专利名称：手掌参提取物及在制备治疗肺纤维化药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药技术领域，涉及一种中药提取物及其在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
背景技术：
肺纤维化是以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征的疾病。多种因素如细菌、粉尘、放射性物质、创伤以及药物均可引起肺纤维化。由于肺纤维化发病率高，治愈率低，目前缺乏有效的治疗药物而成为严重危害人民健康的疾病。如可以引起肺纤维化的疾病尘肺病是我国的一种主要职业病，自上世纪50年代以来我国累计报告尘肺病例58万多人，已死亡14万多人，现患者44万多人。近年来尘肺病的流行呈现出群发性、低龄化以及致残率高的新特点，2001年-2003年我国每年新发尘肺病患者1万例左右，因此造成的直接经济损失达90多亿，间接损失难以计数。又如2003年造成影响全国的突发性事件的非典型肺炎SARS，也可以引起患者的肺纤维化。总之，随着我国工业化的进程，环境污染的加剧，各种原因造成的呼吸系统疾病的发病率逐年提高，多数会转归为肺纤维化，对我国国民经济和社会发展造成了很大的影响。目前，临床上用于治疗的肺纤维化的药物存在副作用大，疗效差等缺点，开发治疗肺纤维化的新药非常迫切和重要。
手掌参属兰科多年生草本植物的块茎，味甘微苦，性平，入肺、脾经，有补益气血、生津止渴、收敛止血等多种功效。现代药理研究表明手掌参含有多糖、甙类、菲类和芪类等多种活性成分，具有抗炎、抗过敏和免疫调节等多种药理作用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种手掌参提取物。
本发明的第二个目的是提供一种手掌参提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下一种手掌参提取物，用下述方法制成将手掌参生药粉碎后过筛，用所述手掌参生药粉重量4-10倍的体积百分比浓度为50～70％乙醇水溶液浸泡18-30小时后，加热回流提取0.5-3小时，过滤，所述提取次数为1-3次，合并滤液，滤液减压浓缩至50℃时相对密度为1.05-1.2，即制成一种手掌参提取物。
所述乙醇水溶液的加入量为手掌参生药粉重量的8倍，所述乙醇水溶液的浓度为60％。
所述手掌参生药粉的浸泡时间为24小时。
权利要求1-3之一的手掌参提取物，在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
本发明的优点是经实验证明手掌参提取物对实验性矽肺具有一定的治疗作用，提示手掌参提取物在其它肺部纤维化病变也具有使用价值。
图1手掌参醇提物对染矽尘大鼠不同时间点肺组织形态的影响(HE染色，×100)；图2手掌参醇提物对染矽尘大鼠不同时间点肺组织I、III胶原合成的影响(天狼猩红染色，×200)。
具体实施例方式
实施例1一种手掌参提取物，用下述方法制成将手掌参生药粉碎后过筛，用所述手掌参生药粉重量8倍的体积百分比浓度为60％乙醇水溶液浸泡24小时后，加热回流提取2小时，过滤，提取2次，合并滤液，滤液减压浓缩至50℃时相对密度为1.05，即制成一种手掌参提取物。
实施例2一种手掌参提取物，用下述方法制成将手掌参生药粉碎后过筛，用所述手掌参生药粉重量4倍的体积百分比浓度为70％乙醇水溶液浸泡18小时后，加热回流提取3小时，过滤，提取1次，合并滤液，滤液减压浓缩至50℃时相对密度为1.2，即制成一种手掌参提取物。
实施例3一种手掌参提取物，用下述方法制成将手掌参生药粉碎后过筛，用所述手掌参生药粉重量10倍的体积百分比浓度为50％乙醇水溶液浸泡30小时后，加热回流提取0.5小时，过滤，提取3次，合并滤液，滤液减压浓缩至50℃时相对密度为1.1，即制成一种手掌参提取物。
各种肺间质疾病(如矽肺)，胶原性疾病所致的肺纤维化导致的肺间质纤维化改变病理过程相似从肺泡炎开始，在发展和过度修复过程中导致肺纤维化。本发明采用大鼠气管暴露法注入矽尘(50mg/只)造成矽肺动物模型，随机将大鼠分为四组，即对照组、染矽尘组、手掌参治疗组、阳性药对照组，大鼠染尘24小时后各治疗组开始灌胃给药(手掌参组每天给予手掌参醇提物8g/kg，阳性药组隔日给予汉防己甲素50mg/kg)，观察时间点为7天、14天、21天、28天、60天。在各时间点，动物在麻醉状态下解剖后腹主动脉取血及摘取肺脏，作病理和生化分析。主要指标包括脏器系数；天狼猩红染色观测I III胶原合成；丙二醛含量；超氧化物歧化酶活力；谷胱甘肽过氧化物酶活力；常规HE染色观测肺病理变化。结果显示矽肺组和治疗组在上述指标上都存在显著性差异，与传统的抗矽肺药物汉防己甲素疗效相当。从而，证实了本发明的手掌参提取物可有效用于抗肺纤维化的治疗。
利用本发明的一种手掌参提取物与药学上可接受的载体，制成各种剂型，如颗粒剂、片剂、胶囊、丸剂和液体药剂等形式口服给药。
实施例4本发明手掌参提取物的药效学试验材料和方法材料1动物 清洁级Wistar大鼠160只，雄性，体重200-240g，购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。
2试剂 SiO2购于美国Sigma公司，纯度99％，粒子大小范围在0.5-10μm，80％的粒子直径在1-5μm之间，用生理盐水配成50g/L混悬液，经高压蒸汽灭菌后备用；天狼猩红购于Mobay化学试剂公司；MDA、SOD和GHS-Px试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
3药物 手掌参购于西藏药品公司，经本校生药教研室鉴定符合药用。用实施例1的方法制备。
方法1实验动物的分组及模型的建立根据随机化原则将160大鼠分为对照组、染矽尘组、手掌参提取物治疗组、阳性药对照组，各40只。经腹腔注射0.4％戊巴比妥麻醉后，于无菌条件下，在大鼠颈部皮肤正中线纵向切口，暴露气管，对照组大鼠气管内注入1ml灭菌生理盐水，染矽尘组、手掌参治疗组和阳性药对照组注入1ml配制好的矽尘混悬液。染尘后第2d，手掌参治疗组按8g·kg-1·d-1灌胃给予用实施例1的方法制备的手掌参提取物，阳性药对照组按50mg·kg-1·3d-1给予汉防己甲素，对照组、染矽尘组给予等容蒸馏水。
2血浆丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶活力(SOD)；谷胱甘肽过氧化物酶活力(GHS-Px)的测定染尘后第7、14、21、28、60d各组分别取8只大鼠，称重后，腹主动脉取血，离心得血浆，采用硫代巴比妥酸显色法测定含量；采用亚硝酸盐形成法测定SOD活力；采用二硝基苯甲酸直接法测定GHS-Px活力。操作步骤均按试剂盒说明书进行。
3肺组织标本的处理 取血后处死大鼠，经右心灌注生理盐水冲洗肺内血液，将整个肺脏从胸腔内取出，剔除气管、支气管等结缔组织，在生理盐水内漂洗一次，记录肉眼病理变化，电子天平称肺重，计算肺系数(肺系数＝肺重/体重)。取左肺中段用10％中性缓冲福尔马林液固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，进行HE染色和天狼猩红染色。
4图象分析 用Nikon E600POL偏振光显微镜观察大鼠肺组织I III型胶原的形成。每组至少观察5只动物，每只动物随机观察一张切片，每张切片随机选取上、中、下、左、右5个视野，摄像并存入计算机，然后用Image-Pro Plus Version 4.5 for windowsTM图像分析系统进行分析。用HIS模式(Hue，Saturation，Intensity)将阳性目标从背景色中分离出来，用阳性区域的面积百分比代表胶原含量。
5统计学处理 所有数值均用x±s表示，在不同时间点四组间的比较用单因素方差分析的LSD法，全部数据的统计学处理均采用SPSS 11.5 for windows统计分析软件。
结果与分析1肺脏器系数染矽尘组大鼠各时间点肺组织脏器系数均高于对照组，在14d、21d、28d、60d有显著性差异(P＜0.01)。与染矽尘组比较，手掌参提取物治疗组肺组织脏器系数在14d、21d、28d、60d时显著降低(P＜0.05)，阳性药对照组在14d、28d、60d时显著降低(P＜0.05)，两组间在各时间点均无显著差异。见表1。
2I、III胶原含量染矽尘组I型胶原面积百分比呈进行性增加，与对照组比较，各时间点都有显著性差异(P＜0.01)；手掌参提取物治疗组各时间点I型胶原面积百分比亦高于对照组，都有显著性差异(P＜0.05)。与染矽尘组比较，手掌参提取物治疗组及阳性药对照组各时间点I型胶原面积百分比低于染矽尘组，差异有显著性(P＜0.01)。表明矽尘能够增加染矽尘大鼠I型胶原的形成，手掌参提取物对矽尘诱导的I型胶原的增加具有抑制作用，作用与阳性药相当。与对照组比较，染矽尘组各时间点III胶原面积百分比都高于对照组，有显著性差异(P＜0.05)；与染矽尘组比较，手掌参提取物及阳性药对照组治疗组各时间点III胶原面积百分比均低于染矽尘组，14d、21d有显著性差异(P＜0.01)。见表2-3。
3血浆丙二醛含量与对照组比较，染矽尘组大鼠各时间点血浆MDA含量显著升高，其中7d、14d、21d、28d时P＜0.01，60d时P＜0.05。手掌参提取物治疗组及阳性药组大鼠各时间点血浆MDA含量均低于染矽尘组，其中7d、14d、21d、28d时有显著性差异(P＜0.05)。见表4。
4血浆超氧化物歧化酶活力及谷胱甘肽过氧化物酶活力与对照组比较，不同时间点染矽尘组大鼠血浆SOD及GSH-PX活力变化相似除在7d时略高外，其余各个时间点均降低。SOD在14d、21d、28d、60d显著降低(P＜0.05)，GSH-PX在14d、21d、28d显著降低((P＜0.05)，其中14d时陡然下降到最低(P＜0.01)然后开始缓慢增加。与染矽尘组比较，手掌参治疗组及阳性药组大鼠血浆SOD及GSH-PX活力从14d开始均不同程度地增高，在14d、21d、28d时有显著性差异(P＜0.05)。见表5-6。
5病理结果5.1HE染色结果对照组，各个时间点肺组织结构基本正常。染矽尘组，注入矽尘后7d，肺泡隔水肿并明显增厚，内有淋巴细胞、单核巨噬细胞侵润，肺泡腔小肉芽肿弥漫存在，并融合成较大的肉芽肿，可发生中心坏死。肉芽肿内伴有成纤维细胞增生、胶原纤维形成和玻璃样变化，出现胶原性结节和纤维化改变，病灶内肺泡腔变小。14d时，肺泡隔仍有较多的淋巴细胞、巨噬细胞及少数中性粒细胞侵润，伴有较多的成纤维细胞和平滑肌细胞增生并平行排列，肺泡壁增厚，可见胶原纤维积聚，肺泡结构破坏，出现斑片状纤维化。细胞结节数量多，体积大。21d时，肺泡间隔断裂现象较严重，肉芽肿大面积纤维化，结节间有灶性肺气肿形成。28d时，肺泡壁显著增厚，肺泡结构大部遭到破坏，部分肺泡腔消失，由胶原纤维和成纤维细胞占据，肺组织广泛纤维化，可见纤维性结节。60d时纤维组织明显增生，形成巨大的纤维性矽结节。手掌参提取物治疗组相应时间点HE染色结果介于与矽尘组与对照组之间，肺泡炎和纤维化有不同程度的减轻。见图1。图1中A7天，对照组；B7天，矽肺组；C7天，手掌参提取物治疗组；D14天，对照组；E14天，矽肺组；F14天，手掌参提取物治疗组；；G21天，对照组；H21天，矽肺组；I21d天，手掌参提取物治疗组；J28天，对照组；K28天，矽肺组；L28天，手掌参提取物治疗组；M60天，对照组；N60天，矽肺组；O60天，手掌参提取物治疗组。
5.2天狼猩红染色镜下观对照组，肺泡隔正常。染矽尘组，7d时，正常肺泡结构被破坏，取而代之的是交织存在的两型胶原I型胶原较粗，呈桔黄、深红色；III型胶原较细，呈淡绿色。14d时，可见弥漫性、淡绿色弯曲的胶原呈网织状存在，其间夹杂少量粗大的桔黄色纤维及矽尘颗粒。21d时，淡绿色胶原进一步增加，桔红色胶原也增加，但相对较少。28d时，粗大的桔红色胶原明显增多，与纤细的淡绿色胶原呈网状交织存在，布满整个视野，其间夹杂矽尘颗粒。60d时，粗大的桔红色胶原进一步增加，纤细的淡绿色胶原较少。手掌参醇提物治疗组在相应时间点的胶原染色介于染矽尘组和对照组之间，两种胶原的数量有不同程度的减少，在28d和60d时，尤为明显。见图2。图2中A7天，对照组；B7天，矽肺组；C7天，手掌参提取物治疗组；D14天，对照组；E14天，矽肺组；F14天，手掌参提取物治疗组；；G21天，对照组；H21天，矽肺组；I21d天，手掌参提取物治疗组；J28天，对照组；K28天，矽肺组；L28天，手掌参提取物治疗组；M60天，对照组；N60天，矽肺组；O60天，手掌参提取物治疗组。
从以上结果表明手掌参提取物可以提高染矽尘大鼠机体抗氧化能力，减少矽尘导致的氧化损伤，抑制矽肺早期的炎症反应和中后期I、III胶原合成的增加。从而，证实了本发明的手掌参提取物可有效用于抗肺纤维化的治疗。
表1 手掌参对染矽尘大鼠不同时间点肺脏器系数的影响(n＝8，x±S，mg/g)
*p＜0.05，**p＜0.01与对照组比较；#p＜0.05，##p＜0.01vs与矽肺组比较表2 手掌参对染矽尘大鼠不同时间点I型胶原面积百分比的影响(n＝8，x±S，％)
p＜0.05，**p＜0.01与对照组比较；#p＜0.05，##p＜0.01vs与矽肺组比较表3 手掌参对染矽尘大鼠不同时间点III型胶原面积百分比的影响(n＝8，x±S，％)
*p＜0.05，**p＜0.01与对照组比较；#p＜0.05，##p＜0.01vs与矽肺组比较表4 手掌参对染矽尘大鼠不同时间点血浆MDA含量的影响(n＝8，x±S，nmol/ml)
p＜0.05，**p＜0.01与对照组比较；#p＜0.05，##p＜0.01vs与矽肺组比较表5 手掌参对染矽尘大鼠不同时间点肺脏器系数的影响(n＝8，x±S，U/ml)
*p＜0.05，**p＜0.01与对照组比较；#p＜0.05，##p＜0.01vs与矽肺组比较表6 手掌参对染矽尘大鼠不同时间点血浆GHS-PX活力的影响(n＝8，x±S，U)
*p＜0.05，**p＜0.01与对照组比较；#p＜0.05，##p＜0.01vs与矽肺组比较。
权利要求
1.一种手掌参提取物，其特征是用下述方法制成将手掌参生药粉碎后过筛，用所述手掌参生药粉重量4-10倍的体积百分比浓度为50～70％乙醇水溶液浸泡18-30小时后，加热回流提取0.5-3小时，过滤，所述提取次数为1-3次，合并滤液，滤液减压浓缩至50℃时相对密度为1.05-1.2，即制成一种手掌参提取物。
2.根据权利要求1所述的一种手掌参提取物，其特征是所述乙醇水溶液的加入量为手掌参生药粉重量的8倍，所述乙醇水溶液的浓度为60％。
3.根据权利要求1所述的一种手掌参提取物，其特征是所述手掌参生药粉的浸泡时间为24小时。
4.权利要求1-3之一的手掌参提取物，在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种手掌参提取物及在制备治疗肺纤维化药物中的应用，手掌参提取物是用下述方法制成将手掌参生药粉碎后过筛，用所述手掌参生药粉重量4－10倍的体积百分比浓度为50～70％乙醇水溶液浸泡18－30小时后，加热回流提取0.5－3小时，过滤，所述提取次数为1－3次，合并滤液，滤液减压浓缩至50℃时相对密度为1.05－1.2，即制成一种手掌参提取物，经实验证明手掌参提取物对实验性矽肺具有一定的治疗作用，提示手掌参提取物在其它肺部纤维化病变也具有使用价值。
文档编号A61K125/00GK101077390SQ20061001379
公开日2007年11月28日 申请日期2006年5月22日 优先权日2006年5月22日
发明者王世鑫, 汪骏, 曾锦波 申请人:中国人民武装警察部队医学院