多核苷酸的递送的制作方法

专利名称：多核苷酸的递送的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及向细胞递送多核苷酸的方法和制剂。具体来说，本发明涉及增强多核苷酸跨生物膜转运的方法和制剂。
相关技术的描述多核苷酸的递送生物技术领域的各项发展使得在治疗那些从前很难治愈的各种疾病(比如癌症和炎性疾病)方面有了长足的进步。这些技术发展中有许多涉及到将多核苷酸，包括寡核苷酸给予受试者，尤其是人受试者。亲本给予这类分子已被证实能有效地治疗多种疾病和紊乱。参见例如Draper等，于1997年1月21日授权的美国专利5,595,978，该项专利公开了以玻璃体内注射的方式将反义寡核苷酸直接递送到哺乳动物眼睛的玻璃体液。还可参见Robertson，Nature Biotechnology，1997，15209和Genetic Engineering News，1997，151，这两篇文章讨论了通过玻璃体内滴注反义寡核苷酸来治疗克罗恩病(Crohn′s disease)。非亲本途径(比如经皮、口服或直肠递送或者其他粘膜的途径)能够允许我们更简单、容易和安全地给予寡核苷酸。例如寡核苷酸的经皮药物递送是替代注射的一种很有吸引力的无痛方法，但是由于皮肤的通透经低，市场上只有少数经皮产品供应。为了提高药物的经皮流量，人们对各种化学渗透增强剂进行了研究(见，例如Williams et al.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.9304-53(1992)；Finnin et al.，J.Pharm.Sci.88955-958(1999)；Karande et al.，Nature Biotech.22192-197(2004))。但是，对透皮递送寡核苷酸来说，仍然存在的问题是这样一个事实，即所用制剂在其浓度足以有效地增强渗透时，往往会引起皮肤的不适(见例如Lashmar etal.，J.Pharm.Pharmacol.41118-122(1989)。因此，人们需要这样的局部制剂，这些制剂能够有效提高寡核苷酸递送的皮肤通透性，而不会引起皮肤的不适。
相应地，还需要提供一些在以非亲本途径给予新的多核苷酸药物时，能够提高这些药物的可利用率的制剂和方法。人们期望能开发出新的制剂和方法，以便简单、方便、可行并且效果最佳地进行多核苷酸，例如寡核苷酸的非亲本递送。
转录因子细胞能够通过改变特定基因的表达水平对正常或病理刺激做出反应。因此，许多疾病可能与一或多个基因的异常表达(过表达或表达不足)联系在一起。通常，这些基因的表达是由多种转录因子控制的。
转录因子代表细胞内一组其功能是将从胞外信号到胞内应答之间的途径联系起来的分子。受到环境刺激之后，这些主要位于胞质溶胶的蛋白质立即被转移到细胞核内，在核内它们与靶基因之启动子元件的特异DNA序列结合，并激活这些靶基因的转录。
a.NF-κB转录因子NF-κB是一个可诱导性的二聚体转录因子家族，该家族包含识别一个相同序列基元的DNA结合蛋白质中的Rel家族的成员。在其活性DNA结合形态中，NF-κB是异源的二聚体集合，包含NF-κB/Rel家族成员间的各种组合。目前，该家族由5个成员构成，命名为p52、p50、p65、cRel和Rel B。Rel家族成员间的同源性体现在Rel同源性结构域，该结构域有约300个氨基酸，构成了这些蛋白质的DNA结合结构域。
不同NF-κB二聚体对NF-κB位点显示出不同的结合亲和性，该位点带有共有序列GGGRNNYYCC(SEQ ID NO1)，其中R是嘌呤，Y是嘧啶，N是任意碱基。Rel蛋白质激活转录的能力不同，比如在哺乳动物家族成员中只有p65/RelA和c-Rel被发现含有强力的转录激活结构域。细胞质中发现的NF-κB是其非活性形态，它与43kDa的蛋白质IκB结合在一起，后者覆盖了p65/p50二聚体的细胞核转位信号区。NF-κB的活化由IκB被蛋白水解降解开始，然后RelA/p50复合体被转运到细胞核，在核中它结合到DNA上的识别位点，并激活靶基因的转录。关于NFκB家族的进一步综述，参见例如Gomez et al.，Frontiers in Bioscience 249-60(1997)。
p52和p50不含有反式激活结构域。仅含有p52和/或p50蛋白质的二聚体缺少转录激活结构域，通常不是转录激活子，并且能介导转录抑制。
Rel/NF-κB家族的转录因子是免疫和炎性反应的关键调节因子，对淋巴细胞增殖、存活以及肿瘤发生有作用。因此，NF-κB对参与发炎、细胞增殖和免疫应答的多个基因的表达起着关键作用(D′Acquisto et al.，GeneTherapy 71731-1737(2000)；Griesenbach et al.，Gene Therapy 7，306-313(2000)；Morishita et al.，Gene Therapy 71847-1852(2000))。NF-κB所调节的基因中有许多在各种疾病和病症中发挥重要的作用，比如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、再狭窄(restenosis)、心肌梗塞、缺血再灌注损伤(ischemiareperfusion injury)、肾小球性肾炎、异位性皮炎(atopic dermatitis)、大隐静脉移植物(saphenous vein graft)、阿尔茨海默氏病等等。参见例如，Khaled et al.，Clinical Immunology and Immunopathology 86(2)170-179(1998)；Morishita etal.，Nature Medicine 3(8)894-899(1997)；Cho-Chung et al.，Current Opinion inMolecular Therapeutics 1(3)386-392(1999)；Nakamura et al.，Gene Therapy 91221-1229(2002)；Shintani et al.，Ann.Thorac.Surg.741132-1138(2002)；以及Li et al.，J.Neurochem.74(1)143-150(2000)。
已有人提议用NF-κB诱骗物来抑制血管成形术后的新生内膜增生(neointimal hyperplasia)、再狭窄和心肌梗塞(Yoshimura et al.，Gene Therapy 81635-1642(2001)；Morishita et al.，Nature Medicine 3(8)894-899(1997))。更强地抑制再灌注损伤、移植后的急性和慢性排斥导致异源移植存活时间延长以及移植物冠状动脉疾病下降(Feeley et al.，Transplantation 70(11)1560-1568(2000))。体内转染NFκB诱骗物提供了一种治疗急性心肌炎的新策略(Yokoseki et al.，同前)。Ueno et al.(同前)报导了用NFκB诱导物阻断NFκB能够预防心脏的缺血再灌注损伤。
Ziegler-Heitbrock et al.(J.Leukoc.Biol.55(1073-80(1994)、Kastenbauer和Ziegler-Heitbrock(Infect.Immunol.67(4)1553-9(1999)已经证实将人单核细胞系Mono Mac6用低剂量的脂多糖(LPS)预先处理两天时，其对随后的LPS刺激的应答急剧下降。在用LPS刺激这些LPS-耐受性细胞时，凝胶阻滞实验显示这些细胞主要形成p50同型二聚体。然后这些作者借助报告基因分析法检测了被改变的NF-B复合体对基因表达的影响。将NF-B-依赖性HIV-1 LTR报告基因构建体转染到Mono Mac6细胞中，然后在有和没有LPS的情况下进行预培养，测量萤光素酶活性。当检测LPS耐受性细胞时，LPS刺激没有提高NF-B-依赖性HIV-1 LTR报告基因的反式激活。这表明LPS耐受性细胞中的NF-B复合体不具备功能活性。这也适用于NF-B控制的TNF基因的转录。利用TNF启动子控制的萤光素酶报告构建体，LPS耐受性细胞对LPS刺激仅显示出最低水平的应答。因此，结论是LPS耐受性所诱导产生的p50同型二聚体缺乏反式激活活性。相反这些p50同型二聚体占据了相关的NF-B结合位点并阻止p50/p65复合体的反式激活作用，因此也就阻止了它引发的转录。
b.E2F转录因子另一个转录因子家族，E2F转录因子家族在控制细胞周期的进展中发挥至关重要的作用，并能调节大量基因的表达，这些基因包括参与调节细胞周期，编码c-Myc、c-Myb、Cdc2、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白A、二氢叶酸还原酶、胸苷激酶和DNA聚合酶α的基因。
目前E2F被认为是一个包含由不同基因编码的6个异源二聚体复合体的家族，可分成不同的两组E2F蛋白质(E2F-1-E2F-6)和DP蛋白质(DP-1和DP-2)。E2F蛋白质本身又可以从功能上分为两组，即在休眠细胞中过表达时能够诱导S期进展的那些蛋白质(E2Fs 1-3)，和没有诱导功能的蛋白质(E2Fs 4-5)。E2F-6在功能上与之不同，因为有报导说过表达E2F-6能抑制和它一起表达的E2F-1和DP-1的反式激活作用。此外，有报导说E2F-6的表达延迟了脱离S期，而非诱导S期的发生。E2F和DP组中的蛋白质通过异源二聚体化产生E2F活性。体内存在E2F-DP复合体的所有可能组合形态。根据D2F基元的情况，以及该复合体相关联的蛋白质，各个E2F-DP复合体会引发不同的转录反应。另外E2F分子的同源二聚体也已有描述。(见例如，Zheng et al.，Genes & Devel 13666-674(1999))根据是否与口袋蛋白成视网膜细胞瘤(Rb)家族相关，E2F蛋白质可以成为转录的阻抑蛋白或激活蛋白(Hiebert et al.，Genes & Devel 6177-185(1992)；Weintraub et al.，Nature 358259-261(2002))。
E2F转录因子负责激活血管细胞生长和增殖过程中必须启动的十几个或更多的基因。阻断它能够防止这些异常细胞的增殖(新生内膜增生)，而这种增殖最终会造成动脉粥样硬化。因为其生物学功能，E2F转录因子已经被认为可能参与新生内膜增生、肿瘤相关性肾小球肾炎、血管再生和炎症。已有报导描述了多个E2F家族成员在癌症中有一些作用，并且认为它们是抗癌剂的作用目标。关于E2F家族成员的综述、其调节和途径参见例如Harbour，J.W.and Dean，D.C.，Genes Dev 14，2393-2409(2000)；.Mundle，S.D.and Saberwal，G.，Faseb J 17，569-574(2003)；以及Trimarchi，J.M.and Lees，J.A.Nat Rev Mol Cell Biol 3，11-20(2002)。
许多细胞基因的启动子区都鉴定到了E2F结合位点，在例如以下出版物中有报导Farnham et al.，Biochim.Biophys.Acra 1155125-131(1993)；Nevins，J.R.，Science 258424-429(1992)；Shan et al.，Mol.Cell.Biol.14299-309(1994)；Thalmeier et al.，Genes Dev.3517-536(1989)；Delton et al.，EMBO J.111797-1804(1992)；Yamaguchi et al.，Jpn.J.Cancer Res.83609-617(1992)。
1995年5月4日公开的PCT公开号WO 95/11687中描述了针对E2F转录因子的寡核苷酸诱骗物，该文件的全部内容此处确切引做参考文献。
临床上正在开发E2F寡核苷酸诱骗物以用于改变静脉移植物的自然发展史(natural history)，因其没有那些需要体内引入寡核苷酸的方法的潜在危害，预期对于解决所有手术转流和各种临床情况中需要修复动脉时都会遇到的问题有极高的临床价值。美国食品与药品监督局已经给一个E2F诱骗物分子(Corgentech，Inc.，South San Francisco，CA)授予了快速审批资格，设计该分子是用于防止冠状动脉和外周动脉旁路移植过程中静脉移植物发生堵塞和失效。
涉及到E2F诱骗物疗法的其他代表性参考文献包括Morishita，R.，G.H.Gibbons，M.Horiuchi，K.E.Ellison，M.Nakama，L.Zhang，Y.Kaneda，T.Ogihara and V.J.Dzau.(1995).A gene therapy strategy using a transcriptionfactor decoy of the E2F binding site inhibits smooth muscle proliferation in vivo.Proceedings of the National Academy of Sciences USA，92，5855-5859；Dzau，V.J.，M.J.Mann，R.Morishita and Y.Kaneda.(1996)Fusigenic viral liposomefor gene therapy in cardiovascular diseases.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA，93，11421-11425；von der Leyen，H.E.，M.J.Man andV.J.Dzau.(1996)Gene inhibition and gene augmentation for the treatment ofvascular proliferative disorders.Semin Interv Cardiology，1，209-214；Kaneda，Y.，R.Morishita and V.J.Dzau.(1997).Prevention of restenosis by gene therapy.Annals of the NY Academy of Sciences，811，299-308，discussion 308-210；Mann，M.J.and V.J.Dzau.(1997).Genetic manipulation of vein grafts.CurrentOpinion in Cardiology，12，522-527；Mann，M.J.，G.H.Gibbons，P.S.Tsao，H.E.von der Leyen，J.P.Cooke，R.Buitrago，R.Kernoff and V.J.Dzau.(1997).Cellcycle inhibition preserves endothelial function in genetically engineered rabbitvein grafts.Journal of Clinical Investigation，99，1295-1301；Morishita，R.，G.H.Gibbons，M.Horiuchi，M.Nakajima，K.E.Ellison，W.Lee，Y.Kaneda，T.Ogihara and V.J.Dzau.(1997).Molecular Delivery System for AntisenseOligonucleotidesEnhanced Effectiveness of Antisense Oligonucleotides byHVJ-liposome Mediated Transfer.Journal of Cardiovascular Pharmacology，2，213-222；Braun-Dullaeus，R.C.，M.J.Mann and V.J.Dzau.(1998).Cell cycleprogressionnew therapeutic target for vascular proliferative disease.Circulation，98，82-89；Mann，M.J.(1998).E2F decoy oligonucleotide for geneticengineering of vascular bypass grafts.Antisense Nucleic Acid Drug Development，8，171-176；Morishita，R.，G.H.Gibbons，M.Horiuchi，Y.Kaneda，T.Ogiharaand V.J.Dzau.(1998).Role of AP-1 complex in angiotensin II-mediatedtransforming growth factor-beta expression and growth of smooth muscle cellsusing decoy approach against AP-1 binding site.Biochemistry and BiophysicsRes Community，243，361-367；Poston，R.S.，K.P.Tran，M.J.Mann，E.G.Hoyt，V.J.Dzau and R.C.Robbins.(1998).Prevention of ischemically inducedneointimal hyperplasia using ex-vivo antisense oligodeoxynucleotides.Journalof Heart and Lung Transplant，17，349-355；Tomita，N.，M.Horiuchi，S.Tomita，G.H.Gibbons，J.Y.Kim，D.Baran and V.J.Dzau.(1998).An oligonucleotidedecoy for transcription factor E2F inhibits mesangial cell proliferation in vitro.American Journal of Physiology，275，F278-284；*Mann，M.J.，G.H.Gibbons，H.Hutchinson，R.S.Poston，E.G.Hoyt，R.C.Robbins and V.J.Dzau.(1999).Pressure-mediated oligonucleotide transfection of rat and human cardiovasculartissues.Proceedings of the National Academy of Sccinces USA，96，6411-6416；Mann，M.J.，A.D.Whittemore，M.C.Donaldson，M.Belkin，M.S.Conte，J.F.Polak，E.J.Orav，A.Ehsan，G.Dell′Acqua and V.J.Dzau.(1999).Ex-vivo genetherapy of human vascular bypass grafts with E2F decoythe PREVENTsingle-centre，randomised，controlled trial.Lancet，354，1493-1498；Poston，R.S.，M.J.Mann，E.G.Hoyt，M.Ennen，V.J.Dzau and R.C.Robbins.(1999).Antisense oligodeoxynucleotides prevent acute cardiac allograft rejection via anovel，nontoxic，highly efficient transfection method.Transplantation，68，825-832；Tomita，S.，N.Tomita，T.Yamada，L.Zhang，Y.Kaneda，R.Morishita，T.Ogihara，V.J.Dzau and M.Horiuchi.(1999).Transcription factor decoy tostudy the molecular mechanism of negative regulation of renin gene expressionin the liver in vivo.Circulation Research，84，1059-1066；von der Leyen，H.E.，R.Braun-Dullaeus，M.J.Mann，L.Zhang，J.Niebauer and V.J.Dzau.(1999).Apressure-mediated nonviral method for efficient arterial gene and oligonucleotidetransfer.Human Gene Therapy，10，2355-2364；Ehsan，A.，and M.J.Mann.(2000).Antisense and gene therapy to prevent restenosis.Vascular Medicine，5，103-114；Mann，M.J.(2000).Gene therapy for vein grafts.Current CardiologyReports，2，29-33；Mann，M.J.(2000).Gene therapy for peripheral arterialdisease.Molecular Medicine Today，6，285-291；Mann，M.J.and.J.Dzau.(2000).Therapeutic applications of transcription factor decoy oligonucleotides.Journalof Clinical Investigation，106，1071-1075；Tomita，N.，R.Morishita，S.Tomita，G.H.Gibbons，L.Zhang，M.Horiuchi，Y.Kaneda，J.Kaneda，J.Higaki，T.Ogihara，and V.J.Dzau.(2000).Transcription factor decoy for NFkappaBinhibits TNF-alpha-induced cytokine and adhesion molecule expression in vivo.Gene Therapy，7，1326-1332；Ehsan，A.，M.J.Mann，G.Dell′Acqua and V.J.Dzau.(2001).Long-term stabilization of vein graft wall architecture andprolonged resistance to experimental atherosclerosis after E2F decoyoligonucleotide gene therapy.Journal of Thoracic_Cardiovascular Surgery，121，714-722。所引用的文献全文引入本文作参考。
c.HIF-1转录因子低氧诱导因子(HIF-1)是一个异源二聚体转录因子，它介导对组织氧合作用发生的变化的适应性反应。HIF-1是一个由组成型表达的HIF-1β亚基和一个受到高度调节的HIF-1α亚基构成的异源二聚体。HIF-1α的合成不依赖于氧气，但是其降解主要是通过氧气依赖性的机制调节的。活化的HIF-1α亚基迁移到细胞核内，与ARNT(芳香基受体核转位子)亚基发生二聚体化从而形成活性的转录因子HIF-1。HIF-1识别位于许多基因增强子或启动子内的低氧反应元件(HRE，或者5’-ACGTG-3’(SEQ ID NO1)，并导致它们的表达。目前已知HIF的三个亚型(HIF-1、HIF-2、HIF-3)；它们都是借助保守的HRE来影响基因的调节的。
已鉴定的HIF-1直接作用的假定靶基因有60多个，鉴定这些基因是基于其是否存在含HIF-1结合位点的顺式作用低氧反应元件，在HIF-1α缺失细胞中这些基因失去低氧诱导性的表达，或者是基于其在von Hippel-Lindau(VHL)缺失细胞中或转染了HIF-1α表达载体的细胞中表达增强。
假定受HIF-1调节的基因包括肾上腺髓质素(adrenomedullin)、醛缩酶A、醛缩酶C、自分泌运动因子、组织蛋白酶、内分泌腺来源的VEGF、endoglin、内皮素-1、促红细胞生成素(EPO)、纤连蛋白1、烯醇化酶1、葡萄糖转运蛋白1、葡萄糖转运蛋白3、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶、己糖激酶、类胰岛素生长因子2、类胰岛素生长因子结合蛋白1和2、角蛋白14、18和19、多药耐药蛋白1、基质金属蛋白酶2、一氧化氮合酶2、纤溶酶原激活物抑制剂1、丙酮酸激酶M、转化生长因子-α、转化生长因子β2、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶纤溶酶激活物受体、VEGF受体-2和波形蛋白(Semenza，Nature Rev.3721-732(2003))。
一些HIF-1靶基因(如VEFG)的表达在多数细胞类型中都被低氧诱导，但是对绝大多数HIF-1靶基因来说，低氧所诱导的表达具有细胞型特异性。
其转录被HIF-1所激活的基因参与到癌症生物学的一些重要方面，包括血管发生、细胞存活、葡萄糖的代谢以及癌症侵入。肿瘤内低氧和基因改变能够导致HIF-1α过表达，而人们已将HIF-1α的过表达与一些类型癌症患者死亡率增加联系在了一起。已有建议针对HIF-1及其作用途径来开发抗癌剂(Semenza 2003，同前)。
双链HIF-1寡脱氧核苷酸诱骗物(dsODN)分子曾被用于研究HIF-1的生物学作用。Wang and Semenza，J.Biol.Chem.26821513-21518(1993)以及Wang and Semenza，J.Biol.Chem.2701230-1237(1995)描述过具有以下序列的HIF-1 dsODN分子5′-GCCCTACGTGCTGTCTCA-3′(有义链)(SEQ IDNO338)和5′-TGAGACAGCACGTAGGGC-3′(反义链)(SEQ ID NO339)。Oikawa et al.，Biochem.Biophys.res.Commun.28939-43(2001)；以及Yangand Zou，Am.J.Physiol.Renal Physiol.281F900-8(2001)中也公开过HIF-1诱骗物分子。
美国申请(公开号20050164240)(PCT/US04/33272)公开了E2F dsODN分子；美国申请公开号20050182012(PCT/US04/40673)公开了NF-κBdsODN分子；PCT/US04/40704公开了HIF-1 dsODN分子，这些专利申请全文以参考文献的形式明确引入本文。
发明概述本发明提供了新的有效的方法和制剂来向细胞递送核酸分子(包括多-和寡核苷酸)。
因此，本发明一方面涉及通过令生物膜与制剂进行接触向细胞递送多核苷酸的方法，所述制剂包含多核苷酸、至少一种重量总浓度约0.2％到约10％的渗透增强剂(penetration enchancer)、以及浓度约1％到60％的乙醇。
一实施方案中，所述多核苷酸是寡核苷酸。
另一实施方案中，本发明涉及向哺乳动物细胞递送寡核苷酸。
另一实施方案中，本发明涉及将寡核苷酸递送给人。
再一实施方案中，发明涉及向细胞递送寡核苷酸，其中所述生物膜是皮肤或粘膜。
一实施方案中，所述渗透增强剂是阴离子表面活性剂。另一实施方案中，该阴离子表面活性剂是月桂基硫酸钠、硫酸烷基乙醚或月桂醇醚硫酸钠或N-月桂酰肌氨酸(N-lauroylsarcosine)。
一实施方案中，所述渗透增强剂是非离子性表面活性剂。另一实施方案中，该非离子表面活性剂是失水山梨醇单月桂酸酯(sorbitan monolaurate)20(Span 20)。
另一实施方案中，本发明涉及向细胞递送寡核苷酸，其中所述制剂包含重量约0.4％到10％的所述渗透增强剂，或重量约为0.4％到1％的所述渗透增强剂，或者重量约0.8％的所述渗透增强剂。一实施方案中，该制剂包含约0.8％的月桂醇醚硫酸钠。还有一实施方案中，该制剂包含约0.6％的N-月桂酰肌氨酸和约0.4％的失水山梨醇单月桂酸酯20(Span 20)。
在另一实施方案中，本发明涉及向细胞递送寡核苷酸，其中的制剂包含乙醇。一实施方案中，该制剂包含重量约1％到约50％的醇，或者重量约为5％到50％的醇，或者重量约为10％到50％的醇，或者重量约20％到50％的醇，或者重量约30％到50％的醇，或重量约40％到50％的醇，或者重量约49％的醇，或者重量约20％的醇，或重量约10％的醇，或重量约5％的醇，或者重量约为1％的醇。在另一实施方案中，所述醇是乙醇。
在另一实施方案中，本发明涉及向细胞递送寡核苷酸，其中的制剂是水性制剂。再一实施方案中，所述水性制剂是基于凝胶的水性制剂。
在一实施方案中，所述基于凝胶的水性制剂包含约0.8％重量的月桂醇醚硫酸钠。另一实施方案中，该基于凝胶的水性制剂进一步包含约重量1％、约5％、约10％、约20％或约49％的乙醇。
在另一实施方案中，本发明涉及向细胞递送寡核苷酸，其中的制剂是含有脂质体的制剂。
在另一实施方案中，该含脂质体的制剂包含重量约0.8％的月桂醇醚硫酸钠。在另一实施方案中，该含脂质体的制剂进一步包含重量约2.5％、约5％、或约10％的乙醇。
另一实施方案中，所述含脂质体的制剂包含重量约0.6％的N-月桂酰肌氨酸、重量约0.4％的失水山梨醇单月桂酸酯20(Span 20)和重量约5％的乙醇。
在一实施方案中，本发明涉及一种通过令生物膜与一种基于乳剂的制剂进行接触向细胞递送多核苷酸的方法，所述制剂含有多核苷酸，至少一种重量总浓度约0.2％到约10％的渗透增强剂和水。在一实施方案中，所述多核苷酸是寡核苷酸。
在一实施方案中，上述基于乳剂的制剂包含重量约0.8％或0.35％的月桂醇醚硫酸钠。另一实施方案中，该基于乳剂的制剂包含重量约0.15％的1-苯基哌嗪(phenyl piperazine)。再有一实施方案中，该基于乳剂的制剂包含重量约0.6％的N-月桂酰肌氨酸，约0.4％的失水山梨醇单月桂酸酯20(Span20)和约5％的乙醇。在另一实施方案中，该基于乳剂的制剂进一步包含重量约10％的十四烷酸异丙酯(isopropyl myristate)。还有一实施方案中，该基于乳剂的制剂进一步包含重量约10％的单硬脂酸甘油酯(glycerylmonostearate)。
在一实施方案中，本发明涉及向细胞递送多核苷酸或寡核苷酸，其中所述细胞是血管平滑肌细胞、肿瘤细胞或内皮细胞。
另一实施方案中，发明涉及向细胞递送寡核苷酸，其中的寡核苷酸是双链寡脱氧核苷酸(dsODN)分子。在一实施方案中，dsODN分子的第一链与第二链至少部分互补或者与第二链完全互补。在另一实施方案中，该dsODN分子包含至少一个单链突出端。另一实施方案中，dsODN分子包含两条寡脱氧核苷酸链，它们在3’或5’末端，或者两个末端共价地结合在一起，因此形成一个哑铃结构，或者环形分子。另一实施方案中，该dsODN分子具有一个磷酸二酯骨架。在另一实施方案中，该dsODN分子具有一个硫代磷酸酯骨架。另一实施方案中，该dsODN分子具有磷酸二酯-硫代磷酸二酯混合骨架。另一实施方案中，所述dsODN分子的第一和第二链仅通过Watson-Crick碱基配对联系在一起。另一实施方案中，该dsODN至少有5、10、15、20或25个碱基对长。
再一实施方案中，发明涉及向细胞递送dsODN分子，其中所述dsODN分子包含一段能够与转录因子特异结合的序列。在一实施方案中，所述转录因子选自E2F、AP-1、AP-2、HIF-1和NFκB。另一实施方案中，所述dsODN分子能够特异结合NFκB转录因子。
在一具体实施方案中，所述能特异结合NFκB转录因子的dsODN分子在其第一链中，从5’到3’，包含FLANK1-CORE-FLANK2序列，其中CORE选自下列序列GGGACTTTCC(SEQ ID NO5)、GGGACTTTCC(SEQ ID NO7)、GGGACTTTCCC(SEQ ID NO9)、GGGATTTCC(SEQ IDNO11)、GGACTTTCC(SEQ ID NO13)、GACTTTCC(SEQ ID NO15)、GACTTTCCC(SEQ ID NO17)、GGATTTCC(SEQ ID NO19)、GGATTTCCC(SEQ ID NO21)、GATTTCC(SEQ ID NO23)、GATTTCCC(SEQ ID NO24)、GGACTTTCCC(SEQ ID NO25)和AGGACTTTCCA(SEQID NO78)；FLANK1选自CCTTGAA(SEQ ID NO79)；AT；TC；CTC；CT；AGTTGA(SEQ ID NO80)，TTGA(SEQ ID NO81)；AGTTGC(SEQ ID NO82)；GTTGA(SEQ ID NO83)；A；AAGA(SEQ ID NO84)；ATAT(SEQ ID NO85)；CAAC(SEQ ID NO86)；CAGT(SEQ ID NO 87)；TGA；和GA；以及FLANK2选自TCC；GT；TC；TGT；TCA；TC；CA；AGGC(SEQ ID NO88)；.AG；AGG；A；AGAG(SEQ ID NO89)；TTAA(SEQ ID NO90)；ACAC(SEQ ID NO91)；ACTG(SEQ ID NO92)和AGGCT(SEQ ID NO93).
在一实施方案中，CORE选自GGGATTTCC(SEQ ID NO11)、GGACTTTCC(SEQ ID NO13)和GGATTTCC(SEQ ID NO19)；并且
FLANK1是AT，FLANK2是GT；或者FLANK1是TC，FLANK2 is TC；或者FLANK1是CTC，FLANK2是TGT；或者FLANK1是AGTTGA(SEQID NO80)，FLANK 2是AGGC(SEQ ID NO88)。
另一实施方案中，CORE是GGGATTTCC(SEQ ID NO11)或GGACTTTCC(SEQ ID NO13)；FLANK1是AGTTGA(SEQ ID NO80)，FLANK 2是AGGC(SEQ ID NO88)。
再一实施方案中，CORE是GGACTTTCC(SEQ ID NO13)，FLANK1是AGTTGA(SEQ ID NO80)，FLANK 2是AGGC(SEQ ID NO88)。
在一实施方案中，所述能够特异结合NFκB转录因子的dsODN分子包括一个第二链，该链与所述第一链至少部分互补，并具有磷酸二酯、硫代磷酸酯、混合的磷酸二酯-硫代磷酸酯，或其他修饰形式的骨架。另一实施方案中，这两条链仅通过Watson-Crick碱基配对和/或共价键联系在一起。再一实施方案中，所述能够特异结合NFκB转录因子的dsODN分子包含一段序列，从5’到3’方向，选自SEQ ID NO 26到77。再一实施方案中，所述能够特异结合NFκB转录因子的dsODN分子包含一段序列，从5’到3’方向，选自SEQ ID NO 26到34。再一实施方案中，所述能够特异结合NFκB转录因子的dsODN分子包含一段序列，从5’到3’方向，选自SEQ ID NO 26到31。还有一实施方案中，所述能够特异结合NFκB转录因子的dsODN分子包含SEQ ID NO30的序列。
在一实施方案中，所述能够特异结合NFκB转录因子的dsODN分子是12到28，或14到24，或14到22个碱基对长，并且可能包含修饰的或不常见的核苷酸。
另一实施方案中，dsODN分子能够特异结合E2F转录因子。在具体实施方案中，所述能够特异结合E2F转录因子的dsODN分子包含核心序列，该序列能够特异结合E2F转录因子，旁接5′和3′序列，其中(i)所述核心序列由约5到12个碱基对组成；(ii)所述分子包含约12到28个碱基对长的双链区，该区域由两条完全互补的链组成；以及(iii)该E2F dsODN结合到所述E2F转录因子的结合亲和力至少是图26(SEQ ID NOS94和95)所示参照诱骗物分子与该转录因子亲和力的约5倍，这一数据是通过用THP-1细胞的核提取物进行的竞争性凝胶阻滞试验测定的。
在另一实施方案中，dsODN分子能够特异结合HIF-1转录因子。在具体实施方案中，所述能够特异结合HIF-1转录因子的dsODN分子包含核心序列，后者能够特异结合HIF-1转录因子。
本发明的另一方面涉及一种制剂，其含有寡核苷酸分子、至少一种总重量浓度为约0.2％到10％的渗透增强剂、和重量浓度为约1％到60％的醇。
在一实施方案中，所述制剂是水性制剂。另一实施方案中，该制剂是基于凝胶的水性制剂。再一实施方案中，该制剂是一种含有脂质体的制剂。
在另一实施方案中，本发明涉及一种乳剂制剂，其含有寡核苷酸，至少一种总重量浓度约0.2％到10％的渗透增强剂和水。
发明的所有方面和实施方案中，所述寡核苷酸优选是双链寡脱氧核苷酸分子(dsODN)，更优选是一种转录因子(TF)dsODN。
本发明涉及向细胞非亲体递送核苷酸分子(包括多-和寡核苷酸)的方法和制剂。相应地，这里描述的优选实施方案适用于本发明的方法和制剂。
附图简述

图1的曲线显示了用含有NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂F1在小鼠模型中治疗尘螨抗原诱导的异位性皮炎的效果。该基于凝胶的水性制剂F1包含0.8％月桂醇醚硫酸钠、49％乙醇、1.5％HPMC 4000cps和48.7％100mM磷酸缓冲液。测量了小鼠皮肤(耳)厚度以便对炎症，进而对NF-κB诱骗物分子在各种浓度时的治疗效果进行量化。
图2的曲线显示了用含有NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂F6在小鼠模型中治疗尘螨抗原诱导的异位性皮炎的效果。测量了小鼠皮肤(耳)厚度以便对炎症，进而对NF-κB诱骗物分子在浓度为0.25％和1％时的治疗效果进行量化。
图3的曲线显示其乙醇浓度不同的含有NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂的效果。
图4的曲线显示尘螨Ag(Dp)诱导的Nc/Nga小鼠接触性皮炎，在用含有0.25％NF-κB分子的基于凝胶的水性制剂治疗时，其IL-1β基因表达水平的下降。
图5的曲线显示尘螨Ag(Dp)诱导的Nc/Nga小鼠接触性皮炎，在用含有0.25％NF-κB分子的基于凝胶的水性制剂F2治疗时，其IL-6基因表达水平的下降。
图6的曲线显示尘螨Ag(Dp)诱导的Nc/Nga小鼠接触性皮炎，在用含有0.25％NF-κB分子的基于凝胶的水性制剂F2治疗时，其TNFα基因表达水平的下降。
图7的曲线显示尘螨Ag(Dp)诱导的Nc/Nga小鼠接触性皮炎，在用含有0.25％NF-κB分子的基于凝胶的水性制剂F2治疗时，其TSLP基因表达水平的下降。
图8显示了经福尔马林固定的异位皮炎小鼠皮肤的苏木精和曙红染色结果，(A)未进行治疗，(B)局部使用倍他米松(betamethasone)治疗，(C)用含有重量约49％的乙醇和重量约0.8％月桂醇醚硫酸钠的制剂进行治疗，以及(D)用含有重量约49％的乙醇和重量约0.8％月桂醇醚硫酸钠，并含有NF-κB诱骗物分子的制剂进行治疗。
图9显示对尘螨Ag(Dp)诱导的Nc/Nga小鼠接触性皮炎，在停止治疗后，NF-κB诱骗物分子的持续疗效，而在倍他米松治疗停止后，肿胀和发炎的突然严重复发。
图10(A)的曲线显示Nc/Nga小鼠经尘螨Ag(Dp)诱导接触性皮炎，在未经治疗、用倍他米松治疗，以及用NF-κB诱骗物分子治疗时其皮肤厚度。图10(A)显示了倍他米松治疗导致皮肤萎缩。
图10(B)显示在NF-κB诱骗物分子治疗中，没有出现可见于倍他米松治疗的全身性皮肤萎缩副作用。
图11显示倍他米松治疗和NF-κB诱骗物治疗对皮肤厚度的影响。图11显示NF-κB诱骗物治疗没有导致皮肤变薄。
图12显示患有异位性皮炎的小鼠用含有0.25％NF-κB诱骗物分子的制剂F6治疗和用局部倍他米松治疗后，其经福尔马林固定的皮肤用苦味酸-天狼星红(picro-sirius red)染色的结果。
图13示利用基于凝胶的水性制剂F2给猪皮肤递送NF-κB诱骗物分子。
图14显示竞争性结合凝胶变动实验的定量结果，它表明在DNFB致炎的猪皮肤中存在着NF-κB结合诱骗物分子，该猪皮肤用含有10％乙醇和不同浓度NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂F2治疗过。这个实验中P32标记的寡核苷酸探针是放射性标记的。将加入竞争剂后剩下的条带量做曲线。条带用TYPHOONTM8600 phosphorimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)进行了定量。凝胶图像中P32标记的寡核苷酸探针与P65蛋白质结合的减少证明猪皮肤中存在着结合了NF-κB的诱骗物分子。
图15显示竞争性结合凝胶变动实验的定量结果，它表明在DNFB致炎的猪皮肤中存在着NF-κB结合诱骗物分子，该猪皮肤用含有5％乙醇和不同浓度NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂F3治疗过。这个实验中P32标记的寡核苷酸探针是放射性标记的。将加入竞争剂后剩下的条带量做曲线。条带用TYPHOONTM8600 phosphorimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)进行了定量。凝胶图像中P32标记的寡核苷酸探针与P65蛋白质结合的减少证明猪皮肤中存在着结合了NF-κB的诱骗物分子。
图16显示竞争性结合凝胶变动实验的定量结果，它表明在DNFB致炎的猪皮肤中存在着NF-κB结合诱骗物分子，该猪皮肤用含有10％乙醇和不同浓度NF-κB诱骗物分子的含脂质体的制剂F9治疗过。这个实验中P32标记的寡核苷酸探针是放射性标记的。将加入竞争剂后剩下的条带量做曲线。条带用TYPHOONTM8600 phosphorimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)进行了定量。凝胶图像中P32标记的寡核苷酸探针结合到P65蛋白质的减少证明猪皮肤中存在着结合了NF-κB的诱骗物分子。
图17的曲线显示二硝基氟苯致炎的猪皮肤中的IL-6mRNA表达水平。
图18的曲线显示用含有0.25和0.5％NF-κB诱骗物分子的含脂质体的制剂F9治疗过的二硝基氟苯致炎的猪皮肤中，当与安慰剂治疗或未治疗皮肤相比时，相对IL-6mRNA表达水平的下降。
图19的曲线显示了用含有0.25％NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂治疗后，二硝基氟苯致炎的猪皮肤中的相对IL-6mRNA表达水平下降。
图20的曲线显示用含0.5或1％NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂治疗后，二硝基氟苯致炎的猪皮肤中相对IL-1βmRNA表达水平下降。
图21显示的TUNNEL试验结果表明倍他米松和NF-κB诱骗物分子治疗在Ag(Dp)诱导的炎症中导致凋亡增加。
图22显示异位性皮炎的福尔马林固定的小鼠皮肤的Ki67染色结果，所述小鼠皮肤用含有1％NF-κB的基于凝胶的水性制剂F6和局部倍他米松治疗过。
图23的曲线显示一些NF-κB诱骗物分子的p65/p50结合。
图24的曲线显示一些NF-κB诱骗物分子的p50/p50结合。
图25显示EMSA试验的定量结果。试验中检测了指定为“E”的诱骗物分子非特异性竞争结合转录因子Oct-1。该项试验中对Oct-1诱骗物分子进行了同位素标记。加入竞争剂后剩余的条带量进行做图。条带用TyphoonPhosphorimager(Molecular Dynamics)定量。结果表明，受测NF-κB诱骗物分子不能非特异性竞争结合对它而言不具备特异性的启动子。阳性对照是没有同位素标记的Oct-1探针(cold Oct-1probe)。
图26显示的序列是“参照诱骗物分子”(SEQ ID NO 94和95)，″新诱骗物分子″(SEQ ID NO96和97)以及″拼凑诱骗物分子″(SEQ ID NO 98和99)，其中核心序列是粗体并加有下划线。
图27显示了竞争结合试验的结果，该试验是用本发明描述的代表性诱骗物分子进行的，与参照诱骗物分子和阴性对照进行了比较。
图28的矩阵从计算学上描述了本发明的HIF-1诱骗序列的核心和其紧邻的旁侧区的碱基组成。
图29显示了按照结合亲和性分类的HIF-1诱骗物分子，其中强调了与结合亲和性相关的一些共有序列。
优选实施方案详述A.定义除非另外界定，本文使用的技术和科学名词其含义与本发明所属领域普通技术人员通常的理解相同。Singleton et al.，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley & Sons(New York，NY 1994)andMarch，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure 4thed.，John Wiley & Sons(New York，NY 1992)，对本发明申请中使用的许多名词可以为本领域技术人员提供一个普遍的指导。
名词″多核苷酸″以单数或复数形式使用时，通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，它们可以是未修饰的RNA或DNA，或者修饰过的RNA或DNA。因此，例如本文界定的多核苷酸包括，不限于，单链和双链DNA、包含单链和双链区域的DNA、单链和双链RNA、以及包含单链和双链区域的RNA、包含DNA和RNA的杂交分子，该杂交分子可以是单链或，更常见的双链分子，或者包括单链和双链区域。此外，文中所用的名词“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或者既有RNA也有DNA的三链区域。这样区域中的链可以来自相同的分子或不同的分子。所述区域可以包括全部一或多个分子，但更常见地只涉及到一些分子的一个区域。三螺旋区域的分子中的一个经常是一个寡核苷酸。名词“多核苷酸”特别包括cDNAs。该名词包括含有一或多个修饰碱基的DNAs(包括cDNAs)和RNAs。因此，那些因为稳定性或其他原因而对骨架进行了修饰的DNA或RNA也是本文中名词所要表达的“多核苷酸”。此外，包含罕见碱基(比如肌苷)，或者修饰碱基，比如含氚碱基也包含在本文界定的名词“多核苷酸”中。总之，名词“多核苷酸”涵盖了未修饰多核苷酸的所有化学方法、酶学方法和/或代谢修饰形式，也涵盖了化学合成的病毒和细胞(包括简单和复杂细胞)所特有的DNA和RNA，尤其包括寡核苷酸，比如例如寡核苷酸诱骗物分子和反义寡核苷酸。
名词“寡核苷酸”是指相对较短的多核苷酸，包括但不限于，单链脱氧核糖核苷酸、单或双链核糖核苷酸、RNA:DNA杂交分子和双链DNA。寡核苷酸，比如单链DNA探针寡核苷酸通常是通过化学方法合成的，例如利用市场上销售的自动寡核苷酸合成仪来合成。但是，寡核苷酸也可以通过其他许多种方法来制备，这些方法包括体外重组DNA介导的技术以及通过在细胞和生物体内表达DNA。通常，寡核苷酸由约5到50(比如10到40，或15到30)个核苷酸碱基组成。
名词“反义寡核苷酸”用来表示这样一种寡核苷酸或其类似物，它与RNA或DNA的一个片段互补，并与之结合而抑制其正常功能。
名词“生物膜”用于指代哺乳动物中隔离外界的任何类型的身体表面。该名词特别包括皮肤和动物体内管状结构的被覆层，比如粘膜。
名词“双链”用于指代包含两条互补核苷酸链的核酸分子，其中两条链是通过Watson-Crick碱基配对结合在一起。该名词特别包括那些除了由两条互补链形成的双链区域，还含有单链突出端，和/或在其3’和/或5’末端共价连在一起的分子。
名词“寡核苷酸诱骗物”、“双链寡核苷酸诱骗物”、“寡脱氧核苷酸诱骗物”以及“双链寡脱氧核苷酸诱骗物”可以互换使用，用于指代一些短的核酸分子，其包含一个能够结合并干扰目标转录因子生物功能的双链区。例如，名词″NF-κB寡核苷酸诱骗物″、“双链NF-κB寡核苷酸诱骗物″、“NF-κB寡脱氧核苷酸诱骗物”以及″双链NF-κB寡脱氧核苷酸诱骗物″可以互换使用，指代一些短的核酸分子，其包含一个能够结合并干扰NF-κB转录因子生物功能的双链区。名词“双链”用于指代包含两条通过Watson-Crick碱基配对结合在一起的互补核苷酸链的核酸分子。该名词特别包括E2F、NF-κB和HIF-1寡脱氧核苷酸诱骗物分子，除了由两条互补链形成的双链区，这些分子还包含单链突出端。此外，该名词还特别包括E2F、NF-κB和HIF-1寡脱氧核苷酸诱骗物分子，除了双链区，其中的两条链还在3′和/或5′末端共价连在一起。
文中所用名词″E2F″是其最广泛的含义，包括所有天然存在于任何动物物种(比如哺乳动物)的E2F分子，包括E2F-1、E2F-2、E2F-3、E2F-4、E2F-5和E2F-6。
文中所用名词″NF-κB″″是其最广泛的含义，包括所有天然存在于任何动物物种(比如哺乳动物)的NF-κB，包括NF-κB/Rel家族成员的所有组合形式，例如p52、p50、p65、cRel和Rel B。
名词″HIF-1″以其最广泛的含义用于本文，包括所有天然存在于任何动物物种(比如哺乳动物)的HIF-1分子，包括HIF-1α/HIF-1β异源二聚体及其亚基。
名词″转录因子结合序列″是结合转录因子的短核苷酸序列。该名词特别包括一些天然结合序列，它们通常可见于其转录受到一或多个转录因子调控的那些基因的调控区。该名词进一步包括人工(合成的)序列，它们不是天然存在的，但能竞争性地抑制转录因子与内源基因中的结合位点的结合。
用于本文的短语″修饰核苷酸″是指那些与天然核苷酸和三磷酸核苷酸在组成和/或结构上不同的核苷酸或三磷酸核苷酸。
用于本文时，名词″5撇″或″5以及″3撇″或″3是指相对核酸来说的特定方向。核酸具有不同的化学方向性，因此它们的两个末端用5撇(5′)或3撇(3′)来区别。核酸的3′端含有连在末端戊糖的3′碳上的游离羟基。核酸的5′端含有连在末端戊糖的5′碳身的游离羰基或磷酸基团。
用于本文时，名词″突出端″是指这样一些双链核酸分子，它们没有平末端，因此两条链的末端不是共同延伸的，以致一条链的5′端延伸超过其互补链的3′端。线性核酸分子可能有零、一或两个5′突出端。
用于本文时，名词″优先结合″及其在语法上的等同词汇用来表示其特异性/亲和性系数至少约40，其中的特异性/亲和性比率定义如下特异性/亲和性系数＝(Sp50/p50-Sp65/p50)×Sp50/p50/Sp65/p50
其中Sp50/p50等于竞争50％p50/p50与来自HIV的非哺乳动物NF-κB启动子(序列113/114)之间的结合所需的诱骗物摩尔多余量；Sp65/p50等于竞争50％p65/p50与来自HIV的非哺乳动物NF-κB启动子(序列113/114)之间的结合所需的诱骗物摩尔多余量。如果诱骗物在试验的任何摩尔比率都不能竞争至少50％结合，其分数(S)定为100。
名词“炎性疾病”或“炎性紊乱”用在本文中是指导致炎症的病理学状态，通常是由嗜中性粒细胞趋化性引起的。这类紊乱的例子包括，但不限于炎性皮肤病(包括银屑病(psoriasis)和异位性皮炎)；系统性硬皮病和胞壁增厚(sclerosis)；以及与发炎性肠道疾病(IBD)(比如克罗恩病和溃疡性结肠炎)相关的反应；缺血再灌注紊乱包括手术组织再灌注损伤(surgical tissuereperfusion injury)、心肌缺血病症比如心肌梗塞、心搏停止、心脏手术后的再灌注和经皮穿刺腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronaryangioplasty)后的缩窄、中风和腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysms)；中风继发脑水肿(cerebral edema secondary to stroke)；颅外伤、低血容量性休克(hypovolemic shock)；窒息；成人呼吸窘迫综合征(adult respiratory distresssyndrome)；急性肺损伤；白塞氏病(Behcet′s Disease)；皮肌炎(dermatomyositis)；多发性肌炎(polymyositis)；多发性硬化(multiple sclerosis)(MS)；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎(uveitis)；骨关节炎；狼疮性肾炎；自身免疫疾病比如类风湿性关节炎(RA)、Sjorgen综合征、血管炎；涉及白细胞渗出(leukocyte diapedesis)的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性疾病、败血症或创伤引发的多器官损伤综合征；酒精性肝炎；细菌性肺炎；抗原-抗体复合物介导的疾病包括肾小球性肾炎；脓毒(sepsis)；肉样瘤病(sarcoidosis)；组织/器官移植的免疫病理反应；肺部炎症，包括肋膜炎、齿槽炎、脉管炎、肺炎、慢性支气管炎、细支气管扩张、祢漫性泛细支气管炎(diffuse panbronchiolitis)、过敏性肺炎(hypersensitivity pneumonitis)，特发性肺纤维化(idiopathicpulmonary fibrosis)(IPF)，和囊肿性纤维化等。优选的适应症包括，但不限于，类风湿性关节炎(RA)、类风湿性脊椎炎、痛风性关节炎和其他关节炎症状、慢性炎症、自体免疫糖尿病、多发性硬化(MS)、哮喘、系统性红斑狼疮、成人呼吸窘迫综合征、白塞氏病、银屑病、慢性肺部炎性疾病、移植物抗宿主反应、克罗恩病、溃疡性结肠炎、发炎性肠道疾病(IBD)、阿尔茨海默氏病、和pyresis，以及任何与炎症及其相关紊乱有关的疾病或紊乱。
名词″凋亡″和″凋亡活性″以其广义用于本文，是指哺乳动物中有序或控制性的细胞死亡方式，通常伴有一或多种特征性的细胞变化，包括细胞质缩合、质膜微绒毛脱落、细胞核分节、染色体DNA降解或线粒体功能丢失。该活性可通过例如细胞活性检测、FACS分析或DNA电泳来确定和测量。
名词″癌症″和″癌性的″是指或者描述了哺乳动物体内的一种生理状态，其典型特征是失控的细胞生长。癌症例子包括，但不限于癌(carcinoma)、淋巴癌、白血病、母细胞瘤(blastoma)和肉瘤。这些癌症的具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme)、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、结肠癌和头颈鳞癌。在一个优选实施方案中，所述癌症包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌。
名词“治疗”是指治愈性治疗以及预防性(prophylactic或preventative)措施，其目的是预防或缓解(减轻)目标病理学状况或紊乱。为本发明目的，有益的或期望的临床结果包括，但不限于症状的减轻、疾病进展停止、疾病状态稳定(即不再恶化)、疾病进展延缓或减慢、疾病状态改善或缓和，以及能检测到或不能检测到的病愈(部分或完全)。需要治疗的人包括已经患有紊乱的人和那些容易染上紊乱的人，或者要预防紊乱的人。在肿瘤(例如癌症)的治疗中，治疗剂可能能够直接减轻肿瘤细胞的病理，或使得肿瘤细胞对其他治疗剂治疗(例如放射和/或化疗)更敏感。
“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选是人类。
名词″哺乳动物″在本文中指任何划归哺乳动物的动物，包括但不限于，人类、高级灵长类、啮齿类、家养和农场动物、以及动物园、运动或宠物动物，如羊、狗、马、猫、牛等。优选，文中所述哺乳动物是人类。
名词″细胞毒剂″用于本文是指抑制或妨碍细胞功能和/或导致细胞被破坏的物质。该名词包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素)、化疗剂、和一些毒素(比如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或有酶活性的毒素)，包括其片段和/或变异体。
名词″化疗剂″用于本文是指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括，但不限于烷化剂比如硫替哌(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐比如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶比如benzodopa、卡波醌(carboquone)、meturedopa和uredopa；乙烯亚胺和甲胺包括六甲蜜胺(altretamine)、三胺嗪(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和trimethylolomelamine；番荔枝内酯(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和bullatacinone)；喜树碱(camptothecin)(包括其合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素(cryptophycins)(尤其是隐藻素1和隐藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；duocarmycin(包括其合成类似物KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥比如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、cholophosphamide，雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、双氯乙基甲胺氧化盐酸(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、novembichin、phenesterine、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲比如亚硝脲氮芥(carmustine)、葡糖氯乙亚硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素比如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素(1I和加利车霉素2I1，参见例如Agnew Chem Intl.Ed.Engl.33183-186(1994)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团和相关的生色蛋白烯二炔类抗生素生色团)，阿克拉霉素aclacinomysins、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、carzinophilin、色霉素、放线菌素(dactinomycin)D、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉-阿霉素、氰吗啉(cyano morpholino)-阿霉素、2-吡咯啉(pyrrolino)-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素、橄榄霉素、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素、quelamycin、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素、链脲菌素(streptozocin)、杀结核霉素、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物比如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物比如denopterin、氨甲蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物比如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、thiamiprine、硫代鸟嘌呤；嘧啶类似物比如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟脱氧尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素比如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮(dromostanolone)丙酸盐、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酪(testolactone)；抗肾上腺素比如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂比如frolinic acid；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；edatraxate；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱(maytansinoids)比如美登素和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝氨吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；podophyllinic acid；2-ethylhydrazide；甲基苄肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；力索新(rhizoxin)；西佐糖(sizofiran)；锗罗胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2′’-三氯三乙胺(trichlorotriethylamine)；单端孢霉毒素族(trichothecenes)(特别是T-2毒素、verracurin A，漆斑菌素(roridin)A和anguidine；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(″Ara-C″)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；硫替哌(thiotepa)；taxoids，例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他赛(doxetaxel)(TAXOTERE，Rhne-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物比如顺铂和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；鬼臼亚乙苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春花新碱(vincristine)；去甲长春花碱(vinorelbine)；长春瑞滨(navelbine)；novantrone；替尼泊苷(teniposide)；柔毛霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班磷酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；以及任何以上物质的可药用盐、酸或衍生物。同样包含在这个定义中的是调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，比如抗雌激素，包括例如三苯氧胺、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制4(5)-咪唑的芳香酶、4-羟基黛莫芬(hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬盐酸盐(keoxifene)、LY117018、欧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；以及抗雄激素比如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任意物质的可药用盐、酸或衍生物。
″抗炎药物″用于本文包括但不限于非类固醇抗炎药物和皮质类固醇，如倍他米松(betamethasone)。可分别参见The Merck Manual of Diagnosis andTherapy(15版，Berkow et al.Eds.，1987，Rahway，N.J.)p2499-2506和p46-49。
B.发明详述本发明涉及利用制剂向细胞递送多核苷酸(包括寡核苷酸)的方法，所述制剂能够提高靶生物膜的通透性，从而使得多核苷酸能够跨越该生物膜。这些方法和制剂可以用于许多目的中多核苷酸(包括寡核苷酸)的递送，包括但不限于，用于基因表达的调控。尤其是，本发明涵盖含有双链寡核苷酸分子的制剂。
本发明的制剂包括，但不限于胶、溶液、乳剂和含有脂质体的制剂。
本发明的一个方面，所述制剂包括一或多种渗透增强剂以便协助多核苷酸(包括寡核苷酸)跨生物膜运输到靶细胞内。
本发明一些实施方案提供了这样的制剂，其含有一或多种多核苷酸与其他药物活性成分组合在一起，比如例如，一或多种化疗剂和/或抗炎药物。
在另一个相关实施方案中，本发明的制剂可以含有针对转录因子的一或多种寡核苷酸，尤其是双链寡核苷酸诱骗物分子。诱骗物分子的大量例子是本领域已知的。
剂量取决于根据待治疗疾病的严重性和对药物的反应性，治疗过程持续几天到数月，或者直至病愈或病况好转。最佳剂量安排可以从药物在患者体内累积的测定值计算得到。普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法学和重复率。根据各个寡核苷酸的相对效力，最佳剂量可能有所变化。一般来说，剂量是每公斤体重0.01μg到100g，每天、每周、每月或每年给予一或多次，甚至每2到20年给予1次。本领域普通技术人员可以根据测定到的药物在体液或组织中存留的时间和浓度很容易地估计出给药重复率。
渗透增强剂(penetration enhancer)本发明应用渗透增强剂来影响多核苷酸，尤其是寡核苷酸(比如双链寡脱氧核苷酸)经动物皮肤的递送效率，所述动物是比如包括人在内的哺乳动物。渗透增强剂是本领域熟知的，可以划归5个大类，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合性非表面活性剂之一(Lee et al.，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92)。以上提到的渗透增强剂种类在下文有更详细的描述。
表面活性剂表面活性剂(Surfactants或″surface-active agents″)是这样一些化学实体，当溶于水溶液时能使溶液的表面张力或水溶液和另一种液体之间的临界面张力降低，这样就导致寡核苷酸经生物膜的吸收被提高。除了胆汁盐和脂肪酸，这类渗透增强剂包括例如，月桂基硫酸钠、月桂醇醚硫酸钠、N-月桂酰肌氨酸、失水山梨醇单月桂酸酯20(Span 20)、十四烷酸异丙酯、聚氧化乙烯-9-月桂基乙醚和聚氧化乙烯-20-十六烷基乙醚(Leeet al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92)；以及全氟化化合物乳剂，比如FC-43(Takahashi et al.，J.Pharm.Pharmacol.，1988，40，252)。
表面活性剂广泛应用于制剂中比如溶胶(包括微乳)和脂质体。对大量不同种类天然和合成表面活性剂进行分类和特性分级的最常用方法是采用亲水/亲脂平衡值(HLB)。亲水基团(又称为“头部”)的特性是对制剂中使用的不同表面活性剂进行分类的最有用手段(Rieger，in Pharmaceutical DosageForms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，p285)。
如果表面活性剂分子没有离子化，它就划分为非离子表面活性剂。非离子表面活性剂在药物和化妆产品中有广泛应用，它们可以在很宽的pH值范围内使用。通常根据其结构，它们的HLB值处于2到约18。非离子表面活性剂包括非离子酯类，比如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、山梨聚糖酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子烷醇酰胺和乙醚比如乙氧基脂肪醇、丙氧基醇和乙氧基/丙氧基嵌段共聚物也包含在这一类中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子表面活性剂这一类中最受欢迎的成员。
在溶于或分散于水中时，表面活性剂分子如果携带负电荷，该表面活性剂划分为阴离子型。阴离子表面活性剂包括羧基盐比如肥皂、酰基乳酰盐、氨基酸的酰胺物、硫酸酯类比如烷基硫酸盐和乙氧基化的烷基硫酸盐、磺酸盐比如烷基苯磺酸盐、酰基羟乙基磺酸盐、酰基牛磺酸盐和磺基琥珀酸盐以及磷酸盐。阴离子表面活性剂的最重要成员是烷基硫酸盐和肥皂。
在溶于或分散于水中时，表面活性剂分子如果携带正电荷，该表面活性剂划分为阳离子型。阳离子表面活性剂包括季胺盐和乙氧化胺。季胺盐是这类中最常用的。
如果表面活性剂分子既能携带阳离子，也可携带阴离子，该表面活性剂就是两性的。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。
表面活性剂在药物制品、制剂和乳剂中的应用已有综述(Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，p285)。
脂肪酸可以用做渗透增强剂的各种脂肪酸包括例如，油酸、月桂酸、癸酸(n-癸酸)、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯(dicaprate)、三癸酸(tricaprate)、油酸单甘油酯(1-单油酰-rac-甘油)、二月桂酸甘油酯(dilaurin)、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-dodecylazacycloheptan-2-one、酰基肉碱(acylcarnitines)、酰基胆碱、其1-10碳烷基酯(例如甲基、异丙基和t-丁基)，及其单-和二甘油酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(Lee et al.，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92；Muranishi，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；El Hariri et al.，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，651-654)。
胆汁盐胆汁的生理学作用包括促进脂肪和脂溶性维生素的分散和吸收(Brunton，Chapter 38 inGoodman & Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，9th Ed.，Hardman et al.Eds.，McGraw-Hill，New York，1996，p934-935)。各种天然胆汁盐及其合成衍生物可以作为渗透增强剂。因此名词″胆汁盐″包括胆汁的所有天然成分以及它们的合成衍生物。本发明的胆汁盐包括例如，胆酸(或其可药用钠盐胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、glucholic acid(sodium glucholate)、乙醇酸(乙醇酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid)(鹅脱氧胆酸钠)、熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid)(UDCA)、牛-24，25-二氢-梭链孢酸钠(sodiumtauro-24，25-dihydro-fusidate(STDHF))、甘氨二氢梭链孢酸钠(sodiumglycodihydrofusidate)和聚氧化乙烯-9-月桂基乙醚(polyoxyethylene-9-laurylether(POE))(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92；Swinyard，Chapter 39 InRemington′s Pharmaceutical Sciences，18thEd.，Gennaro Eds.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990，p782-783；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；Yamamoto et al.，J.Pharm.Exp.Ther.，1992，263，25；Yamashita et al.，J.Pharm.Sci.，1990，79，579-583)。
螯合剂螯合剂在用于本发明时，可以定义为这样的化合物，它们能够通过与金属离子形成复合物而将之从溶液中去除，从而使得寡核苷酸经生物膜的吸收增强。就在本发明中作为渗透增强剂而言，螯合剂另外还有可以作为DNase抑制剂的优点，因为多数已有研究的DNA核酸酶的催化都需要二价金属离子，所以会被螯合剂抑制(Jarrett，J.Chromatogr.，1993，618，315-339)。本发明的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如，水杨酸钠、5-甲氧水杨酸盐和高香草酸盐)、胶原蛋白的N-酰基衍生物、laureth-9和β-二酮(烯胺)的N-氨酰基衍生物(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；Buur et al.，J.Control Rel.，1990，14，43-51).
非螯合非表面活性剂用在本文，非螯合非表面活性剂渗透增强化合物可以定义为这样的化合物，它们没有明显的螯合剂或表面活性剂活性，但是却能增强寡核苷酸经生物膜的吸收(Muranishi，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33)。这类渗透增强剂包括，例如不饱和环脲、1-烷基-和1-alkenylazacyclo-烷酮衍生物(Lee et al.，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92)；以及非类固醇抗炎药物比如双氯芬酸钠、吲哚美辛(indomethacin)和苯丁唑啉(phenylbutazone)(Yamashita et al.，J.Pharm.Pharmacol.，1987，39，621-626)。
还可以在发明所述制剂中加入能够增强寡核苷酸细胞水平的吸收的试剂。例如，阳离子脂质，比如阳离子脂质体(lipofectin)(Junichiet al.，美国专利5,705,188)、阳离子甘油衍生物和多聚阴离子分子，比如聚赖氨酸(Lollo etal.，PCT申请WO 97/30731)，也显示出增强寡核苷酸的细胞吸收的活性。
其他可以用于所给予寡核苷酸的促渗透试剂包括甘醇(比如乙二醇和丙二醇)、吡咯(比如2-吡咯)、azones和萜(比如柠檬烯和薄荷酮)。
本发明涉及向细胞递送核酸分子(包括多核苷酸和寡核苷酸)的方法和制剂，其包含使生物膜与含有至少一种渗透增强剂的制剂进行接触。在一实施方案中，所述渗透增强剂是阴离子表面活性剂。一实施方案中，该阴离子表面活性剂是烷基硫酸盐或月桂基硫酸盐。另一实施方案中，该阴离子表面活性剂是烷基乙醚硫酸盐或月桂醇醚硫酸钠。在一实施方案中，所述制剂包含至少两种渗透增强剂，其中的渗透增强剂是N-月桂酰肌氨酸和失水山梨醇单月桂酸酯20(Span 20)。另一实施方案中，所述制剂进一步包含十四烷酸异丙酯。
载体(carrier)本发明的一些组合物还在制剂中加入了载体。用在本文中″载体化合物″或″载体″可以例如是指一种核酸或其类似物，它是惰性的(即其本身没有生物活性)，但会被那些能减少核酸的生物可得性的体内过程(例如降解有生物学活性的核酸或者促进其从循环系统的去除)认为是核酸。将本发明的多核苷酸与载体化合物一起给药，通常情况下要使用过量的后者，会使得肝、肾或其他循环外储存器吸收的多核苷酸量大大减少，猜测这是由于载体化合物和核酸竞争同一受体造成的。例如，如果与多聚肌苷酸、葡聚糖硫酸盐、多聚胞苷酸或4-乙酰氨基-4′-异硫氰-茋-2，2′-二磺酸一起给药时，部分硫代磷酸酯化的寡核苷酸在肝组织中的吸收会下降(Miyao et al.，Antisense Res.Dev.，1995，5，115-121；Takakura et al.，Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.，1996，6，177-183)。
赋形剂(excipient)与载体化合物不同，″可药用载体″或″赋形剂″是指可药用溶剂、悬浮剂或其他任何用于向动物递送一或多种核酸的药理学上惰性的传递媒介。赋形剂可以是液体或固体，在选择时要考虑到计划的给药方式，从而能够在与核酸以及指定药物组合物的其他成分组合时，提供所需要的体积、密度等。典型的可药用载体包括，但不限于粘合剂(例如，预凝胶化糯玉米淀粉(maize starch)、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、硅石、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉(corn starch)、聚乙二醇、苯甲酸钠、醋酸钠等)；崩解剂(例如淀粉、羧乙酸淀粉钠等)；和润湿剂(例如月桂基硫酸钠等)。
适用于非亲代给药的可药用有机或无机赋形剂也可以用来配制发明所述组合物，这些赋形剂不会与核酸发生有害反应。合适的可药用载体包括，但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
其他成分本发明所述制剂可以另外含有其他药物组合物中常见的辅助成分，参照技术领域已知用量使用。因此，例如所述制剂可以另外含有相容的药物活性物质，比如例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂；或者可以另外含有用于配制发明所述组合物的各种剂量形式的物质，比如染料、增味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。但是，加入这些物质时，它们不能不适当地影响发明所述制剂之成分的生物活性。可以将制剂灭菌，如果需要还可以与不会与制剂中的寡核苷酸进行有害反应的辅剂混合，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透亚的盐、缓冲液、增色剂、增味剂和/或香料等。
水性制剂(aqueous formulation)本发明的制剂可以制备成水性胶、水性溶液或水性悬浮液。
发明的一个方面，本发明所述用于向细胞递送多核苷酸的水性制剂包括至少一种渗透增强剂，其总重量浓度约0.2％到10％，以及重量浓度约1％到60％的醇。在一实施方案中，所述多核苷酸是寡核苷酸。
在另一实施方案中，水性制剂中渗透增强剂的重量浓度约0.8％。用于本发明的各种渗透增强剂是本领域所熟知的。
在另一实施方案中，水性制剂中醇的重量浓度可以在约5％到50％的范围内。一实施方案中，所述醇是乙醇。
再一实施方案中，所述水性制剂是基于凝胶的水性制剂。在一实施方案中，所述基于凝胶的水性制剂包含重量浓度约0.8％的月桂醇醚硫酸钠。另一实施方案中，所述基于凝胶的水性制剂进一步包含重量浓度约1％、5％、10％、20％或49％的乙醇。
在一实施方案中，本发明的基于凝胶的水性制剂粘度足以形成粘胶。另一实施方案中，该基于凝胶的水性制剂中的渗透增强剂是月桂醇醚硫酸钠，醇是乙醇。再一实施方案中，该基于凝胶的水性制剂包含重量浓度约0.8％的月桂醇醚硫酸钠和约49％的乙醇。另一实施方案中，所述基于凝胶的水性制剂还含有另外的可药用的非活性物质，比如羟丙基甲基纤维素-4000 (HPMC 4000)和/或氯化镁。
在另一实施方案中，所述基于凝胶的水性制剂进一步包含1-苯基哌嗪。
水溶胶制剂中采用的非活性成分的最佳用量可以根据具体的活性药物和预期用途来决定。
水悬浮液可以另外或替代地含有能增加悬浮液粘度的物质，这类物质包括例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或萄聚糖。所述悬浮液还可以含有稳定剂。
基于乳剂的制剂(emulsion-based formulation)本发明的制剂可以制备成乳剂。典型的乳剂是一种液体以通常直径超过0.1μm的小滴的形式分散在另一种液体中所形成的异源体系(Idson，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.1，p199；Rosoff in PharmaceuticalDosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.1，p245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.2，p335；Higuchi et al.，in Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，Easton，Pa.，1985，p301)。乳剂通常是包含两个不可混合液相的两相体系，这两个液相密切混合和分散的。一般来说，乳剂或是油包水(w/o)或是水包油(o/w)类型。水相细致地分解成微小液滴并分散到很大体积的油相中时所产生的组合物称为油包水(w/o)乳剂。替代地，如果油相分解成微小液滴并扩散到大体积水相，产生的组合物称为水包油(o/w)乳剂。除了扩散相和活性药物，乳剂还可以含有其他成分，其中活性药物可能是以水相、油相中的溶液形式存在，或者本身自成一相。如果需要，乳剂中还可以有可药用赋形剂，比如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂。可药用乳剂还可以是多重乳剂，包含两个以上的液相，比如例如oil油-水-油(o/w/o)和水-油-水(w/o/w)乳剂。这类复合制剂通常具有一些简单的两相乳剂所没有的优势。o/w乳剂中的单个油滴包裹着小的水滴就构成w/o/w乳剂。类似地，如果油滴被油液中稳定存在的水珠包裹着所构成的体系就是o/w/o乳剂。
乳剂特性在于有很少或没有热动力学稳定性。通常，乳剂的分散或不连续相很好地分散到外相或连续相中，并且借助乳化剂或制剂的粘度而维持这种状态。乳剂的液相可以是半固体或固体的，比如乳剂形式的软膏基质和霜就是这种情况。乳化剂可以大概分成4类合成表面活性剂、天然乳化剂、吸收基质和超细分散固相(Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.1，p199)。
合成表面活性剂(surfactants)，又称为表面活性剂(surface active agents)广泛应用于乳剂制剂，对此已有文献综述(Rieger，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，Vol.1，p285；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，Vol.1，p199)。表面活性剂通常是两亲性的，包含亲水部分和疏水部分。表面活性剂亲水部分与疏水部分的比率被称为亲水/亲脂平衡值(HLB)，是对表面活性剂进行分类和选择用于制备制剂的有用工具。表面活性剂根据其亲水基团可以分成不同种类非离子型、阴离子型、阳离子型和兼性型(Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.1，p285)。
用于乳剂制剂的天然乳剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和金合欢胶。吸附基质具有亲水特性因此它们能够吸收水分形成w/o乳剂，但仍保持它们的半固体稠度，比如无水羊毛脂和亲水凡士林。颗粒极细的固体也可以是很好的乳化剂，尤其是与表面活性剂组合来用于粘性制备物中。这类乳化剂包括极性无机固体，比如重金属氧化物、非膨润性粘土比如皂土、凹凸棒粘土、水辉石(hectorite)、高岭土、蒙脱石(montmorillonite)、胶体硅酸铝和胶体硅酸镁铝、色素以及非极性固体比如碳或甘油三硬脂酸酯。
乳剂制剂中还包括许多影响乳剂特性的非乳化物质。这些物质包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、油酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.335；Idson，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.199)。
亲水胶体(Hydrophilic colloids或hydrocolloids)包括天然树胶和合成多聚物比如多糖(例如金合欢胶、琼脂、褐藻酸、角叉藻聚糖、瓜尔豆胶(guargum)、刺梧桐胶(karaya gum)和黄茋胶)、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)以及合成多聚物(例如carbomers、纤维素醚和多聚羧乙烯)。这些物质分散到水中或者在水中膨胀形成胶溶液，进而通过在分散相液滴周围形成强的界面膜以及增加外相粘度来稳定乳剂。
因为乳剂经常含有许多便于微生物生长的成分，比如碳水化合物、蛋白质、固醇和磷脂，这类制剂常要加入防腐剂。乳剂制剂中常用的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯(methyl paraben)、对羟基苯甲酸丙酯(propylparaben)、季胺盐、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、对羟基苯甲酸和硼酸的酯类。乳剂制剂中也经常加入抗氧化剂来防止制剂的变质。常用抗氧化剂可以是自由基清除剂(比如生育酚、烷基没食子酸盐、丁化羟基苯甲醚、丁化羟基甲苯)，或者还原剂(比如抗坏血酸和焦亚硫酸钠)，以及抗氧化增效剂(比如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂)。
乳剂制剂的经皮、口服以及亲代途径应用和它们的制备方法已有综述文献(Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.199)。口服的乳剂制剂应用很广泛因为制剂方便、吸收效果和生物可得性方面的原因(Rosoff in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.245；Idson，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.199)。矿物油基质缓泻药、脂溶维生素和高脂营养制是常见的以o/w乳剂形式经口服给予的物质中的例子。
本发明一实施方案中，递送寡核苷酸的制剂制备成微乳液。
微乳液可以定义为水、油和亲水脂分子体系，它是一个光学上各向同性的、热动力学稳定的液体溶液(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.245)。制备典型的微乳液是首先将油分散到水表面活性剂溶液中，然后加入足够量的第四种成分(通常是中等链成的醇)从而形成一个透明体系。因此，微乳液被描述为是两种不相溶液体构成的热动力学稳定、各向同性的清澈分散体系，其中这两种液体借助表面活性分子的界面膜来稳定(Leung and Shah，inControlled Release of DrugsPolymers and AggregateSystems，Rosoff，M.，Ed.，1989，VCH Publishers，New York，pages 185-215)。微乳液通常是将包括油、水、表面活性剂、共表面活性剂和电解质的三到五种成分混合制备的。微乳液是油包水(w/o)或水包油(o/w)型取决于所用的油和表面活性剂的特性以及表面活性剂分子极性头部和碳氢化合物尾部的结构和几何排列方式(Schott，in Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，Easton，Pa.，1985，p.271)。
人们广泛研究了采用相位图进行的现象学方法，获取的大量知识可供本领域技术人员决定如何配制微乳液(Rosoff，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，volume 1，p.245；Block，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.335)。相较传统的乳剂，微乳液的优点在于使水不溶性的药物能够溶于自发形成的热动力学液滴构成的制剂中。
用于制备微乳液的表面活性剂包括，但不限于离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ML310)、四甘油单油酸酯(MO310)、六甘油单油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯decaglycerol monocaprate(MCA750)、十甘油单油酸酯(MO750)、十甘油X油酸酯decaglycerolsequioleate(SO750)、十甘油十油酸酯(DAO750)，它们单独或与共表面活性剂组合使用。共表面活性剂通常是能够增加界面流动性的短链醇(比如乙醇、1-丙醇和1-丁醇)，因为它们能渗透到表面活性剂膜内，由于表面活性剂分子间产生的空隙而形成无序的膜。
但是可以不使用共表面活性剂来制备微乳液，技术上已有无醇自乳化微乳液。本发明的一实施方案中，所制备的微乳液制剂没有醇。
水相一般是，但不限于是水、药物水溶液、甘油、PEG300、PEG400、多聚甘油、丙二醇和乙二醇衍生物。油相包括，但不限于以下物质，比如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中链(C8-C12)单、二和三甘油酯、聚氧乙烯化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化的甘油酯、饱和聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅酮油。
从药物溶解性和促进药物吸收的角度考虑，人们对微乳液尤其感兴趣。已有提议利用脂基微乳液(o/w和w/o)来增加包括肽在内的药物的口服生物可得性(Constantinides et al.，Pharmaceutical Research，1994，11，1385-1390；Ritschel，Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.，1993，13，205)。微乳液具备的优点是能提高药物溶解度、防止药物被酶水解、由于表面活性剂导致的膜流动性和通透性的改变使得可能增加药物吸收、易于制备、比固体剂型易于口服给药、临床药效提高以及毒性降低(Constantinides et al.，PharmaceuticalResearch，1994，11，1385；Ho et al.，J.Pharm.Sci.，1996，85，138-143)。室温将全部成分放在一起时，微乳液经常能自发形成。这在配制不耐热的药物、肽或寡核苷酸时尤其有利。微乳液在化妆品和医药应用中都能有效地透皮递送活性成分。我们预期本发明的微乳液制剂能协助提高由肠胃道系统吸收寡核苷酸，以及增强肠胃道、阴道、口腔和其他给药部位内寡核苷酸的局部细胞摄取。
本发明的微乳液还可以含有其他成分和添加剂比如失水山梨醇单硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol以及渗透增强剂来改善制剂的特性，并促进发明所述寡核苷酸的吸收。用于本发明所述微乳液的渗透增强剂可以划归5大类之一-表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(Lee etal.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.92)。这些种类在上文都已讨论过。用于本发明的各种渗透增强剂是本领域熟知的。
发明的一实施方案中，所述基于乳剂的制剂包括一或多种渗透增强剂。在一实施方案中，该渗透增强剂是表面活性剂。在另一实施方案中，渗透增强剂可以选自月桂醇醚硫酸钠、N-月桂酰肌氨酸、失水山梨醇单月桂酸酯20(Span 20)和十四烷酸异丙酯。
基于乳剂的制剂中的渗透增强剂重量浓度可以在约0.2％到10％，或者约0.35％到0.8％。
本发明的一实施方案中，基于乳剂的制剂包含重量浓度约0.35％的月桂醇醚硫酸钠。发明的另一实施方案中，基于乳剂的制剂包含重量浓度约0.8％的月桂醇醚硫酸钠。再一实施方案中，所述基于乳剂的制剂包含重量浓度约0.4％的失水山梨醇单月桂酸酯20(Span 20)和约0.6％的N-月桂酰肌氨酸。还有一实施方案中，该基于乳剂的制剂进一步包含重量约10％的十四烷酸异丙酯。
在发明的另一实施方案中，所述基于乳剂的制剂还可以含有其他非药物活性物质，比如羟丙基甲基纤维素-4000(HPMC 4000)以及防腐剂，比如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
发明的一实施方案中，所述基于乳剂的制剂进一步包含1-苯基哌嗪。
含脂质体的制剂除了微乳液，还有许多有序的表面活性剂结构得到研究并被应用于药物制剂。它们包括单分子层、胶束、双分子层和囊泡。人们对象脂质体这类囊泡很感兴趣，因为其特异性和从药物递送角度来说的药效持续性。用于本发明时，名词“脂质体”表示处于球形双分子层或双分子层的两亲性脂构成的囊泡。
脂质体是这样的单层或多层囊泡，其具有由亲油性物质形成的膜和水性内部。水性部分含有要递送的组合物。阳离子脂质体的优点是能与细胞壁融合。非阳离子脂质体虽然不能很有效地与细胞壁融合，但能被体内巨噬细胞摄取。
脂质体的其他优点还包括由天然磷脂得到的脂质体是生物相容的和生物可降解的；脂质体中可以引入大量水和脂溶性药物；脂质体可以使包裹在其内部的药物免于被代谢和降解(Rosoff，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，volume 1，p.245)。制备脂质体制剂时需要重点考虑的是油脂表面电荷、囊泡大小以及脂质体的水容积。
脂质体可用来将活性成分转移和递送到它们的作用部位。由于脂质体膜与生物膜结构类似，将脂质体供给组织时，脂质体就会开始与细胞膜融合。随着脂质体与细胞的融合逐步进行，脂质体内的物质就会流入细胞，活性成分在此发挥作用。
脂质体制剂以及许多药物的递送模式一直是许多研究项目的重心所在。越来越多的证据表明对于局部给药来说，脂质体比其他制剂形式更有优势。这些优势包括由于所给予的药物的系统吸收高了，相关地副作用降低；药物在目标部位蓄积增加，以及能够将多种(亲水性和疏水性)药物给予皮内。
有些报道描述了脂质体能够将包括高分子量DNA在内的药剂递送到皮内。包括止痛药、抗生素、激素和高分子量DNA在内的化合物都曾被给予皮肤。这些应用多数实现了针对上表皮的定向。
脂质体归属两大类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，它们能与带负电的DNA分子相互作用形成稳定的复合体。带正电的DNA/脂质体复合体结合到带负电荷的细胞表面，并被内在化到内体中。内体中的酸性pH使得脂质体破裂，其内部物质被释放到细胞质内(Wang et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1987，147，980-985)。
pH-敏感或带负电荷的脂质体会截留DNA，而不是和它形成复合体。因为DNA和脂类带电荷类似，它们之间会发生排斥而非形成复合体。但是，一些DNA会被截留到脂质体的水性内部。已有人用pH-敏感的脂质体来将编码胸苷激酶基因的DNA递送给培养物中的单层细胞。在靶细胞中检测到了该外源基因的表达(Zhou et al.，Journal of Controlled Release，1992，19，269-274)。
一类主要的脂质组合物包括除了天然获得的磷脂酰胆碱之外的磷脂。例如可以由二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成中性脂质组合物。阴离子脂质组合物通常是由二豆蔻酰磷脂酰甘油形成的，而阴离子膜融合脂质体主要是由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成的。另一类脂质组合物是由磷脂酰胆碱(PC)(比如大豆PC和卵PC)形成的。还有一类是由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成的。
有些研究对局部递送脂质药物制剂到皮肤进行了评价。在豚鼠皮肤敷上含有干扰素的脂质体导致皮肤疱疹裂口减少，而经其他方式(例如做成溶液或乳液)递送干扰素无效(Weiner et al.，Journal of Drug Targeting，1992，2，405-410)。此外，另一项研究检测了将干扰素作为脂质制剂的一部分来给药，和用水性体系给予干扰素的效力，得到的结论是脂质体制剂优于水性给药方式(du Plessis et al.，Antiviral Research，1992，18，259-265)。
非离子型脂质系统，特别是包含非离子型表面活性剂和胆固醇的系统也受到检验以便确定它们在给皮肤递送药物方面的用途。有人用包含NOVASOME(甘油二月桂酸酯/胆固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂酰醚和甘油二硬脂酸酯/胆固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子型脂质制剂将环孢菌素-A递送到小鼠皮肤真皮。结果表明这类非离子型脂质系统能够有效地促进环孢菌素沉积到皮肤的不同层中(Hu et al.S.T.P.Pharma.Sci.，1994，4，6，466)。
有些脂质体包含的脂类上衍生出一或多个亲水多聚体，许多这类脂质体及其制备方法是本领域已知的。Sunamoto et al.(Bull.Chem.Soc.Jpn.，1980，53，2768)描述了包含一种非离子型去污剂的脂质体，该去污剂含有PEG部分。Illum et al.(FEBS Lett.，1984，167，79)提到用聚乙二醇对聚苯乙烯颗粒进行亲水包被导致其在血液中的半衰期显著提高。Sears(美国专利4,426,330和4,534,899)描述了通过连接聚亚烃基二醇(例如PEG)的羧基基团被修饰的合成磷脂。Klibanov et al.(FEBS Lett.，1990，268，235)描述的实验显示包含衍生了PEG或PEG硬脂酸酯的磷脂酰乙醇胺(PE)的脂质体在血循环系统中半衰期明显延长。Blume et al.(Biochimica et Biophysica Acta，1990，1029，91)将这些观察结果推广了到其他PEG-衍生化的磷脂中，例如DSPE-PEG，它是由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG组合形成的。授予Fisher的欧洲专利EP 0 445 131 B1和WO 90/04384描述了其外表面带有共价结合的PEG部分的脂质体。Woodle et al.(美国专利5,013,556和5,356,633)和Martin et al.(美国专利5,213,804和欧洲专利EP 0 496 813 B1)描述了一些脂质体组合物及其使用方法，这些组合物含有1-20摩尔百分比的PE发生了PEG衍生化。WO 91/05545和美国专利5,225,212(都是授予Martin et al.)以及WO94/20073(Zalipsky et al.)公开了包含许多其他脂类-多聚体偶联物的脂质体。包含PEG修饰的神经酰胺脂类的脂质体在WO 96/10391(Choi et al.)中有描述。美国专利5,540,935(Miyazaki et al.)和5,556,948(Tagawa et al.)描述了含有PEG的脂质体，可以进一步在它们的表面衍生出功能部分。
本领域已知的包含核酸的脂质体很少。授予Thierry et al.的WO96/40062公开了在脂质体中包裹大分子量核酸的方法。授予Tagawa等的美国专利5,264,221公开了结合蛋白质的脂质体，并且宣称这些脂质体的内容物可以包括反义RNA。授予Rahman的美国专利5,665,710描述了一些在脂质体内包裹寡脱氧核苷酸的方法。授予Love等的WO 97/04787公开的脂质体中包含了定向到raf基因的反义寡核苷酸。
传递体(transfersome)是另外一类脂质体，作为形状高度可变的脂类聚集体，它们是一种很有吸引力的可能用于药物递送的载体。传递体可以描述为这样的脂类液滴，因为有高度变形能力，它们能很容易地渗透到比液滴小的孔中。传递体能适应它的使用环境，例如它们能自优化(适应皮肤上的孔的形状)、自身修复、经常无须分裂就能到达目标、以及经常自组装。要制备传递体，可以向标准的脂质组合物中加入表面膜软化剂(通常是表面活性剂)。传递体已被用于向皮肤递送血清清蛋白。传递体介导的血清清蛋白的递送已被证实与皮下注射含有血清清蛋白的溶液一样有效。
本发明的一个方面，所述含脂质体制剂包括一或多种渗透增强剂和醇。用于本发明的各种渗透增强剂是本领域熟知的。在一实施方案中，该渗透增强剂是表面活性剂。还有一实施方案中，渗透增强剂可以选自月桂醇醚硫酸钠、N-月桂酰肌氨酸、失水山梨醇单月桂酸酯20(Span 20)和磷脂酰胆碱(phospholipon 90-H)。
在一实施方案中，所述含脂质体制剂中的渗透增强剂的重量浓度可以在约0.2％到10％的范围，或者约0.4％到0.8％。
另一实施方案中，含脂质体制剂中的醇的重量浓度在约1％到60％的范围，或者约2.5％到10％。在一实施方案中，所述醇是乙醇。
本发明的一实施方案中，含脂质体制剂包含重量浓度约2.5％的乙醇。本发明另一实施方案中，所述含脂质体制剂包含重量浓度约5％的乙醇。发明再一方面，该含脂质体制剂包含重量浓度约10％的乙醇。本发明还有一实施方案中，含脂质体制剂包含重量浓度约0.8％的月桂醇醚硫酸钠和重量约2.5％、5％或10％的乙醇。在一实施方案中，含脂质体制剂包含重量约0.4％的失水山梨醇单月桂酸酯20(Span 20)、重量约0.6％的N-月桂酰肌酸和重量约5％的乙醇。还有一实施方案中，该含脂质体制剂包含重量约10％的磷脂酰胆碱(phospholipon 90-H)。
发明的另一个方面，该含脂质体制剂进一步包含丙二醇。
本发明的再一个方面，所述含脂质体制剂还可以含有其他非活性物质，比如缓冲液、增稠剂和防腐剂。
给药方式本发明所述制剂的给药方式可以是局部(包括眼和粘膜(包括口腔、阴道和直肠)递送)、肺部(例如通过吸入或吹入粉末或者气雾剂，包括利用喷雾器)、气管内、鼻内、表皮、透皮或口服。
用于局部、口服、亲代、鞘内或心室内给药的制剂包括，但不限于透皮膜片、软膏、洗液(lotion)、霜(cream)、胶、滴液、栓剂、喷雾、液体、悬浮液或水溶液或者非水性介质、胶囊、香囊或药片。
本发明的一实施方案中，核酸是经直肠方式进行给药的。具体来说，用于直肠给药的组合物包括溶液(灌肠剂)、乳剂和栓剂。当使用的是常见基质可可油时，成人用的直肠栓剂通常在一端或两端逐渐变细，一般每个重约2g，而婴儿直肠栓剂通常是这个的一半重(Block，Chapter 87 InRemington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，Gennaro，Eds.，Mack PublishingCo.，Easton，Pa.，1990)。
使用促吸收佐剂来改变直肠膜的屏障作用是本领域已知的，并且已有综述(Nishihata and Rytting，Advanced Drug Delivery Reviews，1997，28，205)。促吸收佐剂显示出在影响那些吸收不好的药物制剂(比如稍大的水溶性药物和肽)发挥药效方面有很好的应用前景。氨基酸的烯胺衍生物表现出促吸收特性，但是其提高直肠吸收能力的机制还不清楚。有人证实一些化合物比如螯合剂和巯基去除剂能够提高药物经旁细胞途径和穿细胞途径的直肠吸收。水杨酸盐及其衍生物也能提高药物经旁细胞和穿细胞途径的直肠吸收。脂肪酸在通过药物的直肠吸收方面显示出与水杨酸盐类似的性质。凝集素也能借助诱导微绒毛融合来提高药物的直肠吸收。
发明的另一实施方案中，一或多个核酸是经口递送进行给药的。
经口给药的组合物包括粉末或颗粒、悬浮液或者水或其他非水介质溶液、胶囊、袋剂、锭剂、片剂或SECs(软弹性胶囊或″囊形片剂″)。可以根据需要给这些制剂中加入增稠剂、调味剂、稀释液、乳化剂、分散剂、载体物质或粘合剂。片剂可以通过挤压或压模来制备，任选有一或多种附属成分。挤压片剂可以通过将处于自由流动形式的活性成分，任选与粘合剂(PVP或树胶比如西黄蓍胶、金合欢胶、角叉藻聚糖)、润滑剂(例如硬脂酸盐比如硬脂酸镁)、滑动剂(滑石、胶体二氧化硅)、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合在一起，在一个合适的机器内进行挤压来制备。优选的粘合剂/崩解剂包括EMDEX(dextrate)、PRECIROL(甘油三酯)、PEG和AVICEL(纤维素)。压模片剂可以通过将用惰性液体稀释剂润湿的粉末化化合物混合物压模来制备。片剂任选有包衣或者是划痕片，并且可以配制成能够缓慢或控制释放其中的活性成分。
利用这类制剂可以将核酸递送到消化道与那里的粘膜接触。相应地，这类制剂可以含有这样的肠道物质，该物质能有效保护核酸免于胃部极端pH影响，或者控制核酸的逐渐释放从而优化将所述核酸递送到特定粘膜部位。用于耐酸片剂、胶囊和囊状片剂的肠道物质是本领域已知的，通常包括醋酸邻苯二甲酸、丙二醇、失水山梨醇单油酸酯、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、醋酸纤维素、偏苯三酸醋酸纤维素(cellulose acetate trimellitate)和羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)。肠道物质可以加入剂量形式或者作为覆盖片剂、胶囊或囊状片剂整个表面的包被。肠道物质还可以伴有增塑剂，后者可以赋予肠道物质柔性复原能力来防止例如片剂固化或熟化过程中发生破碎。增塑剂是本领域已知的，通常包括邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、三乙酰甘油酯、二丁基癸二酸盐(DBS)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和柠檬酸三乙酯(TEC)。
制备用于消化道递送的制剂的各种方法是本领域公知的。一般可参见Naim，Chapter 83；Block，Chapter 87；Rudnic et al.，Chapter 89；Porter，Chapter90；以及Longer et al.，Chapter 91，Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thEd.，Gennaro，Eds.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990。本发明中描述的寡核苷酸可以以已知方式，利用惰性无毒的可药用赋形剂或溶剂来配制成常规制剂，比如片剂、有衣片剂、药丸、颗粒、胶囊、气雾剂、糖浆、胶、乳剂、悬浮液和溶液。在以上各种情况中，药物活性寡核苷酸的浓度应该是全部混合物重量的约0.1％到0.5％，就是说其量足够达到标明的剂量范围。组合物可以根据情况用另外的可药用载体或赋形剂，通过传统方式来配制。因此，组合物可以通过传统方式，用载体或赋形剂来配制，所述载体或赋形剂是比如粘合剂(例如预先明胶化的粘玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙甲纤维素)、填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅)、崩解剂(例如淀粉或羧乙酸淀粉钠)或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。可以采用本领域公知的方法将片剂包被。产品根据情况还可以含有调味剂、着色剂和/或甜味剂。
用于口服递送的胶囊可以包括本领域所熟知的配方。另外，Digenis等(美国专利5,672,359)描述的具有控制性释放特性的多隔间硬胶囊，以及Amidon等(美国专利5,674,530)描述的有多级药物递送系统的水通透性胶囊也可以用来配制本发明所述组合物。
我们认为本发明药物组合物的配制及其后给药是本领域技术人员已知的。
一般用于治疗目的时，按照本发明将一或多种核酸(包括寡核苷酸)用可药用载体给予染有或易染某种疾病或紊乱的患者。根据病人的年龄和所治疗的紊乱或病况的严重性，其剂量在每公斤体重0.01μg到100g。此外，根据具体疾病或紊乱的特点、其严重性和患者整体情况，治疗疗程可以持续一段时间，用药可以从每天一次延长到每20年一次。在本发明的语境中，名词″治疗疗程″涵盖治疗、缓解和预防等形式。治疗之后，对患者的状态变化，以及紊乱或病况症状的减轻进行监测。如果患者对现有剂量没有产生明显的反应，可以将核酸的剂量提高；或者如果观察到紊乱或病况症状减轻，或者紊乱或病况消退，可以减少剂量。
剂量取决于待治疗病况的严重性和反应性，治疗过程可以持续几天到几个月，或者直至治愈或达到病况减轻。最佳剂量方案可以由测量药物在患者体内的累积计算得到。普通技术人员可以很容易地确定最佳剂量、给药方法和重复频率。根据各个寡核苷酸的相对效力，其最佳剂量可能有变化，通常可以基于在动物模型体外和体内发现有效的EC.sub.50数值来估计。一般来说，剂量在每公斤体重0.01mu.g to 100g，可以每天、每周、每月或每年给予一或多次，甚至每2到20年给一次。采用最佳给药方案经特定给药模式来递送治疗有效量的核酸。
名词″治疗有效量″用于本发明，是指含核酸的制剂的量，能有效地实现预期目标，而没有不好的副作用(比如毒性、不适或过敏反应)。虽然个体需求会有不同，确定制剂有效量的最佳范围是本领域已有技术。根据动物研究可以推断人的剂量(Katocs et al.，Chapter 27 InRemington′s PharmaceuticalSciences，18th Ed.，Gennaro，Eds.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990)。通常能够提供有效量制剂的剂量(可以由本领域技术人员调整)会随接受者的年龄、健康、身体状况、体重、疾病或紊乱的类型和程度，治疗频率、同步治疗(如果有的话)的特性以及预期疗效的性质和范围而变(Nies et al.，Chapter 3 InGoodman & Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，9th Ed.，Hardman et al.，Eds.，McGraw-Hill，New York，N.Y.，1996)。
治疗成功后，可能希望患者进行维持治疗以便防止病况的复发。在这种维持治疗中给予维持剂量的核酸，每公斤体重0.01μg到100g，每天一或多次，至20年一次。例如，在个体已知或怀疑容易发生自身免疫或炎症状况的情况下，可以通过给予预防剂量(每公斤体重0.01μg到100g，每天一或多次，至20年一次)来达到预防的效果。类似地，可以使个体对由一些医学治疗所导致可能发生的炎症的易感性降低，例如给个体移植细胞、组织或器官导致的移植物抗宿主病。
用于非亲代递送核酸的制剂可以包括灭菌和没有灭菌的水性溶液、溶于常见溶剂比如醇中的非水性溶液、或者所述核酸在液体或固体油基质中的溶液。溶液还可以含有缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂。可以使用不会与核酸发生有害反应，适用于非亲代给药的可药用有机或无机载体物质。合适的可药用载体包括，但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。如果需要可以将制剂灭菌，并混合那些不会与制剂中的核酸发生有害反应的佐剂，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、增味剂和/或香料等。
可药用制剂可以按照医药业熟知的传统技术制备成方便的单位剂量形式。这类技术包括将活性成分与可药用载体或赋形剂放到一起的步骤。通常制剂的制备是通过使活性成分与液态载体或精细粉碎的固态载体或者两者均一地密切地混在一起，然后根据需要使产品成型。
还可以依照本发明采用寡核苷酸和其他核酸的许多生物等同体。因此本发明也涵盖了寡核苷酸和核酸等同体，比如但不限于，寡核苷酸和核酸的前药、删除衍生物、寡核苷酸的偶联体、适配子和核酶。
本发明的方法和制剂还涵盖寡核苷酸固相制备过程中合成的包括内部和末端删除寡核苷酸在内的各种删除寡核苷酸，因为这类删除序列是非常实用的生物等同体。具有特异催化活性的合成RNA分子及其衍生物称为核酶，我们认为它们也是用于本发明所述方法和组合物的寡核苷酸生物等同体。为了本发明的方法和制剂，同样被认为是寡核苷酸生物等同体的是肽核酸(PNAs)和核酸适配子(一般可参见Ellington et al.，Nature，1990，346，818；U.S.Pat.No.5,523,389(Ecker et al.，Jun.4，1996))。
适配子(aptamer)这一名词是Ellington和Szostak(Nature，1990，346，818)为一些核酸分子起的，它们与象肽、蛋白质和小分子(比如药物和染料)这样的非核酸配体吻合并能高特异性地结合。因为这种特异配体结合特性，可以利用带有固定化配体的柱子经亲和层析容易地纯化或分离到属于核酸适配子的核酸和寡核苷酸。核酸适配子可以是相对那些长达几百核苷酸的核酸来说较短的核酸。例如Ellington和Szostak报道过他们发现的155核苷酸长的RNA适配子能够与染料(比如Cibacron Blue和Reactive Blue 4)高选择性地结合(Ellington and Szostak，Nature，1990，346，818)。虽然最初是RNA分子被称为适配子，该名词用在本发明中指代任何特异结合小分子配体的核酸或寡核苷酸，包括但不限于DNA、RNA、DNA衍生物和偶联物、RNA衍生物和偶联物、修饰的寡核苷酸、嵌合寡核苷酸和gapmers。
在一实施方案中，本发明集中描述了将具有生物活性的核酸(比如寡核苷酸)非亲代递送给动物。″具有生物活性″意味着该核酸能调整动物的一或多个基因的表达，从基因的绝对功能(比如核酶活性)或者这些基因编码的蛋白质的产生可以反映这一点。在本发明的语境中，″调整″意味着使得基因的表达或者增加(刺激)或者减少(抑制)。这样的调整可以通过例如双链寡核苷酸诱骗物分子以已知的多种机制结合到靶转录因子上来实现。以下更详细地描述了利用本发明所述制剂进行给药的多种双链寡核苷酸诱骗物分子。
在非人动物中，本发明的制剂和方法可以用于研究该动物的一或多个基因的功能。
如上所述，本发明的制剂和方法有治疗用途，即可以给患有或怀疑患有或者易感某疾病或紊乱的动物(包括人)提供治疗、缓解或预防，而所述疾病或紊乱可以完全或部分地用一或多种核酸进行治疗。名词″疾病或紊乱″(1)包括任何生物或部位的异常状况，尤其是感染、天生虚弱；(2)排除怀孕本身，但包括自身免疫和其他与怀孕相关的疾病；以及(3)包括癌症和肿瘤。名词″患有或怀疑患有或者易感″表明受试动物已被检验出，或者怀疑相对该动物的一般群体增加了发展出此次定义的特定疾病或紊乱的危险性。例如，受试动物可能有经常发生某种疾病或紊乱的个人和/或家庭病史。另外一个例子，可能根据本领域已知技术通过基因筛选确定出受试动物有这类易感性(参见例如U.S.Congress，Office of Technology Assessment，Chapter 5 InGenetic Monitoring and Screening in the Workplace，OTA-BA-455，U.S.Government Printing Office，Washington，D.C.，1990，pages 75-99)。名词″可以完全或部分地用一或多种核酸进行治疗的疾病或紊乱″是指如文中界定的疾病或紊乱(1)其管理、控制或治疗，和/或(2)其治疗、缓解和/或预防可以借助给予一或多种核酸实现。在一个优选实施方案中，这类疾病或紊乱可以用双链寡核苷酸诱骗物分子进行完全或部分治疗。
可以利用上文描述的一或多种制剂进行给药的针对各种转录因子的寡核苷酸诱骗物分子包括，但不限于以下描述的这些。
NF-κB寡核苷酸诱骗物分子本发明的一个方面是这样一个想法，即通过设计能与p65/p50和/或cRel/p50异源二聚体结合，而不结合p50/p50同源二聚体的诱骗物分子，或者优先与p65/p50和/或cRel/p50异源二聚体结合的诱骗物分子，就可以让p50/p50同源二聚体留下来占有这些位点，从而更多地阻断NF-κB驱动的启动子。结果，这类选择性诱骗物分子比已有的NF-κB诱骗物更能阻断NF-κB的活性。
设计性能提高的NF-κB诱骗物1.设计NF-κB dsODN分子设计本发明的寡核苷酸诱骗物利用了结合到免疫球蛋白轻链基因上的p50/p65异源二聚体的晶体结构(Chen et al.，Nature 391(6665)410-3(1998))，该基因含有一个共有序列5’-GGGACTTTCC-3’(SEQ ID NO2)。作者证明p50与5碱基对亚位点5’-GGGAC-3’(SEQ ID NO3)有接触，而p65与4碱基对亚位点5’TTCC-3’(SEQ ID NO4)接触。p50/p65异源二聚体与DNA的接触情况类似于同源二聚体结构(Ghosh et al.，Nature 373(6512)303-10(1995)；Muller et al，FEBS Lett.369(1)113-7(1995))。
一实施方案中，本发明的NF-κB dsODN分子由通过Watson-Crick碱基配对结合在一起的两个寡核苷酸链组成。通常两条链中所有的核苷酸都会参与碱基配对，但这不是必需的。那些一或多个(比如1-3或者1或2个)核苷酸没有参与碱基配对的寡核苷酸诱骗物分子也包括在发明中。此外，双链诱骗物分子可以含有3′和/或5′单链突出端。
在另一实施方案中，本发明的NF-κB dsODN分子包含通过Watson-Crick碱基配对结合在一起，并且在3′或5′端或者两端共价结合的两个寡核苷酸链，形成一个哑铃结构或者环形分子。共价键可以由例如磷酸二酯键或其他连接基团(比如例如一硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或磷酰胺键)提供。
概括来说本发明的dsODN分子包含一个能够特异结合NF-κB转录因子的核心序列，侧接5′和/或3′序列。该核心序列由约5到14，或约6到12个，或约7到10个碱基对组成；旁侧序列有约2到8个，或者2到6个，或者2到4个碱基对长。这些分子通常包含约12到28，优选约14到24个碱基对长的双链区，这一双链区由两条完全或部分互补的链组成(包括核心和旁侧序列)。
改变核心序列(包括其长度、序列、碱基修饰和骨架结构)就可能改变结合亲和性、以及NF-κB诱骗物分子的稳定性和特异性。的确，本发明的NF-κB dsODN分子，能够高亲和性结合p65/p50和/或cRel/p50异源二聚体，而对p50/p50同源二聚体显示出没有或很低的结合亲和性，它们就是根据结合到DNA上的p65/p50异源二聚体的晶体结构，通过删除或改变共有寡核苷酸诱骗物分子的结合位点(核心)中的靶残基设计成的。
此外，旁侧序列的变化会真实地影响并明显提高NF-κB诱骗物分子的体内稳定性，还可能影响其结合亲和性和/或特异性。具体来说，可以通过改变核心结合序列旁边的序列来改变NF-κB诱骗物分子的形状/结构，这些改变会使其稳定性和/或结合亲和性提高。DNA的形状和结构受到碱基对序列、DNA的长度、核苷酸骨架和性质(即天然DNA相对于修饰过的糖或碱基)的影响。因此也可以通过其他手段来改变分子的形状和/或结构，比如例如，通过改变总长、分子中完全互补的双链区长度，通过核心和旁侧序列中的改变，通过改变骨架结构和进行碱基修饰。
本发明的诱骗物分子的核苷酸序列可以包含修饰的或罕见核苷酸，并可以有替代的骨架化学特性。合成核苷酸可以多种方式进行修饰，参见例如Bielinska et al.，Science 250997-1000(1990)。因此，可以用氮、硫或碳取代氧；碳取代磷；用其他糖取代脱氧核糖或将各个碱基取代为非天然碱基。所以用硫基(能够形成硫代磷酸酯键)代替核苷酸间的不能成键氧原子可以提高dsODN分子的核酸酶抗性。下文的实施例部分列出了一些实验，用于确定硫修饰和NF-κB dsODN分子的稳定性和特异性之间的关系。
每种情况中都要对变化进行评估，即评估所做修饰对寡核苷酸诱骗物分子与NF-κB转录因子之间的结合能力和亲和性的影响，对解链温度和体内稳定性的影响，以及任何有害的生理影响。这类修饰已为本领域所熟知，在反义寡核苷酸中有广泛应用，因此它们的安全性和能够保留结合亲和性是得到证实的(参见例如Wagner et al.，Science 26015 10-1513(1993))。
修饰核苷酸的例子(不限于)有4-乙酰胞嘧啶核苷、5-(羧羟甲基)尿苷、2′-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氢尿苷、2′-O-甲基假尿苷、β，D-半乳糖Q核苷、2′-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷、β，D-甘露糖Q核苷、5-甲氧基羰甲基-2-硫代尿苷、5-甲氧基羰甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-beta-D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨甲酰)苏氨酸、N-((9-beta-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)N-甲基氨甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧化乙酸-甲酯尿苷-5-氧化乙酸、wybutoxosine、假尿苷Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-beta-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)-氨甲酰苏氨酸、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、3-(3-3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷(acp3)u和wybutosine。
此外，核苷酸可以通过例如磷酰胺键互相连接。该键是天然磷酸二酯键的类似物，只是成键氧原子(-O-)被氨基(-NR-)取代，其中的R通常是氢或低级烷基，象例如甲基或乙基。也可能利用其他键，比如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯键等。
本发明的诱骗物分子还可以含有通常存在于多核苷酸结构中的核糖或脱氧核糖糖类的修饰或类似物形式。这些修饰包括，但不限于2′-取代的糖(比如2′-O-甲基-、2′-O-烯丙基-、2′-氟-和2′-叠氮-核糖)、羧基糖类似物、α-端基差向异构体糖、差向立体异构体糖(比如阿拉伯糖、木糖、来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、开链类似物和无碱基核苷类似物(比如甲基核苷)。
总之，本发明的寡核苷酸诱骗物分子优选包含超过约50％、更优选超过约80％、最优选超过约90％的传统脱氧核糖核苷酸。
本发明的NF-κB dsODN诱骗物分子可以被进一步修饰以助于其定位、纯化或者提高其一些性能。例如，为了促进它们递送到细胞核内，可以给诱骗物分子连上一个核定位信号(NLS)。NF-κB/Rel蛋白包含一个共有的包含NLS的Rel同源结构域。在一个优选实施方案中，本发明的诱骗物分子中采用了这种天然NLS，或其变异体。
此外，发明所述NF-κB诱骗物分子可以象例如以下参考文献描述的，偶联上一些载体分子，比如肽、蛋白质或其他类型分子Avrameas et al.，JAutoimmun 16，383-391(2001)；Avrameas et al.，Bioconjug.Chem.1087-93(1999)；Gallazzi et al.，Bioconjug.Chem.14，1083-1095(2003)；Ritter，W.et al.，J.Mol.Med.81，708-717(2003)。
本发明的NF-κB诱骗物分子可以进一步衍生以便包含递送载体，后者能够提高诱骗物分子的递送、分配、寻靶到特异细胞类型或者协助穿过细胞屏障转运。这类递送载体包括，但不限于细胞渗透增强剂、脂质体、脂质转染剂、树状聚合物(dendrimers)、DNA嵌入剂(intercalators)和纳米粒子。
2.NF-κB dsODN分子的合成本发明的NF-κB sdODN诱骗物分子可以用商品自动合成仪通过标准磷酸二酯或亚磷酰胺化学来合成。实施例中描述的特定dsODN分子是用自动DNA合成仪(Model 380B；Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)合成的。诱骗物分子经过柱层析纯化，冻干并溶于培养基中。每种诱骗物分子的浓度经分光光度法确定。
3.NF-κB dsODN分子的定性研究本发明的NF-κB诱骗物分子可以方便地在凝胶变动分析或电泳迁移率变动(EMSA)分析中检测和研究。该项分析提供了一种探测转录因子与DNA结合的快速和敏感的方法。这项分析是基于这样的观察，即蛋白质和DNA的复合体在非变性聚丙烯酰胺凝胶中比游离双链寡核苷酸移动得慢。凝胶变动分析的进行是将纯化蛋白或复杂的蛋白混合液(比如核提取物)与含有转录因子结合位点的32P末端标记DNA片段一起保温。然后将反应产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上做分析。转录因子对结合位点的特异性是用过量寡核苷酸(含有目标蛋白质结合位点或者拼凑DNA序列)通过竞争实验来确定。含在混合体系中的蛋白质的身份确定是通过利用识别该蛋白的抗体，然后看DNA-蛋白质-抗体复合体的位移是否减少或者该复合体与放射标记的寡核苷酸探针的结合被破坏。
本文中在设计选择性NF-κB诱骗物分子时，根据结合到DNA上的p65/p50异源二聚体的晶体结构，我们删除了共有寡核苷酸诱骗物分子结合位点(核心)中的靶残基。我们的最终目标是设计这样的双链寡核苷酸，其能高亲和性地结合p65/p50和/或cRel/p50异源二聚体，优选p65/p50和cRel/p50异源二聚体两者，而对p50/p50同源二聚体亲和性低。为了实现这个目标，我们在如以下实施例所述的凝胶位移分析中检测了多种NF-κB诱骗物分子结合不同NF-κB蛋白质的能力。
4.NF-κB dsODN分子的用途NF-κB参与调控大量基因的转录。以下提供了其转录被NF-κB激活的代表性基因的分组和名单。
细胞因子/趋化因子及其调节子，象例如干扰素-γ(IFN-γ)、干扰素-β(IFN-β)、白介素(比如IL-1，Il-2，IL-6，IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15)、淋巴毒素-α、淋巴毒素-β、TNF-α、MIP-1、MIP-2、MIP-3、RANTES、TNF-α、TRAIL。
免疫调节剂，比如例如BRL-1、CCR5、CCR7、CD137、CD154、CD40和CD40配体、CD48、CD83、CD23、IL-2受体α链、一些免疫球蛋白重链和轻链、I型MHC抗原、T细胞受体亚基、TNF受体(p75/80)。
参与抗原递呈的蛋白质，比如例如补体B、补体成分3、TAP1和tapasin。
细胞粘附分子，比如例如E-和P-选择蛋白、ICAM-1、MadCAM-1、VCAM-1和Tenascin-C。
急性期蛋白，比如例如血管紧张肽原、β-防卫素-2、补体因子、组织因子-1(TF-1)、尿激酶型纤溶酶原激活物。
应激基因，比如例如血管紧张肽-2、COX-2、MAP4K1、磷脂酶A2。
细胞表面受体，比如例如CD23、CD69、EGF-R、Lox-1、Mdr1。
凋亡调节子，比如例如Bfl1、Bcl-xL、Caspase-11、CD95(Fas)、TRAF-1、TRAF-2。
生长因子及其调节子，比如例如G-CSF、GM-CSF、EPO、IGFBP-1、IGFBP-2、M-CSF、VEGF-C。
早期应答基因，比如例如TIEG、B94、Egr-1。
此外，NF-κB能够调节其他转录因子(比如c-myc-、c-myb、A20、junB、p53、WT1和病毒)的转录。
因此，抑制NF-κB诱导了一些促炎细胞因子(比如IL-1和TNF-α)和免疫调节子的表达，可以用于治疗炎性、免疫和自身免疫疾病，比如类风湿性关节炎(RA)(Roshak et al，Current Opinion in Pharmacology 2316-321(2002))；克罗恩氏病和炎症性肠病(IBD)(Dijkstra et al.，Scandinavian J.ofGastroenterology Suppl.23637-41(2002))、胰腺炎(Eeber and Adler，Pancreatology 1356-362(2001))、periodonitis(Nichols et al.，Annals ofPeriodontology 620-29(2001))；狼疮(Kammer and Tsokos，Current Directionsin Autoimmunity 5131-150(2002))；哮喘(Pahl and Szelenyi，InflammationResearch 51273-282(2002))；和过敏性眼病(Bielory et al.，Opinion in Allergyand Clinical Immunology 2435-445(2003))。
因为NF-κB在参与以下情况中的细胞因子和粘附分子基因的协调性顺式激活发挥着至关重要的作用，NF-κB诱骗物分子也可以应用于治疗这些疾病和状况。所述疾病和病况包括动脉粥样硬化和血管损伤后损毁的形成(Yoshimura et al.，Gene Therapy 81635-1642(2001))；大脑缺血后的神经损伤(Ueno et al.，J.Thoracic and Cardiovascular Surgery 122(4)720-727(2001))；支气管炎症(Griesenbach et al.，Gene Therapy 7，306-313(2000))；自身免疫性心肌炎进展(Yokoseki et al.，Circ.Res.89899-906(2001))；心脏移植中的急性排斥和移植物动脉病(Suzuki et al.，Gene Therapy 71847-1852(2000))；以及心肌梗塞(Morishita et al.，Nature Medicine 3(8)894-899(1997))。
最近有证据表明NF-κB及参与其活化的信号转导途径对肿瘤发展也很重要。参见例如Karin et al.，Nat.Rev.Cancer 2(4)301-10(2002)。所以，本发明的诱骗物分子用于阻断NF-κB可以预防和治疗癌症，单独使用或与其他治疗方案结合起来提供一种新的抗癌策略。
许多抗炎症和抗风湿药物，包括糖皮质激素、阿司匹林、水杨酸钠和sulfosalazine都是NF-κB活化的抑制剂。用于治疗炎性和自身免疫疾病和症状时，可以任选将本发明的NF-κB诱骗物分子与这些药物治疗结合起来给药。组合治疗包括同时给药以及将2或多种药物以任何顺序连续给药。
E2F寡核苷酸诱骗物分子设计性能改良的E2F诱骗物众所周知，许多转录因子结合到它们的识别位点时能够使DNA折曲，而该非线性DNA结构会促进，甚至决定参与转录的近端和远端DNA-蛋白质接触(Perez-Martin et al.，Microbiol Rev58268-290(1994)；and van der Vlietand Verriizer，Bioassays1525-32(1993))。近期，E2F识别位点被发现含有一个内在DNA折曲(Cress and Nevins，Mol.Cel..Biol.162119-2127(1996))。游离E2F结合到该识别位点造成一个与内在折曲大小类似，但方向相反的DNA折曲。人们还知道E2F-1启动子的结构会影响该启动子的转录活性。E2F位点内和其周围的5个碱基对的取代改变了DNA螺旋结构、E2F结合，并影响了转录活性。E2F结合位点存在的天然折曲，以及E2F与位点的结合对该结构有巨大的影响这一事实似乎提示了DNA结构在E2F结合和E2F依赖性转录控制中发挥作用。转录因子与其结合位点之间的结合对DNA的结构和形状很敏感。它们之间的相互作用的特异性水平会被DNA的弹性和/或变形所提高。更多细节还可参见Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci351501-9(1996)和Rhodes et al.，Indian J.Biochem Biophys3383-7(1996)。
本发明是基于这样的发现，即改变E2F诱骗物分子的形状和/或结构，人们可以极大地提高它和靶E2F转录因子的结合亲和性，而这进而会更有效地抑制靶E2F转录因子的生物功能。
在本文提供的实施例中，E2F诱骗物分子的形状/结构已被通过改变核心结合序列旁边的序列来进行改变，这使得E2F结合亲和性提高了一个数量级。结合亲和性提高使E2F诱骗物分子成了一个E2F生物功能的更有效抑制剂。DNA的形状和结构受到碱基对序列、DNA长度、核苷酸骨架和属性(即天然DNA相对修饰过的糖或碱基)的影响。因此，也可以通过其他方法来改变分子的形状和/或结构，象例如通过改变总长、改变分子中完全互补的双链区的长度、通过核心和旁侧序列内的变动、改变骨架结构和碱基修饰。其结合亲和性增强和/或体内稳定性提高了的E2F诱骗物分子可以通过任意这类方法或者方法的组合进行设计和制备。
具体来说，通过改变核心序列(包括其长度、序列、碱基修饰和骨架结构)，就可能改变E2F诱骗物分子的结合亲和性、稳定性和特异性。旁侧序列中的变化能真正地影响并明显提高该分子的体内稳定性，并可能影响结合亲和性和/或特异性。
因此，在最宽泛的方面，本发明涉及这样的E2F诱骗双链寡核苷酸(dsODN)分子，它们有能改变形状和/或结构的弹性结构，例如折曲和对靶E2F转录因子结合亲和性增强。因此，本发明的E2F诱骗物分子可以具有对E2F-1、E2F-2、E2F-3、E2F-4、E2F-5和E2F-6中的一或多个提高的结合亲和性。
在一个更特定的方面，本发明涉及性能改良的E2F诱骗双链寡核苷酸(dsODN)分子。具体来说，发明涉及新的E2F诱骗dsODN分子，其与E2F转录因子(包括它的异源二聚体(E2F/DP)和同源二聚体(E2F/E2F)形式)的结合亲和性提高，并且/或者体内稳定性增加。
在一实施方案中，所述E2F诱骗dsODN分子包含能够特异结合E2F转录因子，并侧接5′和3′序列的核心序列，其中(i)该核心序列由约5到12个，优选6到10个碱基对构成；(ii)所述分子包含一个约12到28个，优选约14到24个碱基对长的双链区，该双链区由完全互补的两条链组成；以及(iii)该E2F诱骗dsODN结合靶E2F转录因子的结合亲和性是图26中参照诱骗物分子(SEQ ID NOs94和95)的结合亲和性的至少约5倍，优选至少约7倍，更优选至少约10倍，最优选至少约15倍。数据是按照实施例1描述的实验方案，在血管平滑肌细胞(VSMCs)的核提取物上进行竞争性凝胶变动分析测定的。优选，改良的E2F诱骗dsODN分子的解链温度(Tm)也比图26参照诱骗物分子(SEQ ID NOs94和95)的Tm(42.3℃)明显要高。
E2F诱骗物分子的完全互补双链部分的长度据信对增强结合亲和性和稳定性非常重要。为了达到改良这些特性的目的，该区域应该含有至少约12个碱基对，通常其长度在约12到28个碱基对。构成所谓″完全互补″区域的两个核苷酸链中，第一链中的每个核苷酸都与第二链中的每个核苷酸形成Watson-Crick碱基配对。
所述核心序列通常应该包含至少6个碱基对，一般至少8个碱基对以便令人满意地结合到靶E2F转录因子上。一般来说，核心序列由约5到12个，更常见6到10个碱基对组成。核心序列可能是或者含有来自那些转录被E2F转录因子上调或下调的基因之启动子区的E2F结合序列。替代地，核心序列可以是非天然E2F结合序列的合成序列，比如根据多个基因的E2F结合序列，或者多种E2F转录因子的结合序列中每个位点上最常见的核苷酸设计出的共有序列。
所述旁侧序列通常是5到50个碱基长，可以是，但不必须是完全互补的。因此，旁侧区可以在任一端包含单链突出。据信本发明所述寡核苷酸诱骗物分子的结合亲和性和稳定性更多是受到其内由两条完全互补的链组成的真正双链区的长度和序列影响，而非旁侧区本身长度的影响。
本发明的诱骗物分子的核苷酸序列可以包含修饰的或罕见的核苷酸，并且可以有替代的骨架化学构成。合成核苷酸可以以多种方式进行修饰，参见例如Bielinska et al.Science25)；997-1000(1990)。因此，可以用氮、硫或碳取代氧；碳取代磷；用其他糖取代脱氧核糖或将各个碱基取代为非天然碱基。每种情况中，都要评价修饰对寡核苷酸诱骗物分子与E2F转录因子的结合能力和亲和性的影响，对解链温度和体内稳定性的影响，以及任何有害生理效果。这类修饰是本领域众所周知的，在反义寡核苷酸中有广泛应用，因此它们的安全性和保留结合亲和性的能力都是公知的(参见例如Wagner et al.Science2601510-1513(1993))。
修饰核苷酸的例子(不限于)有4-乙酰胞嘧啶核苷、5-(羧羟甲基)尿苷、2′-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氢尿苷、2′-O-甲基假尿苷、β，D-半乳糖Q核苷、2′-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷、β，D-甘露糖Q核苷、5-甲氧基羰甲基-2-硫代尿苷、5-甲氧基羰甲基尿苷(5-metHoxycarbonYlmethyluridine)、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-beta-D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨甲酰)苏氨酸、N-((9-beta-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)N-甲基氨甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧化乙酸-methylester尿苷-5-氧化乙酸、wybutoxosine、假尿苷Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-beta-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)-氨甲酰苏氨酸、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、3-(3-3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷(acp3)u和wybutosine。
此外，核苷酸可以通过例如磷酰胺酯键连在一起。该键是天然磷酸二酯键的类似物，只是成键氧原子(-O-)被氨基(-NR-)取代，其中的R通常是氢或低级烷基，象例如甲基或乙基。
本发明的E2F诱骗物分子可以利用商品自动合成仪，通过标准磷酸二酯或磷酰胺化学反应来合成。
在具体实施方案中，本发明的E2F诱骗物分子包括一个选自以下链的核心序列TTTSGCGS(SEQ ID NO100)TTTGGCGC(SEQ ID NO101)TTTCGCGC(SEQ ID NO102)TTTCCCGC(SEQ ID NO103)TTTGCCGC(SEQ ID NO104)CTTCCCGC(SEQ ID NO105)GTTCCCGC(SEQ ID NO106)CTTCGCGC(SEQ ID NO107)TTAGCGCC(SEQ ID NO108)TGAGCGCC(SEQ ID NO109)GTAGCGCC(SEQ ID NO110)GGAGCGCC(SEQ ID NO111)CTAGCGCC(SEQ ID NO112)CGAGCGCC(SEQ ID NO113)GTTCGCGC(SEQ ID NO114)TTTGCGCC(SEQ ID NO115)TGTGCGCC(SEQ ID NO116)GTTGCGCC(SEQ ID NO117)GGTGCGCC(SEQ ID NO118)CTTGCGCC(SEQ ID NO119)CGTGCGCC(SEQ ID NO120)TTTCCGG (SEQ ID NO121)TTTCGCGG(SEQ ID NO122)GTTGGCGC(SEQ ID NO123)CTTGGCGC(SEQ ID NO124)CTTGCCGC(SEQ ID NO125)GTTGCCGC(SEQ ID NO126)
TTTGGCGG(SEQ ID NO127)TTACCGCC(SEQ ID NO128)TGACCGCC(SEQ ID NO129)GTACCGCC(SEQ ID NO130)GGACCGCC(SEQ ID NO131)CTACCGCC(SEQ ID NO132)CGACCGCC(SEQ ID NO133)TTTCCGCC(SEQ ID NO134)TGTCCGCC(SEQ ID NO135)GTTCCGCC(SEQ ID NO136)GGTCCGCC(SEQ ID NO137)CTTCCGCC(SEQ ID NO138)CGTCCGCC(SEQ ID NO139)CTTCCCGG(SEQ ID NO140)TTTGCCGG(SEQ ID NO141)GTTCCCGG(SEQ ID NO142)CTTCGCGG(SEQ ID NO143)TTTGCGCG(SEQ ID NO144)TTAGCGCG(SEQ ID NO145)TGTGCGCG(SEQ ID NO146)TGAGCGCG(SEQ ID NO147)GTTGCGCG(SEQ ID NO148)GTAGCGCG(SEQ ID NO149)GGTGCGCG(SEQ ID NO150)TTTSGCGCGMNR(SEQ ID NO151)GTTGGCGG(SEQ ID NO153)GTTCGCGG(SEQ ID NO154)TTTCCCGG(SEQ ID NO155)CTTGCCGG(SEQ ID NO156)GTTGCCGG(SEQ ID NO157)TGTCGCGC(SEQ ID NO158)
CTTCCCGG(SEQ ID NO159)CGTCGCGC(SEQ ID NO160)GGTCGCGC(SEQ ID NO161)TTTCGGGC(SEQ ID NO162)TGTGGCGC(SEQ ID NO163)TGTCGCGG(SEQ ID NO164)及其互补链，其中S是G或C根据该信息和其他有关内在E2F结合序列结构的知识，本领域技术人员可以例如通过已有的分子模拟技术、与E2F-DP复合体共结晶的技术和其他本领域的已知手段对这些E2F诱骗物分子的结构做进一步优化。靠近核心序列的旁侧区真实序列比更远区域的序列更关键。因此，与核心序列相邻的位点或者只隔几个核苷酸位置的核苷酸身份需要比离核心序列更远的位置上的核苷酸更谨慎地控制。在具体实施方案中，旁侧序列是图26中所示SEQ ID NOS96和97，它们可以与上面列出的任何核心序列连接在一起。
正如前面讨论过的，E2F和DP蛋白质形成异源二聚体从而产生E2F功能活性。此外，一些E2F蛋白的同源二聚体也已有描述。各个E2F-DP或E2F-E2F种类根据E2F基序的身份以及与复合体相关联的蛋白质的不同，会引用不同的转录反应。如果需要，可以将E2F dsODN分子设计成优选结合某一或多种E2F转录因子，而这样会继而产生不同的体内生物活性。所以可以通过这个方法来设计用于癌症治疗的E2F诱骗物分子。
候选诱骗物分子的结合亲和性可以通过标准方法测定，例如经凝胶变动分析。凝胶变动或电泳迁移率变动(EMSA)分析提供了一种检测转录因子或其他DNA结合蛋白与DNA发生结合的快速和敏感方法。这项分析是基于这样的观察，即蛋白质和DNA的复合体在非变性聚丙烯酰胺凝胶中比游离双链寡核苷酸移动得慢。凝胶变动分析的进行是将纯化蛋白或复杂的蛋白混合液(比如核提取物)与含有转录因子结合位点的32P末端标记DNA片段一起保温。然后将反应产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上做分析。转录因子对结合位点的特异性是用过量寡核苷酸(含有目标蛋白质结合位点或者拼凑DNA序列)通过竞争实验来确定。含在混合体系中的蛋白质的身份确定是通过利用识别该蛋白的抗体，然后看DNA-蛋白质-抗体复合体的位移是否减少或者该复合体与放射标记的寡核苷酸探针的结合被破坏。
主要治疗目标本发明的E2F诱骗物分子有希望临床用于预防和治疗冠心病。美国心脏协会的数据表明冠心病是美国男性和女性第一位的致死原因，1998年在美国引起450,000例死亡。
此外，E2F诱骗物分子还可用于治疗外周血管疾病，该病特点在于外周动脉粥样硬化变窄，导致危害血液循环。在早期临床阶段，该病征兆在于腿部疼痛，如果不进行治疗，就会发展成坏疽，导致必须截肢，造成很高的不可逆转的致残率和致死率。
E2F诱骗物分子更进一步的临床目标是新生内膜增生，该病理过程存在于移植物动脉粥样硬化、狭窄和多数血管移植物闭塞。新生内膜增生常见于发生各种形式的血管损伤之后，并且是静脉移植物对摘除和手术植入高压动脉循环的反应的主要体现。
此外，研究表明E2F在癌症进展中有着重要作用。如上文讨论过的，E2F能够诱导一组细胞生长和细胞分裂所必需的基因的表达。当细胞收到生长抑制信号时，E2F被肿瘤抑制视网膜母细胞瘤基因Rb去活化。结果，E2F调节的生长控制基因维持无活性状态，细胞停留在静止态。有人提议说在携带突变拷贝的Rb的肿瘤细胞中，E2F不再被Rb控制。结果，E2F会激活指导细胞分裂的基因，使细胞停留在永久性增殖状态。更多细节，包括替代机制可参见例如Johnson and Schneider-Broussard，Front Biosci 3d447-8(1998)。有报道说，能够抑制E2F活性的小肽在引入肿瘤细胞系时会导致凋亡(Bandara et al.，Nature Biotechnology15896-901(1997)。无论其机制为何，本发明的E2F诱骗物分子有望用于治疗包括乳腺癌在内的多种癌症。
HIF-1寡核苷酸诱骗物分子在本发明的一实施方案中，我们系统地开发和优化了几组能特异结合转录因子HIF-1的转录因子诱骗物。
1.设计HIF-1 dsODN分子在一实施方案中，本发明的HIF-1 dsODN分子由两个通过Watson-Crick碱基配对连在一起的寡核苷酸链组成。通常两条链中所有核苷酸都参与碱基配对，但这不是必须的。那些有一或多个(比如1-3或者1或2个)核苷酸不参与碱基配对的寡核苷酸诱骗物分子也包括在内。此外，所述双链诱骗物分子可以含有3′和/或5′单链突出。
另一实施方案中，本发明的HIF-1 dsODN分子包含两个通过Watson-Crick碱基配对连在一起的寡核苷酸链，另外还在3′或5′端，或者两个末端共价结合，形成一个哑铃结构或者环形分子。共价键可以由例如磷酸二酯键或其他连接基团(象例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或磷酯氨酰键)提供。
通常本发明的dsODN分子包含能够特异结合HIF-1转录因子，并侧接5′和/或3′序列的核心序列，其中该核心序列由约5到14个，或者约6到12个，或者约7到10个碱基对组成；旁侧序列是约2到8个、或者约2到6个、或者2到4个碱基对长。所述分子一般包含一个约12到28个，优选约14到24个碱基对长的双链区，该双链区由完全或者部分互补的两条链组成(包括核心和旁侧序列)。
改变核心序列(包括其长度、序列、碱基修饰和骨架结构)就有可能改变HIF-1诱骗物分子的结合亲和性。此外，旁侧序列中的变化能真正地影响并明显提高HIF-1诱骗物分子的体内稳定性，并可能影响其结合亲和性和/或特异性。具体来说，HIF-1诱骗物分子的形状/结构可以通过改变核心结合序列旁的序列来进行改变，这使得该分子的稳定性和/或结合亲和性提高。DNA的形状和结构受到碱基对序列、DNA长度、核苷酸骨架和属性(即天然DNA相对修饰过的糖或碱基)的影响。因此，也可以通过其他方法来改变分子的形状和/或结构，象例如通过改变总长、改变分子中完全互补的双链区的长度、通过核心和旁侧序列内的变动、改变骨架结构和碱基修饰。
本发明的诱骗物分子的核苷酸序列可以包含修饰或罕见核苷酸，并且可以有替代的骨架化学构成。合成核苷酸可以以多种方式进行修饰，参见例如Bielinska et al.Science25)；997-1000(1990)。因此，可以用氮、硫或碳取代氧；碳取代磷；用其他糖取代脱氧核糖或将各个碱基取代为非天然碱基。所以用硫基团(能够形成硫代磷酸酯键)代替核苷酸间的不能成键氧原子可以用于提高dsODN分子的核酸酶抗性。下文的实施例中列出了一些实验，用于确定硫修饰和HIF-1 dsODN分子的稳定性和特异性之间的关系。
每种情况中，都要评价修饰对寡核苷酸诱骗物分子与HIF-1转录因子的结合能力和亲和性的影响，对解链温度和体内稳定性的影响，以及任何有害生理效果。这类修饰是本领域众所周知的，在反义寡核苷酸中有广泛应用，因此它们的安全性和保留结合亲和性的能力都是公知的(参见例如Wagner et al.Science2601510-1513(1993))。
修饰核苷酸的例子(不限于)有4-乙酰胞嘧啶核苷、5-(羧羟甲基)尿苷、2′-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氢尿苷、2′-O-甲基假尿苷、β，D-半乳糖Q核苷、2′-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷、β，D-甘露糖Q核苷、5-甲氧基羰甲基-2-硫代尿苷、5-甲氧基羰甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-beta-D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨甲酰)苏氨酸、N-((9-beta-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)N-甲基氨甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧化乙酸-甲酯尿苷-5-氧化乙酸、wybutoxosine、假尿苷Q核苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-beta-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)-氨甲酰苏氨酸、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、3-(3-3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷(acp3)u和wybutosine。
此外，核苷酸可以通过例如磷酰胺键互相连接。该键是天然磷酸二酯键的类似物，只是成键氧原子(-O-)被氨基(-NR-)取代，其中的R通常是氢或低级烷基，象例如甲基或乙基。也可能是其他键，比如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯键等。
本发明的诱骗物分子还可以含有通常存在于多核苷酸结构中的核糖或脱氧核糖糖类的修饰或类似物形式。这些修饰包括，但不限于2′-取代的糖(比如2′-O-甲基-、2′-O-烯丙基-、2′-氟-和2′-叠氮-核糖)、羧基糖类似物、α-端基差向异构体糖、差向立体异构体糖(比如阿拉伯糖、木糖、来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、开链类似物和无碱基核苷类似物(比如甲基核苷)。
总之，本发明的寡核苷酸诱骗物分子优选包含超过约50％、更优选超过约80％、最优选超过约90％的传统脱氧核糖核苷酸。
本发明的HIF-1 dsODN诱骗物分子可以被进一步修饰以助于其定位、纯化或者提高其一些性能。例如，为了促进它们递送到细胞核内，可以给诱骗物分子连上一个核定位信号(NLS)。
此外，发明所述HIF-1诱骗物分子可以象例如以下参考文献描述的，偶联上一些载体分子，比如肽、蛋白质或其他类型分子Avrameas et al.，JAutoimmun 16，383-391(2001)；Avrameas et al.，Bioconjug.Chem.1087-93(1999)；Gallazzi et al.，Bioconjug.Chem.14，1083-1095(2003)；Ritter，W.et al.，J. Mol.Med.81，708-717(2003)。
本发明的NF-κB诱骗物分子可以进一步衍生以便包含递送载体，后者能够提高诱骗物分子的递送、分配、寻靶到特异细胞类型或者协助穿过细胞屏障转运。这类递送载体包括，但不限于细胞渗透增强剂、脂质体、脂质转染剂、树状聚合物(dendrimers)、DNA嵌入剂(intercalators)和纳米粒子。
2.HIF-1 dsODN分子的合成本发明的HIF-1 sdODN诱骗物分子可以用商品自动合成仪通过标准磷酸二酯或亚磷酰胺化学法来合成。实施例中描述的特定dsODN分子是用自动DNA合成仪(Model 380B；Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)合成的。诱骗物分子经过柱层析纯化，冻干并溶于培养基中。每种诱骗物分子的浓度经分光光度法确定。
3.HIF-1 dsODN分子的定性研究本发明的HIF-1诱骗物分子可以方便地在凝胶变动分析或电泳迁移率变动(EMSA)分析中检测和研究。该项分析提供了一种探测转录因子与DNA结合的快速和敏感的方法。这项分析是基于这样的观察，即蛋白质和DNA的复合体在非变性聚丙烯酰胺凝胶中比游离双链寡核苷酸移动得慢。凝胶变动分析的进行是将纯化蛋白或复杂的蛋白混合液(比如核提取物)与含有转录因子结合位点的32P末端标记DNA片段一起保温。然后将反应产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上做分析。转录因子对结合位点的特异性是用过量寡核苷酸(含有目标蛋白质结合位点或者拼凑DNA序列)通过竞争实验来确定。含在混合体系中的蛋白质的身份确定是通过利用识别该蛋白的抗体，然后看DNA-蛋白质-抗体复合体的位移是否减少或者该复合体与放射标记的寡核苷酸探针的结合被破坏。
4.HIF-1 dsODN分子的用途如前面讨论过的，研究表明HIF-1在肿瘤生长(包括血管发生和糖酵解)和转移中发挥关键作用，并且被认为是抗癌治疗策略的潜在目标(Semenza，Nature Rev.3721-732(2003)；Williams et al.，Oncogene 21282-90(2002)；Griffiths et al.，Cancer Res.62688-95(2002)；Welsh et al.，Mol.Cancer Ther.2235-43(2003))。HIF-1在乳腺癌中过表达，并可能与更有侵袭性的肿瘤相关(Bos et al.，J.Natl.Cancer Inst.93309-314(2001))。此外，HIF-1在最近被鉴定为炎症和肿瘤发生之间的关键衔接(Jung et al.，The FASEB JoumakExpress Article 10.1096/fj.03-0329fjc，published online September 4，2003)。在脑、乳腺、宫颈、食管、口咽和卵巢癌的活体解剖中发现的HIF-1α过表达与治疗无效和死亡率有相关性。HIF-1活性提高会促进肿瘤的进展，而抑制HIF-1代表了一种新的肿瘤治疗方法。所以利用本发明的诱骗物分子来阻断HIF-1可以用于癌症的预防和治疗，单独使用或与其他治疗手段结合使用为我们提供一种新的抗癌策略。通过给予本发明的dsODN分子来抑制HIF-1可能还可以增强其他癌症疗法(比如放射治疗和/或用化疗剂治疗)的效力。具体的目标癌症包括，但不限于实体恶性瘤和非霍奇金淋巴瘤。
此外，HIF-1被鉴定为一大类疾病的治疗目标，这些疾病中缺氧是一个主要表现，象例如心脏疾病和中风(Giaccia et al.，Nat.Ray.Drug Discov.2803-822(2003))。相应地，本发明的HIF-1诱骗物分子还可以用于预防和治疗缺氧-相关的病理疾病和状况，象例如心血管疾病，比如心肌局部缺血、心肌梗塞、充血性心力衰竭、心肌病、心肌肥厚和中风。
HIF-1诱骗物分子另外还可以用于眼科学，包括糖尿病视网膜病变，该病在美国是致盲的首要原因。其他的眼科目标包括年龄相关性黄斑变性(AMD)，和与移植手术相关的角膜新生血管。
HIF-1 sdODN分子还可以用于预防和治疗与例如银屑病、角膜新生血管、感染或创伤相关的血管病理性生长。
血管发生的增加也是滑膜炎和关节炎中骨塑造的关键体现。血管发生抑制剂在炎性关节炎的动物模型中的临床前研究支持了抑制新生血管可以降低炎症和关节损伤这一设想。因此，其他的治疗目标还包括关节炎(比如类风湿性关节炎RA)这类炎性疾病和肌肉骨骼病患。进一步的细节可参见例如Walsh and Haywood，Curr Opin Investig Drugs.2(8)1054-63(2001)。此外，与肿瘤生长类似，子宫内膜异位植入物需要新生血管来建立、生长和侵袭。可以利用本发明的HIF-1诱骗物分子来阻断这个过程。还可参见Taylor et al..Ann N Y Acad Sci.95589-100(2002)。
诱骗物分子的给药本发明所述诱骗物分子的优选递送方式是通过使用上文描述的制剂和以下实施例所示。
放在脂质体中给予时，空腔内的诱骗物分子浓度一般在每种诱骗物约0.1μM到50μM的范围，更常见是约1μM到10μM，最常见约3μM。
确定合适的浓度和剂量是本领域技术人员完全能够胜任的。根据适应症、诱骗物分子、和患者的临床状态等，最佳治疗参数可能有所不同，这可以根据本文提供的建议和本领域常识来经验性地确定。
所述诱骗物分子可以以包含单个诱骗物分子或者诱骗物分子混合物的形式给药。通常，混合物含有最多6种，常见最多4种，更常见是最多2种诱骗物分子。
在癌症治疗中，给予诱骗物分子可以与其他治疗方法结合使用，包括结合化疗抗癌剂和/或放射治疗。
超声介导的诱骗物分子的递送本发明的一个方面，证实利用超声波可以提高透皮药物转运，这一现象被称为超声波导入。我们试图在多种与皮肤炎症(异位性皮炎和银屑病)和关节炎症(类风湿性和骨关节炎)相关的靶临床适应症中，就该方法对我们的转录因子诱骗物分子的局部递送治疗之影响进行评估。选择合适的超声波参数，包括频率、强度、脉冲长度以及转导器到皮肤的距离对实现有效的超声波导入非常关键。根据文献中成功使用该方法的报道，我们从评估两种超声波导入治疗策略开始1)治疗频率超声波导入(1MHz频率，2W/cm2强度)；2)低频超声波导入(20kHz频率，最多225mW/cm2强度)。治疗频率超声波导入是超声波导入最常用的超声波频范围率(1MHz)，显示出对多种低分子量药物通常提高10倍或更少，这使得它的用途只限于局部递送而非系统递送。低频超声波导入(20kHz)能够增强各种低分子量药物和高分子蛋白质(至48kDA)的透皮转运，可能能够使透皮通透性比治疗超声波提高达1000倍。我们希望将超声波导入和或不和我们的渗透增强剂组合使用来更高效地进行药物转运，并且提高对多种靶器官的递送。
本发明的更多细节由以下实施例是显而易见的，这些实施例用于解释本发明而非限制它。本领域技术人员可以通过常规实验、特定物质的大量等同物以及文中描述的过程识别或者弄清发明。这类等同物被认为是本发明范围内的。
实施例制备制剂的各种方法是本领域公知的。因此相信制备具有如下所述成分的制剂是本领域技术人员能力范围内的。
制剂成分在下面的表中进行示范。百分比是重量百分比，除非另有说明。
胶基制剂的制备是通过将合适量的A部分和B部分加入两个分开的玻璃容器中。待A部分和B部分完全溶解后，用三刃搅拌翼强力搅拌混匀。乳剂和脂质体基制剂的制备是通过将合适量的A部分和B部分加入两个分开的玻璃容器中。将A部分和B部分加热到65℃直至完全溶解。用三刃搅拌翼将两部分强力搅拌混合到一起。使混合物边搅拌边冷却至室温。
实施例1基于凝胶的水性制剂制备了有以下成分的基于凝胶的水性制剂制剂F1
制备了有以下成分的基于凝胶的水性制剂制剂F2
制备了有以下成分的基于凝胶的水性制剂制剂F3
制备了有以下成分的基于凝胶的水性制剂制剂F4
制备了有以下成分的基于凝胶的水性制剂制剂F5
制备了有以下成分的基于凝胶的水性制剂制剂F6
制备了有以下成分的基于凝胶的水性制剂制剂F7
实施例2制备含脂质体制剂制备了有以下成分的含脂质体制剂制剂F8
制备了有以下成分的含脂质体制剂制剂F9
制备了有以下成分的含脂质体制剂制剂F10
制备了有以下成分的含脂质体制剂制剂F11
制备了有以下成分的含脂质体制剂
制剂F12
实施例3基于乳剂的制剂制备了有以下成分的基于乳剂的制剂制剂F13
制备了有以下成分的基于乳剂的制剂制剂F14
制备了有以下成分的基于乳剂的制剂制剂F15
实施例4递送含有NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂-小鼠模型本实施例显示NF-κB诱骗物分子，在利用本发明的基于凝胶的水性制剂进行给药时，可以高效地渗透入皮肤减少皮肤炎症。
该项分析的基本实验方案在Sasakawa et al.，Int.Arch.Allergy Immunol.，126(3)239-247(2001)和Matsuoka et al.，Allergy，58(2)139-145(2003)中有描述。
不含特异性病原菌(SPF)的NC/Nga雌性小鼠(4-5周)购自Charles RiversJapan(Yokohama，Japan)。将动物在SPF条件下继续生长至6周龄。然后在第0、2、4、7、9和10天，给小鼠在其右耳腹侧皮内注射溶于盐水的5mg/20μl屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus(Dp))提取物(Greer Laboratories，Lenoir，NC)。最后一次Dp注射后1-2天，在Dp处理过的耳朵背侧施用20微升含有±0.1、0.25、0.5或1％NF-κB诱骗物分子的载体2次/天，共进行14天。通过测量耳朵厚度来间接测发炎程度。组织学表明皮肤厚度与真皮和表皮中的炎症细胞量的相关性很高。用改良的弹簧测微计(Oditest，Dyer，Co.，Lancaster，CA)在每次Dp注射后24小时测量耳朵厚度，然后在疗程中隔一天测一次。
图1显示了基于凝胶的水性制剂F1中NF-κB诱骗物分子的剂量滴定，该制剂F1含有0.8％月桂醇醚硫酸钠、49％乙醇、1.5％HPMC 4000cps和48.7％100mM磷酸缓冲液。图1表明用0.1、0.25和0.5％NF-κB诱骗物分子进行的治疗减少了尘螨抗原诱导的异位性皮炎中的耳朵肿胀。该曲线图展示了与没有任何治疗、用不含NF-κB诱骗物分子的制剂进行治疗，以及用倍他米松治疗的小鼠皮肤相比，NF-κB诱骗物分子的效果。
图2进一步显示了基于凝胶的水性制剂F6中NF-κB诱骗物分子的剂量滴定，该制剂F6含有0.8％月桂醇醚硫酸钠、20％乙醇、2.0％HPMC 4000cps和10.0％100mM磷酸缓冲液。图2表明用0.25和1％NF-κB诱骗物分子进行的治疗减少了尘螨抗原(Dp)诱导的NC/Nga小鼠接触性皮炎中的耳朵肿胀。该曲线图展示了与没有任何治疗、用ELIDEL(Novartis AG Corp.，Basel，Switzerland)进行治疗、用含有1％拼凑诱骗物分子的制剂进行治疗、以及用倍他米松治疗的小鼠皮肤相比，NF-κB诱骗物分子的效果。
图3的曲线显示含有不同浓度乙醇和0.25％NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂的效果。指定为F2的制剂含有10％乙醇，制剂F3含有5％乙醇，F4含有1％乙醇。指定为F2对照的制剂不含有NF-κB诱骗物分子。结果与未治疗和用倍他米松治疗的样品进行了比较。
实施例5NF-κB诱骗物分子的抗炎效果-小鼠模型本实施例显示NF-κB诱骗物分子，在利用本发明的基于凝胶的水性制剂进行给药时，能有效地降低NC/Nga小鼠之尘螨Ag(Dp)诱导的接触性皮炎中促炎性细胞因子的基因表达，所述细胞因子有比如IL-1β、IL-6、TNFα和TSLP(胸腺基质淋巴细胞生成素)。
尘螨抗原诱导的异位性皮炎是如上所述进行诱导的(Sasakawa，et al.，2001)。最后一次诱骗物分子治疗1天后，切除注射了Dp的小鼠的右耳。将部分耳朵在液氮中速冻，保存在-80℃。按照厂商的说明，用QIAZOLlysis reagent(Qiagen，Amtsgericht Düsseldorf，Germany)从耳朵中分离总RNA。利用ABI PRISM7900 Sequence Detection System(Applied Biosystems，Foster City，CA)，经实时定量PCR检测小鼠基因的表达。如前所述执行所有过程(Hurst et al.，J.Immunol.，169(1)443-453(July 1，2002))。将DNase处理过的总RNAs与任意六聚体(Gibco-BRL，Carlsbad，California)、Oligo dt(Boehringer，Germany)短暂地混匀，用SurperScript IITMreverse transcriptase(Gibco-BRL，Carlsbad，California)合成cDNA第一链。各个基因的引物是用引物设计软件PRIMER EXPRESS(Applied Biosystems，Foster City，CA)设计的。引物是在Sigma Genosys(Woodlands，TX)合成的。用TAQMANPCRreagent kit(Applied Biosystems，Foster City，CA)按照厂商的实验方法进行定量PCR。384孔PCR板中每个反应的样品取等同于25ng RNA的cDNA样品进行检验。测量每个样品中的泛素水平，并用作内部标准。用相对泛素水平的表达量来表示细胞因子的水平。
图4的曲线显示Nc/Nga小鼠中尘螨Ag(Dp)诱导的接触性皮炎，在用含有0.25％NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂治疗时，其相对IL-1β基因表达水平的下降。
图5的曲线显示尘螨Ag(Dp)诱导的Nc/Nga小鼠接触性皮炎，在用含有0.25％NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂F2治疗时，其相对IL-6基因表达水平的下降。
图6的曲线显示尘螨Ag(Dp)诱导的Nc/Nga小鼠接触性皮炎，在用含有0.25％NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂F2治疗时，其相对TNFα基因表达水平的下降。
图7的曲线显示尘螨Ag(Dp)诱导的Nc/Nga小鼠接触性皮炎，在用含有0.25％NF-κB分子的基于凝胶的水性制剂F2治疗时，其相对TSLP基因表达水平的下降。
实施例6含NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂的递送-小鼠模型本实施例进一步展示了NF-κB诱骗物分子对尘螨Ag(Dp)诱导的NC/Nga小鼠接触性皮炎的效力。这个实验中使用的基于凝胶的水性制剂F1含有0.8％月桂醇醚硫酸钠、49％乙醇、1.5％HPMC 4000cps和48.7％100mM磷酸缓冲液。
如上所述，该项分析的基本实验方案在Sasakawa et al.，Int.Arch.AllergyImmunol.，126(3)239-247(2001)和Masuoka et al.，Allergy，58(2)139-145(2003)中已有描述。
方法将小鼠用含有0.25％NF-κB诱骗物分子的制剂、不含任何诱骗物分子的制剂自身或者局部倍他米松治疗17天。最后一次诱骗物分子治疗1天后，切除注射了Dp的小鼠的右耳。将部分耳朵在10％磷酸缓冲的福尔马林(pH7.2)中固定，包埋在石蜡中，切出3个显微切片。将样品用苏木精和曙红染色，以便进行组织学分析，用甲苯胺蓝染色来探测脱颗粒肥大细胞。
结果与分析在治疗的第17天对皮损进行组织学检验。苏木精和曙红染色显现空白载体治疗过的注射了Dp的耳朵，有严重的表皮过度增生和细胞浸润到真皮的现象，而用NF-κB诱骗物分子治疗使得表皮过度增生和细胞浸润都有降低。注射了Dp的空白载体治疗的小鼠的多数肥大细胞都是脱颗粒的，而用NF-κB诱骗物分子治疗后脱颗粒肥大细胞减少。
图8显示了经福尔马林固定的异位皮炎小鼠皮肤的苏木精和曙红染色结果，(A)未进行治疗，(B)用倍他米松治疗，(C)用含有重量约49％的乙醇和重量浓度约0.8％月桂醇醚硫酸钠的制剂F1进行治疗，以及(D)用含有重量浓度约49％的乙醇和约0.8％月桂醇醚硫酸钠，并含有NF-κB诱骗物分子的制剂F1进行治疗。
这些数据表明疾病施用NF-κB诱骗物分子能够抑制耳朵上注射Dp引起的炎症。相应地，NF-κB诱骗物分子治疗降低了表皮过度增生、细胞浸润和肥大细胞的脱颗粒。
实施例7NF-κB诱骗物分子的效果-小鼠模型本实施例展示了在尘螨Ag(Dp)诱导的NC/Nga小鼠接触性皮炎中，用倍他米松治疗的副作用，而在NF-κB诱骗物分子治疗中没有这样的副作用。
尘螨抗原诱导的异位性皮炎如上所述诱导得到(Sasakawa，et al.，2001)。简而言之，在第0、2、4、7、9和11天，给六周龄雄性NC/Nga小鼠右耳腹侧皮内注射溶于盐水的5mg Dp提取物(Greer Laboratories，Lenoir，NC)。从第11天开始，用20μl含有0.25％或0.1％NF-κB诱骗物分子的制剂F1、F6局部治疗注射了Dp的耳朵，或者局部用0.1％倍他米松戊酸盐治疗作为阳性对照。治疗每天两次共进行11天。每次皮内注射或治疗后24小时用耳朵厚度尺(Oditest，Dyer Co.，Lancaster，CA)测量耳朵厚度。
图9显示停止倍他米松治疗会导致突然并且严重的复发肿胀和炎症。而观察到的NF-κB诱骗物分子的治疗效果在治疗停止后可以维持15天。
而且，图10显示用倍他米松进行治疗时，在4天内就导致皮肤萎缩，与此不同，持续施用NF-κB诱骗物分子没有表现出任何副作用。图10(A)中治疗的耳朵是注射了尘螨/发炎的耳朵。由于发炎，尘螨处理的耳朵的厚度增加。相反，图10(B)中没有治疗的耳朵是正常的对侧耳朵。图10(B)表明给发炎耳朵施用倍他米松时，它会导致未治疗耳朵变薄，表现出皮肤萎缩的系统性副作用。
图11进一步展示了倍他米松治疗对正常耳朵的副作用。图11显示了没有任何治疗、用倍他米松治疗和用NF-κB诱骗物分子治疗的正常耳朵的厚度测量值。倍他米松和NF-κB诱骗物分子每天给药2次，在治疗的第13天读取测量值。
图10和11清楚地显示局部类固醇，比如倍他米松会导致皮肤变薄，而NF-κB诱骗物分子持续治疗不会表现出类似的有害副作用。
进一步的实验，用苦味酸天狼星红将胶原染色。福尔马林固定的石蜡包埋组织样品用天狼星红F3B染料给胶原染色(Puchtler et al.，Beitrag fürPathologie，150174-187(1973)；Junqueira et al.，Histochem J.，11447-455(1979))。在真皮中，该染色法可以特异性探测III型胶原(表皮基底膜内的IV型胶原不被染色)。实验皮肤切片在苦味酸-天狼星红染色前，用爱茜蓝(Alcian blue)(pH＝2.5)染色来刻画软骨(Kiernan，J.A.，Histological &Histochemical MethodsTheory and Practice.3rdEd.，Butterworth-Heinemann，Oxford(1999))。
切片在脱石蜡和重新水化后，用爱茜蓝(pH＝2.5)染色30分钟(BioCareMedical，Walnut Creek，CA)，然后在流动DI水中洗。切片用苦味酸天狼星红(溶于苦味酸(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ)的饱和水溶液的0.1％天狼星红F3B(CI 35782，Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO))染色过夜，随后在流动的DI水中洗，经乙醇脱水，用二甲苯透明并盖上盖片。
用Axioskop 2 microscope，(Carl Zeiss AG，Gottingen，Germany)分析载玻片，所用物镜为20x PlanApo，亮视野照明。用NIKON DXM1200F数码相机(Technical Instruments，Burlingame，CA)收集并在ADOBEPHOTOSHOP(Adobe，San Jose，CA)中组合数码图像。
结果如图12所示。图12显示了倍他米松治疗对正常(未发炎)对侧耳朵表皮厚度的副作用。图12表明当利用本发明的基于凝胶的水性制剂F6来给药，以0.25％NF-κB诱骗物分子治疗正常耳朵时，没有胶原的损失。相反，图12显示了用倍他米松治疗的正常耳朵，表皮厚度变薄。NF-κB诱骗物分子治疗的耳朵表皮厚度是102±17μm，而倍他米松治疗的是67±12μm。
实施例8向猪皮肤递送NF-κB诱骗物分子本实施例展示了猪模型中NF-κB诱骗物分子的有效递送。猪皮肤是测试药物递送和渗透的理想模型，因为它与人皮肤在结构成分和经皮吸收方面是类似的。
在这项实验中，将含在基于凝胶的水性制剂F2中的0.5％生物素化NF-κB诱骗物分子以30μl/cm2涂在浅肤色雌性Yorkshire猪(70-80公斤)的背部区域24小时。用PBS将皮肤彻底清洗以除去任何残留的制剂。将皮肤冻在包埋介质中。将皮肤冷冻切片染色以便给上药部位的诱骗物分子定位。横切片中的生物素化NF-κB诱骗物分子用标记Alexa的链霉亲和素(Molecular Probes，Eugene，OR)来显像，并用Hoechst染色剂(MolecularProbes，Eugene，OR)复染进行细胞核共定位。用彩色数码相机(SPOT DigitalCamera System，Diagnostic Instruments，Inc.，Sterling Heights，MI)获取荧光图像。图13显示了用NF-κB诱骗物分子治疗正常猪皮肤可以高效地做角质形成细胞和基质细胞的核定位。
实施例9含有NF-κB诱骗物分子的水性制剂-猪模型本实施例用猪皮肤炎症模型展示了发明所述制剂递送NF-κB诱骗物分子的效力。本实施例中，检验了二硝基氟苯致炎的猪皮肤中的药物渗透情况。
用于本实验的基于凝胶的水性制剂F2含有0.8％月桂醇醚硫酸钠、10％乙醇、2.0％HPMC 4000cps和10％100mM磷酸缓冲液。
DNFB-诱导的迟发型超敏反应在浅肤色雌性Yorkshire猪(70-80公斤)中诱导对接触二硝基氟苯(DNFB)的超敏反应，这是通过在第一天给每个耳廓的内侧部位和腹股沟施用100μl溶于50％丙酮/10％二甲基亚砜(DMSO)/30％橄榄油混合物的10％(W/V)DNFB实现的。动物在第4天再次在两个耳廓的外侧部分接触100μl溶于58％丙酮/10％二甲基亚砜(DMSO)/30％橄榄油的2％DNFB混合物。在进行最后的DNFB攻击前每隔一定时间，给致敏动物背部皮肤上指定的4cm2区域以25mg/cm2平均地施用局部对照制剂或者是含有NF-kB诱骗物分子的相同制剂，保留一段时间，之后用蘸水的棉花施用器擦去残存的制剂。DNFB攻击是在第12天，将溶于69％丙酮/30％橄榄油的1％到2.5％之间的DNFB混合物，以6.4μl/cm2平均地施用在皮肤的治疗区和对照区。在施加DNFB攻击24小时后，评价目标区域的红斑和水肿，之后从目标区域收集4个打孔活体解剖样品，直径6mm。将活体解剖样品保存进行组织学评价，或者分成两半冻在干冰上用于凝胶变动分析或mRNA转录产物分析。
电泳迁移率变动试验(EMSA)和分析得自上述实验的活体解剖样品中存在的NF-κB诱骗物分子可以通过凝胶变动或电泳迁移率变动试验(EMSA)来方便地测试和定性研究。该项检测提供了一种探测转录因子与DNA结合的快速和敏感的方法。这项检测是基于这样的观察，即蛋白质和DNA的复合体在非变性聚丙烯酰胺凝胶中比游离双链寡核苷酸移动得慢。凝胶变动检测的进行是将纯化蛋白或复杂的蛋白混合液(比如核提取物)与含有转录因子结合位点的32P末端标记DNA片段一起保温。然后将反应产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上做分析。转录因子对结合位点的特异性是用过量寡核苷酸(含有目标蛋白质结合位点或者拼凑DNA序列)通过竞争实验来确定。
将上面6mm活体解剖样品的一半在液氮下粉碎成细末，然后用NE-PERNuclear和Cytoplasmic Extraction Kit(Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，Illinois)按照每个试剂盒的说明提取和分离细胞核蛋白质。将含有5μg蛋白质的核提取物与1μl 1mg/ml多聚dIdC、1μl P32标记的寡核苷酸探针(35fmoles)、100mM KCl、10mM Tris缓冲液(pH8.0)、5mM MgCl2、6％甘油、2mM二硫苏糖醇、2.5％小牛血清清蛋白和0.1％NP-40在总共20μl的体积中于室温下保温30分钟，然后在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上跑胶。将胶在80℃真空干燥，然后给磷感光板曝光，随后在MolecularDynamics TYPHOONTM8600 imager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)上扫描。
通过凝胶图像上P32标记探针与NF-κB的p65蛋白之间的结合有竞争性减少可以确定目标组织中存在着结合了NF-κB的诱骗寡核苷酸。
图14显示表明猪皮肤中存在着结合了NF-κB的诱骗物分子的竞争结合凝胶变动实验的定量结果，该猪皮肤用含有10％乙醇和从0.25到1％的不同浓度的NF-κB诱骗物分子之基于凝胶的水性制剂F2治疗过。这项分析中P32标记的寡核苷酸探针是放射性标记的。将加入竞争剂后剩下的条带量做曲线。条带用TYPHOONTM8600 phosphorimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)进行了定量。凝胶图像中P32标记的寡核苷酸探针结合到P65蛋白质的减少证明猪皮肤中存在着结合了NF-κB的诱骗物分子。
图15显示表明猪皮肤中存在着结合了NF-κB的诱骗物分子的竞争结合凝胶变动实验的定量结果，该猪皮肤用含有5％乙醇以及0.25或0.5％的NF-κB诱骗物分子之基于凝胶的水性制剂F3治疗过。指定为F3对照的制剂不含有NF-kB诱骗物分子。这项分析中P32标记的寡核苷酸探针是放射性标记的。将加入竞争剂后剩下的条带量做曲线。用TYPHOONTM8600phosphorimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)对条带进行定量。凝胶图像中P32标记的寡核苷酸探针结合到P65蛋白质的减少证明猪皮肤中存在着结合了NF-κB的诱骗物分子。
图16显示表明猪皮肤中存在着结合了NF-κB的诱骗物分子的竞争结合凝胶变动实验的定量结果，该猪皮肤用含有10％乙醇和从0.25到1％不同浓度NF-κB诱骗物分子的含脂质体的制剂F9治疗过。指定为F5对照的制剂不含有NF-kB诱骗物分子。这项分析中P32标记的寡核苷酸探针是放射性标记的。将加入竞争剂后剩下的条带量做曲线。条带用TYPHOONTM8600phosphorimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)进行了定量。凝胶图像中P32标记的寡核苷酸探针结合到P65蛋白质的减少证明猪皮肤中存在着结合了NF-κB的诱骗物分子。
实施例10NF-kB诱骗物分子的抗炎效果-猪模型本实施例显示了NF-κB诱骗物分子，在用本发明的基于凝胶的水性制剂进行给药时，能够有效地降低二硝基氟苯致炎的猪皮肤中促炎细胞因子(比如IL-6和IL-1β)的基因表达。
在浅肤色雌性Yorkshire猪(70-80公斤)中诱导对接触二硝基氟苯(DNFB)的超敏感性，这是通过在第一天给每个耳廓的内侧部位和腹股沟施用100μl溶于50％丙酮/10％二甲基亚砜(DMSO)/30％橄榄油混合物的10％(W/V)DNFB实现的。动物在第4天再次在两个耳廓的外侧部分接触100μl溶于58％丙酮/10％二甲基亚砜(DMSO)/30％橄榄油的2％DNFB混合物。在进行最后的DNFB攻击前每隔一定时间，给致敏动物背部皮肤上确定的4cm2区域以25mg/cm2均匀地施用局部对照制剂或者是含有NF-kB诱骗物分子的相同制剂，保留一段时间，之后用蘸水的棉花施用器擦去残存的制剂。DNFB攻击是在第12天，将溶于69％丙酮/30％橄榄油的1％到2.5％之间的DNFB混合物，以6.4μl/cm2均匀地施用在皮肤的治疗区和对照区。在施加DNFB攻击24小时后，收集目标区域。将活体解剖样品做石蜡包埋保存进行组织学分析，并用苏木精和曙红染色冻在干冰上用于mRNA转录产物的凝胶变动分析。
将部分猪皮打孔活体解剖样品在液氮中快速冷冻，保存于-80℃。按照厂商的说明，用QIAZOLlysis reagent(Qiagen，Amtsgericht Düsseldorf，Germany)从耳朵中分离总RNA。利用ABI PRISM7900 Sequence DetectionSystem(Applied Biosystems，Foster City，CA)，经实时定量PCR检测小鼠基因的表达。如前所述执行所有过程(Hurst et al.，J.Immunol.，169(1)443-453(July 1，2002))。将DNase处理过的总RNAs与任意六聚体(Gibco-BRL，Carlsbad，California)、Oligo dt(Boehringer，Germany)短暂地混匀，用SurperScript IITMreverse transcriptase(Gibco-BRL，Carlsbad，California)合成cDNA第一链。各个基因的引物是用引物设计软件PRIMER EXPRESS(Applied Biosystems，Foster City，CA)设计的。引物是在Sigma Genosys(Woodlands，TX)合成的。用TAQMANPCR reagent kit(Applied Biosystems，Foster City，CA)按照厂商的实验方法进行定量PCR。384孔PCR板中每个反应的样品取等同于25ng RNA的cDNA样品进行检验。测量每个样品中的泛素水平，并作为内部标准。用相对泛素水平的表达量来表示细胞因子的水平。
图17的曲线显示了二硝基氟苯致炎的猪皮肤中的IL-6 mRNA表达水平。
图18的曲线显示，与安慰剂治疗或未治疗皮肤相比，经过含有0.25和0.5％NF-κB诱骗物分子的含脂质体制剂F9治疗的猪皮肤中的相对IL-6mRNA表达水平下降。
图19的曲线显示用含有0.25％NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂F2治疗时，二硝基氟苯致炎的猪皮肤中的相对IL-6mRNA表达水平下降。
图20显示用含有0.5％或1％NF-κB诱骗物分子的基于凝胶的水性制剂F10治疗时，二硝基氟苯致炎的猪皮肤中的相对IL-6mRNA表达水平下降。
实施例11NF-κB诱骗物分子在减轻炎症中的作用本项实验的目的是确定NF-κB诱骗物分子减轻NC/Nga小鼠中尘螨诱导的耳部肿胀的机制。
尘螨抗原诱导的异位性皮炎如水所述诱导得到(Sasakawa，et al.，2001)。简而言之，6周龄雄性NC/Nga小鼠皮内注射溶于盐水的5g Dp(GreerLaboratories)提取物。注射是在第0、2、4、7、9和10天，在小鼠右耳腹侧皮内做的。从第11天开始，将注射了Dp的耳朵用20微升含有1％NF-κB诱骗物分子或0.1％倍他米松戊酸盐(对照)的基于凝胶的水性制剂F6局部治疗2次/天，共2天。将组织用福尔马林固定，用石蜡包埋的组织样品通过末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP切口末端标记(TUNNEL)分析(Gavrieli et al.，J.Cell Biol.，119493-501(1992))来鉴定凋亡细胞，该分析中用dUTP-FITC作为标记。所有的试剂在“In Situ Cell Death Detection Kit”(Roche，Indianapolis，IN，Cat.No.1 684 795)中都提供了。TUNNEL反应后，将样品切片用4′，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)(Molecular Probes，Eugene，OR)复染，并用PROLONG GOLD抗褪色试剂(Molecular Probes，Eugene，OR)封固。
福尔马林固定的石蜡包埋组织样品还可以用Ki67兔单克隆抗体(NeoMarkers Cat.No.RM-9106，Lab Vision Corp.，Fremont，CA)来鉴定增殖细胞。用专用的RETRIEVER高压锅(EMS，Hatfield，PA)在柠檬酸盐缓冲液(pH＝6.1)(Target Retrieval Solution，Cat.No.S-1700，DakoCytomation，Carpinteria，CA)中做抗原修复。抗原修复后，用机械免疫染色仪(DakoCytomation Autostainer，DakoCytomation，Carpinteria，CA)做Ki67的定位。用3％H2O2抑制内源过氧化物酶活性。用以下封闭溶液阻断免疫试剂的非特异性结合溶于TBS(50mM Tris，pH＝7.6，500mM NaCl，0.05％Tween 20，全部购自Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)的4％BSA(SigmaChem.Co.，St.Louis，MO)、1％酪蛋白(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ)、0.5％硬骨鱼鱼皮明胶(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)。封闭之后，将切片与Ki67抗体(1μg/ml终浓度)保温1小时。切片在清洗后与标记过氧化物酶(DakoCytomation，Carpinteria，CA)的抗兔IgG ENVISION试剂(1∶1 dilution)保温30分钟。用DAB底物(DAB+reagent，DakoCytomation，Carpinteria，CA)检测过氧化物酶活性。将切片彻底清洗，盖上盖片(不做复染)。样品用Axioskop 2 epi-荧光显微镜(Carl Zeiss AG，Gottingen Germany)做分析，所用物镜是20x NeoFluar。数码图像用SPOT RTTM照相机(DiagnosticInstruments，Sterling Heights，MI)收集并在ADOBEPHOTOSHOP(Adobe，San Jose，CA)中进行整合。
因为阻断NF-κB的功能与诱导细胞凋亡和抑制增殖都相关，我们对尘螨诱导的发炎耳朵进行了TUNNEL分析(图21)和Ki67染色(图22)。图21显示在皮肤的表皮和真皮区，都观察到由施用在发炎耳朵上的倍他米松和NF-kB诱骗物分子所介导的凋亡(绿色核)增强了。相反，拼凑诱骗物没有引起这样的反应。Ki67染色(棕色核，图22)检测到表皮和真皮层细胞增殖加强。施用在发炎耳朵上的倍他米松和NF-κB诱骗物分子使有丝分裂指数急剧下降，表明它们抑制了发炎耳朵中的细胞增殖。与未治疗发炎耳朵相比，拼凑诱骗物没有带来任何Ki67阳性细胞的变化。
图21和22显示局部NF-κB诱骗物分子治疗在Dp诱导的炎症中，导致凋亡增加和炎症细胞的增殖下降。在倍他米松治疗中可见到类似的效果。这些观察解释了NF-κB诱骗物分子在小鼠类异位性皮炎模型中的强大和长久的抗炎效果。
实施例12NF-κB诱骗物分子设计我们设计了NF-κB dsODN诱骗物分子并对其结合和/或竞争结合NF-κB的能力进行了检测。在某个特定方面，本发明的目的是设计这样的NF-κB诱骗物分子，即较之p50/p50同源二聚体，它们更优先结合p65/p50和/或cRel/p50异源二聚体。不会阻断p50/p50同源二聚体的结果是，发明所述选择性诱骗物分子使得这些同源二聚体可以阻断受NF-κB调节的基因的启动子，这就给基因转录提供了又一水平上的负调节。
设计寡核苷酸诱骗物分子时，利用了由晶体结构研究和已知NF-κB结合位点的计算分析提供的信息。
正如以上讨论过的，基于对结合到免疫球蛋白轻链基因(含有5’-GGGACTTTCC-3’(SEQ ID NO2)的共有序列)上的p50/p65异源二聚体晶体结构的研究，已知p50与5碱基对亚位点5’-GGGAC-3’(SEQ ID NO3)接触，而p65与4碱基对亚位点5’TTCC-3’(SEQ ID NO4)接触。我们设计了一系列NF-κB寡核苷酸诱骗物分子，它们在共有结合位点的5’端含有更少的G，其目的是为了制备对p50/p50同源二聚体亲和性更低，但仍能结合p65/p50异源二聚体的诱骗物分子。为了方便识别和陈述，给这些寡核苷酸诱骗物分子指定“核心”和“旁侧”字母代码。核心指定字母代码“A”到“L”，旁侧“T”到“Z”。用凝胶异位实验来检测诱骗物分子，确定它们与一个高亲和性放射标记的寡核苷酸竞争结合NF-κB的能力。结合NF-κB的DNA共有序列选自关于与NF-κB有关的DNA-蛋白质相互作用的出版物，包括Blank et al.，EMBO J.104159-4167(1991)；Bours et al.Mol.Cell.Biol.12685-695(1992)；Bours et al.U.Cell 72729-739(1993)；Duckett et al.Mol.Cell.Biol.131315-1322(1993)；Fan C.-M.，Maniatis T.，Nature 354395-398(1991)；Fujita et al.，Genes Dev.6775-787(1992)；Fujita et al.Genes Dev.71354-1363(1993)；Ghosh et al.，Nature 373303-310(1995)；Ghosh et al.，Cell621019-1029(1990)；Grumont et al.，Mol. Cell.Biol.148460-8470(1994)；Henkel et al.，Cell 681121-1133(1992)；Ikeda et al.Gene 138193-196(1994)；Kunsch et al.，Mol.Cell.Biol.124412-4421(1992)；LeClair et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 898145-8149(1992)；Li C.-C.et al.，J.Biol.Chem.26930089-30092(1994)；Matthews et al.，Nucleic Acids Res.211727-1734(1993)；Mueller et al.，Nature 373311-317(1995)；Neri et al.，Cell671075-1087(1991)；Nolan et al.，Cell 64961-969(1991)；Paya et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897826-7830(1992)；Plaksin et al.，J.Exp.Med.1771651-1662(1993)；Schmid et al.，Nature 352733-736(1991)；Schmitz M.L.，Baeuerle P.A. EMBO J.103805-3817(1991)；Ten et al.，EMBO J.11195-203(1992)；Toledano et al.，J.Mol.Cell.Biol.13852-860(1993)；Urban et al.，EMBO J.101817-1825(1991)。
在这些已有信息的基础上，我们得到一组诱骗物分子做初始筛选。这些诱骗物分子包括″突变诱骗物分子″、拼凑诱骗物分子、其5’或3’端长度不同的诱骗物分子，以及核心区和/或旁侧序列中有替代碱基组成的诱骗物分子。
为了更好地理解NF-κB核心结合位点附近的碱基组成，将核心结合位点与已知结合序列进行计算序列比对(仅正向链)。基于这项序列比对，产生了主要的几组诱骗物分子，它们的核心结合位点略有不同。
表1中列出了主要的核心和旁侧序列。
表1
电泳迁移率变动分析(EMSA)采用EMSA分析来研究NF-κB转录因子的寡核苷酸诱骗物分子。利用一个放射标记的寡核苷酸探针(非哺乳动物，根据来自HIV的NF-κB启动子，序列113/114)，用来自活化单核细胞细胞系的核提取物检测与p65/p50、cRel/p50和p50/p50的结合，所述探针对NF-κB家族的相关成员有高亲和性。利用上述修饰寡核苷酸竞争结合前面提到的NF-κB家族成员，就有可能比较这些寡核苷酸相对高亲和性放射标记探针的结合亲和性，以及它们之间的比较。该项分析还使我们能够设计选择性结合NF-κB家族的特定成员的诱骗物分子。通过使用浓度逐渐升高的不同寡核苷酸，我们观察到删除或改变结合位点里的靶残基，就可能特异地降低诱骗物分子与p50/p50同源二聚体的结合，而对p65/p50和cRel/p50异源二聚体的亲和性保持不变。
如下进行NF-κB凝胶变动分析(EMSA)。用T4多核苷酸激酶(Promega)将含有共有NF-κB结合位点(5’AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC 3’)(SEQID NO26)的双链寡核苷酸末端标记上γ32P-ATP。1微克由LPS刺激的THP-1细胞(人单核细胞细胞系)制备得到的核提取物与35pmol放射标记的探针，在有或没有竞争性未标记NF-κB双链寡核苷酸(dsODN)或拼凑dsODN的情况下保温。保温于室温下，在包含10mM Tris-HCl pH8、100mM KCl、5mMMgCl2、2mM DTT、10％甘油、0.1％NP-40、0.025％BSA和1μg Poly-dIdC的20μl反应体系中进行30分钟。将反应体系上样到6％聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳并干燥。将干燥好的胶显影，并用Typhoon 8600 PhosphorImager(Amersham)和ImageQuant软件定量。复合体中含有的结合了放射标记寡核苷酸探针的NF-κB蛋白质的身份，是通过在加入放射标记探针前，将反应与NF-κB家族每个成员的特异抗体预先保温5分钟来鉴定的。
核酸酶降解和化学修饰天然DNA在细胞内会被迅速降解，这主要是通过3’外切核酸酶的作用，但也是内切核酸酶攻击的结果。因此，寡核苷酸诱骗物分子设计好了，要对它们进行修饰以增加其稳定性。将核苷酸间键合中的一个不成键氧原子用硫基团代替，产生所谓硫代磷酸酯(PS)寡脱氧核苷酸，在这方面非常成功。这些分子是相对核酸酶抗性的，但是研究表明相对3′-末端修饰的和未修饰的寡核苷酸诱骗物分子，它们表现出非特异性蛋白结合(Brown et al，J.Biol.Chem.269(43)26801-5(1994))。因此，我们进行了一组实验以便确定在3’、5’端或内部位点需要多数个硫能够给我们的寡核苷酸诱骗物分子提供核酸酶抗性，同时维持已有的特异性。
EMSA结果分析正如前面讨论过的，本文公开的工作的一个目的是开发相对p50/p50同源二聚体来说，优先结合NF-κB p65/p50和/或cRel/p50异源二聚体的NF-κB寡核苷酸诱骗物分子。实验结果表明与p65/p50和cRel/p50的结合一般是相当的，因此我们的分析仅对p65/p50条带进行了定量。
图23显示了p65/p50与一些NF-κB诱骗物分子的结合。图24显示了p50/p50与一些NF-κB诱骗物分子的结合。
采用特异性/亲和性系数来定量优选结合，计算如下特异性/亲和性系数＝(Sp50/p50-Sp65/p50)×Sp50/p50/Sp65/p50
其中Sp50/p50等于竞争50％p50/p50与来自HIV的非哺乳动物NF-κB启动子(sequence 113/114)之间的结合所需的摩尔过量数；Sp65/p50等于竞争50％p65/p50与来自HIV的非哺乳动物NF-κB启动子(sequence 113/114，其中对应序列113的反向链定为″114″)之间的结合所需的摩尔过量数。如果诱骗物分子在任何测试的摩尔比率都不能竞争至少50％的结合，分数(S)定为100。
优选的诱骗物分子应当对p65/p50异源二聚体的分数较低，对p50/p50同源二聚体的分数较高。诱骗物分子与p65/p50异源二聚体的特异性相对与p50/p50同源二聚体的特异性，和它们分数的不同(score p50/p50-scorep65/50)是成比例的。表2总结了如上所述进行的EMSA竞争结合实验的结果，其中从最特异的诱骗物分子(最高特异性/亲和性系数)开始列出了诱骗物分子。
表2
E-Z-4是删除了两个5’和3’碱基的E-ZE-Z even是E-Z减去两个5’碱基E-Z a to C Even is位点6的A改为C的E-ZA-Z-2是删除了5’和3’碱基的A-ZE-A是核心E在5’和3’末端添加了AE-AG Flank是核心E，5’旁侧序列是AAGA，3’旁侧序列是AGAGE-AT Flank是核心E，5’旁侧序列是ATAT，3’旁侧序列是TTAAE-CAFlank是核心E，5’旁侧序列是CAAC，3’旁侧序列是ACACE-CAGT Flank是核心E，5’旁侧序列是CAGT，3’旁侧序列是ACTGH-Z’(-3’2BP)是删除了两个5’碱基的H-ZH-Z’(-3’1BP)是删除了两个5’碱基，3’端添加一个T的H-ZE-Z-3是5’端删除AGT，3’端删除C的E-ZE-Z-6是5’端删除AGTT，3’端删除GC的E-Z
表2给出的数据表明有更高p65/p50特异性的诱骗物分子，非常可能都有“E”或“D”或″H″核心序列，以及“Z”或″W″或″V″或″U″旁侧序列。在一组更优选诱骗物分子中，核心序列是″E″或″D″，旁侧序列是″Z″。考虑到其他一些参数，从前几位候选分子中选出指定为153/154的诱骗物分子为最佳(见下文)。
分析DNA骨架的化学修饰采用类似分析对被测诱骗物分子之DNA骨架的化学修饰进行了评价。
表3具有不同DNA骨架的153/154的Sp50/p50/Sp65/p50和特异性/亲和性系数
在上面表3中，骨架的化学组成用两个命名表示，第一个表示链153的化学组成，第二个表示链154的化学组成。全部是磷酸二酯的骨架指定为“PO”，全部是硫代磷酸酯的骨架指定为“PS”。混杂的骨架命名为“H”，后面是从3’端开始的硫代磷酸酯键的数量。因此，H3意味着最3’端的三个键是硫代磷酸酯键，其他骨架链接是磷酸二酯键。如果只出现一个命名(比如只有PO)，则两条链具有相同的骨架化学组成。
表3给出的数据表明，如果任何一条链全部是硫代磷酸酯键(例如PS/PO或PO.PS)，则该诱骗物分子对p65/p50和p50/p50的亲和性高，从而就会缺少所需的特异性。虽然不总是如此，但一般来说硫代磷酸酯键数目越多会使得特异性降低。通常有8个以上硫代磷酸酯键的杂合链没有特异性，而少于7个硫代磷酸酯键会维持可以接受的亲和性和特异性。但是，H4/H4只有极低的亲和性，而H3/H3和H5/H5都在可以接受的范围内。H11/PO和PO/H11有良好的亲和性和特异性。基于半衰期、特异性和亲和性，H3/H3、H5/H5、H6/H6和H7/H7被鉴定为153/154诱骗物分子的最优骨架。其他诱骗物分子的最优骨架化学组成能够以类似方式检测和确定。
对其他转录因子的特异性诱骗物分子必须只特异性地阻断靶转录因子，而不能非特异性地结合并阻断无关的转录因子。事实表明有可能设计这样的NF-κB诱骗物分子，它们在进行EMSA时不显示对无关启动子的任何非特异性效应。具体来说，利用对应泛素转录因子Oct-1的启动子序列的放射标记寡核苷酸探针，EMSA显示153/154(其中″154″是指对应序列″153″的反向序列)PO和H3NF-κB诱骗物分子没有表现出对该启动子的任何结合亲和性(图25)。这一点很重要，因为寡核苷酸对细胞内其他重要蛋白质的非特异性效应可能造成诱骗物分子对治疗个体的不受欢迎的毒性。
半衰期天然DNA在细胞内会被迅速降解，主要是3′外切核酸酶的作用，也是内切核酸酶攻击的结果。因此，寡核苷酸诱骗物分子设计好时，要对它们进行修饰以增加其稳定性。将核苷酸间键合中的一个不成键氧原子用硫基团代替，产生所谓硫代磷酸酯(PS)寡脱氧核苷酸，在这方面非常成功。这些分子是相对核酸酶抗性的，但是研究表明相对3′-末端修饰的和未修饰的寡核苷酸诱骗物分子，它们表现出非特异性蛋白结合(Brown et al，J.Biol.Chem.269(43)26801-5(1994))。因此，我们进行了一组实验以便确定在3’、5’端或内部位点需要多数个硫能够给我们的寡核苷酸诱骗物分子提供核酸酶抗性，同时维持已有的特异性。
通过以上描述的凝胶变动分析对结合特异性进行评定。3′-外切核酸酶抗性是用标准的蛇毒分析法检验的(Cummins et al.，Nucleic Acids Res.232019-24(1995))。为了评定诱骗物分子对更相关的哺乳动物核酸酶活性的抗性，采用了一种分析方法，其中使用了由活化的巨噬细胞制备得到的细胞质和细胞核提取物(Hoke et al.，Nucl.Acids Res.19(20)5743-8(1991))。每次分析中都用阳性对照证实了提取物的活性。实验证明将诱骗物分子的每个链的3′端罩上几个硫基团就足以使它免于核酸酶的降解。
综合这些数据表明对p50/p65选择性NF-κB诱骗物分子来说，19聚体寡核苷酸双链3′端的3-5个硫就足以使该诱骗物分子免于核酸酶的降解。此外，它还能保持对转录因子家族中特异亚基的结合，并且不会结合无关的转录因子。这些数据论证了本发明能够提供方法和手段，用于设计寻靶到转录因子(尤其是NF-κB)的特异性和持续性寡核苷酸诱骗物分子。
包含核定位信号的NF-κB诱骗物分子为了确定含有核定位信号(NLS)的肽能否提高寡核苷酸诱骗物分子进入细胞核，Sigma Genosys在猴病毒40大肿瘤抗原(PKKKRKVEDPYC)(SEQID NO78)的基础上合成了一个有NLS序列的肽，并将其如下偶联到NF-κB153 H3寡核苷酸上。简单来说，首先将6.5nmols寡核苷酸与40倍摩尔过量的接头Sulfo-SMCC(Pierce)于室温培育2小时。用NAP-10柱子(PharmaciaBiotech)从反应中去除多余的接头后，将活化的寡核苷酸与5倍摩尔过量的NLS肽于室温培育过夜。将1μl反应上样到20％PAGE胶(非变性)进行分析来评定成功偶联上NLS肽的寡核苷酸的百分比。凝胶用SYBR Gold(Molecular Probes)染色，并在Typhoon Phosphorimager(Amersham)上显影。偶联NLS-肽的单链153 H3浓度通过OD吸光度确定。然后使偶联物退火到它的互补链154 H3(相同摩尔量)，后者在5’端含有生物素分子。至此成为双链的NLS诱骗物分子上的生物素分子使得能够通过显微镜观察(借助链霉亲和素)到诱骗物分子的位置。
实施例13E2F诱骗物分子1.寡核苷酸诱骗物分子的合成图26所示双链寡核苷酸诱骗物分子是用自动DNA合成仪(Model 380B；Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)合成的。诱骗物分子经柱层析纯化、冷冻干燥并溶于培养基中。某种诱骗物分子的浓度经分光光度法测定。
SEQ ID NOS94和95(″参照诱骗物分子″)代表的双链寡核苷酸分子是已知的诱骗物，目前正在临床开发。SEQ ID NOS96和97(″新诱骗物分子″)代表的双链寡核苷酸诱骗物是其特性显著改善的变异体，而SEQ ID NOS99和100代表的″拼凑诱骗物″用作阴性对照。
新诱骗物分子的Tm是55℃，比参照分子的42.3℃的Tm明显高。所以，新诱骗物分子预计比参照诱骗物分子在体内稳定地多。
2.竞争性凝胶变动分析新诱骗物分子与参照诱骗物以及阴性对照(拼凑诱骗物)在竞争E2F结合到标记探针(探针含有E2F共有结合位点)上的差异，在LPS刺激的THP-1细胞内进行了体外检测，测试基本按照Morishita et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92 5855-5859(1995)中描述的实验方案进行。如Horiuchi等(J.Biol.Chem.26616247-16254(1991))所述由血管平滑肌细胞(VSMCs)制备核提取物。如下进行凝胶阻滞分析将含有E2F结合位点(5’CTAGATTTCCCGCGGATC 3’)(SEQ ID NO3)的双链寡核苷酸用T4多核苷酸激酶(Promega)末端标记上γ32P-ATP。5微克由LPS刺激的THP-1细胞(人单核细胞细胞系)制备得到的核提取物与50pmol放射标记的探针，在有或没有竞争性新诱骗物分子、参照诱骗物分子或阴性对照(拼凑诱骗物分子)的情况下保温。保温于室温下，在包含10mMTris-HCl pH7.4、40mM KCl、1mM DTT、0.1mM EDTA、8％甘油、0.05％NP-40和0.5μg Poly-dIdC的20μl反应体系中进行30分钟。将反应体系上样到6％聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳并干燥。将干燥好的胶显影，并用Typhoon8600 PhosphorImager(Amersham)和ImageQuant软件定量。复合体中含有的结合了放射标记寡核苷酸探针的E2F蛋白质的身份，是通过在加入放射标记探针前，将反应与E2F家族每个成员的特异抗体预先保温5分钟来鉴定的。抗E2F1(sc-193x，sc-251x)、E2F2(sc-633x)、E2F3(sc-878x，sc-879x)、E2F4(sc-866x)、E2F5(sc-999x)、p107(sc-318x)和细胞周期蛋白A(sc-239x)的抗体购自Santa Cruz Biotechnology。
如图27所示，新诱骗物分子能够在平滑肌提取物中竞争标记探针与E2F之间的结合，在10倍摩尔过量时，超过60％(对比参照诱骗物分子仅阻断7％)；在40倍摩尔过量时，超过90％(对比参照诱骗物分子只阻断40％)。因此，所述新诱骗物分子大概比已有的参照诱骗物分子竞争性高一个数量级。
实施例14HIF-1诱骗物分子设计结合HIF-1的DNA共有序列选自关于HIF-1相关的DNA-蛋白质相互作用的出版物，是从BioBase TRANSFAC(version7.2)数据库总结的序列组中选出来的。我们确认了它们的相应调控区位置，并从最新的基因组数据库中找到扩展的旁侧基因组DNA序列(见表4)(人的是July 2003版本；小鼠的是Feb，2003版本；大鼠的是June，2003版本)。
表4.实验鉴定的HIF-1结合位点及相应的旁侧序列
核心共有结合位点阵列的构建为了确认HIF-1核心结合位点附近的碱基组成，基于以上已知的HIF-1核心结合序列将核心结合位点进行了计算序列比对。在比对结果的基础上，我们制作了一个表或者“阵列”来计算学地描述核心和紧接的旁侧区的碱基组成(见图28)。图28从统计学角度给出了特定位点出现特定碱基的概率。
HIF-1结合基元的晶体结构分析
HIF-1属于基本的螺旋-环-螺旋(bHLH)DNA结合蛋白家族。位于位点30到位点70的氨基酸(HIF-1a亚基总共826个氨基酸中)负责DNA识别和结合亲和性。现在还没有HIF-1 DNA结合基元的晶体结构，但是其他有类似DNA结合基元的bHLH成员的已知信息可以提供有用的结构信息(Michel et al.，Theor Chem Acc.10151-56(1999)；Michel et al.，J.Biomolecular Structure & Dynamics 18169-179(2000)；Michel et al.，Biochimica et Biophysica Acta 157873-83(2002))。这些研究提示了位于HIF-1结合基元内的几个残基的重要性。中间核心ACGTG(SEQ ID NO165)对HIF-1复合体(HIF-1α和ARNT)的结合至关重要，核心序列紧接的5’上游碱基组成对HIF-1结合的特异性和亲和性也非常重要。DNA足迹研究还提示了5’上游区域可能对HIF-1诱导的基因表达非常重要。因此，我们设计和测试了有不同序列和不同长度的5’旁侧区的候选诱骗物分子。
初始HIF-1a诱骗物分子的序列基于从已公开的对HIF-1结合的研究，已有HIF-1核心结合序列、计算学核心结合阵列、有关bHLH家族的晶体结构模型，以及特定生物信息学方法(用于排除那些可能结合到其他转录因子的诱骗物分子)获得的知识，我们得到一组诱骗物分子进行初筛(见表5)。这些诱骗物分子包括″突变诱骗物分子″、″拼凑诱骗物分子″，5’或3’端长度不同的诱骗物分子，以及在核心区或旁侧有替代碱基组成的诱骗物分子。
表5.用于筛选的初始序列
上面表5中连在一起列出的序列(例如801/802；803/804等)是互补的，它们构成一个双链寡核苷酸诱骗物分子的两条链。例如，HIF诱骗物分子，HIF-1诱骗物分子895896H3具有上链-CAC CAG CGT ACG TGC CTC*A*G*G(SEQ ID NO340)和互补链-CCT GAG GCA CGT ACG CTG*G*T*G(SEQ ID NO341)。
利用TransAM Kit进行的初筛为了评定所述寡核苷酸对含HIF-1α复合体的相对亲和性，使用了HIF-1TransAM分析法(Active Motif，Catalog#47096)。分析按照厂商的使用说明进行。简单来说，将含有低氧反应元件(HRE)的双链寡核苷酸固定到96孔板上。将含有HIF-1α复合体的核提取物与固定的寡核苷酸保温并使之进行结合。洗去未结合物质，用特异识别HIF-1α的抗体检测结合了的HIF-1α。抗HIF-1α抗体借助标记辣根过氧化物酶(HRP)的二级抗体来检测，利用比色底物反应测量每个孔中的HRP量，并用微孔板分光光度计读数。
我们测定了候选诱骗物分子竞争HIF-1α结合固定在微孔板上的HRE元件的能力，并进行了比较来获知其相对结合亲和性。以逐渐增加的摩尔比率(相对固定在微孔板上的寡核苷酸)加入候选诱骗物分子来竞争结合含HIF-1α的复合体。检测中加入的诱骗物分子的量包括0.625、1.25、2.5、5、10和20皮摩。与对HIF-1α亲和性低的诱骗物分子相比，含有以高亲和性结合HIF-1α的竞争诱骗物分子的微孔会给出更低的吸光度读数。然后将所有潜在诱骗物分子进行比较并排序以便评定它们的相对结合亲和性。
TransAM结果分析筛选是用不同诱骗物分子浓度进行的。对于每个UV吸光读数，通过计算样品与野生型对照的吸光读数的比率来做归一化。结果总结于表6。比率越高表示与野生型对照相比，其竞争结合HIF-1α的能力越低。比率越低(低于1.0或接近1.0)代表结合更强或竞争力更强。
表6
(1)比较紧靠5’的序列表明，GCAG或GGAG或GCAT或CCCT或CCGT的碱基组成会造成比野生型诱骗物分子弱(例如比率更高)的竞争力。
(2)如果我们将比率进行整理，那些竞争力强(例如比率较低)的诱骗物分子多数在位点“-4”和“-1”都分别是碱基“G”和碱基“T”(图29)。对较好的竞争诱骗物分子，其紧靠核心序列(ACGTG；SEQ ID NO336)之前的4个碱基更可能是“GCGT”(SEQ ID NO337)(图29)。图29还提示了位点“-4”是“G”和位点“-1”也是“G”的组合对结合亲和性并没有帮助，位点“-3”是“A”和位点“-2”是“A”的组合同样是这样。
通过EMSA进行的证实如下进行HIF-1凝胶变动实验(EMSA)。用T4多核苷酸激酶(Promega)将含有共有HIF-1结合位点的双链寡核苷酸末端标记上γ32P-ATP。1微克由LPS刺激的THP-1细胞(人单核细胞细胞系)制备得到的核提取物与35pmol放射标记的探针，在有或没有竞争性未标记HIF-1双链寡核苷酸(dsODN)或拼凑dsODN的情况下保温。保温于室温下，在包含10mM Tris-HCl pH8、100mM KCl、5mM MgCl2、2mM DTT、10％甘油、0.1％NP-40、0.025％BSA和1μg Poly-dIdC的20μl反应体系中进行30分钟。将反应体系上样到6％聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳并干燥。将干燥好的胶显影，并用Typhoon8600 PhosphorImager(Amersham)和ImageQuant软件定量。复合体中含有的结合了放射标记寡核苷酸探针的HIF-1蛋白的身份，是通过在加入放射标记探针前，将反应与HIF-1家族每个成员的特异抗体预先保温5分钟来鉴定的。
挑选出来的诱骗物分子的结合能力通过常规EMSA方法得到证实。
说明书全文引用的所有参考文献都引入本文作参考。
尽管在解释本发明时借助了一些特定实施方案，但发明并非局限于此。对本领域技术人员来说，很显然可以在不偏离本发明的想法的情况下对其进行改进和变动。所有这类改进和变动都明确地属于本文的范围。
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<120>多核苷酸的递送<130>39753-0027<140>TO BE ASSIGNED<141>2005-09-21<150>US 60/612,046<151>2004-09-21<150>US 60/663,497<151>2005-03-18<160>341<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>诱骗物分子<220>
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<221>misc_feature<222>(7)...(8)<223>y＝嘧啶<400>1gggrnnyycc 10<210>2<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>2gggactttcc 10<210>3<211>5<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>3gggac 5<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>4ctagatttcc cgcggatc18<210>5<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>5gggactttcc 10<210>6<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>6ccttgaatcc 10<210>7<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>7ggggactttc c 11<210>8<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>8atgt 4<210>9<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>9ggggactttc cc 12
<210>10<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>10tctc 4<210>11<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>11gggatttcc 9<210>12<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>12ctctgt 6<210>13<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>13ggactttcc 9<210>14<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>14ctctca 6<210>15<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>15gactttcc 8<210>16<211>4<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>16cttc 4<210>17<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>17gactttccc 9<210>18<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>18tcca 4<210>19<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>19ggatttcc 8<210>20<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>20agttgaaggc 10<210>21<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>21ggatttccc 9<210>22<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>22ttgaaggc 8
<210>23<211>7<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>23gatttcc7<210>24<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>24gatttccc 8<210>25<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>25ggactttccc 10<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>26agttgagggg actttcccag gc 22<210>27<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>27ctcggacttt cctgt 15<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>28agttgaggga tttccaggc 19<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>29agttgaggac tttcccaggc 20<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>30agttgaggac tttccaggc 19<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>31agttgaggat ttcccaggc 19<210>32<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>32tcggactttc cctc14<210>33<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>33atggactttc cgt 13<210>34<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>34tcggatttcc tc 12<210>35<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>35
tcggactttc ctc 13<210>36<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>36ttgaggactt tccaggc 17<210>37<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>37tcgggacttt cctc14<210>38<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>38agttgaggat ttccaggc18<210>39<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>39tgaggacttt ccaggctc18<210>40<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>40tgaggacttt ccaggc 16<210>41<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>41ttgcggactt tccaggc 17<210>42<211>14<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>42ctgggacttt cctc14<210>43<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>43gttgagggac tttccagg18<210>44<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>44ctcgggactt tcctgt 16<210>45<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>45tcggggactt tccctc 16<210>46<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>46cagtagtatg tgagcctgc 19<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>47ttgccgtacc tgacttagcc 20<210>48<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>48agttgagggg actttcccag gc 22<210>49<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>49tcgggatttc ctc 13<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>50agttgaggga ctttccaggc 20<210>51<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>51agttgagact ttccaggc18<210>52<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>52agttgagact ttcccaggc 19<210>53<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>53ggactttcc 9<210>54<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>54aggactttcc a 11<210>55<211>13
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>55ctggactttc ctc 13<210>56<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>56aagaggactt tccagag 17<210>57<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>57atat ggactt tcctt aa 17<210>58<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>58caacggactt tccacac 17<210>59<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>59cagtggactt tccactg 17<210>60<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>60tcgactttcc ctc13<210>61<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>61ctggggactt tccctc 16<210>62<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>62tcggatttcc ctc 13<210>63<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>63tcgatttcct c 11<210>64<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>64tcgatttccc tc 12<210>65<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>65ctcggggact ttccctca18<210>66<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>66ctcggacttt cctca 15<210>67<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>67ttgaggattt ccaggc 16<210>68
<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>68ttgaggattt ccaggct 17<210>69<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>69ttgaggattt ccaggctc18<210>70<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>70tgaggacttt ccagg 15<210>71<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>71gaggactttc cag 13<210>72<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>72gttgaggact ttccaggc18<210>73<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>73gaggactttc caggc 15<210>74<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>74aggactttcc aggc14<210>75<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>75aggactttcc aggctc 16<210>76<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>76ttgaggactt tccaggctc 19<210>77<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>//ctcggggact ttccctgt18<210>78<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>78aggactttcc a 11<210>79<211>7<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>79ccttgaa 7<210>80<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>80agttga 6
<210>81<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>81ttga 4<210>82<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>82agttgc 6<210>83<211>5<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>其有核酸序列<400>83gttga 5<210>84<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>84aaga 4<210>85<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>85atat 4<210>86<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>86caac 4<210>87<211>4<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>87cagt 4<210>88<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>88aggc 4<210>89<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>89agag 4<210>90<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>90ttaa 4<210>91<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>91acac 4<210>92<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>92actg 4<210>93<211>5<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>93aggct 5
<210>94<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>94ctagatttcc cgcg14<210>95<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>95taaagggcgc ctag14<210>96<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>96ctagatttcc cgcggatc18<210>97<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>97gatctaaagg gcgcctag18<210>98<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>98tccagcttcg tagc14<210>99<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>99gaaggatcga tcg 13<210>100<211>8<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>100tttsgcgs 8<210>101<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>101tttggcgc 8<210>102<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>102tttcgcgc 8<210>103<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>103tttcccgc 8<210>104<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>104tttgccgc 8<210>105<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>105cttcccgc 8<210>106<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>106
gttcccgc 8<210>107<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>107cttcgcgc 8<210>108<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>108ttagcgcc 8<210>109<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>109tgagcgcc 8<210>110<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>110gtagcgcc 8<210>111<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>111ggagcgcc 8<210>112<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>112ctagcgcc 8<210>113<211>8<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>113cgagcgcc 8<210>114<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>114gttcgcgc 8<210>115<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>115tttgcgcc 8<210>116<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>116tgtgcgcc 8<210>117<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>117gttgcgcc 8<210>118<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>118ggtgcgcc 8<210>119<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>119cttgcgcc 8<210>120<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>120cgtgcgcc 8<210>121<211>7<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>121tttccgg7<210>122<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>122tttcgcgg 8<210>123<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>123gttggcgc 8<210>124<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>124cttggcgc 8<210>125<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>125cttgccgc 8<210>126<211>8
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>126gttgccgc 8<210>127<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>127tttggcgg 8<210>128<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>128ttaccgcc 8<210>129<211> 8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>129tgaccgcc 8<210>130<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>130gtaccgcc 8<210>131<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>131ggaccgcc 8<210>132<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>132ctaccgcc 8<210>133<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>133cgaccgcc 8<210>134<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>134tttccgcc 8<210>135<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>135tgtccgcc 8<210>136<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>136gttccgcc 8<210>137<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>137ggtccgcc 8<210>138<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>138cttccgcc 8<210>139
<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>139cgtccgcc 8<210>140<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>140cttcccgg 8<210>141<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>141tttgccgg 8<210>142<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>142gttcccgg 8<210>143<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>143cttcgcgg 8<210>144<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>144tttgcgcg 8<210>145<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>145ttagcgcg 8<210>146<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>146tgtgcgcg 8<210>147<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>147tgagcgcg 8<210>148<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>148gttgcgcg 8<210>149<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>149gtagcgcg 8<210>150<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>150ggtgcgcg 8<210>151<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<220>
<221>不确定<222>11
<223>n＝未知的<400>151tttsgcgcgm nr 12<210>152<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>152gttggcgg 8<210>153<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>153gttcgcgg 8<210>154<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>154gttcgcgg 8<210>155<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>155tttcccgg 8<210>156<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>156cttgccgg 8<210>157<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>157gttgccgg 8
<210>158<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>158tgtcgcgc 8<210>159<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>159cttcccgg 8<210>160<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>160cgtcgcgc 8<210>161<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>161ggtcgcgc 8<210>162<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>162tttcgggc 8<210>163<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>163tgtggcgc 8<210>164<211>8<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>164tgtcgcgg 8<210>165<211>5<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>165acgtg 5<210>166<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>166gtgtgctccc agtcagtcaa tcctcacgtt tatgatggat gaatgaaggc ag 52<210>167<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>167ttgtgttatt agtcaccaac aggcaacgtg cagccggaga taaggccag 49<210>168<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>168atccccccgc ccacagagag gacgtgccac gccagcacgt ccgctctcct tgccag 56<210>169<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>169tgtgctccca gtcagtcaat cctcacgttt atgatggatg aatgaaggca gtcaggt 57<210>170<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>170gtgatgaaag agcacaaacg ggtgacaaac gtgtctagcg tgattcatca tgaacaggca 60
ca 62<210>171<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>171tgcttggtaa actgtaaaat gattagcata cgtgaagcgt tagtgtgctc cctggca 57<210>172<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>172gagcgagccg ctgggtgcag gcaggcgacg tgctgccggg ctaggctgcc cgggggagat 60ga 62<210>173<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>173gtggtccgag tcacgtccga ggggg25<210>174<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>174cttcacgtgc ggggaccagg gaccgt 26<210>175<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>175cgcaggcgca ggcggcgcac gtggcc 26<210>176<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>176gagtgcgtgc gggactcgga gtacgtgacg gagccccgag ctctcatgcc 50<210>177<211>53
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>177ggggccccag agcgacgctg agtgcgtgcg ggactcggag tacgtgacgg agc 53<210>178<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>178gcaaggtcga gggccggacg tggggcccca gagcgacgct gagtgcgtgc gg 52<210>179<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>179ggggcgtgag cggggctgct gcagacgtgc gtgtgggtca tgggggctgc tc 52<210>180<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>180gccctacgtg ctgtctcaca cagcctgtct gacctctcga cct43<210>181<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>181ctccggctgc acgttgcctg 20<210>182<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>182atggagacat aattgaggaa caacgtggaa ttagtgtcat agcaaatgat ctagg 55<210>183<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>183gagcggacgt gctggcgtgg cacgtcctct c 31<210>184<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>184gacgcccgcc cccggcccag cctacacgtg ggttcccgca cgtccgctgg g 51<210>185<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>185cgtcagagtg ggagcccagc ggacgtgcgg gaacccacgt gtaggctggg c 51<210>186<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>186gtgactacgt gctgcctagg ggccactgcc 30<210>187<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>187cctgaatgct cttacacacg tacacacaca gagcagc 37<210>188<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>188ccgggtagct ggcgtacgtg ctgcag 26<210>189<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>189ccttgcggtt cgcggcgtgc cggacgtgac aaacggaagc cgcacgtctc acta54<210>190
<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>190ccttgcggtt cgcggcgtgc cggacgtgac aaacggaagc cgcacgtctc acta54<210>191<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>191ctgccagtgc acgtcagtgg 20<210>192<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>192gcccggccgc tgtcaccggg caggagagaa cgttgcttac gtgcgcccgg agtccattgg 60ccaaggcggg cc 72<210>193<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>193aaggccctgg gtccacaggc gtgccgtctg acacgcatca ggcaggcact c 51<210>194<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>194ccatttctag ggccttgggt ccacaggcgt gctggctgac acgcatcagg ccg 53<210>195<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>195ttcctgcacg tacacacaaa gcgcacgtat ttc 33<210>196<211>61<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>196tcagagcacc tcgcgagcgt acgtgcctca ggaagtgacg cacagccccc ctgggggccg 60g 61<210>197<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>197gggttttgcc agactccaca gtgcatacgt gggctccaac aggtcctctt ccctcccagt 60cactg 65<210>198<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>198gccctacgtg ctgtctca18<210>199<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>199tgagacagca cgtagggc18<210>200<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>200ctgtcctccg actgcatg18<210>201<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>201catgcagtcg gaggacag18<210>202<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>202cccctcggac gtgactcgga ccac 24<210>203<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>203gtggtccgag tcacgtccga ggggg25<210>204<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>204tctgtacgtg accacactca cctc 24<210>205<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>205gaggtgagtg tggtcacgta caga 24<210>206<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>其有核酸序列<400>206agggccggac gtggggcccc 20<210>207<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>207ggggccccac gtccggccct 20<210>208<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>208acgctgagtg cgtgcgggac 20<210>209<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>209gtcccgcacg cactcagcgt 20<210>210<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>210gccctacgtg ctgtctcaca cagc 24<210>211<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>211gctgtgtgag acagcacgta gggc 24<210>212<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>212gtgagacgtg cggcttccgt ttg 23<210>213<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>213caaacggaag ccgcacgtct cac 23<210>214<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>214ctgccgacgt gcgctccgga g21<210>215<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>215ctccggagcg cacgtcggca g21<210>216<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>216gaaatacgtg cgctttgtgt gtacgtgcag gaa 33<210>217<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>217ttcctgcacg tacacacaaa gcgcacgtat ttc 33<210>218<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>218cgcgagcgta cgtgcctcag g21<210>219<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>219cctgaggcac gtacgctcgc g21<210>220<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>220tgcatacgtg ggctccaaca g21<210>221<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>221ctgttggagc ccacgtatgc a21<210>222
<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>222aggagacgtg cgagaa 16<210>223<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>223ttctcgcacg tctcct 16<210>224<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>224aggttacgtg cggaca 16<210>225<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>225tgtccgcacg taacct 16<210>226<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>226aggagacgtg ctgcct 16<210>227<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>227aggcagcacg tctcct 16<210>228<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>228tccaatacgt gcagtact18<210>229<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>229agtactgcac gtattgga18<210>230<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>230tccaatgcgt gcagtact18<210>231<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>231agtactgcac gcattgga18<210>232<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>232ggccagacgt gccaccgg18<210>233<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>233ccggtggcac gtctggcc18<210>234<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>234aggcaacgtg cagccg 16
<210>235<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>235cggctgcacg ttgcct 16<210>236<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>236aggcaatacg cagccg 16<210>237<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>237cggctgcgta ttgcct 16<210>238<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>238agcggacgtg cagaagttgc acgtcctct29<210>239<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>239agaggacgtg caacttctgc acgtccgct29<210>240<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>240gtgcatacgt gggctcca18<210>241<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>241tggagcccac gtatgcac18<210>242<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>242gagcgtacgt gcctcagg18<210>243<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>243cctgaggcac gtacgctc18<210>244<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>244ggaacaacgt ggaattag18<210>245<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>245ctaattccac gttgttcc18<210>246<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>246gcctacacgt gggttccc18<210>247<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>247gggaacccac gtgtaggc 18
<210>248<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>248cggagtacgt gacggagc18<210>249<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>249gctccgtcac gtactccg18<210>250<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>250ttgcttacgt gcgcccgg18<210>251<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>251ccgggcgcac gtaagcaa18<210>252<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>252gtgtgtacgt gcaggaaa18<210>253<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>253tttcctgcac gtacacac18<210>254<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>254gcggacgtgc gggaacccac gtgtagg 27<210>255<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>255cctacacgtg ggttcccgca cgtccgc 27<210>256<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>256accgtacgtg ctgatc 16<210>257<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>257gatcagcacg tacggt 16<210>258<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>258ctaatacgtg ccgctg 16<210>259<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>259cagcggcacg tattag 16<210>260<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>260
agcagacgtg caggat 16<210>261<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>261atcctgcacg tctgct 16<210>262<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>262agcagacgtg caggca 16<210>263<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>263tgcctgcacg tctgct 16<210>264<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>264tccgtacgtg ctgcac 16<210>265<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>265gtgcagcacg tacgga 16<210>266<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>266agcagacgtg cagggt 16<210>267<211>16<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>267accctgcacg tctgct 16<210>268<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>268accgtacgtg ctgcca 16<210>269<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>269tggcagcacg tacggt 16<210>270<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>270tccgtacgtg ctgcgt 16<210>271<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>271acgcagcacg tacgga 16<210>272<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>272tgcagacgtg caggtc 16<210>273<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>273gacctgcacg tctgca 16<210>274<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>274accgtacgtg ctgcta 16<210>275<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>275tagcagcacg tacggt 16<210>276<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>276ggctgctgca gacgtgcagg tc 22<210>277<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>277gacctgcacg tctgcagcag cc 22<210>278<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>278ggctgcagga gacgtggaga a21<210>279<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>279ttctccacgt ctcctgcagc c21<210>280<211>16
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>280agaagacgtg caggat 16<210>281<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>281atcctgcacg tcttct 16<210>282<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>282tacagacgtg caggtc 16<210>283<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>283gacctgcacg tctgta 16<210>284<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>284ggctgcaccg tacgtgctga tc 22<210>285<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>285gatcagcacg tacggtgcag cc 22<210>286<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列
<400>286tgcatacgtg caggtc 16<210>287<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>287gacctgcacg tatgca 16<210>288<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>288ggctgctgca tacgtgcagg tc 22<210>289<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>289gacctgcacg tatgcagcag cc 22<210>290<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>290gccctacgtg ctgtctca18<210>291<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>291ctgtcctccg actgcatg18<210>292<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>292ccccctcgga cgtgactcgg accac25<210>293
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>293tctgtacgtg accacactca cctc 24<210>294<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>294agggccggac gtggggcccc 20<210>295<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>295acgctgagtg cgtgcgggac 20<210>296<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>296gccctacgtg ctgtctcaca cagc 24<210>297<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>297gtgagacgtg cggcttccgt ttg 23<210>298<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>298ctgccgacgt gcgctccgga g21<210>299<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>299gaaatacgtg cgctttgtgt gtacgtgcag gaa 33<210>300<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>300cgcgagcgta cgtgcctcag g21<210>301<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>301tgcatacgtg ggctccaaca g21<210>302<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>302aggagacgtg cgagaa 16<210>303<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>303aggttacgtg cggaca 16<210>304<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>304aggagacgtg ctgcct 16<210>305<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>305tccaatacgt gcagtact18
<210>306<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>306tccaatgcgt gcagtact18<210>307<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>307ggccagacgt gccaccgg18<210>308<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>308aggcaacgtg cagccg 16<210>309<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>309aggcaatacg cagccg 16<210>310<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>310agcggacgtg cagaagttgc acgtcctct29<210>311<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>311gtgcatacgt gggctcca18<210>312<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>312gagcgtacgt gcctcagg18<210>313<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>313ggaacaacgt ggaattag18<210>314<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>314gcctacacgt gggttccc18<210>315<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>315cggagtacgt gacggagc18<210>316<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>316ttgcttacgt gcgcccgg18<210>317<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>317gtgtgtacgt gcaggaaa18<210>318<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>318gcggacgtgc gggaacccac gtgtagg 27
<210>319<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>319accgtacgtg ctgatc 16<210>320<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>320ctaatacgtg ccgctg 16<210>321<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>321agcagacgtg caggat 16<210>322<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>322agcagacgtg caggca 16<210>323<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>323tccgtacgtg ctgcac 16<210>324<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>324agcagacgtg cagggt 16<210>325<211>16<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>共有核酸序列<400>325accgtacgtg ctgcca 16<210>326<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>326tccgtacgtg ctgcgt 16<210>327<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>327tgcagacgtg caggtc 16<210>328<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>328accgtacgtg ctgcta 16<210>329<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>329ggctgctgca gacgtgcagg tc 22<210>330<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>330ggctgcagga gacgtggaga a21<210>331<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>331
agaagacgtg caggat 16<210>332<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>332tacagacgtg caggtc 16<210>333<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>333ggctgcaccg tacgtgctga tc 22<210>334<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>334tgcatacgtg caggtc 16<210>335<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>335ggctgctgca tacgtgcagg tc 22<210>336<211>5<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>336acgtg 5<210>337<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>337gcgt 4<210>338<211>18<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>338gccctacgtg ctgtctca18<210>339<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>339tgagacagca cgtagggc18<210>340<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>340caccagcgta cgtgcctcag g21<210>341<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>共有核酸序列<400>341cctgaggcac gtacgctggt g2权利要求
1.一种向细胞递送多核苷酸的方法，所述方法包含令生物膜与一种制剂进行接触，该制剂含有所述多核苷酸、至少一种总重量浓度约0.3％到约10％的渗透增强剂、以及重量浓度约1％到约60％的醇。
2.一种向细胞递送多核苷酸的方法，所述方法包含令生物膜与一种基于乳剂的制剂进行接触，该制剂含有所述多核苷酸、至少一种总重量浓度约0.2％到约10％的渗透增强剂、以及水，其中所述渗透增强剂选自月桂醇醚硫酸钠、N-月桂酰肌氨酸、失水山梨醇单月桂酸酯20(Span 20)和十四烷酸异丙酯。
3.权利要求1或2的方法，其中所述多核苷酸是寡核苷酸。
4.权利要求3的方法，其中所述细胞来自哺乳动物。
5.权利要求4的方法，其中所述哺乳动物是人。
6.权利要求3的方法，其中所述生物膜是皮肤或粘膜。
7.权利要求3的方法，其中所述渗透增强剂是阴离子表面活性剂。
8.权利要求7的方法，其中所述阴离子表面活性剂是烷基硫酸盐或烷基乙醚硫酸盐。
9.权利要求8的方法，其中所述阴离子表面活性剂是月桂基硫酸钠或月桂醇醚硫酸钠。
10.权利要求3的方法，其中所述渗透增强剂是N-月桂酰肌氨酸。
11.权利要求3的方法，其中所述渗透增强剂是失水山梨醇单月桂酸酯20(Span 20)。
12.权利要求3的方法，其中所述制剂包含重量约0.4％到约10％的所述渗透增强剂。
13.权利要求3的方法，其中所述制剂包含重量约0.8％的所述渗透增强剂。
14.权利要求13的方法，其中所述渗透增强剂是月桂醇醚硫酸钠。
15.权利要求3的方法，其中所述制剂包含重量约0.6％的所述渗透增强剂。
16.权利要求15的方法，其中所述渗透增强剂是N-月桂酰肌氨酸。
17.权利要求3的方法，其中所述制剂包含重量约0.4％的所述渗透增强剂。
18.权利要求17的方法，其中所述渗透增强剂是失水山梨醇单月桂酸酯20(Span 20)。
19.权利要求3的方法，其中所述醇是乙醇。
20.权利要求3的方法，其中所述制剂包含重量约1％到约50％的醇。
21.权利要求3的方法，其中所述制剂是水性制剂。
22.权利要求21的方法，其中所述水性制剂是基于凝胶的水性制剂。
23.权利要求22的方法，其中所述基于凝胶的水性制剂包含重量约0.8％的月桂醇醚硫酸钠。
24.权利要求23的方法，其中所述基于凝胶的水性制剂进一步包含重量约5％的乙醇。
25.权利要求23的方法，其中所述基于凝胶的水性制剂进一步包含重量约10％的乙醇。
26.权利要求23的方法，其中所述基于凝胶的水性制剂进一步包含重量约20％的乙醇。
27.权利要求23的方法，其中所述基于凝胶的水性制剂进一步包含重量约49％的乙醇。
28.权利要求3的方法，其中所述制剂是含脂质体的制剂。
29.权利要求28的方法，其中所述含脂质体的制剂包含重量约0.8％的月桂醇醚硫酸钠。
30.权利要求28的方法，其中所述含脂质体的制剂进一步包含重量约10％的乙醇。
31.权利要求28的方法，其中所述含脂质体的制剂进一步包含重量约5％的乙醇。
32.权利要求28的方法，其中所述含脂质体的制剂进一步包含重量浓度约2.5％的乙醇。
33.权利要求28的方法，其中所述含脂质体的制剂包含重量约0.6％的N-月桂酰肌氨酸。
34.权利要求33的方法，其中所述含脂质体的制剂进一步包含重量约0.4％的失水山梨醇单月桂酸酯20(Span 20)。
35.权利要求34的方法，其中所述含脂质体的制剂进一步包含重量约5％的乙醇。
36.权利要求3的方法，其中所述基于乳剂的制剂包含重量约0.8％的所述月桂醇醚硫酸钠。
37.权利要求3的方法，其中所述基于乳剂的制剂包含重量约0.35％的所述月桂醇醚硫酸钠。
38.权利要求37的方法，其中所述基于乳剂的制剂进一步包含重量约0.15％的1-苯基哌嗪。
39.权利要求3的方法，其中所述基于乳剂的制剂包含重量约0.6％的N-月桂酰肌氨酸。
40.权利要求39的方法，其中所述基于乳剂的制剂进一步包含重量约0.4％的失水山梨醇单月桂酸酯20(Span 20)。
41.权利要求3的方法，其中所述基于乳剂的制剂进一步包含重量约10％的十四烷酸异丙酯。
42.权利要求3的方法，其中所述基于乳剂的制剂进一步包含HPMC4000cps、硬脂酸聚氧乙烯(40)酯、单硬脂酸甘油酯、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
43.权利要求3的方法，其中所述寡核苷酸是双链寡核苷酸(dsODN)分子。
44.权利要求43的方法，其中dsODN分子的第一链与第二链至少部分互补。
45.权利要求43的方法，其中dsODN分子的第一链与第二链完全互补。
46.权利要求43的方法，其中dsODN分子包含至少一个单链突出端。
47.权利要求43的方法，其中dsODN分子包含的两条寡核苷酸链在3′或5′端、或者两端共价连接在一起，从而形成哑铃结构或成为环形分子。
48.权利要求43的方法，其中dsODN分子具有磷酸二酯骨架、硫代磷酸酯骨架、或磷酸二酯-硫代磷酸酯混合骨架。
49.权利要求43的方法，其中dsODN分子的所述第一和第二链仅通过Watson-Crick碱基配对连在一起。
50.权利要求43的方法，其中dsODN至少15个碱基对长。
51.权利要求43的方法，其中dsODN分子包含能特异结合转录因子的序列。
52.权利要求51的方法，其中所述转录因子选自E2F、AP-1、AP-2、HIF-1和NFκB。
53.权利要求52的方法，其中所述dsODN分子能够特异结合NFκB转录因子。
54.权利要求52的方法，其中dsODN分子与所述E2F转录因子的结合亲和性至少是所述参照分子与该转录因子结合亲和性的约10倍。
55.权利要求52的方法，其中dsODN分子能够特异结合HIF-1转录因子。
56.治疗哺乳动物受试者炎性疾病或病症的药物组合物，其包含权利要求1-55任何一项所描述的制剂。
57.权利要求56的药物组合物，其中所述寡核苷酸是能特异结合NFKB转录因子的双链寡核苷酸(dsODN)分子。
58.权利要求57的药物组合物，其中所述dsODN分子在整个制剂中的重量浓度为约0.1％到1.0％。
59.权利要求57的药物组合物，其中所述dsODN分子在整个制剂中的重量浓度为约0.1％。
60.权利要求57的药物组合物，其中所述dsODN分子在整个制剂中的重量浓度为约0.25％。
61.权利要求57的药物组合物，其中所述dsODN分子在整个制剂中的重量浓度为约0.5％。
62.权利要求57的药物组合物，其中所述寡核苷酸是能特异结合HIF-1转录因子的双链寡核苷酸(dsODN)分子。
63.权利要求57的药物组合物，其中所述炎性疾病或病症是皮肤炎症或皮肤癌。
64.权利要求63的药物组合物，其中所述疾病或病症与急性或慢性皮肤炎症相关。
65.权利要求63的药物组合物，其中所述皮肤癌是基底细胞癌(BCC)、鳞状细胞癌(SCC)或黑素瘤。
66.权利要求57的药物组合物，其中所述疾病或病症选自异位性皮炎、接触性皮炎、脂溢性皮炎、银屑病、酒糟鼻、湿疹、痤疮、脱发病、愈合伤口和疤痕组织。
67.权利要求66的药物组合物，其中所述病症是异位性皮炎。
68.权利要求66的药物组合物，其中所述病症是银屑病。
69.权利要求57的药物组合物，其中所述哺乳动物受试者是人。
全文摘要
本发明涉及向细胞非亲本地递送核酸分子的方法和制剂。具体来说，本发明涉及增强多核苷酸和寡核苷酸跨生物膜转运的方法和制剂。
文档编号A61K48/00GK101060864SQ200580039741
公开日2007年10月24日 申请日期2005年9月21日 优先权日2004年9月21日
发明者玛亚·达吉, 罗尔夫·埃尔哈特, 汉斯·霍夫兰德, 莱斯利·麦克沃伊, 托尼·马奇默尔, 布莱恩·B·施利弗 申请人:阿尼西瓦股份有限公司