYC202(200和100mg/kg)与给予载体的动物相比，可以延迟NZB/W小鼠狼疮的发生，并显著延长寿命。明确地讲，CYC202延迟蛋白尿和肾功能损伤的发生，限制肾小球和肾小管间质性改变，包括单核细胞的间质性积累，并且在200mg/kg的剂量下效果更加明显。本发明的一个重大发现是，CYC202能够降低抗DNA抗体的水平，这可能是由于CYC202影响T细胞，其进一步可能影响B细胞。通过体外实验，可以观察到能够浓度依赖性地抑制由PMA和ConA诱导的以及在混合淋巴细胞反应中的T细胞增殖。另一方面，显然在SLE中，被激活的组蛋白或核小体特异性自身免疫T细胞可以帮助B细胞分化成抗DNA生成浆细胞(综述参见Rekvig，Arthritis & Rheumatism 48300-312，2003)。
从5月龄开始给药CYC202(100mg/kg)与载体小鼠相比，可以轻微减少蛋白尿小鼠和肾损伤小鼠的百分比。存活率未见改善。
实施例2结果体重NZB/W F1小鼠在研究期间体重增加。各实验组之间的体重没有观察到差异。
生存率从5月龄开始用CYC202和甲强龙(MPS)组合处理的NZB/W F1小鼠，其存活时间显著(P＜0.0001)长于载体小鼠(见表11)。值得注意的是，在12月龄时，当所有给药载体小鼠均已死亡，而用组合治疗的小鼠十六只有十只(62％)存活。接受单一治疗的小鼠的生存曲线与载体组没有差异。
蛋白尿表12显示了在疾病的不同阶段评估的蛋白尿＞4mg/天的小鼠的累积百分比。CYC202和MPS联合用药与载体组相比能够显著延迟蛋白尿的发生。在7-10月龄的间隔内，组合治疗组中蛋白尿小鼠的比例显著低于载体组(6.2-43.8％对40-90％)。CYC202或MPS作为单一治疗剂给药与载体相比只能部分影响蛋白尿的发生，但在7.5个月进行观察时，CYC202组可以见到蛋白尿小鼠百分比显著降低。
肾功能在5(处理之前)-12月期间每月测量血清BUN，评估肾脏功能。表13显示了BUN水平≥30mg/dl的小鼠的累积百分数。在5月龄时，所有实验组的血清BUN水平均在正常范围内(即14至29mg/dl)。在载体组中，肾功能随着时间延长而恶化。因此，在8月和12月龄时，BUN水平≥30mg/dl的动物分别为80％和100％。对比地，组合治疗组的小鼠在这些时间点时只有27％和53％的小鼠肾功能受损。单独给药CYC202或MPS的肾保护效果弱于组合用药。
肾形态学对从不同时间病危的小鼠或12月时处死的小鼠获取的肾样本进行形态学分析。数据如表14所示。给予载体的NZB/W小鼠显示出毛细血管内细胞过多的肾小球改变，并伴有病灶性毛细血管外增生。在肾小球膜和肾小球基底膜的内皮下侧可以检测到免疫型沉淀物。还可以观察到肾小管损伤和间质性炎。用CYC202加MPS进行处理可显著限制肾小球细胞过多症、免疫沉淀和肾小管间质性损伤。在单独给药CYC202或MPS的小鼠中，对肾形态只有轻微影响。
单核/巨噬细胞的间质性积累通过免疫组织化学技术分析了肾脏的F4/80阳性单核/巨噬细胞。在给予载体的NZB/W小鼠的肾间质内F4/80阳性细胞明显积累(表15)。CYC202和MPS组合给药与载体相比可使单核/巨噬细胞的数目减少65％(p＜0.01)。单独给药CYC202可以使间质性渗入物减少33％。在单独用MPS处理的小鼠组中，单核细胞的间质性积累与载体组相似。
总之，结果显示CYC202与低剂量甲强龙组合用药可以显著延长狼疮小鼠的寿命。值得注意的是，该处理是在疾病形成阶段也就是5月龄开始的，此时免疫复合物沉淀已经实际发生。组合治疗可以延迟蛋白尿的发生，限制肾功能损伤和肾小球细胞过多症的发展、免疫沉淀和肾小管间质性改变。同时还显示出抗炎效果，因为单核细胞进入肾间质的累积量减少。单独给药CYC202或甲强龙只有微弱的肾保护效果。
总之，组合CYC202与低剂量甲强龙具有改善狼疮肾表现和延长已患病狼疮小鼠的寿命的治疗效果，为狼疮肾炎的新型治疗方法提供了基础。
实施例3和4材料和方法选择T细胞增生检验作为对抗核抗体效果的替代检验，并试验了所选CDK2、7和9的抑制剂(转录抑制剂)，化合物[1]-[12]。
如上所述，抗核抗体的产生只能够在体内进行研究，因为这些抗体的产生需要有功能失常的免疫系统，同时包括B和T细胞，并且需要不能选择和破坏识别自身的免疫细胞。然而，体外测定T细胞功能(例如，T细胞增殖测定)是鉴定能够在自身免疫疾病的复杂环境下调节免疫反应的化合物的合适筛选工具。因此，T细胞增殖测定能够为对抗核抗体有效的化合物提供测量方法。
外周血单核细胞的制备实施例3和实施例4进行了两个单独的检验。从Scottish National BloodTransfusion Serices获得了来自三个或四个健康供体(分别为实例3和实例4)的血沉棕黄层血液，并在室温下，用BD VacutainerTMCPT细胞制备管(4ml吸取量，含有柠檬酸钠，REF362781)以300g离心30分钟进行分离。外周血单核细胞(PBMC)层的回收是通过吸取并汇集在50ml离心管中，然后在3倍体积的Hank’s缓冲盐溶液(w/o CaCl2和MgCl2，Gibco#14175-053)中通过300g离心15分钟(室温)洗涤2次。PBMC在添加了10％胎牛血清的RPMI1640培养基中重悬，并通过Trypan Blue排除法确定活细胞的数目。
细胞刺激和处理将PBMC以1×105细胞/孔接种在96孔板内，每孔50μl培养基。作为检验对照，将CCRF-CEM白血病和LP-1多骨髓瘤细胞分别以4000和5000细胞/孔接种在100μl/孔RPMI 1640组织培养基/10％胎牛血清(FCS)中，并在实验期间不加刺激或化合物处理的情况下生长。所有刺激剂和化合物均制成4×组织培养基中的最终浓度，然后向孔中添加每种药物和刺激剂25μl，终体积为100μl/孔。对于非刺激对照，向孔中添加25μl组织培养基，而非刺激剂，对于非处理细胞，添加25μl/孔含有等体积DMSO(最终0.1％)的组织培养基。在每个刺激/处理条件下处理3个相邻的孔，并计算出平均值进行分析。
对于实施例3，使细胞在用50μg/ml PHA(植物血球凝集素PHA-P，SigmaL9132)或50/250ng/ml PMA/I(佛波醇12-豆蔻酸酯13-醋酸酯/Ionomycin，Sigma P1839/I0634)刺激之前沉降2小时。此外，用浓度为0.5μg/ml-100μg/ml的ConA(伴刀豆球蛋白A，Sigma C5275)刺激PBMC以鉴定其刺激效果和最佳浓度。对于实例4，PBMC在接种之后立即用50μg/ml或10μg/ml ConA进行刺激。
对于实施例3，受刺激或未受刺激的PBMC用浓度为IC50，2×IC50，3×IC50和4×IC50的化合物[1]-[10]加以处理。化合物在刺激之前2小时(接种时)、刺激时和刺激之后2小时添加，然后细胞在37℃、5％CO2下分别与化合物培养50、48和46小时，或者直至刺激后48小时。对于实施例4，受刺激的PBMC用上述化合物、化合物[11]+[12]、所有测试化合物以先前的浓度，另用0.5×IC50和0.25×IC50的浓度进行处理。化合物在刺激之后立即添加，并且细胞培养48和72小时。根据在肿瘤细胞板上通过室内细胞毒性检验测得的72小时IC50平均值获得IC50值(表16)，但不包括化合物[1]和[3]，其IC50的获得是根据先前在实验室内(in-house)使用中已公开的IC50，因为没有获得实验室内IC50数据。
BrdU ELISA和Alamar Blue检验在刺激和化合物处理之后，PBMC的增殖活性通过使用细胞增殖ELISA，BrdU(比色法)试剂盒(Roche#1 647 229)测量BrdU的掺入加以确定。该试剂盒是用于3H胸腺嘧啶脱氧核苷掺入的一种非放射性替代方法。在收集细胞之前2小时，用BrdU标记细胞。然后以300g(室温)将板离心10分钟，通过吸取从孔中除去上清液，细胞在60℃干燥1小时。向板中添加FixDenat溶液(100μl/孔)，培养30分钟，然后轻弹除去，向板中添加抗BrdU-POD溶液(100μl/孔)，并培养90分钟。在用洗液冲洗3次(200μl/孔)之后，板用底物溶液(100μl/孔)培养30分钟，然后添加1M H2SO4(25μl/孔)，在AscentFluoroskan板读数器上读出在450nm的光密度。
用Alamar Blue试剂(Biosource#DAL1100)评估PBMC的活力。在培养基中新鲜制备20％Alamar Blue，每孔加100μl，终浓度为10％。在收集时间之前(48或72小时)，板用Alamar Blue在37℃、5％CO2中培养3小时，然后在Tecan Ultra板读数器用535nm激发波长和595nm发射波长读出荧光。
实施例3结果用PHA刺激与未刺激细胞相比，BrdU掺入量提高到大约7倍。用DMSO载体处理不影响BrdU掺入或PHA刺激或未刺激的细胞的活力(图4)。如图5所示，用所有测试化合物处理PHA刺激的细胞可降低BrdU的掺入，在许多情况下降低到未刺激细胞的水平。除化合物[9]和[10]之外，在低至IC50的浓度下即可显著降低BrdU的掺入量，BrdU的掺入量还与化合物浓度没有相关性，综合表明，化合物在IC50时达到了其最大的增殖抑制效果。对于化合物[9]和[10]，其效果明显地呈剂量依赖性，在IC50时，比其它化合物多3-4倍的BrdU掺入量在更高的浓度下才降低到未刺激细胞的水平。
对大多数化合物，相对于刺激时间，化合物的处理时间对BrdU的掺入水平不具有很大的影响，很可能是因为该刺激在PBMC接种后4小时内还没产生作用。而化合物[2]、[3]和[4]是例外，其中，令人吃惊的，用化合物预处理(-2h)的BrdU掺入水平与化合物处理和刺激同时或处理在刺激之后相比减少较小(图5)。
与PHA处理相似，在没有化合物时，PMA/I刺激使BrdU掺入量比未刺激细胞高大约7倍(图5)。用除化合物[4]、[9]和[10]之外的其他所有化合物处理，在所有浓度下，可使BrdU掺入量降低，甚至优于在PHA刺激细胞中的情况，一般都会达到低于未刺激细胞的水平。如上所述，用PMA/I刺激并用DMSO处理的PBMC在Alamar Blue检验中只显示非常低的活力，而BrdU掺入量增加(图4)。类似地，在用化合物[4]、[9]和[10]处理用PMA/I刺激的细胞之后，BrdU掺入量仍然高于PHA刺激的细胞，只是Alamar Blue值为负。
伴刀豆球蛋白A滴定显示ConA以浓度依赖的方式刺激PBMC，在10μg/ml时达到最大效果。然后BrdU的掺入量降低到未刺激细胞的水平(更高浓度下)，与活力评估和显微镜观察的结果一致，其表明PBMC在更高的ConA测试浓度下不能生存。在与PHA和PMA/I进行比较时，用10μg/mlConA刺激可使BrdU掺入量增加到相当高的水平，或者比未刺激的PBMC高大约6倍，而不降低活力(图7)。
实施例4结果实例3得出的结论是，所有试验化合物在低至IC50的浓度下均可以影响受刺激PBMC细胞的增殖活性。进行随后的实验(实例4)研究在药物浓度低于IC50时，该效果的浓度依赖性。重复前面的处理，对于所有先前试验的化合物以及化合物[11]和[12]均添加较低的浓度，0.5×和0.25×IC50及DMSO对照。因为化合物处理相对于刺激的时间不是抑制增殖活性的核心，所以在接种之后，立即同时进行PBMC刺激和化合物处理。细胞的刺激或者像前面那样用PHA处理，或者用10μg/ml ConA进行。
与未刺激细胞相比，在48小时，PHA刺激使DMSO处理细胞的BrdU掺入量增加超过20倍，ConA刺激增加超过10倍，在72小时进一步增加，DMSO载体对BrdU掺入或活力均没有影响(图8)。如图9所示，当用PHA刺激时，所有化合物均以浓度依赖的方式减少BrdU掺入量，在IC50或2×IC50浓度时达到最大效果。这证实了先前的观察，在浓度超过IC50时，没有检测到浓度依赖性，因为已经达到了最大效果。总体而言，用ConA刺激PBMC见到了相同的效果，尽管最大效果是在略低的浓度下达到。这可能是由于BrdU信号在最大效果时降低到了背景水平的结果，因为对于ConA刺激的细胞，其信号一般只有PHA刺激细胞的一半高度，所以检测灵敏度略小于前者。
与前面一样，化合物[4]、[9]和[10]的行为与其余化合物略有不同。与先前的实验一致，在浓度超过IC50时，仍可清楚地看到化合物[9]和[10]的浓度依赖性，并且延伸到较低的浓度。对于ConA刺激的细胞，在4×IC50时，BrdU掺入仍然降低，信号接近背景水平，但略微高于PHA刺激的细胞。并非希望与理论相关联，但这表明与其他化合物一样，它们可以完全抑制增生活性，但达到这个目的需要更高的浓度。
对于用化合物[4]处理的细胞，在两种刺激下，BrdU信号均不降低到背景水平，甚至在4×IC50也是如此。而且，在更高浓度下，BrdU掺入与化合物浓度之间没有多少关联，这与我们先前的结果一致。并非希望与理论相关联，但表明化合物[4]对增殖活性的影响在大约2×IC50时最大，与其它绝大部分化合物一样，但抑制程度较低。
通过Alamar Blue检验活性评估显示，PBMC的活性在受刺激时会略微降低，但在化合物处理、DMSO处理和未处理PBMC之间总体上是大致相当的。而且，随着化合物浓度的增加，Alamar Blue计算值没有降低，证明BrdU掺入量的降低不是由于化合物细胞毒作用造成的，而只是单纯代表了增殖活性的抑制。
总之，实验显示，用任何系列的转录抑制剂进行处理均可以改变PHA或ConA对T淋巴细胞刺激的效果，并以剂量依赖的方式完全抑制增殖活性。总之，对于PHA和ConA刺激的细胞可以看到相同的趋势，尽管在ConA刺激的细胞中达到完全抑制增殖所需的药物浓度看起来低于PHA刺激的细胞。这可能是由于由ConA获得的完全刺激小于PHA造成的假象。大多数化合物具有相同的模式，其中最初在低至0.25×IC50或0.5×IC50的浓度下可以见到对增殖活性的一些抑制作用，然后在大约2×IC50时达到完全抑制，存在的一些差异在于随着化合物浓度的增加，增殖活性降低的快慢不同。一个值得关注的实例是化合物[7]，其在低至0.25×IC50的浓度下即达到完全抑制。然而，在不同化合物特定浓度之间的比较必须审慎进行，因为IC50值是基于不同细胞板的平均值。
化合物[9]和[10]可以见到与上述模式不同的情况，它们需要比其它化合物更高的浓度才能达到相同的效果，而对于化合物[4]，它遵循与其它化合物相同的浓度依赖性，但在更高浓度下也不能实现完全抑制增殖活性。
实验显示，PBMC活性在受刺激时略微降低，但不显著，进一步的降低与化合物处理有关。更重要的是，活性显然不依赖于化合物浓度，因此在BrdU掺入中测到的减少代表了增殖活性的真实抑制，而不是化合物的细胞毒性。
对于本领域的技术人员而言，在不背离本发明范围和精神的前提下，本发明的各种修改和改变是显而易见的。尽管本发明是联系特殊的优选实施方案加以说明的，但是应当理解，申请权利的本发明并不仅限于这些特殊的实施方案。事实上，对于相关领域技术人员而言显然的用于进行本发明的所述模式的各种修改也在本发明的覆盖范围之内。
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表1体重
数值用平均值±SE表示表2食物摄取
数值用平均值±SE表示表3水摄取
数值用平均值±SE表示表4存活率％
表5蛋白尿小鼠的累积百分率
*P＜0.05，**P＜0.01与载体相比表6用血清BUN评估肾功能
表7血清抗DNA抗体(U/ml)
数值用平均值±SE表示*P＜0.05，**P＜0.01在对应时间与载体相比表8血清转氨酶(IU/L)
数值用平均值±SE表示表9肾组织学
数值用平均值±SE表示.*P＜0.05，**P＜0.05，○○P＜0.01对CYC202(100mg/kg)从5个月表10肾间质中的F4/80阳性单核细胞/巨噬细胞
表11存活率％
处理从5月龄开始。相对载体，CYC202+MPS显著地(P＜0.0001)延长生命。
表12蛋白尿＞4mg/天地小鼠的累积百分率
每个点反应了存活小鼠中当前的蛋白尿水平以及下降小鼠中的最后一次测量。0.05，**p＜0.01对载体.
表13肾功能-BUN＞30mg/dl的小鼠的累积百分数
BUN水平＞30mg/dl认为是不正常(正常范围14-29mg/dl)
表14肾组织学
数值用平均值±SE表示.*p＜0.05，**p＜0.01对载体；○p＜0.05对MPS.
表15肾间质中的F4/80单核细胞/巨噬细胞(细胞/HPF)
数值用平均值±SE表示。HPF＝高倍视野。**p＜0.01对载体，○p＜0.05对＜PS对照CD-1小鼠范围0-4细胞/HPF表16室内细胞板的72小时IC50平均值(μM)和使用的IC50约数值，以便于计算
*无室内细胞毒数据，HCT116细胞的IC50公开于Rayanud等人，ClinCancer Res 11(13)4875-87，2005。
表17室内激酶检测的对抗CDK/细胞周期蛋白和Aurora酶的化合物的IC50平均值(μM)
权利要求
1.CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂或其药物可接受的盐在制备用于治疗与抗核抗体有关疾病的药物药物中的用途，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂或其药物可接受的盐的给药量足以下调抗核抗体的水平。
2.根据权利要求1的用途，其中该疾病是自身免疫性风湿病或器官特异性自身免疫病。
3.根据权利要求2的用途，其中该自身免疫性风湿病选自药物诱发的狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎。
4.根据权利要求3的用途，其中该自身免疫性风湿病是系统性红斑狼疮(SLE)。
5.根据前述任一项权利要求的用途，其中抗核抗体是抗DNA抗体。
6.根据前述任一项权利要求的用途，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的量足以下调Mcl-1的表达。
7.根据前述任一项权利要求的用途，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的量足以延迟蛋白尿和肾功能损伤的发生。
8.根据前述任一项权利要求的用途，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的量足以减少肾小球和肾小管间质性改变。
9.根据前述任一项权利要求的用途，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的量足以降低单核细胞的间质性积累。
10.根据前述任一项权利要求的用途，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的量足以抑制(由PMA和ConA诱发的)T细胞增生。
11.根据前述任一项权利要求的用途，其中该药物用于和甲强龙的组合治疗。
12.一种治疗对象体内与抗核抗体有关疾病的方法，所述方法包括向对象给药CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂或其药物可接受的盐，其用量足以下调抗核抗体的水平。
13.一种通过下调对象体内抗核抗体的水平治疗该对象自身免疫性疾病的方法，所述方法包括给药CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂或其药物可接受的盐，其用量足以下调抗核抗体的水平。
14.一种通过下调抗核抗体的水平治疗对象与抗核抗体有关的疾病的方法，所述方法包括给药CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂或其药物可接受的盐，使所述疾病被治疗。
15.一种下调对象体内抗核抗体水平的方法，所述方法包括向所述对象给药CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂或其药物可接受的盐，其用量足以下调抗核抗体的水平。
16.根据权利要求12-15中任一项的方法，其中该疾病是一种自身免疫性风湿病或器官特异性自身免疫性疾病。
17.根据权利要求16的方法，其中该自身免疫性风湿病选自药物诱发的狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎。
18.根据权利要求17的方法，其中该自身免疫性风湿病是系统性红斑狼疮(SLE)。
19.根据权利要求12-18中任一项的方法，其中所述抗核抗体是抗DNA抗体。
20.根据权利要求12-19中任一项的方法，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的量足以下调Mcl-1的表达。
21.根据权利要求12-20中任一项的方法，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的量足以延迟蛋白尿和肾功能损伤的发生。
22.根据权利要求12-21中任一项的方法，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的量足以减少肾小球和肾小管间质性改变。
23.根据权利要求12-22中任一项的方法，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的量足以降低单核细胞的间质性积累。
24.根据权利要求12-23中任一项的方法，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂的量足以抑制由PMA和ConA诱发的T细胞增生。
25.根据权利要求12-24中任一项的方法，其进一步包括向对象给药甲强龙。
26.根据权利要求25的方法，其中甲强龙与CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂或其药物可接受的盐同时、顺次或分开给药。
27.一种下调细胞中抗核抗体水平的方法，所述方法包括使所述细胞与CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂或其药物可接受的盐相接触，其用量足以下调所述细胞中抗核抗体的水平。
28.一种用于治疗与抗核抗体有关疾病的药物组合物，所述组合物包括与药物可接受的稀释剂、赋形剂或载体混合的CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂，其用量足以下调抗核抗体的水平。
29.一种组合，包括CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂或其药物可接受的盐及甲强龙。
30.一种药物组合物，其包括根据权利要求29的组合和药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
31.一种药物产品，其包括CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂或其药物可接受的盐及甲强龙，作为组合制剂在治疗中同时、顺次或分开使用。
32.根据权利要求31的药物产品，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9的抑制剂或其药物可接受的盐及甲强龙同时给药。
33.根据权利要求31或权利要求32的药物产品，其进一步包括药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
34.根据权利要求31-33中任一项的药物产品，用于治疗与抗核抗体有关的疾病。
35.根据权利要求34的药物产品，其中该疾病是自身免疫性风湿病或器官特异性自身免疫性疾病。
36.根据权利要求35的药物产品，其中自身免疫性风湿病选自药物诱发的狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎。
37.根据权利要求36的药物产品，其中该自身免疫性风湿病是系统性红斑狼疮(SLE)。
38.一种药物组合物，包括(i)CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐；和(ii)甲强龙；以及与上述组分混合的药物可接受的稀释剂、赋形剂或载体进行混合。
39.根据权利要求28、30或38的药物组合物，或根据权利要求31-37中任一项的药物产品，其中该CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂是嘌呤衍生物或嘧啶衍生物。
40.根据权利要求28、30或38的药物组合物，或根据权利要求31-37中任一项的药物产品，其中该CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂由下化合物中选择 及其药物可接受的盐。
41.根据权利要求28、30或38的药物组合物，或根据权利要求31-37中任一项的药物产品，其中该CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂选自roscovitine、奥罗莫星和purvalanol A，及其药物可接受的盐。
42.根据权利要求28、30或38的药物组合物，或根据权利要求31-37中任一项的药物产品，其中该CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂是roscovitine，或其药物可接受的盐。
43.根据权利要求29的组合在制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物中的用途。
44.CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐在制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物中的用途，其中该药物用于和甲强龙组合使用。
45.甲强龙在制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物中的用途，其中该药物用于和CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐组合使用。
46.CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐及甲强龙在制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物中的用途。
47.CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐在制备用于治疗与抗核抗体有关的疾病的药物中的用途，其中所述治疗包括同时、顺次或分开向对象给药CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐及甲强龙。
48.根据权利要求43-47中任一项的的用途，其中该疾病是自身免疫性风湿病或器官特异性自身免疫。
49.根据权利要求48的用途，其中该自身免疫性风湿病选自药物诱发的狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎。
50.根据权利要求43-49中任一项的用途，其中该自身免疫性风湿病是系统性红斑狼疮(SLE)。
51.根据权利要求43-50中任一项的用途，其中抗核抗体是抗DNA抗体。
52.根据权利要求43-50中任一项的用途，其中抗核抗体的水平被降低。
53.一种治疗对象体内与抗核抗体有关的疾病的方法，所述方法包括向对象给药治疗可接受量的(i)CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂，或其药物可接受的盐；和(ii)甲强龙。
54.根据权利要求53的方法，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐和甲强龙与药物可接受的稀释剂、赋形剂或载体混合。
55.根据权利要求53或权利要求54的方法，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐和甲强龙同时、顺次或分开给药。
56.根据权利要求55的方法，其包括在顺次或分开向对象给药甲强龙之前，向所述对象给药CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐。
57.根据权利要求55的方法，其包括在顺次或分开给药CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐之前，向所述对象给药甲强龙。
58.根据权利要求53-57中任一项的方法，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐和甲强龙在每次给药时以各个成分的治疗有效剂量给药。
59.根据权利要求53-57中任一项的方法，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂或其药物可接受的盐和甲强龙在每次给药时以各个成分的亚治疗剂量给药。
60.根据权利要求53-57中任一项的方法，其中该疾病是自身免疫性风湿病或器官特异性自身免疫性疾病。
61.根据权利要求60的方法，其中该自身免疫性风湿病选自药物诱发的狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎。
62.根据权利要求61的方法，其中该自身免疫性风湿病是系统性红斑狼疮(SLE)。
63.根据权利要求1-11或43-52中任一项的用途，或根据权利要求12-27或53-62中任一项的方法，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂是嘌呤衍生物或嘧啶衍生物。
64.根据权利要求1-11或43-52中任一项的用途，或根据权利要求12-27或53-62中任一项的方法，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂从以下化合物中选择 及其药物可接受的盐。
65.根据权利要求1-11或43-52中任一项的用途，或根据权利要求12-27或53-62中任一项的方法，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂选自roscovitine、奥罗莫星和purvalanol A。
66.根据权利要求1-11或43-52中任一项的用途，或根据权利要求12-27或53-62中任一项的方法，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂是roscovitine及其药物可接受的盐。
67.方法、用途、组合、药物组合物或药物产品基本上如本文所述，并参考附图。
全文摘要
本发明涉及使用CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂及其药物可接受的盐制备药物，用于治疗与抗核抗体相关的疾病，其中CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂及其药物可接受的盐的给药量足以下调抗核抗体的水平。本发明进一步的方面涉及包括CDK2和/或CDK7和/或CDK9抑制剂及其药物可接受的盐与甲强龙的组合物，及其用于治疗与抗核抗体相关的疾病，例如SLE。
文档编号A61P37/00GK101048160SQ200580037089
公开日2007年10月3日 申请日期2005年8月25日 优先权日2004年8月27日
发明者阿里拉·贝尼格尼, 卡拉·佐加, 朱斯普·雷马齐, 阿索斯·詹内拉-博拉多里 申请人:西克拉塞尔有限公司